Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài an xoa (helicteres hirsuta) và màng kiêng (Pterospermum Truncatolobatum) thuộc họ trôm (Sterculiaceae) tại Việt Nam

t;128 >128 >128 >128 20,58 >128 15,24 Đối chứng Ampicillin 0,1205 0,0704 - - 0.0099 0.0304 0.0106 Streptomycin - - 10,3164 - Amphotericin B - - - 0,073 Qua bảng trên cho thấy, các cao chiết thân lá và rễ An xoa có hoạt tính tốt với chủng L. fermentum. Đặc biệt là cao chiết nước của thân lá và butanol của rễ cây An xoa. 3.1.2.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư KB Khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô của một số cao chiết từ thân - lá và rễ cây An xoa được thể hiện trong bảng 3-11. Bảng 3-11. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB của các cao chiết cây An xoa Mẫu IC50 (µg/ml) Thân – lá Rễ n-Hexane >128 23,08 Ethyl acetate 102,6 3,23 Butanol >128 64,98 Nước >128 >128 Ellipticine 0,51 Từ kết quả trong bảng 3-11, có thể thấy cao chết EtOAc của rễ cây An xoa có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB mạnh nhất (IC50 là 3,23 µg/ml), mạnh hơn nhiều lần so với các cao chiết khác. 82 Trong công trình nghiên cứu về thân, lá và hoa của cây An xoa năm 2016 của tác giả Lê Thị Hải Yến và cộng sự [45] cho biết phân đoạn chloroform thể hiện khả năng gây độc một số tế bào ung thư mạnh. Mặt khác, Chin Y.W. và cộng sự (2006) [47] cho biết trong các hợp chất trong thân cây An xoa thì các hợp chất phenol đặc biệt là pinoresinol thể hiện khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, LNCaP khá mạnh. 3.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất sạch Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc 5 dòng tế bào ung thư của 10 hợp chất phân lập được từ cây An xoa được chỉ ra ở bảng 3-12. Bảng 3-12. Hoạt tính gây độc 5 dòng tế bào ung thư (giá trị IC50, M) của các hợp chất phân lập từ cây An xoa Hợp chất IC50 () SK-LU-1 HepG2 Hela SK-Mel- 2 AGS L1 (Betulinic acid methyl ester) 129,45 ± 9,96 164,74 ± 15,17 170,57 ± 8,09 140,79 ± 8,13 148,81 ± 14,40 L2 (Stigmasterol)  100  100  100  100  100 L3 (3β-Benzoylbetulinic acid) >100 >100 >100 >100 >100 L5 (3β-O-Trans- caffeoylbetulinic acid) 105,76 ± 4,19 88,32 ± 3,25 94,22 ± 9,27 74,48 ± 5,13 108,58 ± 6,99 L8 (3,5-Dimethoxyl gallic acid) >100 >100 >100 >100 >100 L9 (Betulinic acid) 126,69 ± 7,11 123,29 ± 8,77 148,86 ± 14,25 159,19 ± 8,82 117,32 ± 10,77 L10 (Icosanoic acid) 171,99 ± 7,63 234,23 ± 12,08 239,78 ± 20,58 259,20 ± 21,99 189,17 ± 14,49 L11 (3-Hydroxyprotosta- 17(20), 24-dien-21-oic acid) 174,12 ± 7,16 80,50 ± 5,23 74,01 ± 9,62 Không thử Không thử L12 (5,7-Dihydroxy-4’- >100 >100 >100 >100 >100 83 methoxy-flavone-8-yl O-β- D-glucopyranoside) L14 (5,8-dihydroxy-4’,7- dimethoxy-flavone) 266,15 ± 21,11 305,92 ± 13,44 225,92 ± 24,17 316,27 ± 16,02 238,69 ± 8,57 Ellipticine 1,91 ± 0,24 1,79 ± 0,28 1,59 ± 0,12 2,28 ± 0,33 2,03 ± 0,16 Nhận xét: - Tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế 5 dòng tế bào ung thư SK-Lu-1, Hep-G2, Hela, SK-Mel-2, AGS của 10 hợp chất phân lập tử cây An xoa thì 6 hợp chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư (L1, L5, L9, L10, L11, L14) với giá trị IC50 dao động từ 74,01 đến 316,27 M), 4 hợp chất còn lại (L2, L3, L8, L12) không có biểu hiện hoạt tính. - Theo kinh nghiệm dân gian thì cây An xoa có tác dụng chữa ung thư gan. Kết quả thử nghiệm trên tế bào ung thư gan dòng Hep-G2 cho thấy cả 6 chất đều có hoạt tính gây độc Hep-G2 với giá trị IC50 từ 74,01 đến 316,27 M. 3.2. Cây Màng kiêng 3.2.1. Xác định cấu trúc các hợp chất Hợp chất M1 Phổ 1H-NMR của M1 (hình 3-33 và 3-34) có sáu nhóm methyl, đó là hai vân đơn H-28 (0,68 ppm) và H-29 (1,01 ppm), một methyl doublet ở 0,92 ppm (H-19). Ngoài ra, tín hiệu ở 5,36 ppm là một olefinic proton (H-6). Peak ở 3,52 ppm (m) được quy kết cho nguyên tử H-3. 84 3-33. Phổ 1H-NMR của M1 HÌnh 3-34. Phổ giãn 1H-NMR của M1. Phổ 13C-NMR của M1 có 27 nguyên tử carbon. Cụ thể có hai olefinic carbon ở 140,8 ppm (C-5) và 121,7 ppm (C-6), một nhóm carbinol ở 71,8 ppm (C-3) (hình 3- 35). CH=CR2 CH- OH H-19 H-29 H26 H 27 H-28 85 Hình 3-35. Phổ 13C-HMR của M1 Các liên kết trực tiếp giữa C-H được xác định bằng phổ HSQC. Ví dụ C-6 tương ứng với H-6, C-13 tương ứng với H-13 và một số tín hiệu khác được mô tả trong hình 3-36. HÌnh 3-36. Phổ HSQC của M1 Phổ HMBC cho thấy tương tác gián tiếp của C và H ví dụ như C-6 với H-10 và H-29; C-9 với H-12, C-17 và C-14 với H-12 cùng với một số tín hiệu khác thể hiện trong hình 3-37. C5=C C=C6 C-OH 86 Hình 3-37. Phổ HMBC của M1 Từ các dữ liệu phân tích phổ ở trên, kết hợp với so sánh dữ liệu phổ của β- sitosterol được phân lập từ cây Rubus suavissimus [95] kết luận M1 là β- sitosterol. M1 β- sitosterol Bảng 3-13. Bảng 3-13. Dữ liệu phổ NMR của M1 và β-sitosterol Vị trí M1 β- sitosterol 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 37,3 37,5 2 31,9 31,9 3 3,52 (m) 71,8 3,53 72,0 4 42,4 42,5 5 140,8 140,9 6 5,36 (d, J = 5,5Hz) 121,7 5,36 121,9 7 31,91 32,1 8 31,91 32,1 9 50,2 50,3 87 10 36,5 36,7 11 21,1 21,3 12 39,8 39,9 13 42,3 42,6 14 56,8 56,9 15 26,2 26,3 16 28,3 28,5 17 56,1 56,3 18 36,2 36,3 19 0,92 (d, J =6,5) 19,1 0,93 19,2 20 34,0 34,2 21 26,15 26,3 22 45,9 46,1 23 23,10 23,3 24 12,0 0,84 12,2 25 29,2 29,4 26 0,84 (d, J =6,5) 19,8 0,83 20,1 27 0,82 (d, J =6,0) 19,4 0,81 19,6 28 0,68 (s) 19,1 0,68 19,0 29 1,01 (s) 11,9 1,01 12,0 Hợp chất M2 Phổ +IDA TOF MS của hợp chất M2 có peak ion giả phân tử ở m/z 335 [M+Na]+, như vậy M2 có khối lượng phân tử là 312, ứng với công thức phân tử C20H40O2. Nghiên cứu phổ 1H-NMR của hợp chất M2 ta thấy xuất hiện 2 nguyên tử H methylene của Cα với nhóm carboxylic. Do sự có mặt của nhóm carboxylic nên tín hiệu của Hα bị kéo về phía trường yếu và nguyên tử Hα bị tách bởi 2 nguyên tử H tương đương của Cβ nên xuất hiện vân triplet (J = 7,5 Hz). Ngoài ra có tín hiệu của một nhóm CH3 liên kết trực tiếp với nhóm CH2 và tín hiệu của các nguyên tử H của nhóm methylene. Phổ 13C-NMR cho thấy sự có mặt của 16 nguyên tử C trong hợp chất M2 trong đó có một nguyên tử C được quy kết là nguyên tử C của nhóm carboxylic có tín hiệu ở vị trí 179,9 ppm và các nguyên tử C no có tín hiệu từ 34,0 đến 14,1 ppm. 88 Từ kết quả phân tích phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR và phổ +IDA TOF MS của hợp chất M2 có thể khẳng định M2 là acid béo có 19 nguyên tử C no: icosanoic acid. Công thức cấu tạo của hợp chất M2 như sau: M2 Icosanoic acid Bảng 3-14. Dữ liệu phổ NMR của M2 và Icosanoic acid Vị trí M2 Icosanoic acid 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 179,9 178,4 2 2,34 (t, 7,5) 34,0 2,34 (t, 7,53) 34 3 1,63 (t, 7,5) 24,7 1,63 (m) 24,7 4 1,26 (s) 29,1 1,63 (m) 29 5 1,26 (s) 29,4 1,27 (m) 29,3 6 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 7 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 8 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 9 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 10 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 11 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 12 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 13 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 14 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 15 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 16 1,26 (s) 29,6 1,27 (m) 29,6 17 1,26 (s) 29,4 1,27 (m) 29,3 18 1,26 (s) 31,9 1,27 (m) 31,9 89 19 1,26 (s) 22,7 1,27 (m) 22,7 20 0,87 (t, 6,5) 14,1 0,88 (m) 14,1 Hợp chất M3 Phổ +IDA TOF MS của hợp chất M3 có peak ion giả phân tử với số khối là m/z 477,3332 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C30H46O3Na (tính toán lý thuyết là 477,3345). Vậy, M3 có công thức phân tử là C30H46O3. Phổ 1H-NMR của chất M3 (xem hình 3-39) có tín hiệu của một H ở vị trí 3,01 ppm (m) được xác định là H-19 do bị tách bởi với 2 loại H không tương đương (H ở C-18 và C-21). Tại vị trí 4,75 và 4,74 ppm có 2 peak đôi (J = 1,5 Hz) của 2H được quy kết cho H liên kết với Csp2 (H-29). Xuất hiện vân multiplet của 1H ở vị trí 2,42 và 2,50, hai vân này được quy kết cho 2 nguyên tử H-2. Tín hiệu của 2 nguyên tử H no bị kéo xuống trường yếu do sự ảnh hưởng của nhóm carbonyl ở C-3 đến nguyên tử H ở vị trí α với nhóm carboxylic. Hình 3-38. Phổ giãn 1H-NMR của M3 Phân tích phổ 13C-NMR của M3 cho thấy sự có mặt của 31 nguyên tử carbon trong đó có hai olefinic carbon ở 150,3 và 109,7 ppm), một C của nhóm carbonyl CH=CH H-19 CH2CO CH2CO 90 (218,1 ppm), một nguyên tử C được quy kết là C của gốc acid cacboxylic (181,2 ppm) (Hình 3-39). Hình 3-39. Phổ 13C-NMR của M3 Phân tích phổ HSQC và phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa C và H: C-3 với H-2, C-28 với H-18, C-20 với H-18, C-19 với H-29 và H-18, C-20 với H-19, C-5 với H-23, H-24 và H-25; C-9 với H-12 và H-25, C-19 với H-30, C-24 với H-23. Cụ thể được thể hiện trong các hình 3-40 và 3-41, 3-42. Hình 3-40. Phổ HSQC của M3 C20=C C=O -COOH C=C29 91 Hình 3-41. Phổ giãn HSQC của M3 Hình 3-42. Phổ giãn HMBC của M3 Kết quả phân tích phổ kết hợp với dữ liệu phổ của bentulonic acid được tách ra từ lá cây Hopea odorata Roxb. ở các rừng mưa nhiệt đới [96] cho phép kết luận hợp chất M3 là bentulonic acid. 92 M3 Betulonic acid Bảng 3-15. Dữ liệu phổ NMR của M3 vàBentulinic acid Vị trí M3 Bentulonic acid 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 1,38 (m) 39,6 1,38 (m) 1,91 (m) 39,6 2 2,42 (m) 2,50 (m) 34,1 2,42 (m) 2,50 (m) 34,1 3 218,1 218,2 4 47,3 47,3 5 1,34 (m) 55,0 1,35 (m) 54,9 6 1,52 (m) 19,6 1,52 (m) 19,6 7 1,44 (m) 33,6 1,44 (m) 33,6 8 40,7 40,6 9 1,38 (m) 49,9 1,38 (m) 49,9 10 36,3 36,9 11 1,34 (m) 1,46 (m) 21,4 1,34 (m) 1,44 (m) 21,4 12 1,07 (m) 1,70 (m) 25,5 1,06 (m) 1,73 (m), 25,4 13 38,5 2,23 (m), 38,5 14 42,5 42,5 15 1,42 (m) 1,99 (m) 30,6 1,42 (m) 1,99 (m) 30,5 16 1,46 (m) 32,1 1,44 (m) 2,28 (m) 32,1 17 56,3 56,3 93 18 1,64 (m) 49,2 1,64 (m) 49,2 19 3,01 (m) 46,9 3,02 (td, J=10,7; 4,8) 46,9 20 150,3 150,3 21 1,50 (m) 29,7 1,22 (m) 1,54 (m) 29,7 22 1,48 (m) 1,99 (m) 37,0 1,47 (m) 1,99 (m) 37,0 23 1,07 (s) 26,7 1,08 (s) 26,6 24 1,02 (s) 21,0 1,03 (s) 21,0 25 0,93 (s) 15,9 0,94 (s) 16,0 26 0,99 (s) 15,8 0,99 (s) 15,8 27 0,99 (s) 14,6 1,00 (s) 14,6 28 181,2 180,8 29 4,62 (d, J=1,5) 4,74 (d, J=1,5) 109,7 4,62 (s) 4,75 (s) 109,8 30 1,70 (m) 19,4 1,70 (s) 19,4 Hợp chất M4 Phổ khối của M4 (Hình 3-43) có peak ion giả phân tử ở m/z 427,2 [M+H]+, dự đoán công thức phân tử của M4 là C30H50O. HÌnh 3-43. Phổ khối của M4 Phân tích phổ 1H-NMR (Hình 3-44) thấy rằng M4 có 6 methyl singlet có độ chuyển dịch hóa học ở 1,05; 1,14; 0,90; 0,99; 0,93 và 0,78 ppm. Ngoài ra, hai methyl doublet có độ chuyển dịch hóa học ở 0,89 (d, J = 6,5 Hz) và 0,83 (d, J = 6,5 Hz) là H- 29 và H-30. Một olefinic proton-H6 ở 5,61 ppm và một proton của nhóm carbinol có 94 độ chuyển dịch hóa học ở 3,47 ppm (H-3). Hình 3-44. Phổ giãn 1H-NMR của M4 Tiếp tục phân tích phổ 13C-NMR (Hình 3-45) kết hợp với phổ HSQC (Hình 3- 49 và 3-50) cho thấy M4 có 30 carbon, trong đó có hai olefinic carbon ở 142,0 ppm (C-5) và 122,0 ppm (C-6) và các nguyên tử carbon nó khác. HÌnh 3-45. Phổ 13C-HMR của M4 C5=C C6=C 95 Hình 3-46. Phổ HSQC của M4 Hình 3-47. Phổ giãn HSQC của M4 Tương tác HMBC giữa C3/H-23, H-24; C-1, C-5/H-3 gợi ý rằng nhóm –OH gắn với C-3. Ngoài ra, H-6 có tương tác HMBC với C-4, C-7, C-8 và C-10 giúp xác định vị trí liên kết đôi ở C5-C6. Như vậy, M4 là một E:B-friedo-hopane-type 96 triterpenoid [97]. Hình 3-48. Phổ giãn HMBC của M4 Phân tích phổ ROESY của M4 có các peak giao giữa H-26/H-18, H-18/H-21 giúp xác định H-26, H-18 và H-21 hướng ra phía sau. Hơn nữa, H-28 có tương tác NOE với H-27 và H-22 suy ra chúng hướng ra phía trước. Hình 3-49. Phổ ROESY của M4 Sau nhiều cố gắng, chúng tôi đã kết tinh thành công M4 trong propanol. Phổ X- ray đơn tinh thể (hình 3-53) khẳng định cấu trúc của M4 là simiarenol [97] có cấu trúc như sau. 97 1 3 6 25 28 30 29 23 24 Hình 3-50. Phổ X-ray của M4 HO 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 14 13 12 16 18 19 21 22 24 23 6 25 26 28 29 30 27 17 M4 (Simiarenol) Bảng 3-16. Dữ liệu phổ NMR của M4 và Simiarenol Vị trí M4 Simiarenol 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 18,1 18,1 2 27,8 27,8 3 3,47 (t, J=2,5) 76,4 3,47 (brs) 76,4 4 40,9 40,8 5 142,0 142,0 6 5,61 (dd, J=2,0; 4,0) 122,0 5,62 (ddd, J=6,0; 2,0; 2,0) 122,0 7 24,1 24,1 8 44,3 44,3 9 34,9 34,8 10 50,3 50,2 98 11 34,2 34,1 12 29,0 29,0 13 38,7 38,6 14 39,4 39,3 15 29,1 29,1 16 35,5 35,4 17 42,8 42,8 18 51,8 51,7 19 19,9 19,9 20 28,3 28,3 21 60,1 60,0 22 30,8 30,8 23 1,05 (s) 29,2 1,05 (s) 29,1 24 1,14 (s) 25,5 1,14 (s) 25,5 25 0,90 (s) 17,9 0,90 (s) 17,9 26 0,99 (s) 15,8 1,01 (s) 15,8 27 0,93 (s) 15,0 0,93 (s) 15,0 28 0,78 (s) 16,1 0,78 (s) 16,1 29 0,89 (d, J=6,5) 22,0 0,89 (d, J=6,7) 22,0 30 0,83 (d, J=6,5) 22,9 0,83 (d, J=6,7) 22,9 Hợp chất M5 Phổ 1H-NMR của M5 có tín hiệu của 6 nhóm methyl, một proton của nhóm carbinol. Phổ 13C-NMR của nó có 29 nguyên tử carbon, trong đó có bốn olefinic carbon. Các dữ liệu phổ khẳng định M5 là của stigmasterol [98]. 99 M5 stigmasterol Bảng 3-17. Dữ liệu phổ NMR của M5 và Stigmasterol Vị trí M5 Stigmasterol 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 37,3 37,6 2 31,9 32,1 3 3,51 (m) 71,8 3,51 (tdd, J=4,5; 4,4; 3,8) 72,1 4 42,3 42,4 5 140,8 141,1 6 5,35 (t, J=2,0) 121,7 5,31 (d, J=6,1) 121,8 7 31,9 31,8 8 31,9 31,8 9 50,2 50,2 10 36,6 36,6 11 21,1 21,5 12 39,7 39,9 13 42,4 42,4 14 56,9 56,8 15 24,4 24,4 16 28,9 29,3 17 56,1 56,2 18 0,70 (s) 12,2 0,71 (s) 12,2 19 1,02 (s) 19,0 1,03 (s) 18,9 20 40,5 40,6 21 1,03 (d, J=7,0) 21,2 0,91 (d, J=6,2) 21,7 100 22 5,02 (dd, J= 9,0; 10,5) 138,3 4,98 (m) 138,7 23 5,16 (dd, J=9,0; 15,0) 129,3 5,14 (m) 129,6 24 46,8 46,1 25 31,7 29,6 26 0,85 (d, J=7,0) 21,1 0,82 (d, J=6,6) 20,0 27 0,80 (d, J=7,5) 19,4 0,80 (d, J=6,6) 19,8 28 25,4 25,4 29 0,83 12,1 0,83 (t, 7,1) 12,1 Hợp chất M6 Phổ 1H-NMR của M6 có hai methyl singlet ở 0,64 ppm (H-18), 1,21 ppm (H- 19), một methyl doublet ở 1,04 ppm (H-21). Có hai olefinic proton ở 5,16 (H-22) và 5,02 ppm (H-23). Ngoài ra, một peak ở 3,95 ppm là proton của nhóm carbonol (H-3). Đồng thời, các tín hiệu của phần đường (Hình 3-51) cũng xuất hiện, trong đó cấu hình  được xác định do hằng số tách lớn J = 8,0 Hz của vân phổ ở 4,99 ppm. Hình 3-51. Phổ 1H-NMR của M6 101 Hình 3-52. Phổ giãn 1H-NMR của M6 Phổ 13C-NMR của M6 có 35 nguyên tử carbon. Trong đó, có bốn olefinic carbon ở 140,8; 121,8; 138,6 và 129,4 ppm và một anomeric carbon ở 102,3 ppm cùng các peak khác như trong hình 3-53 và 3-54. HÌnh 3-53. Phổ 13C-NMR của M6 102 HÌnh 3-54. Phổ giãn 13C-NMR của M6 Từ các phân tích trên, M6 được xác định là stigmasterol glucoside. Hợp chất này đã được phân lập từ cây Cussonia arborea [98]. M6 (Stigmasterol glucoside) Bảng 3-18. Bảng so sánh dữ liệu phổ của M6 và stigmasterol glucoside Vị trí M6 (C5D5N) Stigmasterol glucoside (C5D5N) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 37,3 37,5 2 32,0 32,1 3 3,95 (m) 71,4 4,28 (m) 73,0 4 39,2 39,4 5 140,8 141,0 6 Lẫn với dung môi 121,8 5,34 (brs) 121,9 7 31,9 32,1 8 31,2 32,1 103 9 50,2 50,4 10 36,8 37,0 11 23,3 22,9 12 39,8 40,0 13 42,4 42,4 14 56,7 56,9 15 24,4 24,6 16 29,4 29,3 17 56,1 56,1 18 0,64 (s) 11,8 0,64 (s) 12,2 19 1,21 (s) 19,8 0,93 (s) 19,4 20 40,6 40,8 21 1,04 (d, J=6,5) 21,3 1,06 (d, J=6,5) 21,5 22 5,16 (m) 138,6 5,18 (dd, J=15,2; 6,4) 138,9 23 5,02 (m) 129,4 5,02 (dd, J=15,2; 6,4) 129,5 24 51,3 51,4 25 32,0 32,9 26 0,87 (d, J=6,5) 19,3 0,86 (d, J=6,2) 19,2 27 0,78 (d, J=7,0) 12,4 0,76 14,3 28 25,5 25,7 29 0,88 (t, J= 6,5) 12,4 0,88 (t) 12,5 1’ 4,99 (d, J=8,0) 102,3 5,05 (d, J=7,8) 102,6 2’ 78,1 78,1 3’ 78,2 78,6 4’ 75,0 75,4 5’ 78,2 78,5 6’ 62,5 71,7 Hợp chất M7 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất M7 xuất hiện tín hiệu của 8 nhóm methyl ở các vị trí δH 0,80 (3H, s); 0,82 (3H, s); 0,91 (6H, s); 0,93 (3H, s); 0,95 (3H, s); 0,98 (3H, s); 1,09 (3H, s) cùng với proton gắn với nguyên tử C liên lết với nhóm –OH tại vị trí 3,19 ppm (H-3). Proton tại vị trí 3,19 ppm này bị tách dưới dạng dd với một hằng số 104 tương tác lớn và một hằng số tương tác nhỏ cho biết nguyên tử H-3 có cấu hình α. Ngoài ra, vân phổ ở 5,54 ppm là H-15. Hình 3-55. Phổ 1H NMR của M7 Hình 3-56. Phổ giãn 1H NMR của M7 Tiếp tục phân tích phổ 13C-NMR kết luận được M7 có 30 carbon. Một số tín hiệu cơ bản có thể thấy đó là 8 nhóm methyl, 10 nhóm methylen, một nguyên tử carbon liên lết trực tiếp với oxi tại vị trí 79,1 ppm. Ngoài ra xuất hiện trên phổ tín hiệu của liên kết đôi C=C tại vị trí 116.9 ppm. Phân tích dữ liệu phổ cho thấy M7 là một triterpene chứa một liên kết đôi ở C-15 và một nhóm –OH liên kết với C-3. Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất M7 kết hợp với hoàn toàn trùng với hợp chất taraxerol trong tài liệu [99], [100]. 105 Hình 3-57. Phổ 13C NMR của M7 Hình 3-58. Phổ giãn 13C NMR của M7 Phổ X-ray đơn tinh thể (hình 3-59) khẳng định cấu trúc của hợp chất M7 là β-Taraxerol. 106 Hình 3-59. Phổ X-ray đơn tinh thể của M7 M7 (β-taraxerol) Bảng 3-19. Bảng so sánh dữ liệu phổ của M7 và β-taraxerol Vị trí M7 β-taraxerol 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1H NMR H (ppm), J (Hz) 13C NMR C (ppm) 1 37,8 37,6 2 27,2 27,0 3 3,19, (dd, J=11,0; 4,0 Hz) 79,1 3,19 79,0 4 39,0 39,2 5 0,77 (m) 55,4 55,2 6 18,8 18,6 7 2,04 (dt, J=13,0; 3,0Hz) 35,1 35,0 8 38,8 38,6 9 48,8 48,5 10 37,6 37,5 11 17,5 17,2 12 35,8 35,6 13 37,7 37,6 107 14 158,1 158,0 15 5,54 (dd, J=8,0; 3,0 Hz) 116,9 5,52 116,7 16 1,92 (dd, J=14,5; 2,0Hz) 1,70 (m) 36,7 36,6 17 38,0 38,2 18 49,3 49,0 19 41,4 41,2 20 28,8 29,6 21 33,7 33,6 22 33,1 33,0 23 0,93 (s) 28,0 0,92 28,2 24 0,91 (s) 15,5 0,90 15,4 25 0,98 (s) 15,4 0,97 15,2 26 1,09 (s) 29,8 1,08 29,7 27 0,82 (s) 25,9 0,82 25,5 28 0,80 (s) 29,9 0,80 29,7 29 0,91 (s) 33,4 0,90 33,2 30 0,95 (s) 21,3 0,94 21,2 Hợp chất M8 Phân tích phổ 1H NMR của hợp chất M8 nhận thấy tín hiệu của các nguyên tử H gắn với carbon của vòng benzene tại δ 7,95 ppm (d, 2H, J =6,5 Hz) và 6,86 ppm (d, 2H, J =6,0 Hz). Qua đó xác định được M8 chứa vòng thơm có 2 nhóm thế. Tại vị trí δ 3,89 ppm xuất hiện tín hiệu với cường độ 3H cho thấy sự có mặt của nhóm –OCH3. 108 Hình 3-60. Phổ 1H NMR của M8 Tiếp tục phân tích phổ 13C NMR cho thấy hợp chất M8 có 6 tín hiệu của C vòng thơm. Ngoài ra, tín hiệu tại vị trí δ 51,9 ppm được quy kết cho nhóm – OCH3. C = 168,8 ppm được quy kết cho nguyên tử C nhóm carboxyl. Hình 3-61. Phổ 13C NMR của M8 Nhu vậy, M8 là 2-methoxy benzoic acid. M8 (2-methoxy benzoic acid) Bảng 3-20. Dữ liệu phổ NMR của M8 và 2-Methoxy benzoic acid Vị trí M8 2- Methoxy benzoic acid 109 1H NMR H (ppm), J (Hz) (CDCl3) 13C NMR C (ppm) (CDCl3) 1H NMR H (ppm), J (Hz) (CDCl3) 13C NMR C (ppm) (DMSO – D6) 1 122,76 119,9 2 159,8 156,3 3 6,86 (d, J =6,0) 115,2 7,08 111,1 4 7,95 (d, J =6,5) 131,9 7,56 131,5 5 6,86 (d, J =6,0) 115,4 7,10 118,7 6 7,95 (d, J =6,5) 129,4 8,13 129,2 7 166,9 10,30 165,5 8 3,89 (s) 51,9 4,06 55,0 Như vậy, từ các cao chiết cây Màng kiêng, 8 hợp chất đã được tinh sạch như sau: β-sitosterol (M1) Icosanoic acid (M2) HO 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 14 13 12 16 18 19 21 22 24 23 6 25 26 28 29 30 27 17 Bentulonic acid (M3) Simiarenol (M4) 110 Stigmasterol (M5) β-Taraxerol (M7) Stigmasterol glucoside (M6) 2-Methoxy benzoic acid (M8) 3.2.2. Hoạt tính sinh học các cao chiết Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính độc tế bào của các cao CH2Cl2, butanol, EtOAc, n-hexane, và cao nước trên dòng tế bào ung thư KB ở các nồng độ mẫu khác nhau. Kết quả thu được cho thấy cao chiết n-hexane, CH2Cl2 và EtOAc có hoạt tính khả quan. Trong đó cao EtOAc có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB mạnh nhất (IC50 7,6 ± 0,41μg/ml). Cao butanol không thể hiện hoạt tính. Bảng 3-20. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào các cao chiết từ cây Màng kiêng STT Tên mẫu IC50 (µg/ml) 1 Cao n-Hexane 14,57 ± 1,40 2 Cao CH2Cl2 54,09 ± 1,52 3 Cao EtOAc 7,6 ± 0,41 4 Cao Butanol 182,51 ± 5,68 5 Cao nước >256 6 Đối chứng (Ellipticine) 0,21 ± 0,05 3.2.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất sạch Sau khi tiến hành phân lập và xác định công thức cấu tạo của các hợp chất, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính độc tế bào của hợp chất M3, M4 và M7 (bảng 3-26) trên 4 dòng tế bào ung thư (Hep-G2, Lu, KB, MCF7). Kết quả cho thấy hợp chất M3 thể hiện hoạt tính khá với 3 dòng tế bào ung thư Hep-G2, KB, MCF7 (IC50 < 150 M). 111 Hợp chất M4 thể hiện hoạt tính yếu hơn với 3 dòng tế bào ung thư Hep-G2, Lu-1, MCF7 (các giá trị IC50 đều nhỏ hơn 115 M) và không gây độc cho tế bào ung thư KB. Hợp chất M7 không thể hiện hoạt tính. Bảng 3-21. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của M3, M4, M7 Hợp chất IC50 (M) Hep-G2 Lu-1 KB MCF7 M3 (Bentulonic acid) 44,78 ± 3,68 147,91 ± 8,04 35,24 ± 2,09 82,53 ± 3,35 M4 (Simiarenol) 90,31 ± 6,29 113,54 ± 7,16 >64 109,98 ± 8,45 M7 (β-Taraxerol) >64 >64 >64 >64 Ellipticin 1,46 ± 0,12 1,30 ± 0,12 0,98 ± 0,08 2,07 ± 0,12 3.3. Kết quả docking của các triterpenoid với protein wMUS81 Kết quả docking của 9 hợp chất triterpenoid (L1, L2, L5, L7, L9, L11, M3, M4 và M7) với protein wMUS81 được trình bày trong bảng 3-22. Theo thuật toán của AutoDock4, giá trị năng lượng tự do liên kết càng âm nhiều có nghĩa ái lực liên kết giữa phối tử và protein đích càng mạnh. Từ bảng số liệu cho thấy chất chuẩn Mitoxantrone có điểm năng lượng liên kết với wMUS81 là -9,81 kcal/mol, do đó có thể coi đây là giá trị chuẩn để so sánh, các hợp chất có điểm năng lượng tự do liên kết gần bằng hoặc âm nhiều hơn giá trị này có thể được giả thuyết là tiềm năng liên kết tốt với wMUS81. Bảng 3-3-22. Thứ tự năng lượng liên kết của các hợp chất với protein wMUS81 (2MC3) Ký hiệu Năng lượng liên kết Gpred (kcal/mol) Ký hiệu Năng lượng liên kết Gpred (kcal/mol) L1 (Betulinic acid methyl ester) -7,12 L11 3-Hydroxyprotosta- 17(20), 24-dien-21-oic acid -7,92 L2 (Stigmasterol) -4,88 M3 (Bentulonic acid) -9,54 112 L5 (3β-O-Trans- caffeoylbetulinic acid) -9,13 M4 (Simiarenol) -6,31 L7 (β-Amyrin) -8,24 M7 (β-Taraxerol) -4,39 L9 (Betulinic acid) -7,84 Mitoxantrone -9,81 Kết quả từ bảng 3-22 cho thấy các hợp chất M3 và L5 được xác định có tiềm năng liên kết với wMUS81 với giá trị năng lượng liên kết lần lượt là -9,54 và -9,13 kcal/mol. Bảng 3-12 và 3-21 trình bày kết quả thử nghiệm độc tính tế bào IC50 đã được xác định trong các công bố trước đây của các hợp chất nghiên cứu trên một số dòng tế bào ung thư với thời gian ủ 48 tiếng. Trên cơ sở so sánh giữa năng lượng liên kết phối tử - protein và giá trị IC50 thực nghiệm, bước đầu nhận thấy có sự tương quan cao giữa mô phỏng tính toán và thực nghiệm, 2 hợp chất thể hiện hoạt tính độc tế bào ở mức khá đồng thời cho kết quả ái lực liên kết tốt với protein đích wMUS81 gồm M3 và L5. Tiến hành phân tích tương tác tạo thành của 2 hợp chất tiềm năng với đích tác dụng, kết quả được trình bày trong hình 3-62. (A) (B) M3 113 L5 Mitoxantrone Hình 3-62. Mô phỏng tương tác của các phối tử với các amino acid trong vùng hoạt động của protein MUS81. (A) Cấu hình tương tác 2D-pharmacophore; (B) Cấu hình tương tác 3D- pharmacophore Phân tích tương tác trong hình 3-62 cho thấy, đa số các amino acid quan trọng cấu thành nên vùng hoạt động của wMUS81 (Leu62, His63, Asn65, Asn 68, Arg69) có tham gia tạo liên kết với chất ức chế chuẩn Mitoxantrone. Kết quả mô phỏng tương tác đã chỉ ra trong số các hợp chất thể hiện hoạt tính kháng u, có hai hợp chất M3 và L5 thể hiện ái lực liên kết mạnh với wMUS81 kèm theo là các tương tác tạo thành với những amino acid quan trọng trong vùng hoạt động của đích protein này. Qua đó có thể nhận định bước đầu rằng hai hoạt chất này thể hiện hoạt tính kháng u thông qua cơ chế bất hoạt đích sinh học là protein wMUS81. 114 Hợp chất M3 được quan sát tạo 2 liên kết hydro với Arg59 và His63, bên cạnh đó, liên kết giữa phối tử và protein được củng cố bền vững thêm thông qua các liên kết không cực với Arg69 và Ala74. Hợp chất L5 hình thành 3 liên kết hydro với các amino acid Asn65, Val67, Arg69. Các liên kết yếu tạo thành với Leu62 và His63 cũng góp phần tăng cường ái lực liên kết của hợp chất với đích protein nghiên cứu. Kết quả này là cơ sở khởi đầu, định hướng cho các nghiên cứu sâu hơn về các chất ức chế protein wMUS81 bằng các mô hình thực nghiệm in vitro và in vivo. 115 KẾT LUẬN Sau một thời gian nghiên cứu và thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được những kết quả nghiên cứu chính sau đây: 1. Về thành phần hóa học: - Cây An xoa: Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất từ rễ (L1÷L9), 5 hợp chất từ thân lá (L10-L14) cây An xoa. Đó là methyl betulinate (L1), stigmasterol (L2), 3β-benzoylbetulinic acid (L3), methyl 3,4- dihydroxybenzoate (L4), 3β-O-trans-caffeoylbetulinic acid (L5), p-hydroxybenzoic acid (L6), β-amyrin (L7), 3,5-dimethoxy gallic acid (L8) và betulinic acid (L9), icosanoic acid (L10), 3β-hydroprotosta-17(20),24-dien-21-oic acid (L11), 5,7- dihydroxy-4’-methoxy-flavone-8-yl O-β-D-glucopyranoside (L12), methyl caffeate (L13), 5,8-dihydroxy-4’,7-dimethoxy-flavone (L14). Trong đó, hợp chất 3β- benzoylbetulinic acid (L3) là chất mới. - Cây Màng kiêng: Lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 8 hợp chất. Đó là β-sitosterol (M1), icosanoic acid (M2), bentulonic acid (M3), simiarenol (M4), stigmasterol (M5), stigmasterol glucoside (M6), β-taraxerol (M7), 2-methoxy benzoic acid (M8). Trong đó, cấu trúc của M4 và M7 còn được xác định bằng X-ray đơn tinh thể. 2. Về hoạt tính sinh học Đã tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật. Một số hợp chất phân lập được tiến hành thử khả năng gây độc tế bào trên các dòng ung thư. Các kết quả thu được cho thấy: - Cao phân đoạn EtOAc của mẫu thân - lá và rễ có hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất với IC50 tương ứng lần lượt là 0,112 và 0,117 mg/ml. - Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô KB cho thấy: 4 cao chiết từ cây An Xoa (TLE, RH, RE, RB) và 4 cao chiết (PH, PD, PE và PB) từ cây Màng kiêng có hoạt tính (IC50 dao động từ 7,4 đến 182,51 μg/ml). Trong đó, cao chiết EtOAc ở cả rễ cây An xoa và cây Màng kiêng có khả năng gây độc tế bào ung thư dòng KB mạnh nhất với IC50 lần lượt là 3,23 µg/ml và 7,6 µg/ml. - Cao chiết butanol của mẫu thân - lá và rễ cây An xoa có khả năng ức chế mạnh L. fermentum với IC50 lần lượt là 2,95 và 1,55 µg/ml. - Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư SK-Lu-1, Hep- G2, Hela, SK-Mel-2, AGS của 13 chất phân lập được cho thấy 6 chất từ cây An xoa (L1, L5, L9, L10, L11, L14) và hai hợp chất từ cây Màng kiêng (M3, M4) có hoạt tính. 116 3. Kết quả docking phân tử Kết quả mô phỏng tương tác đã chỉ ra trong số các hợp chất thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư, có hai hợp chất M3 và L5 thể hiện ái lực liên kết mạnh với wMUS81 kèm theo là các tương tác tạo thành với những amino acid quan trọng trong vùng hoạt động của đích protein này. Qua đó có thể nhận định bước đầu rằng hai hoạt chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư thông qua cơ chế bất hoạt đích sinh học là protein wMUS81. 117 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Pham Huu Dien, Phong Thị Thanh Huyen, Le Thi Khanh Linh, Dang Ngoc Quang. Cytotoxic constituents from aerial parts of Helicteres hirsuta plant, collected in Binh phuoc province, Journal of Science, Hue University, 127, 111-117, 2018. 2. Diem Thi Thuy Dung, Trinh Huyen Trang, Le Thi Khanh Linh, Dao Van Tan, Le Thi Phuong Hoa. Second metabolites and antioxidant, antimicrobial, anticancer activities of Helicteres hirsuta root extract. Academia Journal of Biology, 40, 45–51, 2018. 3. Dang Ngoc Quang, Nguyen Thanh Chung, Le Thi Khanh Linh, Ta Ngoc Quynh, Dang Kim Ngoc, Hoang Thi Nhung, Pham Huu Dien. Cytotoxic constituents from Helicteres hirsuta collected in Vietnam, Natural Product Research, 34, 585-589, 2020 (SCIE). 4. Le Thi Khanh Linh, Thongphet Chansounom, Nguyen Quang Tuyen, Dang Ngoc Quang. Chemical constituents of the dichloromethane fraction of Pterospermum truncatolobatum collected in Lang Son province. HNUE Journal of Science, Natural Sciences, 66, 127-133, 2021. 5. Le Thi Khanh Linh, Nguyen Thu Uyen, Pham Huu Dien, Dang Ngoc Quang. Cytotoxic constituents from Vietnamese Pterospermum truncatolobatum. Indian Journal of Natural Products and Resources, 13(1), 32-35, 2022 (Scopus). 6. Le Thi Khanh Linh, Pham Quoc Long, Pham Thi Hong Minh, Le Thi Phuong Hoa, Pham Minh Quan, Dang Ngoc Quang. Potential wMUS81 inhibitory activity of triterpenoids isolated from Helicteres hirsuta and Pterospermum truncatolobatum revealed by molecular docking simulation. Vietnam Journal of Chemistry, 2022 (Scopus) (submitted). 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Zhang X. C., Gilbert M. G. (2013), Flora of China 12, The USA, pp. 305-310 [2] Backer C. A., R. C. Bakhuizen vanden brink (1963), Flora of Java, vol. 1, Netherlands, pp. 401-418. [3] Pengklai C. (2001), Flora of Thailand, vol. 7, BangKok, pp. 539-574. [4] Feng K. M. (1984), Flora yunanica 2, pp. 160-165. [5] Vo V. C. (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam 2, NXB Y học, pp. 1010-1013. [6] Pham T. N. (2018), Nghiên cứu phân loại các chi thuộc họ Trôm (Sterculiaceae Vent.) ở Việt Nam, Luận văn thạc sĩ. [7] Ahmat N., Al Muqarrabun L.M.R. (2015), "Medicinal uses, phytochemistry and pharmacology of family Sterculiaceae: A review" European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 1, pp. 514-530. [8] Hadacek F., Greger H. (2000), "Test of antifungal natural products: methodolagies, comparability of result and assay choise" Phytochemical Analysis, vol. 11, no. 3, pp. 137-147. [9] Shukla Y.N., Bhakuni R.S., Thakur R.S. (1987), "Cyclopeptide alkaloids from Melochia corchorifolia" Phytochemistry, vol. 26, pp. 324-325. [10] Vieira E.R., Hoelzel S.C.S.M., Giacomelli S.R., Dalcol I.I., Zanatta N., Morel A.F. (2005), "An unusual quinolinone alkaloid from Waltheria douradinha" Phytochemistry, vol. 66, pp. 1163-1167. [11] Dias G.C., Gressler V., Hoenzel S.C., Silva U.F., Dalcol II., Morel AF. (2007), "Constituents of the roots of Melochia chamaedrys" Phytochemistry, vol. 68, pp. 668-672. [12] Gressler V., Stüker C.Z., Dias Gde O., Dalcol II., Burrow R.A., Schmidt J., Wessjohann L., Morel A.F. (2008), "Quinolone alkaloids from Waltheria douradinha" Phytochemistry, vol. 69, pp. 994-999. [13] Shukla Y.N., Kapadia G.J., Basak S.P. (1978), "Melovinone, an open chain analogue of melochinone from Melochia tomentosa" Phytochemistry, vol. 17, pp. 1444-1445. [14] Collin H.A., Jalal M.A.F. (1977), "Polyphenols of mature plant, seedling and 119 tissue cultures of Theobroma cacao" Phytochemistry, vol. 16, pp. 1377-1380. [15] Vardamides J.C., Azebaze A.G., Nkengfack A.E., Van Heerden F.R., Fomum Z.T., Ngando T.M., Conrad J., Vogler B., Kraus W. (2003), "Scaphopetalone and scaphopetalumate, a lignan and a triterpene ester from Scaphopetalum thonneri" Phytochemistry, vol. 62, pp. 647-650. [16] Teles Y.C., Horta C.C., Agra Mde F., Siheri W., Boyd M., Igoli J.O., Gray A.I., de Souza Mde F. (2015), "New Sulphated Flavonoids from Wissadula periplocifolia (L.) C. Presl (Malvaceae)" Molecules, vol. 20, no. 11, pp. 20161- 20172. [17] Tripathi S.K., Biswal B.K. (2018), "Pterospermum acerifolium (L.) wild bark extract induces anticarcinogenic effect in human cancer cells through mitochondrial-mediated ROS generation" Mol. Biol. Rep., vol. 45, no. 6, pp. 2283-2294. [18] Fernandes D.A., Souza M.S.R., Teles Y.C.F., Oliveira L.H.G., Lima J.B., Conceição A.S., Nunes F.C., Silva T.M.S., Souza M.F.V. (2018) "New Sulphated Flavonoids and Larvicidal Activity of Helicteres velutina K. Schum (Sterculiaceae)" Molecules, vol. 23, no. 11, pp. 2784. [19] Chen C.M., Chen Z.T., Hong Y.L. (1990), "Constituents of Formosan antitumor folk medicine. Part 3. A mansonone from Helicteres angustifolia" Phytochemistry, vol. 29, pp. 980-982. [20] Blois M.S. (1958), “Antioxidant determination by the use of a stable free radical”, Nature, 181, pp. 1199 - 1200. [21] Vo V. C. (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, pp. 1230-1232. [22] Dang V.S., Dang M.Q., Hoang N.S. (2020), "Helicteres binhthuanensis V.S.Dang (Malvaceae, Helicteroideae), a new species from southern Vietnam" PhytoKeys, vol. 166, pp. 87–95. [23] Wang M., Liu W. (1987), "A naphthoquinone from Helicteres angustifolia" Phytochemistry, vol. 26, pp. 578-579. [24] Chen Z.T., Lee S.W., Chen C.M. (1994), "New flavonoid glycosides of Helicteres angustifolia" Heterocycles, vol. 38, pp. 1399-1406. 120 [25] Chen W.L., Tang W.D. et al. (2006), "Pregnane, coumarin and lupan derivatives and cytotoxic constituent from Helicteres angustifolia" Phytochemistry, vol. 67, no. 10, pp. 1041-1047. [26] Chen W., Tang W., Lou L., Zhao W. (2006), "Pregnane, coumarin and lupane derivativesand cytotoxic constituents from Helicteres angustifolia" Phytochemistry, pp. 1041-1047. [27] Pan M.H., Chen C.M. (2008), "Cytotoxic triterpenoids from the roots bark of Helicteres angustifolia" Chemistry and Biodiversity, vol. 5, pp. 565-574. [28] Wang G.C., Li T., Wei Y.R., Zhang Y.B., Li Y.L., Sze S.C., Ye W.C. (2012), "Two pregnane derivatives and a quinolone alkaloid from Helicteres angustifolia" Fitoterapia, vol. 83, pp. 1643-1647. [29] Huang Q., Huang R., Wei L., Chen Y., Lv S., Liang C., Zhang X., Yin F., Li H., Zhuo L., Lin X. (2013), "Antiviral activity of methyl helicterate isolated from Helicteres angustifolia (Sterculiaceae) against hepatitis B virus" Antiviral Res, vol. 100, pp. 373-381. [30] Yin X., Lu Y., Cheng Z.H., Chen D.F., (2016), "Anti-Complementary components of Helicteres angustifolia" Molecules, vol. 21, no. 11, p. 1506. [31] Bean M.F., Antoun M. Abramson D., Chang C.J. (1985), "Cucurbitacin B and isocucurbitacin B: cytotoxic components of Helicteres isora" J. Nat. Prod, vol. 48, p. 500. [32] Ramesh P., Yavarajan C.R. (1995), "A new flavone methyl ether from Hecliteres isora" J. Nat. Prod., vol. 58, pp. 1242-1243. [33] Satake T., Kamiya K., Saiki Y. (1999), "Studies on Jamu and the medicinal resources in Indonesia. Part 2. Studies on the constituents of fruits of Helicteres isora L." Chem. Pharm. Bull., vol. 44, pp. 1444- 1447. [34] Tezuka Y., Terazono M., Kusumoto T.I. (1999), "Helisterculins A and B, two new (7.5’,8.2’)-neolignans, and helisorin, the first (6.4’, 7.5’,8.2’)-neolignan, from the Indonesian medicinal plant Helicteres isora" Helv.Chim. Acta, vol. 8, pp. 408-417. [35] Tezuka Y., Terazono M., Kusumoto T.I. (2000), "Helicterins A-F, six new dimeric (7.5’, 8.2’)-neolignans from the Indonesian medicinal plant Helicteres 121 isora" Helv.Chim. Acta, vol. 83, pp. 2908-2919. [36] Kamiya K., Saiki Y., Hama T.(2001), "Flavoinoid glucuronides from Helicteres isora" Phytochemistry, vol. 57, pp. 297-301. [37] Vennila S., Bupesh G., Saravanamurali K., SenthilKumar V., SenthilRaja R., Saran N., Magesh S. (2014), "Insilico docking study of compounds elucidated from Helicteres isora fruits with ampkinase- insulin receptor" Bioinformation, vol. 10, no. 5, pp. 263-266. [38] Truong B. N. (2012), Nghiên cứu thành phần hoá học của một số loài thực vật có hoạt tính chống lao của vườn quốc gia Cúc Phương, Luận án tiến sĩ hóa học. [39] Luu H. T., Nguyen H. C., Tran H. D., Trinh T. M. D., Pham T. C., Tran T.H. Hanh, Tran H. Q., Nguyen H.D., Nguyen X. C., Nguyen H. N., Chau V. M. (2021), "Sulphated flavones and pregnane-type steroids from Helicteres viscida" Natural Product Research, vol. 35, no. 20, pp. 3390-3395. [40] Li K., Yu Y., Sun S., Liu Y., Garg S., Kaul S.C., Lei Z., Gao R., Wadhwa R., Zhang Z. (2016), "Functional characterization of anticancer activity in the aqueous extract of Helicteres angustifolia L. roots" PloS ONE, vol. 11, no. 3, p. e0152017. [41] Varghese E, Sathia Narayanan S, Gopal RV, Nair A, Chittethu AB, Anson TA. (2011), "Anticancer activity of chloroform extract of Helicteres isora" Int.J. of Pharm.& Tech., vol. 3, no. 2, pp. 2560-2564 . [42] Basniwal P.K. et al. (2009), "In-vitro antioxidant activity of hot aqueous extract of Helicteres isora Linn. Fruits" Nat. Prod. Radiance, vol. 8, no. 5, p. 483 – 487. [43] Tran V. T., Vo T. M. H. (2017), “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết cây an xoa (Helicteres hirsuta Lour.)” Tuyển tập hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, pp. 1496-1501. [44] Le T. H. Yen; Nguyen T.N.; Nguyen T.Q.; Pham T. H. N.; Luu T.B. N. (2016), Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư của cây an xoa (Helicteres hirsuta Loureiro), Báo cáo đề tài NCKH cấp cơ sở, Trường Cao đẳng Y tế Hà Nội. 122 [45] Le T.H. Y., Nguyen T. T. H., Nguyen T.N., Ta V. B., Thai T. H. Oanh (2017), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau của cao lỏng chiết từ cây an xoa (Helicteres hirsuta Lour.) trên chuột nhắt thực nghiệm” Tạp chí Dược học, tâp̣ 496, pp. 56-59. [46] Chin Y.M., Jones W.P., Rachman (2006), "Cytotoxic lignans from the stems of Helicteres hirsuta collected in Indonesia" Phytotherapy Research, vol. 20, pp. 62-65. [47] Nguyen H. D., Le T. P. (2016), “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của cây an xoa (Helicteres hirsuta L.)” Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tâp̣ 47, pp. 93-97. [48] Nguyen T.T., Kretschmer N., Pferschy-Wenzig E.M., Kunert O., Bauer R. (2019) “Triterpenoidal and Phenolic Compounds Isolated from the Aerial Parts of Helicteres hirsuta and their Cytotoxicity on Several Cancer Cell Lines”, Natural Product Communications, vol.14, no.1, pp.7-10. [49] Hoang D. T., Truong T. T. H., Nguyen T.T. H., T. M. D., Do T. T., Nguyen P. K. N., Le C. V. C., Hoang L. T. A. (2020) “Phenolic and flavonoid compounds isolated from ethyl acetate fraction of Helicteres hirsuta Lour. collected in Thua Thien Hue”, Tạp chí Y-dược học quân sự, Tập 8, Trang 122-128. [50] Tran T. K. M. (2019) Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt Nam bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. Luận văn thạc sĩ hóa học [51] Le D. K., Hoang M. H. (2020) “Triterpenoids isolated from Helicteres hirsuta”, Journal of Technical Education Science, vol.56, pp.12-16 [52] Huynh L. N. T., Phan H. X., L. V. T. (2021) “Hoạt tính bảo vệ gan của các hợp chất phân lập từ cây an xoa (helicteres hirsuta) thu hái ở Gia Lai”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế, Tập 18, số 2, trang 65- 74. [53] Le N.T., Van H.T., Nguyen N.T.P, Le V.S., Chu V.H., Vu T.H.A., Nguyen Q.H., Nguyen H.D., Trinh N.N., Pham V.T (2021) “Chemical profiles and antibacterial, antioxidant, cytotoxicactivities of acetone extract from leaves of Helicteres hirsuta Lour.”, Journal of Science and Technology, Vol.52B, pp.62-69. 123 [54] Dixit P., Khan M.P., Swarnkar G., Chattopadhyay N., and Maurya R. (2011), "Osteogenic constituents from Pterospermum acerifolium Willd. flowers" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 21, no. 15, p. 4617–4621. [55] Nahar N., Khan M. S. H., Mosihuzzaman M., Rashid M. A. (2015), "Neolignan and megastigmane glycosides from the leaves of Pterospermum semisagittatum" Original articles, vol. 60, p. 72–74. [56] Li H., Huang G., Liu B., Liu Y., Zhan R., Chen (2014), "A new naphthol from the twigs and leaves of Pterospermum yunnanense" Nat. Prod. Res, vol. 28, no. 19, pp. 1539-1543. [57] Li S., Shi Y., Shang X.Y., Cui B.S., Yuan Y., Chen X.G., Yang Y.C., Shi J.G., (2009), "Triterpenoids from the roots of Pterospermum heterophyllum Hanc" Journal of Asian Natural Products Research, vol. 11, no. 7, pp. 652-657. [58] Yang L., Liu R., Fan A., Zhao J., Zhang Y., He J. (2020), "Chemical Composition of Pterospermum heterophyllum Root and its Anti-Arthritis Effect on Adjuvant-Induced Arthritis in Rats via Modulation of Inflammatory Responses" Front. Pharmacol, vol 11, pp.1-13 [59] Chopra R. N., Nayar S. L., Chopra I. C. (1956), Glossary of Indian Medicinal Plants, New Delhi, India: Council of Scientific & Industrial Research [60] Dixit P., Chand K., Khan M.P., Siddiqui J.A., Tewari D., Ngueguim F.T., Chattopadhyay N., Maurya R. (2012), "Phytoceramides and acylated phytosterol glucosides from Pterospermum acerifolium Willd. seed coat and their osteogenic activity" Phytochemistry, vol. 81, pp. 117-125. [61] Li H., Huang G., Liu B., Liu Y., Zhan R., Chen Y. (2014) "A new naphthol from the twigs and leaves of Pterospermum yunnanense" Natural Product Research: Formerly, pp. 1539-1543. [62] Basnet B. K., Siwakoti M. (2018), "Pterospermum truncatolobatum Gagnepain (Sterculaceae): A new addition to the flora of Nepal" Banko Janakari, vol. 28, no. 1, pp. 48-49. [63] Paul T. K. (2013), "Pterospermum truncatolobatum Gagnepain [Sterculiaceae] – an addition to the floral of Myanmar" Pleione, vol. 7, no. 2, pp. 571-573. 124 [64] Lopez-Vallejo F. et al. (2011), "Integrating virtual screening and combinatorial chemistry for accelerated drug discovery", Comb Chem High Throughput Screen. Vol.14, no.6, pp. 475-87. [65] Kitchen D. B. et al. (2004), "Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications", Nat Rev Drug Discov, vol.3, no.11, pp. 935-49 [66] Kikuchi K. et al. (2013) “Structure-specific endonucleases Xpf and Mus81 play overlapping but essential roles in DNA repair by homologous recombination” Cancer Res. Vol.73, pp.4362–4371 [67] Fadden A.J., Schalbetter S., Bowles M., Harris R., Lally J., Carr A.M., McDonald N.Q. (2013) “A winged helix domain in human MUS81 binds DNA and modulates the endonuclease activity of MUS81 complexes”, Nucleic Acids Res., vol.41, pp.9741–9752. [68] Lu R. et al. (2019) “MUS81 participates in the progression of serous ovarian cancer associated with dysfunctional DNA repair system’’, Front. Oncol. 9, e01189. [69] Zhong A., Zhang H., Xie S., Deng M., Zheng H., Wang Y., Chen M., Lu R, Guo L. (2018) “Inhibition of MUS81 improves the chemical sensitivity of olaparib by regulating MCM2 in epithelial ovarian cancer”, Oncol. Rep. Vol.39, pp.1747–1756 [70] Xie S., Zheng H., Wen X., Sun J., Wang Y., Gao X., Guo L., Lu R. (2016) “MUS81 is associated with cell proliferation and cisplatin sensitivity in serous ovarian cancer”, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.476, pp.493–500 [71] Waterhouse A.L. (2002), “Determination of total phenolics, In current Protocols”,Food Analytical Chemistry, I1.1.1 - I1.1.8. [72] Sapkota K., Park S.E., Kim J.E., Kim S., Choi H.S., Chun H.S., Kim S.J. (2010), “Antioxidant and antimelanogenic properties of chestnut flower extract”, Biosci Biotechnol Biochem, vol.74, pp. 1527-1533. [73] Schrodinger L.L.C. The PyMOL molecular graphics system. Version 2.2.2. 2015 125 [74] Frisch, M.J., Trucks, G.W., Schlegel, H.B., Scuseria, G.E., Robb, M.A., Cheeseman, J.R., et al. (2009) Gaussian 09 Rev. d.01. Wallingford, CT [75] Fadden, A.J., et al. (2013) “A winged helix domain in human MUS81 binds DNA and modulates the endonuclease activity of MUS81 complexes” Nucleic Acids Research, vol.41, No.21, pp. 9741-9752. [76] Morris, G.M., et al. (2009) “AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility”, Journal of Computational Chemistry, vol.30, no16, pp. 2785-2791 [77] Pham H.N.T., Vuong Q.V., Bowyer M. C., Scarlett C. J. (2017), "Optimization of ultrasound-assisted extraction of Helicteres hirsuta Lour. for enhanced total phenolic compound and antioxidant yield" Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, vol. 7, pp. 113-123. [78] Jain A., Sinha P., Desai N.S. (2014), "Estimation of flavonoid, phenol content and antioxidant potential of Indian screw tree (Helicteres isora L.)" International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, vol. 5, no. 4, pp. 1320-1330. [79] Pham H.N.T., Nguyen V.T., Vuong Q.V., Bowyer M.C., Scarlett C.J. (2017), "Phytochemical profiles and antioxidant capacity of the crude extracts, aqueous and saponin-enriched butanol fractions of Helicteres hirsuta Lour. leaves and stems" Chemical Papers-Slovak Academy of Sciences, vol. 71, no. 11, pp. 1-10. [80] Choi J.Y., Choi E.H., Jung H.W., Oh J.S., Lee W.H., Lee J.G., Son J.K., Kim Y., Lee S.H. (2008), "Melanogenesis inhibitory compounds from Saussureae radix" Arch. Pharm. Res., vol. 31, no. 3, pp. 294-299. [81] Pierre L.L., Moses M.N. (2015), "Isolation and Characterisation of Stigmasterol and β-Sitosterol from Odontonema strictum (Acanthaceae)" Journal of Innovations in Pharmaceuticals and Biological Sciences, vol. 2, no. 1, pp. 88- 95. [82] Maria de L., e Silva, Juceni P. David et al. (2012), "Bioactive oleanane, lupane and ursane triterpene acid derivatives" Molecule, vol. 17, pp. 12197-12205. [83] Aminah N.S., Yulvia A., Tanjung M. (2017), "Methyl 3,4-dihydroxybenzoate 126 and 9,10-dihydrophenanthrene-2,4,7-triol two phenolic compounds from Dioscorea alata L. and their antioxidant activity" AIP Conference Proceeding 1888, no. 020050. [84] Cho J.Y., Kim C.M., et al. (2013), "Caffeoyl triterpenes from pear (Pyrus pyrifolia Nakai) fruit peals and their antioxidant activities against oxidation of rat blood plasma" J. Agrical. Food. Chem., vol. 61, no. 19, pp. 4563-4569. [85] Gealt M.A. (1982), "Isolation of β-amyrin from the fungus Aspergillus nidulans" Microbiology, vol. 129, p. 543 – 546. [86] Liao C.R., Kuo Y.H. (2014), "Studies on cytotoxic constituents from the leaves of Elaeagans oldhamii Maxim in non-small cell lung cancer A549 cells" Molecule, vol. 19, pp. 9515 -9534. [87] Bisoli E., Garcez W.S., Hamerski L., Tieppo C., Garcez F.R. (2008), "Bioactive pentacyclic triterpenes from the stems of Combretum laxum." Molecules, vol. 13, pp. 2717-2728. [88] Sharaf M., El-Ansari M. A., Saleh N. A. M. (1998), "A new flavonoid from the roots of Glossostemon bruguieri" Fitoterapia, vol. 69, no. 1, p. 47–48. [89] Roosevelt A. G., Rafael R. A. R. et al. (2011), "Phenolic compounds from Sidastrum micranthum (A. St.-Hil.) fryxell and evaluation of acacetin and 7,4'- Di-O-methylisoscutellarein as motulator of bacterial drug resistence" Quím. Nova, vol. 34, no. 8, pp. 1801-1807. [90] Teles Y.S..F., Chaves O.S. (2015), "Chemical constituents from Sidastrum paniculatum and evaluation of the leishmanicidal activity" Revista Brasileira de farmacognosia, vol. 25, pp. 363-368. [91] Li K., Lei Z. (2015), "In vitro and in vivo bioactivities of aqueous and ethanol extracts from Helicteres angustifolia L. root" Journal of Ethnopharmacology, vol. 172, pp. 61-69. [92] Hoang T. H., Pham T. T. C. (2006), “Một số thành phần hóa sinh và hoạt tính sinh học của dịch ép từ thịt quả mƣớp đắng (Momordica charantia L.)” Tạp chí Sinh học, 28, tr. 75. [93] Nguyen V. M. (2007), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà 127 Nội, tr 108-109. [94] Conforti F., Statti G., Loizzo M. R., Sacchetti G., Poli F., Menichini F. (2005), "In Vitro Antioxidant Effect and Inhibition of a -Amylase of Two Varieties of Amaranthus caudatus Seeds" Biology and Pharmaceutical Bullentin, vol. 28, pp. 1098-1102. [95] Chaturvedula V.S.P., Prakash I. (2012), "Isolation of Stigmasterol and β- Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus" International Current Pharmaceutical Journal, vol. 1, no. 9, DOI:10.3329/icpj.v1i9.11613. [96] Satiraphan M., Pamonsinlapatham P., Sotanaphun U., Sittisombut C., Raynaud F., Garbay C., Michel S. (2012), "Lupane trierpenes from the leaves of the tropical rain forest tree Hopea odorata Roxb. and their cytotoxic activities" Biochemical systematics and ecology, vol. 44, pp. 407-412. [97] Chakravarty A. K., Masuda K., Suzuki H., Ageta H. (1994), "Unambiguous assignment of 13C chemical shifts of some hopane and migrated hopane derivatives by 2D NMR" Tetrahedron, vol. 50, pp. 2865-2876. [98] Oladimeji A.O., Oladosu I.A., Jabeen A., Faheem A., Mesaik M.A., Ali M.S. (2017), "Immunomodulatory activities of isolated compounds from the root- bark of Cussonia arborea" Pharmaceutical biology, vol. 55, no. 1, pp. 2240- 2247. [99] Hernández-Chávez I., Torres-Tapia L. W., Simá-Polanco P., Cedillo-Rivera R., Moo-Puc R., and Peraza-Sánchez S. R. (2012), "Antigiardial activity of Cupania dentata bark and its constituents" Journal of the Mexican Chemical Society, vol. 56, no. 2, pp. 105-108. [100] Tareq F. S., Sohrab Md H., Chowhdury AM., S., U., Afroz F., Al-Mansur M., Hasan C.M. (2009), "Phytochemical studies on the Leaves of Xylia dolabriformis," Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 8, no. 2, pp. 171-172.