Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính cây ngón hoa trắng (nhài bắc) và cây trúc đào ở Việt Nam phục vụ cho giám định hóa pháp

hấp thụ đặc trƣng cho liên kết C-H ở max 2829 cm -1 . Nhóm cacbonyl cho dải hấp thụ đặc trƣng ở max 1661 cm -1 . Sự có mặt của vòng benzen trong phân tử một lần nữa đƣợc khẳng định thông qua các dải hấp thụ đặc trƣng cho liên kết C=C của vòng thơm ở max 1612, 1507 và 1385 cm -1 , liên kết C-O-C thể hiện dải hấp thụ đặc trƣng ở max 1178 cm -1 . Các dữ kiện phổ trên cho phép xác định chất HF 5.2.1 là một hợp chất flavonoid. Hình 3.88: Phổ 1H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH của hợp chất HF 5.2.1 122 Hình 3.89: Phổ 13C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC của hợp chất HF 5.2.1 Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic [M-H]- tại m/z 285 kết hợp với các dữ kiện phổ trên cho phép xác định công thức phân tử của chất 2 là C15H10O6. Kết hợp các dữ kiện phổ và so sánh dữ liệu của chất 2 với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo [34], [38] cho phép kết luận chất HF 5.2.1 là kaempferol tên IUPAC là 3,5,7- trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one. Kaempferol là một chất flavonol đã đƣợc tìm thấy trong nhiều loài thực vật và đƣợc biết đến với các hoạt tính kháng viêm, lợi tiểu, chống oxi hóa, ức chế các enzym topoisomerase-II, adenosine deaminase, tyrosine kinase và xanthine oxidase. Hình 3.90: Cấu trúc hóa học của hợp chất kaempferol Trong hoa trúc đào có 4 hợp chất đã phân lập đƣợc trong đó có hai hợp chất glycosid và hai hợp chất flavonoid. Hai hợp chất 16-dehydroadynerigenin, 123 16-digitoxigenin có độ độc cao, hai hợp chất flavonoid là quercetin, kaempferol, hai hợp chất flavonoid này tƣơng đối phổ biến trong một số cây khác nữa. 3.6. NHẬN XÉT VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC  Thành phần hóa học cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) - Về thành phần hóa học của cây ngón hoa trắng hiện tại trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam chƣa có tác giả nào nghiên cứu. Các hợp chất 1-triacontanol; tyrosol; β-sitosterol là các hợp chất tƣơng đối phổ biến ở những thực vật bậc cao nhƣng đây là lần đầu tiên các hợp chất này đƣợc phân lập từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc). Bảng 3.17: Các hợp chất phân lập đƣợc từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) STT Tên và công thức phân tử Mẫu nghiên cứu Ghi chú 1 1-triacontanol (70mg) Lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) Lần đầu phân lập 2 β-sitosterol (50mg) Lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) Lần đầu phân lập 3 tyrosol (115mg) Lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) Lần đầu phân lập - Trên đây cũng mới chỉ là nghiên cứu bƣớc đầu về thành phần hóa học của lá cây ngón hoa trắng. Do vậy trong thời gian tới sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần các hợp chất khác có trong lá, thân, rễ của cây ngón hoa trắng(Nhài bắc) 124  Thành phần hóa học lá và hoa cây trúc đào - Thành phần hóa học có trong cây trúc đào rất phức tạp và có nhiều nhóm chất khác nhau. Trong cùng một loại nhƣng trồng ở những nơi khác nhau thì các hoạt chất cũng khác nhau, độc tính cấp cũng khác nhau. Trong nghiên cứu này cũng cho biết thành phần hóa học, độc tính cấp của cây trúc đào trồng tại Việt Nam, qua đó để giúp phòng tránh bị ngộ độc và giúp việc giám định hóa pháp trở lên thuận tiện hơn. - Trong lá cây trúc đào đã phân lập đƣợc 12 chất, trong đó có 6 hợp chất glycosid là neriasid, adynerigenin 3-O--D-diginosid, oleandrigenin-3-O--D- diginosid, oleandrin, gitoxigenin-3-O--L-oleandrosid, 16- adynerigenin 3-O--D- diginosid, đây là các glycoid có độc tính cao và đặc biệt là oleandrin. Còn các hợp chất acid oleanolic, acid betulinic, betulin, acid 27-hydroxy-3β-hydroxyurs-12-en- 28-oic, pinoresinol, syringaresinol hiện nay chƣa thấy tài liệu nào đề cập đến việc gây ngộ độc cho con ngƣời. - Từ hoa cây trúc đào đã phân lập đƣợc 4 chất là 16-dehydroadynerigenin, 16-digitoxigenin, quercetin, kaempferol theo các tài liệu tham khảo trong nƣớc thì chƣa thấy tác giả nào đề cập đến việc phân lập 4 hợp chất trên từ hoa cây trúc đào. Trong 4 hợp chất trên thì có 2 hợp chất flavonoid là quercetin, kaempferol tƣơng đối phổ biến trong các thực vật bậc cao. - Các hợp chất phân lập đƣợc trong lá và hoa cây trúc đào trong nghiên cứu này hiện tại ở Việt Nam chƣa có tác giả nào công bố, ngoài GS.Đỗ Tất Lợi công bố phân lập oleandrin từ 5 kg lá cây khô. - Cây trúc đào là một cây có độc tính cao và chƣa rất nhiều hoạt chất, cho đến nay trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về nghiên cứu thành phân hóa học cũng nhƣ tác dụng sinh học các chất phân lập đƣợc từ cây trúc đào. Nhƣng hiện tại trong nƣớc hầu nhƣ chƣa ai nghiên cứu sâu về hóa học, độc tính cấp cây trúc đào và với việc nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính cấp của cây trúc đào tại Việt Nam có thể coi là một điểm mới của luận án. 125 Bảng 3.18: Các hợp chất phân lập đƣợc từ lá, hoa cây trúc đào STT Tên và công thức phân tử Mẫu nghiên cứu Ghi chú 1 O O O O OH 1 2 65 7 9 10 11 12 14 15 17 18 19 20 4 22 23 O OH H3CO 1'2' 4' 5' 6' 3' 3 16 8 21 neriasid (8mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 2 O O O OO OH H3CO 2 1 3 4 6 8 21 10 12 13 15 17 18 19 20 22 23 1'2' 4' 5' adynerigenin 3-O--D-diginosid (6mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 3 O O OH O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1' 2'3' 4' 5' 6' 23 O O OH H3CO oleandrigenin-3-O--D-diginosid (6mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 126 4 O O OH O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1' 2' 3' 4' 5' 6' 23 O O MeO HO oleandrin (7mg) Lá trúc đào 5 O OH OH O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1' 2' 3' 4' 5' 6' 23 O H3CO HO gitoxigenin-3-O--L-oleandrosid (5mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 6 O O O OO OH H3CO 2 1 3 4 6 8 21 10 12 13 15 17 18 19 20 22 23 1'2' 4' 5' 16- adynerigenin 3-O--D-diginosid (6mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 7 HO COOHH 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25 23 27 28 29 30 24 26 10 12 oleanolic acid (12mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 127 8 COOH HO 1 2 3 5 7 9 10 11 12 25 24 17 18 19 20 30 29 28 26 22 21 14 16 betulinic acid (6mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 9 CH2OH HO 1 2 3 5 7 9 10 11 12 25 24 17 18 19 20 30 29 28 26 22 21 14 16 betulin (7mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 10 HO COOH OH 1 3 5 7 9 10 11 12 14 15 17 18 19 21 22 2324 27 28 29 30 27-hydroxy-3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid (6mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 11 pinoresinol (10mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 128 12 syringaresinol (8mg) Lá trúc đào Mới tại Việt Nam 13 16-dehydroadynerigenin (10mg) Hoa trúc đào Mới tại Việt Nam 14 16-digitoxigenin (30mg) Hoa trúc đào Mới tại Việt Nam 15 quercetin (50mg) Hoa trúc đào Mới tại Việt Nam 16 kaempferol (50mg) Hoa trúc đào Mới tại Việt Nam 129  Các phƣơng pháp nhận dạng Trong nghiên cứu này các hợp chất phân lập đƣợc đều đƣợc sử dụng phƣơng pháp MS, 13 C-NMR(125 MHz, CHCl3)δC, 1 H-NMR(500 MHz, CHCl3)δH, HSQC, DEPT. Các hợp chất này đều đạt yêu cầu về độ tinh khiết. Ngoài ra các chất còn đƣợc đo điểm nóng chảy, đây là một kỹ thuật đơn giản, tiến hành nhanh chóng, cho phép đánh giá sơ bộ định tính và đánh giá mức độ tinh khiết của hợp chất. 3.7. ĐỊNH LƢỢNG GLYCOSID TIM TRONG LÁ TRÖC ĐÀO Quy trình định lƣợng làm theo mục 2.3.5 và kết quả định lƣợng glycosid tim đƣợc tính theo công thức: X = trong đó: X: hàm lƣợng phần trăm của glycosid. 𝑥: khối lƣợng cặn (g). 𝑦: khối lƣợng nguyên liệu (g). z: độ ẩm mẫu thử (%). Kết quả định lƣợng đƣợc trình bày dƣới bảng 3.19. Bảng 3.19: Bảng kết quả định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào khô STT Mẫu lá cây trúc đào (g) Hàm lƣợng ẩm (%) Khối lƣợng cặn (g) Hàm lƣợng (%) 1 50,142 15,98 0,798 1,89 2 50,654 16,21 0,813 1,925 3 50,098 15,79 0,724 1,72 TB 50,298 16,99 0,7783 1,845 Qua phần định lƣợng, kết quả hàm lƣợng glycosid tim trung bình trong lá trúc đào là 1,845%. Nhận xét về phương pháp định lượng glycosid tim trong lá trúc đào: Kết quả định lƣợng theo phƣơng pháp cân có kết quả chỉ là tƣơng đối nhƣng từ kết quả này cho biết hiệu suất chiết xuất của phƣơng pháp. Theo Inchem 2005 thì 130 hàm lƣợng glycosid tim có trong cây trúc đào khoảng 2%. Mặt khác phƣơng pháp cân đƣợc sử dụng để sơ bộ xác định lƣợng hợp chất toàn phần hay lƣợng sản phẩm chiết đƣợc, xác định lƣợng hợp chất phân lập, qua đó tính đƣợc hiệu suất của mỗi quá trình. Đây là phƣơng pháp đơn giản, chủ yếu đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu suất chiết xuất. Hàm lƣợng glycosid tim có trong lá cây trúc đào thu hái tại đƣờng Hoàng Diệu là 1,845%. Hàm lƣợng glycosid tim xác định đƣợc ở phƣơng pháp này chƣa thực sự chính xác tuyệt đối, nhƣng theo [55] thì hàm lƣợng glycosid tim có trong lá trúc đào khoảng 2%, nhƣ vậy định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào thu hái tại Hà Nội đƣợc sấy khô theo phƣơng pháp cân cho kết quả tƣơng đối tin cậy, hiệu suất chiết xuất glycosid tim từ lá trúc đào khô là khá cao. Theo các tài liệu nghiên cứu sâu về cây trúc đào [27], [42], [70] thì các tác giả cũng chƣa thấy đề cập đến việc định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào, do vậy định lƣợng đƣợc glycosid tim trong mẫu lá trúc đào khô có ý nghĩa quan trọng trong thực tế cũng nhƣ trong các nghiên cứu tiếp về cây trúc đào. 3.8. THỬ ĐỘC TÍNH CẤP 3.8.1. Thử độc tính cấp mẫu lá trúc đào - Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong 24giờ và theo dõi hoạt động của chuột trong thời gian 7 ngày. Bảng 3.20: Thể tích đƣa mẫu thử và mức liều thử nghiệm trên chuột Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch thử/20g chuột) Liều dùng (g mẫu thử/kg chuột) Số chuột thí nghiệm Mức liều 1 0,40 ml hd thử 16mg mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 2 0,50 ml hd thử 20mg mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 3 0,60 ml hd thử 24mg mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 4 0,70 ml hd thử 28mg mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 5 0,80 ml hd thử 32mg mẫu thử/kg chuột 10 Theo dõi: Tiêu thụ thức ăn và uống của chuột: 131 Sau khi uống dung dịch thử ở mức liều 1 chuột giảm hoạt động, thở nhanh và sau 2 tiếng thì bình thƣờng trở lại. Ở mức liều 2, 3, 4 và 5, sau khi uống dung dịch thử, chuột có biểu hiện giảm hoạt động, nằm mệt, thoi thóp. Số chuột không chết ở các mức liều trên sau 24 giờ hoạt động bình thƣờng trở lại. Quan sát dấu hiệu ngộ độc: Sau khi uống dung dich thử ở các mức liều 2, 3, 4 và 5, chuột có biểu hiện giảm hoạt động, sau đó chuột nằm mệt, thoi thóp và chết trong khoảng thời gian 4 - 6 giờ sau khi uống. Kết quả: Theo dõi tỷ lệ chuột chết/ sống khi đƣợc uống dung dịch thử ở các mức liều thử nghiệm theo bảng 3.20 đƣợc thể hiện trên bảng 3.21 và hình 3.91. Bảng 3.21: Bảng số liệu kết quả thử nghiệm mẫu cao trúc đào Mức liều Liều thử (mg mẫu thử/kg chuột) Số chuột chết/ sống thực tế Số chuột chết/ sống tích l y % Chết 1 16 0/10 0/26 0 2 20 1/9 1/16 6,25 3 24 5/5 6/7 46,15 4 28 8/2 14/2 87,5 5 32 10/0 24/0 100 Tính LD50 theo Behrens ( 50 – a) x D LD50 = A + ------------------- b – a Trong đó: A - Liều gây chết a% ĐVTN a - % ĐVTN chết sát dƣới 50% sao cho a < 50% b - % ĐVTN chết sát trên 50% sao cho b >50% D - khoảng cách giữa các liều (g) Theo bảng trên, ta có: a = 46,15% b = 87,5% A = 24mg mẫu thử/ kg chuột D = 4mg mẫu thử/ kg chuột 132 ( 50 – 46,15) x 4 LD50 = 24 + ------------------------ = 24,37 mg mẫu thử/kg chuột 87,5- 46,15 Hình 3.91: Đồ thị theo các số liệu trên bảng 3.19 Tính sai số chuẩn của LD50 kSD (SELD50) 2 = ------------ n Trong đó: k: Hệ số Behrens = 0,66 n: Số chuột trong mỗi nhóm. S: Phân phối chuẩn Theo đồ thị, ta có: LD16 = 21,25 mg mẫu thử/ kg chuột LD84 = 27 mg mẫu thử/ kg chuột 27– 21,25 S = ------------------ = 2,875 mg mẫu thử/ kg chuột. 2 kSD 0,66 x 2,875 x 4 Sai số chuẩn: (SELD50) 2 = ------------- = ----------------------- n 10 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100 16 16. 5 17 17. 5 18 18. 5 19 19. 5 20 20. 5 21 21. 5 22 22. 5 23 23. 5 24 24. 5 25 25. 5 26 26. 5 27 27. 5 28 28. 5 29 29. 5 30 30. 5 31 31. 5 32 Liều (mg/kg) % c h u ộ t ch ết 133  SELD50 = 0,70 mg mẫu thử/ kg chuột Vậy LD50 = (24.37 ± 0,70) mg mẫu thử/ kg chuột. Kết luận: Độc tính cấp trên chuột nhắt trắng của mẫu cao chiết lá trúc đào: Liều không gây chết chuột là 16mg mẫu thử/ kg chuột. Liều gây chết 100% số chuột thử nghiệm là 32mg mẫu thử/ kg chuột. Dựa trên số liệu thí nghiệm thực tế đã tìm đƣợc liều LD50 là (24,37 ± 0.70) mg mẫu thử/ kg chuột. Với kết quả thử nghiệm trên và so sánh với các tài liệu [24], [25], [26], [37] ta thấy lá trúc đào ở Việt Nam có độ độc rất cao. 3.8.2. Thử độc tính cấp mẫu lá ngón hoa trắng - Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong 24giờ và theo dõi hoạt động của chuột trong thời gian 7 ngày sau khi uống. Bảng 3.22: Thể tích đƣa mẫu thử và mức liều thử nghiệm trên chuột Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch thử/20g chuột) Liều dùng (g mẫu thử/kg chuột) Số chuột thí nghiệm Mức liều 1 0,40 ml hd thử 3g mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 2 0,60 ml hd thử 4,5g mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 3 0,80 ml hd thử 6g mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 4 1,00 ml hd thử 7,5g mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 5 1,20 ml hd thử 9g mẫu thử/kg chuột 10 Theo dõi: Tiêu thụ thức ăn và uống của chuột: - Sau khi uống dung dịch thử ở mức liều 1 chuột ăn uống, hoạt động bình thƣờng. Ở mức liều 2, 3, 4 và 5, sau khi uống dung dịch thử, chuột có biểu hiện giảm hoạt động, nằm mệt,thoi thóp. Số chuột không chết ở các mức liều trên sau 24 giờ hoạt động bình thƣờng trở lại. - Quan sát dấu hiệu ngộ độc: Sau khi uống dung dich thử ở các mức liều 2, 3, 4 và 5, chuột có biểu hiện giảm hoạt động, sau đó chuột nằm mệt, thoi thóp và chết trong khoảng thời gian 4 - 6 giờ sau khi uống. 134 - Theo dõi tỷ lệ chuột chết/ sống khi đƣợc uống dung dịch thử ở các mức liều thử nghiệm theo bảng 3.22 đƣợc thể hiện trên bảng 3.23và hình 3.92. Bảng 3.23: Bảng số liệu kết quả thử nghiệm mẫu cao ngón hoa trắng (Nhài bắc) Mức liều Liều thử (g mẫu thử/kg chuột) Số chuột chết/ sống thực tế Số chuột chết/ sống tích l y % Chết 1 3 0/10 0/25 0 2 4.5 2/8 2/14 12.25 3 6 6/4 8/6 57.1 4 7.5 8/2 16/2 88.8 5 9 10/0 25/0 100 Hình 3.92: Đồ thị theo các số liệu trên bảng 3.21 Tính LD50 theo Behrens: ( 50 – a) x D LD50 = A + ------------------- b – a 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100 16 16. 5 17 17. 5 18 18. 5 19 19. 5 20 20. 5 21 21. 5 22 22. 5 23 23. 5 24 24. 5 25 25. 5 26 26. 5 27 27. 5 28 28. 5 29 29. 5 30 30. 5 31 31. 5 32 Liều (mg/kg) % c h u ộ t ch ết 135 Trong đó: A - Liều gây chết a% ĐVTN a - % ĐVTN chết sát dƣới 50% sao cho a < 50% b - % ĐVTN chết sát trên 50% sao cho b >50% D - khoảng cách giữa các liều (g) Theo bảng trên, ta có: a = 12,25% b = 57,1% A = 4,5g mẫu thử/ kg chuột D = 1,5g mẫu thử/ kg chuột (50 – 12,25) x 1,5 LD50 = 4,5 + --------------------------- = 5,76 g mẫu thử/kg chuột 57,1- 12.25 , Tính sai số chuẩn của LD50: kSD (SELD50) 2 = ------------- n Trong đó: k: Hệ số Behrens = 0.66 n: Số chuột trong mỗi nhóm. S: Phân phối chuẩn Theo đồ thị 3.2, ta có: LD16 = 4,65 g mẫu thử/ kg chuột LD84 = 7,2 g mẫu thử/ kg chuột 7,2 – 4,65 S = ----------------------- = 1,275g mẫu thử/ kg chuột. 2 kSD 0,66 x 1,275 x 1,5 Sai số chuẩn: (SELD50) 2 = ------------- = ---------------------------- n 10  SELD50 = 0,11 g mẫu thử/ kg chuột Vậy LD50 = (5,76 ± 0,11) g mẫu thử/ kg chuột. Kết luận: Kết quả của mẫu thử cao lá Ngón hoa trắng (Nhài bắc) thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng: Trong thử nghiệm này, đã tìm đƣợc liều không gây chết chuột là 3g mẫu thử/ kg chuột. Liều gây chết 100% số chuột thử nghiệm là 9g mẫu 136 thử/ kg chuột. Từ số liệu thực tế thí nghiệm, đã tìm đƣợc liều LD50 là (5,76 ± 0,11)g mẫu thử/kg chuột. Nhận xét về kết quả thử độc tính cấp: - Kết quả thử độc tính cấp của lá ngón hoa trắng, LD50 = 5,76g/kg, theo kết quả này thì cây ngón hoa trắng có độ độc thấp. Vì nghiên cứu này mới chỉ là bƣớc đầu thử độc tính cấp của dịch chiết lá do vậy cần phải tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về độc tính cấp của dịch chiết thân, rễ của cây ngón hoa trắng (Nhài bắc), để từ đó giúp cho việc giám định hóa pháp thuận tiện và chính xác. - Theo kết quả thử độc tính cấp của lá trúc đào, LD50 = 24,37mg/kg. So sánh với các tài liệu [23], [24], [25], [37] thì thấy độ độc của trúc đào trồng tại Việt Nam là tƣơng đối cao. - Kết quả thử độc tính cấp của dịch chiết toàn phần lá trúc đào và lá ngón hoa trắng (Nhài bắc) là mới tại Việt Nam và hiện chƣa có tài liệu nào trong nƣớc công bố thử độc tính cấp dịch chiết toàn phần của lá trúc đào, lá của cây ngón hoa trắng (Nhài bắc). Với kết quả thử nghiệm này, thì đây cũng có thể coi là công bố đầu tiên về độc tính cấp của dịch chiết toàn phân lá trúc đào khô và lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) khô. 3.9. ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH HÓA PHÁP Oleandrin phân lập đƣợc từ lá cây trúc đào đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu đại diện trong giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc kí lớp mỏng và Sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cặn chiết từ phủ tạng nạn nhân nghi ngộ độc trúc đào đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp TLC và HPLC. 3.9.1. Ứng dụng giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc ký lớp mỏng Chấm chất cần phân tích (cặn chiết từ phủ tạng nạn nhân) và chất đối chiếu lên bản mỏng tráng sẵn rồi triển khai trên hai hệ dung môi sau. Hệ dung môi 1: aceton : toluen : ethanol : amoniac (45 : 45 : 7 : 3). Dung môi triển khai đƣợc khoảng 9cm, lấy ra khỏi bình triển khai sắc kí và để cho khô. Soi dƣới đèn tử ngoại bƣớc sóng 254nm ta có sắc ký đồ nhƣ hình 3.86. Dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254nm ta thấy oleandrin và các glycosid trên mẫu PT01 và PT02 có mầu sậm và Rf của oleandrin là ~ 0,71. 137 a b Hình 3.93: Sắc ký lớp mỏng của oleandrin và mẫu phân tích PT01, PT02 soi dƣới đèn tử ngoại Trong đó: a: oleandrin chuẩn và mẫu PT01 b: oleandrin chuẩn và mẫu PT02 Hệ dung môi 2: EtOAc : MeOH : H2O tỷ lệ [81 : 11 : 8]. Phun thuốc thử Kedde sẽ cho màu đỏ tía của oleandrin và màu tím của các glycosid khác và Rf của oleandrin là ~ 0.85. (nhƣ hình 3.87) 138 Hình 3.94: Sắc ký lớp mỏng của oleandrin và mẫu phân tích PT01, PT02 phun thuốc thử Kedde Trong đó: 1: mẫu oleandrin phân lập đƣợc từ lá trúc đào. 2: mẫu cắn chiết từ nạn nhân nghi bị ngộ độc trúc đào (PT02). 3: mẫu cắn chiết từ nạn nhân nghi bị ngộ độc trúc đào (PT01). Hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng là EtOAc : MeOH : H2O tỷ lệ [81 : 11 : 8] phân tách các chất tốt, có thể áp dụng hệ dung môi này vào trong phân tích hóa pháp (trƣờng hợp ngộ độc glycosid cây trúc đào). Nhận xét: Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng khi phân tích sàng lọc xác định nạn nhân ngộ độc glycosid của cây trúc đào tƣơng đối hiệu quả khi có chất đối chiếu. Hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng aceton : toluen : ethanol : amoniac [45 : 45 : 7 : 3] và EtOAc : MeOH : H2O [81 : 11 : 8] tách tốt các hợp chất glycosid. Thuốc thử Kedde cho màu đặc trƣng khi xác định các hợp chất glycosid trong cây trúc đào. 3.9.2. Ứng dụng giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao  Khảo sát giới hạn phát hiện 139 Giới hạn phát hiện (LOD - limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đƣợc về mặt định tính nhƣng không nhất thiết phải định lƣợng trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Giới hạn phát hiện đƣợc coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng của mẫu trắng. Tiến hành pha oleandrin đối chiếu với nồng độ giảm dần, xử lý mẫu rồi chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng, ghi tỷ số giữa chiều cao pic và nhiễu đƣờng nền. Tại nồng độ 0,01ppm đối oleandrin cho tín hiệu thỏa mãn điều kiện của giới hạn phát hiện. Vậy giới hạn phát hiện của chất đối chiếu oleandrin là 0,01ppm. So sánh với [58] thì giới hạn phát hiện oleandrin trong nghiên cứu này là tốt hơn.  Giám định mẫu thật Mẫu oleandrin phân lập đƣợc dùng làm mẫu đối chiếu đại diện và cặn chiết từ dịch dạ dày của nạn nhân nghi ngộ độc trúc đào (ký hiệu PT01 và PT02) đƣợc phân tích trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện chạy máy nhƣ sau: chƣơng trình chạy gradien từ 0 phút đến 50 phút với hệ pha động là từ 10% acetonitril : 90% acid formic 0,1% đến 90% acetonitril : 10% acid formic 0,1%; cột pha đảo C- 18; tốc độ dòng 0,5ml/phút; detetor DAD đo ở bƣớc sóng 245nm. Kết quả đo đƣợc thể hiện dƣới sắc ký đồ ở hình 3.86, hình 3.87, hình 3.88, hình 3.89, hình 3.90, hình 3.91 và hình 3.92. Hình 3.95: Sắc ký đồ của oleandrin 140 Trên sắc ký đồ thời gian lƣu của pic oleandrin đối chiếu ở phút 37.589. Ở sắc ký đồ ở hình 3.88 của mẫu PT01 trên ta thấy có một pic xuất hiện tại thời gian lƣu ở phút 37,68. Hình 3.96: Sắc ký đồ của mẫu PT01 Để khẳng định chính xác pic xuất hiện ở thời gian lƣu ở phút 37.68 là của oleandrin trong mẫu PT01, áp dụng phƣơng pháp thêm chất chuẩn đối chiếu vào mẫu cần phân tích, nếu pic trong sắc ký đồ ở hình 3.87 có thời gian lƣu ở phút 37,68 cao nên, thì có thể khẳng định chính xác nạn nhân đã bị ngộ độc trúc đào. Ở sắc ký đồ hình 3.88 thấy pic ở thời gian lƣu ở phút 37,65 cao lên, có thể khẳng định đó chính là pic của oleandrin. Hình 3.97: Sắc ký đồ của mẫu PT01 đã thêm chất đối chiếu oleandrin min0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 mAU 0 20 40 60 80 100 DAD1 A, Sig=245,4 Ref=360,100 (TRUCDAO092013-L2\MAU PT01.D) 5 .4 26 1 8. 20 3 1 8. 67 3 1 9. 07 2 2 0. 06 8 2 1. 06 6 2 2. 04 9 2 2. 38 2 2 4. 32 6 2 5. 10 6 2 6. 05 4 2 6. 87 8 2 7. 64 1 2 8. 13 0 3 0. 52 1 3 1. 07 6 3 2. 23 9 3 2. 82 2 3 3. 30 6 3 4. 42 4 3 4. 75 4 3 5. 75 2 3 7. 68 3 3 9. 21 3 3 9. 54 8 min0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 mAU 0 20 40 60 80 DAD1 A, Sig=245,4 Ref=360,100 (TRUCDAO092013-L2\MAU PT01 THEM.D) 5 .4 11 1 9. 07 2 2 2. 05 4 2 6. 04 9 2 6. 87 4 2 7. 63 0 2 8. 12 0 3 0. 51 4 3 1. 07 0 3 2. 23 6 3 2. 81 2 3 3. 30 3 3 4. 41 1 3 5. 74 5 3 6. 62 9 3 7. 65 2 3 9. 16 8 3 9. 50 7 141 Hình 3.98: Sắc ký đồ của mẫu PT01, mẫu PT01 đƣợc thêm oleandrin và mẫu đối chiếu oleandrin Với mẫu PT02 cũng sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn để khẳng định pic ở thời gian lƣu ở phút 37,598 là của oleandrin. Hình 3.99: Sắc ký đồ của mẫu PT02 142 Hình 3.100: Sắc ký đồ của mẫu PT02 thêm chất đối chiếu oleandrin Ở sắc ký đồ của mẫu PT02 trên cho thấy có một pic xuất hiện tại thời gian lƣu ở phút 37,589, sau khi thêm chất đối chiếu oleandrin thấy sắc ký đồ mẫu PT02 có pic tại thời gian lƣu ở phút 37,60 cao lên. So sánh với sắc ký đồ oleandrin từ đó khẳng định chính xác nạn nhân cũng đã bị ngộ độc trúc đào. Hình 3.101: Sắc ký đồ của mẫu PT02, PT02 thêm oleandrin và mẫu đối chiếu oleandrin min10 20 30 40 mAU -20 0 20 40 60 80 100 120 DAD1 A, Sig=245,4 Ref=360,100 (TRUCDAO092013-L2\MAU PT02L2-THEM.D) 5 .4 14 6 .9 54 2 0. 13 5 2 3. 82 9 2 4. 42 6 2 4. 98 5 2 6. 02 9 2 6. 76 0 2 7. 17 1 2 7. 50 6 2 8. 19 0 2 9. 27 8 2 9. 97 3 3 0. 38 6 3 1. 06 8 3 2. 14 1 3 2. 73 6 3 3. 20 8 3 4. 31 1 3 4. 66 2 3 5. 76 6 3 6. 54 3 3 7. 60 0 3 9. 13 4 3 9. 46 9 143 Từ kết quả phân tích 02 mẫu nạn nhân nghi ngờ ngộ độc trúc đào bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, nhận thấy đây là phƣơng pháp có độ chính xác và tin cậy. Hợp chất oleandrin phân lập đƣợc dùng làm chất đối chiếu đại diện trong giám định Hóa pháp bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho kết quả tốt. Nhận xét về giám định Hóa pháp: - Trong giám định hóa pháp các nạn nhân ngộ độc thực vật thì chỉ cần chọn một chất tiêu biểu và ổn định làm chất đối chiếu. Do đó trong nghiên cứu này oleandrin đƣợc chọn làm chất đối chiếu vì oleandrin là một chất rất độc cũng là chất chính trong cây trúc đào và lâu bị phân hủy, có độ ổn định cao khi đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu trong giám định hóa pháp bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đã khảo sát và lựa chọn đƣợc hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc kí là aceton : toluen : ethanol : amoniac (45 : 45 : 7 : 3) và EtOAc : MeOH : H2O tỷ lệ [81 : 11 : 8], hai hệ dung môi này cho thấy khả năng tách các hợp chất glycosid rất tốt. Hệ dung môi aceton : toluen : ethanol : amoniac cho Rf của oleandrin là 0,71 còn hệ dung môi EtOAc : MeOH : H2O cho Rf của oleandrin là 0,85. Đối với thuốc thử hiện màu thì thuốc thử Kedde có phản ứng màu tốt. Do đó phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng có thể dùng làm phƣơng pháp sàng lọc trong giám định hóa pháp nạn nhân ngộ độc cây trúc đào. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao cũng đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới cũng sử dụng để giám định nạn nhân ngộ độc do trúc đào. Điều đó cho thấy phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng tuy là phƣơng pháp cổ điển, nhƣng vẫn còn là một phƣơng pháp sàng lọc tốt trong giám định ngộ độc trúc đào nói riêng và các giám định độc chất khác nói chung. - Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ứng dụng trong giám định nạn nhân ngộ độc trúc đào khi sử dụng chất đối chiếu là oleandrin cho kết quả tốt và chính xác. Trong nghiên cứu này cũng đã nghiên cứu và khảo sát và tìm đƣợc chƣơng trình chạy HPLC để giám định nạn nhân ngộ độc trúc đào nhƣ sau: chƣơng 144 trình chạy gradien từ 0 phút đến 50 phút với hệ pha động là 10% acetonitril : 90% acid formic 0.1% đến 90% acetonitril : 10% acid formic 0.1%, cột pha đảo C-18, tốc độ dòng 0,5ml/phút, detetor DAD đo ở bƣớc sóng 245nm. Mặt khác giới hạn phát hiện oleandrin bằng HPLC là 0,01ppm, điều này rất thuận lợi cho việc giám định nạn nhân ngộ độc trúc đào. Ngoài oleandrin đƣợc làm chất đối chiếu thì trong thực tế khi giám định mẫu nạn nhân ngộ độc trúc đào, các chất đã phân lập đƣợc ở trên cũng đã đƣợc đƣa vào làm chất đối chiếu để tăng độ chính xác. - Phƣơng pháp HPLC cũng đã đƣợc các nhà khoa học cũng sử dụng để giám định xác định oleandrin các trƣờng hợp bò bị ngộ độc trúc đào. Phƣơng pháp HPLC trong giám định nạn nhân ngộ độc trúc đào không đòi hỏi sự phức tạp cũng nhƣ đòi hỏi chi phí lớn. Chất đối chiếu oleandrin đƣợc sử dụng trong HPLC có sự ổn định cao, ít bị sai lệch về thời gian lƣu. - Khi triển khai hai phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC giám định các vụ ngộ độc trúc đào xuống các trung tâm chống độc của các tỉnh thì sẽ rất thuận lợi do hai phƣơng pháp này có chi phí đầu tƣ ít lại có độ chính xác cao. 145 KẾT LUẬN Trên cơ sở các nội dung khoa học đã triển khai nghiên cứu thực hiện, luận án đã đạt đƣợc các kết quả và đóng góp mới nhƣ sau: A. Kết quả đã đạt đƣợc:  Xây dựng đƣợc bộ hồ sơ thực vật tƣơng đối hoàn chỉnh về cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) gồm: định danh tên khoa học Jasminum coarctatum Roxb.; mô tả chi tiết đặc điểm hình thái, phân bố; giải phẫu vi phẫu; giám định DNA và so sánh sự giống và khác nhau với cây ngón hoa vàng (Gelsemium elegans).  Đã định danh tên khoa học của cây trúc đào Nerium oleander L. ở Việt Nam.  Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc đƣợc 3 hợp chất từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) là: 1-triacontanol (70mg); β-sitosterol (50mg), tyrosol (115mg) và 16 hợp chất từ lá, hoa cây trúc đào: neriasid (8mg), adynerigenin 3-O--D-diginosid (6mg), oleandrigenin-3-O--D-diginosid (6mg), oleandrin (7mg), gitoxigenin-3-O--L-oleandrosid (5mg), 16- adynerigenin 3-O-- D-diginosid (6mg), oleanolic acid (12mg), betulinic acid (6mg), betulin (7mg), 27- hydroxy-3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid (6mg), pinoresinol (10mg), syringaresinol (8mg), 16-dehydroadynerigenin (10mg), 16-digitoxigenin (30mg), quercetin (50mg), kaempferol (50mg).  Xác định hàm lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào là 1,845% .  Đã tiến hành thử độc tính cấp (LD50) của cao chiết toàn phần của lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) là (5,76 ± 0,11) g/kg chuột và cao chiết toàn phần lá trúc đào là (24,37 ± 0,70)mg/kg chuột.  Đã ứng dụng hợp chất oleandrin đã phân lập đƣợc làm chất đối chiếu đại diện trong giám định Hóa pháp. B. Những đóng góp mới của luận án:  Bƣớc đầu xây dựng đƣợc bộ hồ sơ thực vật tƣơng đối hoàn chỉnh về cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) gồm: định danh tên khoa học Jasminum coarctatum 146 Roxb.; mô tả chi tiết đặc điểm hình thái, phân bố, giải phẫu vi phẫu, giám định DNA và so sánh sự giống và khác nhau với cây ngón hoa vàng (Gelsemium elegans).  Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc đƣợc 3 hợp chất từ lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và 16 hợp chất từ lá, hoa cây trúc đào.  Định lƣợng glycosid tim trong lá trúc đào.  Độc tính cấp (LD50) của cao chiết toàn phần của lá cây ngón hoa trắng (Nhài bắc) và cao chiết lá trúc đào.  Ứng dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao trong giám định hóa pháp nạn nhân ngộ độc trúc đào với chất đối chiếu là hợp chất oleandrin đã phân lập đƣợc. C. Hƣớng nghiên cứu tiếp theo:  Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, thử độc tính cấp trên toàn cây trúc đào nhƣ: lá, hoa, rễ  Phân lập, tinh chế một số hợp chất từ cây trúc đào làm chất đối chiếu trong giám định hóa pháp.  Tiếp tục nghiên cứu sâu thành phần hóa học, thử độc tính cấp trên toàn cây ngón hoa trắng nhƣ: lá, hoa, thân, rễ 147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Tiến Vững, Lê Anh Hào (2011), Phân lập và xác định cấu trúc của oleandrin từ lá trúc đào, Tạp chí Dược học, No.421 (Vol.51), 33 - 35. 2. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững (2011), Phân lập và xác định cấu trúc của adynerin, acid betulinic và betulin từ lá trúc đào, Tạp chí Dược học, No.423 (Vol.51), 19 - 22. 3. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững (2011), Phân lập và xác định cấu trúc của neriasid và acid oleanolic từ lá trúc đào, Tạp chí Dược học, No.421 (Vol.51), 39 - 41. 4. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững (2012), Phân lập và xác định cấu trúc của nerigosid từ lá trúc đào, Tạp chí Dược học,No.431 (Vol.52), 53 - 55. 5. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững (2012), Phân lập và xác định cấu trúc của dehydroadynerigenin3-diginosid, pinoresinol và syringaresinol từ lá trúc đào, Tạp chí Dược học,No.432 (Vol.52), 41 - 43. 6. Nguyễn Tiến Vững, Lê Anh Hào (2012), Phân lập và xác định cấu trúc của gitoxigenin-3-O--L-oleandroside và acid 3,27-dihydroxyurs-12-en-28-oic từ lá trúc đào, Tạp chí Dược học,No.433 (Vol.52), 23 - 25. 7. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững (2012), Phân lập và xác định cấu trúc của 16-dehydroadynerigenin và 16-digitoxigenin từ hoa cây trúc đào, Tạp chí hoá học 4A50, 174-176. 8. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững, Đào Công Minh (2013), Phân lập xác định cấu trúc của quercetin và kaempferol từ hoa cây trúc đào. Tạp chí hoá học 2AB51, 314- 316. 9. Lê Anh Hào, Nguyễn Tiến Vững, Đào Công Minh, Nguyễn Quang Huy (2014), Phân lập và nhận dạng một số hợp chất từ phân đoạn n-hexan của cây Ngón hoa trắng (Jasminum coarctatum Roxb.). Tạp chí Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, tập 5, số 3, 99-101. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Bộ Y Tế, Đề án (2012), “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030”. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, Nhà xuất bản y học Hà Nội. Nguyễn Thị Vĩnh Hà (1996), Nghiên cứu tác dụng chế phẩm đông y trên một số thông số miễn dịch chuột nhắt trắng, Luận án phó tiến sĩ Y dược, Hà Nội. Nguyễn Thị Hồng Hƣơng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2007), Góp phần nghiên cứu các flavonoid trong cây chè vằng, Tạp chí dược học, số 379. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học. Viện Dƣợc liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (2004) tập 2, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, trang 1025-1028. Trần Đình Lý (2007), Thực vật chí Việt Nam, tập 5, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, trang 205-208. Đại Huệ Ngân (2005), Tác dụng sinh học và hóa học của cây Chè vằng Việt Nam. Ngô Vân Thu (2011), Dược liệu học, tập 1, Nhà xuất bản y học. Nguyễn Viết Tựu, Nguyễn Văn Đàn (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học Hà Nội. Nguyễn Tiến Vững (2008), Đề tài cấp Bộ Y tế, Nghiên cứu phƣơng pháp xác định độc tính của cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae) trong kiểm định y pháp. Nguyễn Tiến Vững, Lê Anh Hào (2007), Phân lập và xác định cấu trúc của Humantenin từ rễ cây lá ngón (Gelsemiium elegans Benth.) ở Việt Nam, Tạp chí Dược học, 47, 380, 39-41. Nguyễn Tiến Vững, Lê Anh Hào (2007), Phân lập và xác định cấu trúc của Gelsemin từ rễ cây lá ngón (Gelsemiium elegans Benth.) ở Việt Nam, Tạp chí Dược liệu, 12, 6, 167-169. 14. 15. Nguyễn Tiến Vững, Hoàng Kim Huế (2007), Phân lập và xác định cấu trúc của Gelsevirin từ rễ cây lá ngón (Gelsemiium elegans Benth.) ở Việt Nam, Tạp chí Dược học, 47, 376, 11-13. Nguyễn Tiến Vững, Hoàng Kim Huế (2007), Phân lập và xác định cấu trúc của Koumin từ rễ cây lá ngón (Gelsemiium elegans Benth.) ở Việt Nam, Tạp chí Dược học, 47, 372, 19-21. Tiếng Anh: 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Abe F. and Yamauchi T. (1976), Pregnanes in the root bark of Nerium odorum Sand. Phytochemistry, 15, 1745. Abe F. and Yamauchi T. (1978), Cardenolides with unusual framework in oleander leaves, Tennen Yuki-Kagobutsu-Toronkai, Koen, Yoshishu, 592-599. Abe F., and Yamauchi T. (1978), Digitoxigenin Oleandroside and 5α- Adynerin in the leaves of Nerium odorum (Nerium 9). Chem. Phar. Bull. 26(10) 3023-3027. Abe F. and Yamauchi T. (1992), Two pregnanes from oleander leaves Phytochemistry, 31, 2819. Abe F., Yamauchi T. (1992), Cardenolide Triosides of Oleander Leaves. Phytochemistry 31, 2459-2463. Adam S., Alyahya M. and Alfarhan A. (2002), Toxicity of Nerium oleander in sheep. American J. Chiness Med., 30: 255-262. Agrawal P.K. (1989), Carbon-13 NMR of flavonoids, Elservier, 151-155. Almahy H. A. and Khalid H. E. (2006), Chemical examination of the leaves of Nerium oleander, International Journal of Tropical Medicine 1(2): 58-61. Ali Aziz Alkhayyat, Lubna Ahmed Kafi, Zena Ahmed Hatif (2010), Acute toxicity study of three type of Nerium-oleander leaves of hexane extract in mice. لا عراق ية لاب ي طر ية لاطب ية لامج لة (Hiqarala Hartaibla Habtala Hljmla) 34 (2): 194 - 201. Aslani M. R., Movassaghi A. R., Mohri M., Abbasian A., Zarehpour A. M. (2004), Clinical and pathological aspects of experimental oleander (Nerium 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. oleander) toxicosis in sheep. Veterinary Research Communications, 28(7): 609-616. Aslani, M.R., Movassaghi, A.R., Janati-Pirouz, H. and Karazma, M. (2007), Experimental oleander (Nerium oleander) poisoning in goats: a clinical pathological study; Iranian Journal of Veterinary Research, University of Shiraz, Vol. 8, No. 1, Ser. No. 18. Atiya Ziaui Haque (1997), Doctor of Philosophy, Studies of the effect of the and constituents of Nerium Olaender leaves on the central nervous system of Mice, University of Karachi, Pakistan. Barbosa R. R., Fontenele-Neto J. D and Soto-Blanco B. (2008), Toxicity in goats caused by oleander (Nerium oleander). Research in Veterinary Science, 85(2): 279-281. Barbara Vermes, Otto Seligmann and Hildebbert Wagner (1991), Synthesis of Biologically Active Tetrahydrofurofuranlignan (syringin,pinoresinol) mono and bisglucosides. Photochemistry, Vol. 30, No. 9, 3087-3089. Begum S., Adil Q., Siddiqui B.S. and Siddiqui S. (1993), Constituents of the leaves of Thevetia neriifolia. J. Nat. Prod., 56, 613. Bilal Ghareeb* (2011),Ex vivo assessment of Nerium oleander (Defla) toxicity and Silybum marianum (Khurfeish) antidotal virtues, Journal of Al- Quds Open University for Research and Studies - No. 23 (1). Cabrera G. M., Deluca M. E., Seldes A. M., Gros E. G., Oberti J. C., Crockett J. and Gross M. L. (1993), Cardenolide glycosides from the roots of Mandevilla pentalandiana, Phytochemistry, 32, 1253. Chang Da Liu, Jing Chen, and Jin Hui Wang (2009), A novel Kaempferol triglycoside from flower buds of Panax quinquefolium, Chemistry of Natural Compounds, Vol. 45, No. 6, 808-810. Chien-Chang Shen, Yuan-Shiun Chang, Li-Kang Hott (1993), Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, 34, 843-845. Coll J. C. and Bowden B. F. (1986), The Application of vacuum liquid 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. chromatography to the separation of terpene mixtures. J. Nat. Prod., 49, 934. Covas MI, Miró-Casas E, Fitó M, Farré-Albadalejo M, Gimeno E, Marrugat J, De La Torre R. (2003), Bioavailability of tyrosol, an antioxidant phenolic compound present in wine and olive oil, in humans, Drugs under experimental and clinical research.29(5-6):203-206. Chowdhury M.G.A, Azizunnesa, Hossain M.A, Rahman M.L and Hasan Q. (2004), Toxic effect and oral acute LD50 study of Nerium Oleander in male Guinea pigs, Bang. J. Vet. Med, 159-161. Dictionary of Natural Products on CD-ROM (1982-2007), Chapman & Hall_CRC. Ding K., Fang J., Dong T and Tasim W.( 2003),Characterisation of the compounds isolated from Nerium oleander and their activities on PC12 pheochromocytoma cells. J. natural prod., 66: 7-10. Drakenberg T., Brodelius P., McIntyre D. D. and Volgel H. J. (1990), The conformation of digitoxose and digitoxin in solution has been studied in detail, Can. J. Chem., Vol. 68, p. 272-277. El-shazly M., El-zayat E. M., and Hermersdorfer H. (2005), Insecticidal activity, mammalian cytotoxicity and mutagenicity of an ethanolic extract from Nerium oleander (Apocynaceae). Annals of Applied Biology, 136(2): 153-157. Farnaz S. (1996), Master of Philosophy Dissertation, Investigation of new inhibitors of human platelet aggregation, arachidonic acid metabolism and thrombosis, University of Karachi. Firouz Matloubi Moghaddam, Mahdi Moridi Farimani, Sabah Salahvarzi and Gholamreza Amin (2007), Chemical Constituents of Dichloromethane Extract of Cultivated Satureja khuzistanica, Evid Based Complement Alternat Med.; 4(1): 95-98. Gabriela M Cabrera, Monica E. Deluca, Alicia M. Sekdes, Eduardo G. Gros, Juan C Oberti,* Janeen Crockett and Michael Gross (1993), Gardenolide glycosides from the roots of Mandevilla Pentlandiana. Phytochemistry Vol 32, No.5, 1253-1259. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. Goetz Rebecca. J (1998), “Oleander”. Indiana Plants Poisonous to Livestock and Pets. Cooperative Extension Service, Purdue University. Hafeez F. (1987), Ph. D. Dissertation, Studies in the Chemical Constituents of Nerium oleander (Kaner), University of Karachi. Hanada R., Abe F., Yamauchi T. (1992), Steroid Glycosides from the Roots of Nerium-Odorum. Phytochemistry (Oxford) 31, 3183-3187. Hadizadeh I., Peivastegan B. and Kolahi M. (2009), Antifungal Activity of nettle (Urtica dioica L.), Colocynth (Citrillus colocynthis L.), Oleander (Nerium oleander L.) and Konar (Ziziphus spina-christi L.) Extractes on Plants Pathogenic Fungi. Pakistan Journal of Biological Sciences, 12(1): 58-63. Haeba M., Mohamed A., Mehdi A and Nair G. (2002), Toxicity of Nerium oleander leaf extract in mice. J.Environmental Biology., 23, 231-237. Hassan Abdalla Almahy, Hassan Elsubki Khalid (2006), Chemical Examination of the leaves of Nerium oleander, International Journal of Tropical Medicine, 58-61. Hussain M. A. and Gorsi M. S. (2004), Antimicrobial Activity of Nerium oleander Linn, Asian Journal of Plant Sciences, 3(2): 177-180. Huq M. M., Jabbar A., Rashid A., and Hasan C. M. (1999), A novel antibacterial and cardiac steroid from the roots of Nerium oleander, Fitoterapia, 70, 5. Huq M. M. , Jabbarn A., Rashid M. A. and Hasan C. M. (1998), A new cardeonolide from the roots of Nerium oleander, Fitoterapia, 69, 545-546. Huq M. M., Jabbar A., Rashid A., Hasan C. M., Ito C. and Furukawa H. (1999), Steroids from the roots of Nerium oleander, J. Nat. Prod. 62, 1065. Inchem (2005), “Nerium oleander L.(PIM 366)”. IPCS Inchem. Imad Hadi Hameed, Huda Jasim, Muhanned Abdulhasan Kareem and Ameera Omran Hussein (2015), Alkaloid constitution of Nerium oleander using gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS), Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 9(9), 326-334. Kojima H. and Ogura H. (1989), Configurational studies on hydroxyl groups at 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. C-2,3 and 23 or 24 of oleanene and ursene-type triterpenes by NMR spectroscopy, Phytochemistry, 28, 1703-1710. Knight, Dr. A. P. (1999), “Guide to Poisonous Plants: Oleander”. Colorado University. James A. Downer and Arthur Craigmill (1998), Toxicity of Oleander derived Compost. University of california.(slosson.ucdavis.edu). Liming Bai, Ming Zhao, Asami Toki, Jun-ichi Sakai, Xiao-yang Yang, Yuhua Bai, Mariko Ando, Katsutoshi Hirose, and Masayoshi Ando (2010). Three New Cardenolides from Methanol Extract of Stems and Twigs of Nerium oleander. Chem. Pharm. Bull. 58(8) 1088-1092. Maillard M., Adewunmi C.O. and Hostettmann K. (1992), Atriterpene glycoside from the fruits of tetrapleura tetraptera. Phytochemistry, vol.31, No.4, 1321-1323. Manjunath B.L. (1966), The Wealth of India, Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi, Vol. VII, p.15. Maryam Mohadjerani (2012), Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Nerium oleander L. Grown in North of Iran, Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2012), 11 (4): 1121-1126. Mochammad Sholichin, Kazuo Yamasaki, Ryoji Kasai, and Osama Tanaka (1980). 13 C Nuclear Magnetic Resonance of Lupane-Type Triterpenes, Lupeol, Betulin and Betulinic Acid. Chem. Pharm. Bull. 28 (3) 1006-1008. Ming Zhao, Liming Bai, Liyan Wang, Asami Toki, Toshiaki Hasegawa, Midori Kikuchi, Mariko Abe, Jun-ichi Sakai, Ryo Hasegawa, Yuhua Bai, Tomokazu Mitsui,Hirotsugu Ogura,Takao Kataoka,Seiko Oka, Hiroko Tsushima, Miwa Kiuchi, Katutoshi Hirose, Akihiro Tomida, Takashi Tsuruo, and Masayoshi Ando (2007), Bioactive Cardenolides from the Stems and Twigs of Nerium oleander. Journal of Natural Products, Vol. 70, No.7, pp.1098-1103. Ming Zhao, Liming Bai, Asami Toki, Ryo Hasegawa, Jun-ichi Sakai, Toshiaki Hasegawa, Hirotsugu Ogura, Takao Kataoka, Yuhua Bai, Mariko Ando, 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. Katsutoshi Hirose and Masayoshi Ando (2010), Three New Cardenolides from Methanol Extract of Stems and Twigs of Nerium oleander, Chem. Pharm. Bull.58(8) 1088-1092. Ming Zhao, Liming Bai, Asami Toki, Ryo Hasegawa, Jun-ichi Sakai, Toshiaki Hasegawa, Hirotsugu Ogura, Takao Kataoka, Yuhua Bai, Mariko Ando, Katsutoshi Hirose and Masayoshi Ando (2011), The Structure of a New Cardenolide Diglycoside and the Biological Activities of Eleven Cardenolide Diglycosides from Nerium oleander, Chem. Pharm. Bull. 59(3) 371-377. Mulas M., Perinu B., Francesconi A., Johnson C. and Franz C. (2002) Evaluation of spontaneous Nerium oleander and Nerium indicum as a medicinal plant. J. Herbs Species and Med. Plants, 9: 121-125. Nasir E. and Ali S. I. (1982), Flora of West Pakistan, Pakistan Agriculture Research Council, Islamabad, Vol. 148, p.19. Numata A., Takahashi C., Miyamoto T., Yoncda M. and Yang P. (1990), New triterpenes from a Chinese medicine, goreishi. Chem. Pharm Bull. 38, 942-944. Patel Govind, Nayak Satish, Shrivastava Shobhit (2010), Antiulcer activity of Methanolic leaves extract of Nerium-Indicum Mill. International Journal of Biomedical Research, 55-61. Quang. B. H, Bach. T. T., Choudhary. R. K., Chinh. V. T., Hai. D. V., Park. S. H., Lee. J. k. (2013), Jasminum extensum Wall. ex G. Don (Oleaceace), a new record to the flora of Vietnam. Journal Taiwania, Taiwan, China, 58(2): 128- 131. Razia Sultana (2001), Ph. D. Dissertation, Studies in the Chemical Constituents of Nerium oleander (Kaner), University of Karachi. Ravi Kumar.A., Deepthi Yadav.CH.S.D.Phani (2013), Antibacterial activity of ethanolic extracts of Nyctathes Arbortristis and Nerium Oleander, Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology, ISSN: 2320 - 3471(Online). Reynolds W. F., Maxwell A., Telang B., Bedaisie K. and Ramcharan G. (1995), Total assignment of the 1 H and 13 C NMR chemical shifts of four 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. bufadienolides by 2D NMR spectroscopy, Magnetic Resonance in Chemistry, 33, 412. Satish Sardana, Arun Mittal, Anima Pandey (2011), Ethnobotanical, Phytochemical and Pharmacological Profile of Jasminum sambac (L.) Ait, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, vol.11, Issue11. Siddiqui S., Hafeez F., Begum S. and Siddiqui B. S. (1987), Isolation and structure of two cardiac glycosides from the leaves of Nerium oleander Phytochemistry, 26, 237. Sholichin M., Yamasaki K., Kasai K. and Tanaka O. (1980), Nuclear Resonance of lupane-type triterpenes, lupeol, betulin and betulinic acid, Chem. Pharm. Bull.,28, 1006. Siddiqui S., Siddqui B. S., Naeed A., and Begum S. (1990), Three pentacyclic triterpenenoid from the leaves of Plumeria obtuse, Journal of Natural Products Vol. 53, No.5, pp. 1332-1336. Siddiqui B.S., Begum S., S.Siddiqui and Lichter W. (1995), Two cytotoxic pentacyclic triterpenoids from Nerium oleander, Phytochemistry, 39, 171. Siddiqui S., Siddiqui B. S., Hafeez F. and Begum S. (1988), Oleanderoic acid and oleanderen from the leaves of Nerium oleander. Planta Medica, 54, 232. Siddiqui S., Hafeez F., Begum S. and Siddiqui B. S. (1988), Oleanderol a new pentacyclic triterpene from the leaves of Nerium oleander. J. Nat. Prod., 51, 229. Siddiqui S., Siddiqui B. S., Naced A. and Begum S. (1992), Pentacyclic triterpenoids from the leaves of Plumeria obtuse, Phytochemistry, 31, 4279. Siddiqui B. S., Sultana R., Begum S., Zia A., and Suria A. (1997), Cardenolides from the Methanolic extract of Nerium Oleander leaves possessing Central Nervous system Depressant activity in Mice, J. Nat. Prod., Vol. 60, p. 540-544. Soto Blanco B., Fontenele Neto J. D., Silva D. M., Reis P. F. C. C and Nobrega J. E. (2006), Acute cattle intoxication from Nerium oleander, Tropical Animal Health and Production, 38(6): 451-454. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. Sushma S., Singh D. and Singh S. (1997), Molluscicidal activity of Nerium indicum leaf. Fitoterapia, 68: 545- 546. Suganya R.S., Priya K. and Snmi Roxy B. (2012), Phytochemical screening and antibacterial activity from Nerium Oleander and Evaluvate their plant mediated nanoparticle synthesis, International Research journal of pharmacy, ISSN 2230-8407. Syed Shahid Ali, Samina Ali, Ahahid Munir and Tanzeela Riaz (2008), Insecitidal and Bactericidal Effects of Ethanolic Leaf Extract of Common Oleander, Nerium Oleander, Punjab Univ. J. Zool., Vol. 23 (1-2), 081-090. The Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS), U.S. Department of Labor | Occupational Safety & Health Administration | 200 Constitution Ave., NW, Washington, DC 20210. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2012), Isolation of Stigmasterol and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus, Chaturvedula and Prakash, International Current Pharmaceutical Journal, 1(9): 239-242. Vikas Gupta and Payal Mittal (2010), Phytochemical and pharmacological potential of Nerium oleander. I.J.P.S.R, Vol.1, Issue 3. Yamauchi T., Abe F. and Takahashi M. (1976), Neriumosides, cardenolide pigments in the root bark of neium odorum. Tetrahedron Lett, 17 (14), 1115- 1116. Yamauchi T., Takahashi M, Abe F. (1976), Cardiac Glycosides of the Root Bark of Nerium-Odorum. Phytochemistry, 15, 1275-1278. Yamauchi T., Abe F. (1978), Neriaside a 8 14 Seco Cardenolide in Nerium- Odorum. Tetrahedron Letters, 1825-1828. Yamauchi T. and Abe F. (1990), Cardiac Glycosides and Pregnanes from Adenium obesum (Studies on the Constituents of Adenium. I). Chem. Pharm. Bull. 38(3) 669-672. Yamauchi T., Hara M. and Mihashi K. (1972), Pregnenolone Glucosides of Nerium-Odorum Phytochemistry, 11, 3345. 97. 98. 99. 100. Yamauchi T., Mori Y.and Ogata Y. (1973), Δ16-dehydroadynerigenin glycosides of Nerium odorum, Phytochemistry, 12, 2737. Yadav R. N. and Thakur V. (1994), A cardenolide cardiogenin 3-O-beta-D- xylopyranoside from the seeds of crotalaria-Juncea, Phytochemistry, 35, 1375. Wehrli F. W. and Nishida T. (1979), In: Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Vol. 36. The use of carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in Natural Products Chemistry (W. Herz, H. Grisebach and G. W. Kirby Eds.), pp. 80, 100, 104. Zia A., Siddiqui B.S., Begum S. and Suria A. (1995), Studies on the constituents of the leaves of Nerium oleander on behaviour patterns in mice. J. Ethanopharmacol. 49, 33. Website: 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. ài glycosid.html ha-noi-2012-tran-van-on-111-trang.9849/