Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nguyệt quế (murraya paniculata (l.) jack) và loài tràm bông đỏ (callistemon citrinus (curtis) skeels) ở Việt Nam

Việc thử nghiệm hoạt tính kháng viêm [103], nghiên cứu sự ức chế sự sinh NO của đại thực bào RAW264.7 đã bị kích thích gây viêm bằng nội độc tố LPS, được thực hiện tại Khoa Dược, trường đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc. 2.2.4.1. Hóa chất Dòng tế bào đại thực bào RAW264.7, mua của hãng ATCC, Hoa kỳ. MTT assay ((3-(4,5-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), Sulfuretin (98.0%) được mua của hãng Sigma-Aldrich, Hoa kỳ. Các hóa chất khác được mua của hãng Invitrogen, Hoa kỳ. 2.2.4.2. Phương pháp xác định nồng độ NO: Đại thực bào RAW264.7 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung FBS 10%, 100 g/L streptomycin, và 100 IU/mL penicillin được ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2. Thay môi trường nuôi cấy cứ mỗi 48 h / lần. Các chất nghiên cứu được pha trong DMEM (không chứa FBS) ở các nồng độ khác nhau (10; 20 và 40 g/mL) được đưa vào mỗi giếng sao cho tổng thể tích đạt được 500 L / giếng. Sau 1h, tế bào được kích thích bằng 1 g/mL LPS trong 24 h. Nồng độ NO sinh ra trong dịch nuôi cấy đại thực bào sau khi cho tiếp xúc với yếu tố gây viêm LPS sẽ được xác định gián tiếp qua nồng độ NO2 bằng phản ứng Griess. Cụ thể, 100 mL dung dịch nuôi cấy tế bào (không chứa phenol red) được trộn với một thể tích tương đương tác nhân Griess (sulfanilamide 1% (w/v) trong phosphoricacid 5% (v/v) và naphthylethylenediamine-HCl 0.1% (w/v)), ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo trên máy ELISA ở 540/550 nm. Sulfuretin sử dụng làm chất chuẩn dương. Dịch nuôi cấy được dùng làm chuẩn âm

pdf66 trang | Chia sẻ: tueminh09 | Ngày: 25/01/2022 | Lượt xem: 602 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nguyệt quế (murraya paniculata (l.) jack) và loài tràm bông đỏ (callistemon citrinus (curtis) skeels) ở Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
có 3 gân, lúc non có lông và màu đỏ nhạt, màu tươi, khi già màu đậm, vò nhẹ toát mùi thơm đặc trưng của tinh dầu tràm. Phân cành nhiều, dài rủ xuống như liễu. Hoa nhiều, tập trung ở đầu cành màu đỏ tươi, đầu cành hoa có lá mọc tiếp tục. Cụm hoa bông dài, xếp sát nhau dày đặc với chỉ nhị màu đỏ nổi trên cánh hoa. Cụm hoa bông với phần đỉnh tiếp tục có lá như tràm; đài cao 3mm; nhị nhiều có chỉ nhị dài 12-25mm, màu đỏ. Quả nang hình chuông. Ra hoa quả quanh năm. 22 A. B. Hình 1.2.:A. Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật và B. Ảnh chụp cây Tràm Bông đỏ (Callistemon citrinus (Curtis) Skeels) (nguồn ảnh: Wikipedia) Đặc điểm sinh lý, sinh thái: Tốc độ sinh trưởng và phát triển trung bình. Cây ưa sáng, đất ẩm ướt nhưng thoát nước tốt. Công dụng: Gỗ nhỏ, cây được trồng rộng rãi để làm cảnh vì cho hoa đẹp, trong lâm nghiệp để trồng rừng lấy gỗ. Tính vị, tác dụng: Có tác dụng khư đàm, tiêu viêm [83]. Tinh dầu cây được dùng để làm thuốc kháng khuẩn và kháng nấm, chống giun, chống ấu trùng sâu bọ. 1.3.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Callistemon trên thế giới Nghiên cứu tài liệu cho thấy, thành phần hóa học của các loài thực vật chi Callistemon chứa tinh dầu (trong lá), các flavonoids, triterpenoids, phloroglucinols (polyphenol). Trong đó các loài đã được nghiên cứu thành phần hóa học và thành phần hóa học là C. citrinus (tên cũ C. lanceolatus), C. linearis, C. macropunctatus, C. phoeniceus, C. rigidus, C. salignus, C. viminallis, vv.[84] 1.3.2.1. Tinh dầu Một vài flavonoids, triterpenoids, tannins, hợp chất phenol đã được chiết tách từ lá cây. Trong lá còn chứa tinh dầu chủ yếu là các monoterpen và sesquiterpen. Tinh dầu lá cây chứa α-pinene (140), β-pinene (141), α-thujene (142), myrecene (143), α- phellandrene (144), limonene (145),1,8-cineol (eucalypton) (146), β-ocimene (147),- terpinene (148), terpinolene (149), linalool (150), terpinene 4-ol (151) , α-terpineol (152), spathulenol (153). 23 α-pinene (140) β-pinene (141) α-thujene (142) myrecene (143) α-phellandrene (144) limonene (145) 1,8-cineol (146) β-ocimene (147)  -terpinene (148) terpinolene (149) linalool (150) terpinene 4-ol (151) α-terpineol (152) spathulenol (153) 1.3.2.2. Các hợp chất flavonoid Các flavonoids như pelargonidin-3,5-diglucoside (155), cyanidin-3,5-diglucoside (156), kaempferol (157); kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside (157a); 3,4,7- trihydroxy flavonol (158). (155) R1=H, R2=R3=OGlc (156) R1=OH, R2=R3=OGlc (157) R1=H, R2=R3=OH (157a) R1=H, R3=OH, R2= O-Galactopyranose (158) R1=OH, R2=R3=H 1.2.2.3. Các hợp chất triterpenoid Các hợp chất triterpenoid đã được chiết tách từ hoa điển hình là betulic acid (165), betulinic acid 3-O-caffeate (165a), α-amyrin (166), oleanolic acid (159), vv. (bảng 1.9) Bảng 1.9: Các triterpenoids chiết tách từ các loài thực vật chi Callistemon R1 R2 R3 R4 R5 R6 159 Oleanolic acid H OH COOH Me Me H 160 Methyl oleanolate H OH COOMe Me Me H 24 161 Ursolic acid H OH COOH H Me Me 161a 2-hydroxyursolic acid OH OH COOH H Me Me 162 Methyl ursolate H OH COOMe H Me Me 162a 2-hydroxyursolate OH OH COOMe H Me Me 163 Uvaol H OH CH2OH H Me Me 163a 2-hydroxyuvaol OH OH CH2OH H Me Me A = R1=A betulinic acid 3-O-caffeate (165a) -lupeol (164) R1=H betulic acid (165) α-amyrin (166) 1.2.2.4. Các hợp chất polyphenol Hoa và lá loài Callistemon giàu các polyphenols như acid gallic (168), gallic acid 4-o-methyl ester (168a), kaempferol (157), quercetin, acid ellagic (169), pyragallol (170), catechol (171), vv. [85] acid gallic (168) gallic acid 4-o- methyl ester (168a) ellagic acid (169) pyragallol (170) catechol (171) Chi Callistemon đặc biệt là C. citrinus (C. lanceolatus) rất giàu các hợp chất phlorglucinol như myrtucommulone A (172), B (172b), callistenone A-D (173, a-d), leptospermone (174);và các lignan nhưcallislignan A- B (175a-b). myrtucommulone A (172) myrtucommulone B (172b) callistenone A (173 a) callistenone B (173 b) callistenone C (173 callistenone C (173 c) callistenone D leptospermone 25 c) (173 d) (174) callislignan A (175a) callislignan B (175b) viminadioneA (176a) viminadioneB (176b) 1.3.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Callistemon trên thế giới Callistemon có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng nhuyễn thể, tác dụng ức chế elastase, chống tiểu đường và hạ mỡ máu, kháng viêm và các tác dụng khác (bảng 1.10). Bảng 1.10: Hoạt tính sinh học của các dịch chiết cây thuộc chi Callistemon STT Hoạt tính Dịch chiết cây TPHH chính TLTK 1 Tác dụng kháng khuẩn ức chế tụ cầu Staphylococcus aureus (194.8%) C. citrinus C. linearis C. macropunctatus C. phoeniceus C. salignus Tinh dầu lá cây acylphloroglucinol Dịch chiết nước hoa [86] 2 Tác dụng kháng nấm Phaeoramularia angolensis A. oryzae, Fusarium oxysporum, Fusarium sp. và Mucor sp. C. citrinus tinh dầu chứa 1,8-cineol (146) (100% ức chế sinh trưởng ở nồng độ 0.681 mg/ml). 3 Kháng nhuyễn thể, kháng giun sán, chống sán xơ mít (sán dây) và giun móc C.citrinus C. viminalis Tinh dầu (1,8-cineol (146) và -terpineol (152)) [86] 4 Tác dụng ức chế elastase C.citrinus Dịch chiết 5 Tác dụng kháng viêm chống viêm, chống phù nề niêm mạc bụng chuột bị tiêm carragennan C. citrinus triterpenoids [87] Các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Callistemon được thử nghiệm các tác dụng sinh học như kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, chống tiểu đường. a. Tác dụng kháng vi sinh vật Từ lâu, các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên đã được biết có tác dụng kháng VSV phong phú. Tuy nhiên, do các VSV ngày càng có khả năng biến đổi, kháng lại các kháng sinh nên việc tìm kiếm các loại thuốc kháng sinh mới luôn đóng vai trò quan trọng. Với định hướng này, các nhà khoa học đã thử nghiệm và phát hiện các hợp chất acylphloroglucinols callistenone A-C (173a-c) chiết tách từ loài C. lanceolatus có tác dụng kháng tụ cầu vàng S. aureus (SA) với giá trị ức chế tối thiểu 26 MIC 0,5; 8 và 8g/ml, chống tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) với MIC là 1; 8 và 8 mg/ml [88]. Myrtucommulone A (172) có khả năng kháng lại nhiều dòng tụ cầu vàng SA [89]. Các neolignan callislignan A-B (175a-b) chiết tách từ C. lanceolatus cũng có tác dụng kháng tụ cầu vàng SA và MRSA, trong đó 175b có tác dụng kháng khuẩn cao hơn với giá trị MIC 8 g/mL chống lại cả hai chủng tụ cầu trên [85]. Tinh dầu lá cây C.comboynensis còn có tác dụng kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus subtilis và cả vi khuẩn Gram (-) (Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa); kháng cả nấm bệnh Candida albicans [86]. b. Tác dụng kháng ký sinh trùng và côn trùng Thành phần tinh dầu lá cây chi Callistemon đã được công bố trong nhiều công trình nghiên cứu. 1,8-cineol (146) và -terpineol (152) là thành phần chính tinh dầu lá và hoa của loài C. citrinus và có tác dụng chống giun sán và kháng khuẩn. Tinh dầu lá cây còn thể hiện tác dụng kháng virus, kháng nấm men, nấm mốc, và nấm ký sinh trên da [90]. Tinh dầu lá cây C. viminalis có tác dụng chống cả sán xơ mít và giun kim [91]. Cũng từ loài C. viminalis, hai acylphloroglucinol là viminadione A (176a) và viminadione B (176b), có tác dụng chống lại các loài côn trùng như ruồi, rận, bọ trĩ (dĩn) khá thấp so với dung dịch chuẩn pyrethrum chiết từ hoa cúc [92]. c. Tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzyme elastase Tinh dầu lá cây C. viminalis nói riêng, chi Callistemon nói chung đều có tác dụng chống oxy hóa [93]. Theo nghiên cứu của tác giả Kim & cs., các hợp chất triterpenoid betulinic acid 3-O-caffeate (165a) và flavonoid catechin có tác dụng oxy hóa mạnh nhất. Hợp chất 165a còn có tác dụng ức chế enzyme elastase gây lão hóa da với giá trị IC50 1.5 g/mL, còn mạnh hơn cả chất chuẩn là acid oleanolic acid (159) với giá trị IC50 là 3.0 g/mL [94]. d. Tác dụng kháng viêm Các triterpenoids như 161, 165 và các glucoside của chúng, được chiết tách từ thân, cành và lá cây C. lanceolatus có tác dụng kháng viêm trên cơ sở ức chế sự sản sinh NO trong dòng đại thực bào RAW264.7 bị kích thích bởi LPS. Hợp chất betulinic acid 3-O-caffeate (165a) có tác dụng kháng viêm tốt nhất với giá trị IC50 là 15.4μM [95]. e. Tác dụng chống tiểu đường 27 Các hợp chất tinh dầu và flavones có tác dụng chống tiểu đường [96]. Flavonoid ở mức liều 36 mg/kg thể trọng, điều trị trong 15 ngày có tác dụng tái tạo lại mô tụy và tăng lượng insulin giải phóng ra và làm giảm đường huyết trên chuột bị gây bệnh tiểu đường bằng streptozotocin [96]. 1.4. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG LUẬN ÁN Trong luận án đã sử dụng các phương pháp thử nghiệm sinh học bao gồm: (1) Phương pháp thử tác dụng độc tế bào, (2) phương pháp thử nghiệm tác dụng giãn mạch, (3) phương pháp ức chế enzyme sEH và (4) phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm qua yếu tố NO. Giới thiệu tổng quan về các phương pháp thử nghiệm được trình bày như sau. 1.3.1. Phương pháp thử độc tế bào Để có thể phát triển một dược chất từ cây cỏ có tác dụng kháng ung thư thì trước tiên người ta phải đánh giá tác dụng độc tính với các dòng tế bào ung thư in vitro, ví dụ như các dòng tế bào ung thư HepG2, MCF-7, vv. Để sàng lọc lượng lớn mẫu có tác dụng độc tế bào thì thông thường người ta phải xác định tỷ lệ phần trăm tế bào ung thư bị chết (% Survival Rate) ở một nồng độ xác định của mẫu thử (thông thường ở nồng độ 100 mg/ml với mẫu dịch chiết thô và 20 mg/ml với chất tinh sạch). Các mẫu có tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót thấp sẽ được tiếp tục đánh giá ở nhiều nồng độ khác nhau để xác định giá trị IC50 (mg/ml). Thông thường, với dịch chiết mẫu có IC50< 20 g/mL và chất tinh sạch có IC50< 4 g/ml được coi là có hoạt tính. Hiện nay, có nhiều phương pháp thử nghiệm độc tế bào với các ưu, nhược điểm khác nhau. Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp cytotoxic assay thử nghiệm tác dụng độc tế bào và tác dụng sống sót của tế bào bằng tác nhân muối tetrazolium MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). 1.3.2. Phương pháp thử nghiệm tác dụng giãn mạch Để phát hiện các dược chất được sử dụng trong y học làm thuốc hạ huyết áp thì trước tiên các chất phải được thử nghiệm tác dụng giãn mạch. Cơ chế của quá trình giảm huyết áp bởi tác dụng giãn mạch có thể giải thích theo định luật sức cản dòng chảy Poiseulle. Theo đó,tốc độ dòng chảy (QB) sẽ tỷ lệ nghịch với sức cản dòng chảy 28 (R) nhưng lại tỷ lệ thuận với sự chênh lệch áp suất giữa hai đầu điểm của ống mạch QB= ୼௉ோ ; còn sức cản dòng chảy (R) tỷ lệ thuận với độ nhớt dòng chảy () và độ dài đoạn ống mạch (L) và tỷ lệ nghịch với bán kính ống (r) theo biểu thức ܴ = ଼ఎ௅ ௥ర . Do vậy, sự thay đổi đường kính ống mạch sẽ làm giảm sức cản dòng chảy, làm tăng tốc độ dòng chảy, làm hạ huyết áp. Thử nghiệm tác dụng giãn mạch được thử nghiệm trên động mạch được tách tươi từ chuột (có thể là động mạch chủ, động mạch cảnh, mạch bụng, mạch đùi), sau đó gây co động mạch bằng các tác nhân gây co như dung dịch muối K+ nồng độ cao hoặc phenylephrine và cho tiếp xúc với chất thử nghiệm để xác định tác dụng gây giãn mạch. Động mạch là mạch máu chính vận chuyển máu từ tim đi toàn cơ thể, được cấu tạo gồm 3 lớp tunica intima – tunica media và tunica adventitia (Hình 1.3). Tunica intima là lớp trong cùng cấu tạo thành mạch, chứa một đơn lớp nội bào, tiếp xúc trực tiếp với dòng máu chảy qua. Lớp tunica media là lớp giữa chứa chủ yếu tế bào cơ trơn, có vai trò quan trọng, gây ra sự co-giãn mạch máu. Lớp ngoài cùng tunica adventitia chứa phần lớn là các tế bào liên kết dạng sợi có tính đàn hồi (Hình 1.3). Hình 1.3: Cấu trúc thành động mạch (nguồn ảnh: Wikipedia)) Lớp nội bào ngoài vai trò giữ dòng chảy trong mạch, làm rào chắn giữa máu và lớp mô cơ của mạch máu và điều tiết dòng mạch. Lớp nội bào này sản xuất ra chất nonprostanoid gây giãn mạch (yếu tố giãn mạch xuất phát từ nội bào - epithelium- derived relaxing factor - EpDRF) và gây ảnh hưởng (kích thích hoặc ức chế) tác dụng của các chất giãn mạch thử nghiệm. Do vậy trong quá trình thực nghiệm, để đánh giá 29 tác dụng giãn mạch thực sự của các hoạt chất nghiên cứu thì cần phải loại bỏ lớp nội bào khỏi vòng động mạch nghiên cứu. Các thí nghiệm đã cho thấy, tác dụng giãn cơ của các hóa chất khảo sát tăng lên nhiều khi loại bỏ lớp nội bào. Các thông số quan trọng cần xác định là chỉ số Emax và IC50. Emax là chỉ số đầu tiên cần xác định để biết hợp chất nghiên cứu có tác dụng giãn mạch hay không. Emax là phần trăm cơ còn co gây ra bởi chất thử so với co cơ ban đầu gây ra bởi K60 (100%). Emax được tính theo công thức: Emax = 100% - % X gây giãn. Các chất có chỉ số Emax > 50% được tiếp tục xác định chỉ số IC50. IC50 là giá trị nồng độ chất nghiên cứu mà tại đó đáp ứng giãn mạch đạt được 50%. Chất có giá trị IC50 càng nhỏ là chất có tác dụng giãn mạch càng lớn. 1.3.3. Phương pháp ức chế enzyme epoxide hydrolase hòa tan (sEH) Bệnh tim mạch là căn bệnh nguy hiểm, gây tử vong hàng đầu cho nhân loại. Các nghiên cứu cho thấy, các acid epoxyeicosatrienoic (EETs) có nhiều tác dụng sinh học quan trọng bao gồm giãn mạch và kháng viêm [97]. Trong cơ thể động vật có vú, các EETs no, mạch dài, được tạo thành từ acid arachidonic, bị thủy phân thành dạng diol tương ứng dihydroxyeicosatrienoic acids (DHETs) bởi các enzyme epoxide hydrolase hòa tan (sEH) [98], là các enzyme thuộc họ epoxide hydrolase, tìm thấy trong bào tương và peroxisomes của các tế bào gan, cơ tim, vv. (hình 1.4). Hình 1.4.: Lộ trình chuyển hóa từ acid arachidonic thành các eicosanoids EETs có khả năng điều trị bệnh tim mạch và bệnh viêm và tác dụng thủy phân của enzyme sEH trên phân tử PHOME phát huỳnh quang. DHETs, dihydroxyeicosatrienoic acids. Do đó, sự ức chế hoạt động của các enzym sEH có thể ngăn chặn sự chuyển hóa các EET về dạng DHET tương ứng, làm tăng nồng độ EET trong mô. Các tác dụng sinh học của EET như giãn mạch, kháng viêm sẽ tăng lên và gây hạ huyết áp và đẩy lùi bệnh viêm trong cơ thể. [99]. Trong thập kỷ vừa qua, rất nhiều chất ức chế sEH đã 30 được nghiên cứu phát hiện, đặc biệt là các chất có trọng lượng phân tử nhỏ. Các chất ức chế sEH có nguồn gốc thiên nhiên, có khối lượng phân tử thấp được đặc biệt quan tâm phát triển thành thuốc nghiên cứu do đặc tính thân thiện, an toàn và giảm tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài [100]. Trong luận án này, hoạt độ enzyme sEH được xác định bằng phương pháp huỳnh quang [100], có ưu điểm rất nhạy và hữu hiệu để đo sàng lọc chỉ số IC50 của chất thử. Phương pháp này dựa trên việc đo cường độ huỳnh quang của cơ chất (3- phenyl-oxiranyl)-acetic acid cyano-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-methyl ester (PHOME), khi bị thủy phân bởi sEH sẽ tạo thành hợp chất 6-methoxy-2- naphthaldehyde phát huỳnh quang rất mạnh, có thể đo được ở bước sóng kích thích 330 nm và phát xạ ở bước sóng 465 nm (hình 1.4). Enzyme sEH sử dụng trong phương pháp là enzyme tinh chế, đã loại bỏ hoàn toàn các enzyme cạnh tranh (esterase và glutathione S-transferase). Phương pháp có độ chính xác SD<20% cho IC50 trong khoảng 1-100,000 nM. Ở phương pháp này, hoạt độ sEH bị ảnh hưởng rất nhiều bởi sự có mặt của chất tẩy rửa là các chất có khả năng vây cơ chất thành dạng hạt micel. Khi đó, enzyme sEH không tiếp xúc được với cơ chất sẽ gây ra kết quả thí nghiệm bị sai lệch, tính toán hoạt lực enzyme giảm. Do vậy, cần hòa tan enzyme sao cho nồng độ chất tẩy rửa <0.01% hoặc nồng độ tạo hạt micel dưới ngưỡng cho phép [101]. 1.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm qua yếu tố NO Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay đã có nhiều các phương pháp thử nghiệm ở mức độ sinh học phân tử nhằm phát hiện và phát triển các hoạt chất điều trị nhiều loại bệnh trong đó có bệnh viêm và tim mạch nói riêng. Viêm là một đáp ứng tự nhiên của hệ miễn dịch, bảo vệ cơ thể trước sự tấn công của các tác nhân bên ngoài như vi khuẩn, vi sinh vật, tác nhân hóa, lý hoặc của tác nhân bên trong như các phản ứng miễn dịch, sự hoại tử do thiếu máu cục bộ, các bệnh tự miễn. Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu đến nơi tổn thương. Tuy nhiên quá trình viêm và hồi phục có thể gây hại cho cơ thể do các hóa chất kích hoạt viêm (cytokine) có thể tác động lâu dài gây nên phản ứng quá mẫn, phản ứng viêm cấp tính và tình trạng viêm mạn tính. Nghiên cứu cho thấy mối liên hệ giữa viêm mãn tính với sự bệnh sinh 31 nhiều bệnh tật tim mạch, ung thư, tiểu đường, thoái hóa thần kinh vv. Do vậy vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học hiện nay là phát hiện được các thuốc, dược phẩm có khả năng chống viêm đặc biệt là viêm mãn tính, giúp việc kiểm soát phát sinh các bệnh tật liên quan như ung thư, tim mạch, làm giảm gánh nặng cho cộng đồng. Trong quá trình viêm, các tế bào viêm bị hoạt hóa (neutrophils, đại thực bào, vv) sẽ sản sinh ra nhiều nitric oxide (NO), các cytokines viêm như interleukin (IL-1, IL- 6), vv để tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn thương, gây bất hoạt các độc tố và khôi phục lại các mô bị tổn thương. Trong các nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có tác dụng kháng viêm thườngđược tiến hành trên cơ sở ức chế sự sản sinh NO và ức chế các enzyme gây viêm là iNOS và COX-2 trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 bị gây viêm bằng nội độc tố LPS. Hoạt tính kháng viêm của chất nghiên cứu được xác định thông qua khả năng làm giảm lượng NO sinh ra (giá trị IC50 mg/mL) và nồng độ enzyme iNOS và COX-2 giảm so với đối chứng. Lượng NO sinh ra được định lượng theo phản ứng Griess. Các enzyme iNOS, COX-2 được xác định nhờ phương pháp Western blotting. Các chất nghiên cứu có thể là dịch chiết như dịch chiết hoặc các hợp chất tinh khiết. 32 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Cây Nguyệt quế (Murraya paniculata (L.) Jack) được thu hái vào tháng 3/2011 ở Chí linh, Hải dương. Cây Tràm bông đỏ (Callistemon citrinus (Curtis) Skeels) được thu hái vào tháng 7/2011 tại Huế. Tên khoa học của hai loài cây trên được xác định bởi TS. Trần Thế Bách, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật HN thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-425 và HCTN-2118. Hình 2.1: Hình tiêu bản và phiếu xác định tiêu bản 33 Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng.Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, CHCl3 hoặc điclometan, etyl axetat, BuOH và MeOH. Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng. Mô hình nghiên cứu: Phân lập chất theo sự dẫn đường của các phép thử sinh học như hoạt tính độc tế bào, tác dụng tim mạch (giãn mạch, ức chế sEH) và kháng viêm. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Các phương pháp sắc ký được sử dụng để nhận biết và phân lập các hợp chất từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch. 2.1.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, và sử dụng các phương pháp phổ 2.1.3.1. Xác định điểm chảy và góc quay cực Điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius. Góc quay cực được đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet là 10 cm. Một số mẫu được đo ở khoa Dược, trường đại học Chungnam, Hàn quốc. 2.1.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany). 34 2.1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C- và DEPT NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY và ROESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội. Sử dụng các dung môi hòa tan được hoàn toàn mẫu thử chủ yếu là DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3. 2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính độc tế bào của dịch chiết cây thuốc được đánh giá theo phương pháp so màu, bằng bộ kít thử EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit (Promega, Madison, WI), xác định số tế bào sống dựa trên sự phân hủy muối tetrazolium bởi hệ enzym khử succinate-tetrazolium reductase của chuỗi hô hấp trong mitochondria của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan tan trong nước. Thử nghiệm được thực hiện tại khoa Dược, trường đại học Chungnam, Hàn quốc. 2.2.1.1. Chuẩn bị mẫu thử: Các dịch chiết cây (n-hexane và chloroform) được làm khô trong chân không (ít nhất 12 tiếng), sau đó được pha trong DMSO tại nồng độ 500 mg/mL để chuẩn bị cho phép thử tiếp theo. 2.2.1.2. Hóa chất - Nuôi cấy tế bào: Dòng tế bào ung thư gan hepatocarcinoma HepG2, được giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) có bổ sung 5% huyết thanh bê tươi (v/v) FBS và chất kháng sinh penicillin - streptomycin 1% ở 37oC, 5% CO2. Tế bào HepG2 được nuôi trong đĩa 96 giếng ở nồng độ 105 tế bào / giếng, tại 37 °C và 5% CO2. Sau khi ủ 24 giờ, môi trường nuôi cấy tế bào được thay mới nhờ bơm hút và Pasteur pipette, sau đó 100 l mẫu chiết cây ở nồng độ 500 g/mL trong phenol-red-free D-MEM được nhỏ vào mỗi giếng. Mẫu chứng dương (blank sample) là DMSO (nồng độ tương đương mẫu cao chiết trong phenol-red-free D-MEM). Mẫu chứng âm là dung dịch nuôi cấy. Mỗi mẫu được thí nghiệm lặp lại trong 5 giếng (n=5). Sau khi ủ tiếp 72 giờ ở 37 °C, 5% CO2, 10l dung dịch kít thử được nhỏ vào mỗi giếng. Ủ tiếp 45 phút trong tủ cấy. Đo hàm lượng formazan tạo thành bằngmáy quang phổ ELISA ở bước sóng 490 nm để tìm giá trị SR(%) (Survival Rate) theo công thức: SR= [OD mẫu thực / OD mẫu chứng] x 100%, trong đó SR là tỷ lệ phần trăm tế bào còn sống trong dung 35 dịch nuôi cấy so với đối chứng ở nồng độ thử xác định của chất nghiên cứu; OD là giá trị hấp thụ bước sóng của mẫu thực và mẫu chứng tương ứng đo được. 2.2.1.3. Xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu được xử lý và tính toán trên phần mềm Microsoft Excel. 2.2.2. Phương pháp thử tác dụng giãn mạch Phép thử giãn mạch được thực hiện tại khoa Thần kinh học, trường đại học Sienna, Italia. 2.2.2.1. Động vật thí nghiệm Tất cả động vật thí nghiệm được chăm sóc và thực nghiệm theo qui định quốc tế (NIH Publication No. 85–23, revised 1996) và phù hợp với Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của trường Đại học Sienna, Italy. Chuột đực Sprague-Dawley (300-400g) bị gây mê qua màng bụng, bị cắt đầu và cho chảy hết máu. Lấy động mạch đuôi chuột bằng cách cắt đuôi chuột khỏi thân, loại bỏ da và bảo dưỡng trong dung dịch muối sinh lý pH 7.35. Tiếp theo, cắt mạch thành các vòng nhỏ có độ dày 1.5-3-4mm. Đoạn mạch được bảo trì trong dung dịch sinh hóa Krebs-Henseleit tại nhiệt độ 37oC và oxy hóa bằng khí hỗn hợp O2/CO2 95/5(%). 2.2.2.3. Thử nghiệm giãn mạch Các dịch chiết được thí nghiệm trên các vòng động mạch đuôi chuột. Vòng mạch để cân bằng ngoài 60 phút dưới sức nặng của một vòng dây tungsten 40μm 1.5g cho vào bên trong mặt kính lumen, dùng thủy tinh Plexi nối với một máy cảm biến (2B Biological Instruments, Varese, Italy) nối với một thiết bị ghi bằng bút (Ugo Basile, Comerio, Varese, Italy). - Thí nghiệm với vòng động mạch loại bỏ lớp nội bào (-ER): Lớp nội bào được loại đi bằng cách luồn một sợ dây thép không gỉ vào bên trong vòng và lăn nhẹ bề mặt bên trong của thành mạch. Rửa với dung dịch muối sinh lý, gây co vòng động mạch bằng dung dịch 60mM K+ tới khi bão hòa và cho chất thử vào. - Thí nghiệm với vòng động mạch giữ lớp nội bào (+ER): Thực hiện tương tự như trên với gây co vòng động mạch bằng dung dịch 60mM K+ tới khi bão hòa và cho chất thử vào. 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme thủy phân epoxide hòa tan (soluble epoxide hydrolase (sEH) inhibition assay) Tác dụng ức chế các enzyme sEH được thực hiện theo phương pháp đo huỳnh quang, đo hoạt độ enzyme sEH xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất phát huỳnh quang 36 trong sự có mặt / vắng mặt chất nghiên cứu [102]. Thử nghiệm được thực hiện tại Khoa Dược, trường đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc. 2.2.3.1. Hóa chất – Nguyên liệu Chất phát huỳnh quang 3-phenyl-cyano(6-methoxy-2- naphthalenyl)methyl ester-2-oxiraneacetic acid (PHOME), chất chuẩn 12- [[(tricyclo[3.3.1.13,7]dec-1-ylamino)carbonyl]amino]-dodecanoic acid (AUDA), enzyme sEH tinh khiết và 6-methoxy-2-naphtaldehyde (chất nội chuẩn cho fluorometric assays) được mua của hãng Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Enzyme được chuẩn bị trong những ống nhỏ, bảo quản lạnh ở nhiệt độ -10 oC và chỉ được làm rã đông ngay trước khi sử dụng. Các phản ứng được thực hiện trong khí quyển khí N2 khô và được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng (TLC) Merck F254 silica gel 60 đế nhôm, các điểm chất phản ứng được nhận biết nhờ ánh sáng tử ngoại UV bước sóng 254 và 365 nm. Thể tích phản ứng là 200 μL, bao gồm 80 μL dung dịch đệm Bis-Tris buffer 25 mM (chứa 0.1% huyết thanh bò (bovine serum albumin), pH 7.0), 20 μL mẫu các nồng độ khác nhau, 50 L dung dịch PHOME 40 M, 50 L sEH enzyme. Dịch chuẩn AUDA (hòa tan trong MeOH, 15 nM) làm chứng dương. Ống phản ứng được điều nhiệt ở 37°C trong 1 h, và đo huỳnh quang 2 phút / lần (trong vòng 1h) bằng thiết bị Genios microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland) ở bước sóng kích thích / phát xạ (excitation/emission wavelengths) 320 và 465 nm. Hoạt độ ức chế enzyme sEH cho mỗi mẫu được tính toán theo phương trình: Hoạt độ enzyme sEH (%) =[(S-So)/(C-Co)] x 100 trong đó C là cường độ huỳnh quang mẫu chứng (enzyme, dung dịch đệm, MeOH và cơ chất) sau khi ủ 60 phút, Co là cường độ huỳnh quang của mẫu chứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng; S là là cường độ huỳnh quang mẫu đo (enzyme, dung dịch đệm, dung dịch mẫu và cơ chất) sau khi ủ 60 phút, So là cường độ huỳnh quang của mẫu chứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng. Giá trị IC50 là nồng độ chất thử tại đó hoạt độ của enzyme sEH bị ức chế 50% hoạt độ, được xác định bằng độ tuyến tính của 4 – 5 điểm dữ liệu trên đường cong độ hấp thụ huỳnh quang tìm được. Các thông số động học enzyme Km (nồng độ cơ chất tại đó tốc độ thủy phân cao nhất) và Vmax (tốc độ thủy phân cơ chất cao nhất) được tính toán theo phương trình Michaelis-Menten. 37 2.2.3.3. Xử lý số liệu thống kê Các số liệu được trình bày dạng chỉ số trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Trong các phép so sánh, P<0.05 được coi là có ý nghĩa. Hoạt độ sEH trong sự có mặt của các chất nghiên cứu sẽ được trình bày dạng phần trăm so với giá trị từ mẫu chứng. Giá trị IC50 tính toán được từ đường biễu diễn và phương trình Hill (Hồi quy không tuyến tính) (non-linear regression) với giá trị phương sai thấp nhất; Km và Vmax được tính toán theo phương trình Michaelis-Menten, tính trên phần mềm GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Sự sai khác thống kê giữa các nhóm được phân tích bằng chương trình ANOVA tiếp theo là phép so sánh Dunnett’s (P < 0.05). 2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm Việc thử nghiệm hoạt tính kháng viêm [103], nghiên cứu sự ức chế sự sinh NO của đại thực bào RAW264.7 đã bị kích thích gây viêm bằng nội độc tố LPS, được thực hiện tại Khoa Dược, trường đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc. 2.2.4.1. Hóa chất Dòng tế bào đại thực bào RAW264.7, mua của hãng ATCC, Hoa kỳ. MTT assay ((3-(4,5-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), Sulfuretin (98.0%) được mua của hãng Sigma-Aldrich, Hoa kỳ. Các hóa chất khác được mua của hãng Invitrogen, Hoa kỳ. 2.2.4.2. Phương pháp xác định nồng độ NO: Đại thực bào RAW264.7 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung FBS 10%, 100 g/L streptomycin, và 100 IU/mL penicillin được ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2. Thay môi trường nuôi cấy cứ mỗi 48 h / lần. Các chất nghiên cứu được pha trong DMEM (không chứa FBS) ở các nồng độ khác nhau (10; 20 và 40 g/mL) được đưa vào mỗi giếng sao cho tổng thể tích đạt được 500 L / giếng. Sau 1h, tế bào được kích thích bằng 1 g/mL LPS trong 24 h. Nồng độ NO sinh ra trong dịch nuôi cấy đại thực bào sau khi cho tiếp xúc với yếu tố gây viêm LPS sẽ được xác định gián tiếp qua nồng độ NO2 bằng phản ứng Griess. Cụ thể, 100 mL dung dịch nuôi cấy tế bào (không chứa phenol red) được trộn với một thể tích tương đương tác nhân Griess (sulfanilamide 1% (w/v) trong phosphoricacid 5% (v/v) và naphthylethylenediamine-HCl 0.1% (w/v)), ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo trên máy ELISA ở 540/550 nm. Sulfuretin sử dụng làm chất chuẩn dương. Dịch nuôi cấy được dùng làm chuẩn âm. Lượng nitrite tạo thành trong mẫu được xác định 38 trên đường chuẩn độ NaNO2và suy ra lượng NO tạo thành. Kết quả thu được là giá trị IC50 (g/ml hoặc M) – giá trị ức chế bán phần sự tạo thành NO trong tế bào. 2.2.4.3. Phương pháp xác định khả năng sống sót của tế bào: Các hợp chất chiết tách sẽ được thử nghiệm xác định khả năng sống sót của tế bào theo phương pháp MTT assay để xác định tỷ lệ tế bào còn sống sót sau khi tiếp xúc với chất thử. Cụ thể, các tế bào RAW 264.7 được cấy trên đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào / giếng. Chất nghiên cứu với các nồng độ khác nhau (10; 20 và 40 M/ml) được đưa vào mỗi đĩa và ủ trong 24h tại 37oC and 5% CO2. Cuối cùng, 10 L MTT (5 mg/mL, trong PBS) được nhỏ vào mỗi giếng. Sự sinh trưởng của tế bào được xác định qua khả năng khử màu vàng của thuốc MTT thành sản phẩm formazan màu tím. Sau khi ủ thêm 3 h nữa, dịch nuôi cấy được loại bỏ. Kết tủa formazan còn lại đáy giếng được hòa tan trong 150 L DMSO và đo trên máy Eliza ở 550 nm. Celastrol được dùng làm chất chuẩn dương. 2.2.4.4. Xử lý số liệu thống kê: Số liệu thể hiện là trung bình của 3 lần đo ± standard deviation (SD). Trong các phép so sánh, P<0.05 được coi là có ý nghĩa. Phân tích thống kê được xử lý theo phương pháp ANOVA followed by Tukey’s test trên phần mềm SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) hoặc Graphpad Prism 6.0 (USA). 2.3. Xử lý mấu thực vật và chiết tách 2.3.1. Cây Nguyệt quế Murraya paniculata Lá cành loài Nguyệt quế M. paniculata(3,2 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (3 lần x 3 l), lọc và cô cất trong chân không. Phần cặn metanol (120g) được hoà trong lượng tương đương H2O (tỉ lệ 1 : 1). Và chiết lần lượt bằng các dung môi n – hexan, chloroform, etyl axetat và nước cho các cặn chiết tương ứng là các cặn n- hexane (1,6g), chloroform (7,0 g), ethyl acetate (2,6 g) và nước (90 mL) (Sơ đồ 1). Sơ đồ 1: Qui trình chiết và phân lập sơ bộ các chất trong lá và cành cây Nguyệt quế (Murraya paniculata) 39 2.3.1.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết chloroform Cặn dịch chiết chloroform (7,0 g) được hoà tan bằng một lượng CH3OH vừa đủ. Dung dịch thu được đem trộn với một lượng vừa đủ silica gel Merck, cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này được đưa lên cột sắc ký đường kính 3,6 cm, được nhồi 250 g silica gel Merck (loại 400 – 630 mesh) theo phương pháp nhồi cột ướt. Cột sau khi đã tương đối ổn định, bột silica gel tẩm dịch chiết được đưa lên đầu cột, với hệ dung môi rửa giải là n-hexane / EtOAc: 1/0 – 0/1; EtOAc / MeOH: 1/0 – 0/1) tăng dần độ phân cực (gradient dung môi), thu được 9 phân đoạn khác nhau (ký hiệu F-2A ÷ F-2I). Phân đoạn F-2B (3,1g) sau đó được tiếp tục tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel (230-400 mesh), triển khai theo chế độ gradient dung môi n-hexan-EtOAc (1/0 – 0/1, v/v), thu được 29 phân đoạn khác nhau (F-2B-1 ÷ F-2B-29). Phân đoạn F- 2B-8 (55 mg), sau khi cất loại dung môi thu được chất dầu màu nâu, đem hòa tan trong hỗn hợp n-hexan / EtOAc (2/1, v/v) thu được kết tủa rắn màu trắng. Rửa 3 lần bằng n-hexan (1 mL) thu được hợp chất MP.01 (42 mg) (sơ đồ 2). Sơ đồ 2: Qui trình phân lập các hợp chất từ dịch chiết chloroform từ lá và cành cây Nguyệt quế (M. paniculata) Phân đoạn F-2B-11 (111,3 mg) được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.Chất rắn trắng tách ra đem rửa 3 lần bằng MeOH lạnh thu được hợp chất sạch ký hiệu là MP.02 (35mg). Phân đoạn F-2C (1.2 g) tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường (230-400 mesh), rửa giải với hệ dung môi n-hexan – EtOAc (2:1, v/v) thu được 5 phân đoạn. Kết tủa trắng trong phân đoạn F-2C-2 (50 mg) được lọc, rửa hai lần bằng MeOH 40 lạnh (1 mL) thu được hợp chất MP.03 (23 mg). Phân đoạn F-2E (0.9 g) được tiếp tục tinh chế trên cột silicagel pha thường (230-400 mesh) với hệ dung môi rửa giải là n- hexan-aceton (5/1 - 1/1, v/v) thu được 4 phân đoạn. Phân đoạn F-2E-2 (55 mg) được kết tinh chậm ở nhiệt độ thấp. Tinh thể thu được đem lọc tách, rửa thu được hợp chất MP.05 (20 mg). Phân đoạn F-2E-3 (30 mg) được tiếp tục phân tách trên cột silica-gel với hệ dung môi n-hexan - aceton (3/1, v/v) thu được hợp chất MP.04 (17 mg) (sơ đồ 2). 2.3.1.2. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết n-hexane Sơ đồ 3: Qui trình phân lập các hợp chất từ dịch chiết n-hexan từ lá và cành cây Nguyệt quế (Murraya paniculata) Phần cặn chiết n-hexane (màu nâu đỏ, 1,6 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường với hệ gradient dung môi n-hexan-aceton (40/1 ÷ 1/1, v/v) để thu được 10 phân đoạn. Phân đoạn H4 được tiếp tục phân tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải n-hexan-aceton, (3.5/1, v/v) để thu được hợp chất MP.06 (10 mg) và dịch phân đoạn H41.Chất rắn màu trắng kết tinh trong dịch H41 được lọc rửa, kết tinh lại trong n-hexan để thu được hợp chất MP.07 (5 mg) (Sơ đồ 3). 2.3.2. Cây Tràm bông đỏ Callistemon citrinus Lá cành mẫu thực vật Callitemon citrinus(3,2 kg) khô được xay nhỏ, tiến hành ngâm chiết trong MeOH ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cặn chiết MeOH tổng (190 g). Cặn chiết MeOH này được hòa trong MeOH-H2O (1:1), rồi tiến hành phân bố bằng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan, CH2Cl2, EtOAc và cặn nước. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng: n-hexane ( 27,3g), CH2Cl2 (63,0 g), EtOAc (55,4 g) (Sơ đồ 4) 41 Sơ đồ 4: Quy trình chiết và phân lập sơ bộ các chất trong cây Tràm bông đỏ (lá cành) 2.3.2.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết DCM 63.0 g cặn dịch chiết dichlormethane được hoà tan bằng một lượng CH3OH vừa đủ. Dung dịch thu được đem trộn với một lượng silica gel Merck (1/1, m/m), cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này được đưa lên cột sắc ký đường kính 3,6 cm, được nhồi 250 g silica gel Merck (loại 400 – 630 mesh) theo phương pháp nhồi cột khô. Cột sau khi đã tương đối ổn định, bột silica gel tẩm dịch chiết được đưa lên đầu cột, với hệ gradient dung môi rửa giải là DCM – MeOH tăng dần độ phân cực theo các tỷ lệ 1/0; 40/1; 20/1; 10/1; 5/1; 2.5/1; 1/1 và 0/1 (1,5L / gradient, v/v), thu được 6 phân đoạn (D1-D6). Phân đoạn D1 được tiếp tục phân tách trên cột CC, silicagel với hệ dung môi n- hexane-CH2Cl2-Me2O (1/2/0.1), thu được 12 phân đoạn (D1A-D1L). Phân đoạn D1C được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng dung môi n-hexane-DCM (1/3-1/4, v/v) để thu được hợp chất CC.07 (6.1 mg), CC.08 và CC.09 (157.3 mg). Phân đoạn D1D chiết tách trên cột cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane-Me2CO (6/1, v/v) thu được 2 phân đoạn D1DA và D1DB. Tiến hành rửa giải phân đoạn D1DA trên cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi Me2CO-MeOH (1/2, v/v) thu được 3 phân đoạn D1DA1-A3. Phân đoạn D1D-A3 được chiết tách tiếp tục trên cột silicagel bằng hệ dung môi n-hexane-DCM-Me2CO (5/1/0.2, v/v/v) thu được chất CC.19 (20 mg) dưới dạng chất rắn trắng (3-Acetylmorolic acid). Phân đoạn D1-G được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng n-hexan – aceton (5/1, v/v) thu được 4 phân đoạn (D1G-1 đến -4). Phân đoạn D1G-4 được tách tiếp trên cột silica gel với hệ dung môin- hexan-EtOAc-MeOH (4:1:0.1, v/v/v) để thu được 2 phân đoạn (D1G4-A và -B). Kết tủa trong phân đoạn D1G4-B được lọc, rửa bằng n-hexan và MeOH (2 x 1 ml) thu được hợp chất CC.21 (10.4 mg) (diospyrolide) (sơ đồ 5). 42 Sơ đồ 5:Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DCM Phân đoạn D1I được tiếp tục phân tách trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải n-hexane-EtOAc (3/1) thu được 2 phân đoạn I2A và I2B. Phân đoạn I2A phân tách trên cột silicagel CC, rửa giải bằng CHCl3-Me2CO (15/1) thu được phân đoạn I2A1. Phân đoạn I2A1 này lại tiếp tục được tinh chế trên cột pha đảo RP-18 với MeOH-H2O (8/1) để thu được 2 phân đoạn I2A1A và I2A1B. Tinh chế phân đoạn I2A1B trên cột silicagel, rửa giải bằng dung môi n-hexane-Me2CO (5.5/1) thu được chất CC.20 (18.3 mg) dạng chất rắn không màu (11,12-Dehydroursolic acid lactone). Phân đoạn D1J được tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-acetone (5/1, v/v) thu được chất CC.01 và CC.02 (17.9 mg, dạng bột màu vàng) (sơ đồ 5). Phân tách phân đoạn D4 trên cột silica gel với dung môi n-hexan-aceton (3:1, v/v) thu được 2 phân đoạn D4-A và -B. Tách tiếp phân đoạn D4-A trên cột silica gel bằng n-hexan-EtOAc (4:1, v/v) thu được 2 phân đoạn D4-A1 và D4-A2. Tách D4A1 trên cột silicagel với dung môi CHCl3-EtOAc (4:1, v/v) thu được hợp chất CC.18 (79.0 mg) (acid betulinic) và từ phân đoạn D4-A2 với dung môi CH2Cl2-aceton (12/1, v/v) thu được hợp chất CC.22 (60.0 mg) (sơ đồ 5). 43 2.3.2.2. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết EtOAc Cặn EtOAc được tiến hành phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel, rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH, thu được 7 phân đoạn (E1-E7). Phân đoạn E3 được phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel, rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (15/1) thu được 2 phân đoạn (E3A, E3B). Phân đoạn E3B được tinh chế bằng sắc kí cột CC, silicagel với hệ dung môi n-hexane- Me2CO (2/1), thu được chất CC.04 (11,9 mg), dưới dạng chất rắn màu vàng chanh (quercetin), chất CC.09 (99 mg) dưới dạng chất rắn màu nâu (methyl gallate) và CC.16 (4.9 mg) (blumenol A). Phân đoạn E4 được phân tách bằng sắc kí cột CC, silicagel, rửa giải với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (4/1/0.1 – 3/1/0.1, 0,4 L / gradient), thu được 6 phân đoạn (E4A-E4F). Phân đoạn E4- B được chiết tách trên cột silicagel bằng hệ dung môi n-hexane-EtOAc-MeOH (1/2/0.3) thu được phân đoạn E4B1. Phân đoạn này lại đem phân tách tiếp tục trên cột silicagel bằng hệ dung môi CHCl3-Me2CO-H2O (1/2/0.05) thu được hai acylphloroglucinol glucoside là CC.13 (4.5 mg) và CC.14 (7.2 mg) đều dạng chất rắn không màu. Dịch thu được đem tinh chế trên cột YMC với hệ dung môi MeOH-nước (1/3 – 3/2, v/v) thu được hợp chất CC.12 (61mg) và CC.26 (11.0 mg) dưới dạng chất rắn trắng (sơ đồ 6). Sơ đồ 6: Quy trình phân lập các chất từ cặn dịch chiết EtOAc 44 Phân đoạn E4-C được tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột CC với gradient dung môi Me2CO-CHCl3-H2O (2/1/0.1, v/v/v), thu được 6 phân đoạn (E4C1-E4C6). . Phân đoạn E4C1 được tinh chế bằng sắc kí cột pha đảo RP-18, rửa giải với hệ dung môi MeOH-H2O (1/3, v/v), thu được 6 phân đoạn (E4C1A-E4C1D). Phân đoạn E4C1A được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP-18, với hệ dung môi rửa giải là MeOH-H2O (1/3, v/v), thu được chất CC.05 (36 mg), dưới dạng chất rắn màu vàng và CC.10 (123 mg) dưới dạng chất bột màu vàng nhạt. Phân đoạn E4-C3 được tinh chế trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (4/1/0.1) thu được chất CC.03 (11.7 mg) dưới dạng chất rắn màu vàng xanh (astragalin) và chất CC.23 (5 mg) dạng chất rắn trắng. Phân đoạn E5 được tinh chế trên cột CC, silicagel với hệ dung môi DCM-MeOH (6/1, v/v), thu được 3 phân đoạn (E5A, B, C). Phân đoạn E5A được cho kết tinh chậm ở nhiệt độ thấp. Chất rắn kết tinh đem lọc rửa bằng MeOH thu được chất CC.24 (3.2mg) (sơ đổ 6). 2.3.2.3. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết n-hexane Tiến hành phân tách cặn n-hexane (27 g) trên cột CC silicagel, rửa giải với hệ gradient dung môi n-hexane – EtOAc (1/0, 40/1, 20/1, 10/1 và 5/1) thu được 5 phân đoạn (H1-H5) (sơ đồ 7). Sơ đồ 7: Quy trình phân lập các chất từ cặn dịch chiết n-hexane Phân đoạn H4 được lọc, rửa với n-hexane thu được chất CC.06 (11 mg) dưới dạng bột rắn màu vàng chanh (eucalyptine). Dịch chiết H4A được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silica gel với dung môi CHCl3 – EtOAc (15/1, v/v) thu được CC.17 45 (5.6 mg) dạng bột trắng. Phân đoạn H3 cũng đem lọc rửa bằng n-hexan thu được chất CC.15 (12.8 mg) dưới dạng chất rắn trắng. Dịch chiết H3A được phânt tách tiếp trên cột YMC rửa giải bằng hệ dung môi aceton – methanol (1/4, v/v) thu được CC.25 (15.7 mg) và CC.27 (7.2 mg). Phân đoạn H5 đem chiết tách trên cột CC silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane-Me2CO (5/1) thu được 6 phân đoạn (H5A – HA5F). Phân đoạn H5A được tách tiếp trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải DCM- EtOAc (20/1) thu được chất CC.17 (11.0 mg) dạng bột trắng. 3.4. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất 3.4.1. Loài Nguyệt quế Murraya paniculata Kimcuongin (Chất mới) (MP.01): 2H-8-(3-methyl-2-O-isopropylideneacetylbut-2- ene-1-one-1-yl)-7-methoxy-1-benzopyran-2-one, tinh thể trắng, tan tốt trong CHCl3, C20H20O6 (M=356), m.p. 149-151oC. Phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 3.1. HR-ESI-MS m/z: 357.10408 (100%) [M + H]+; 273.0605 (4%) [M – C5H7O + H]+ ; 203.02536 (3%) [M- sidechain + CO]+; 177.04809 (3.5%) (M - sidechain]. ESI-MS (m/z): 357.1 [M + H]+. Murracarpin (MP.02): 2H-8-[(1S,2S)-2-hydroxy-1-methoxy-3-methyl-3-buten-1-yl]- 7-methoxy-1-benzopyran-2-one, chất rắn trắng, tan tốt trong MeOH và CHCl3, C16H18O5 (M = 290), m.p. 148-149oC.. Phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 3.2. []D25 -15.6º (c=0.063, CHCl3). Murrangatin (MP.03): 2H-8-[(1S,2S)-2,3-dihydroxy-3-methyl-3-buten-1-yl]-7- methoxy-1-Benzopyran-2-one, tinh thể hình kim trắng, tan trong MeOH và CHCl3, C15H16O5 (M = 276), ), m.p. 140-142oC. Phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 3.3. Omphalocarpin (MP.04): 2H-8-(2-hydroxy-3-methoxy-3-methylbutyl)-5,7- dimethoxy -1-benzopyran-2-one, chất rắn trắng, C17H22O6 (M=322), m.p. 148-149°C. Phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 3.4. HR-ESI-MS: 645.24386; 597.19411; 511.15173; 345.11613; 291.11142. Mexoticin (MP.05): 2H-8-(2, 3-dihydroxy-3-methylbutyl)-5,7-dimethoxy-1- benzopyran-2-one: chất rắn trắng, C17H22O4(M=290), ), m.p. 147-149oC. Phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 3.5. --Sistosterol (MP.06): tinh thể hình kim, không màu. C29H50O (M=414). Phổ 1H- NMR  (ppm): xem bảng 3.6. 46 Stigmast-5,22-dien-3-ol (MP.07): tinh thể hình kim, không màu, m.p. 155-157oC. C29H48O (M=412). Phổ 1H-NMR  (ppm): 5,34 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 5,12 (1H, dd, H-22), 5,03 (1H, dd, H-23). 3.4.2. Loài Tràm bông đỏ Callistemon citrinus 5,7-Dihydroxy-6,8-dimethyl-4'-methoxy flavone (CC.01): Chất rắn màu vàng, tan tốt trong metanol và clorofom), có Rf = 0.50 trong diclometan /EtOAc 6/1. Phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 3.7. HR-ESI-MS: m/z 311.0947 [M-H]- (theo tính toán cho C18H15O5, 311.0924). Callistine A (5,7-Dihydroxy-6-methyl-4'-methoxy flavone) (CC.02): chất rắn màu vàng, tan tốt trong metanol và clorofom), có Rf = 0.50 trong diclometan /EtOAc 6/1. IR, UV Phổ 1H- và 13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6): xem bảng 3.8. HR-ESI-MS: m/z 299.0844 [M+H]+ (calcd C17H15O5, 299.0914); 297.0944 [M-H]- (theo tính toán cho công thức C17H14O5 – H, 298.0840). Astragalin (CC.03) dạng bột màu vàng xanh, nhiệt độ nóng chảy 178-180oC, hiện màu dưới ánh sáng UV 254 và có Rf= 0.3 trong hỗn hợp Clorofom /Metanol / nước 3/1/0.1. C21H20O11 (M=448.37).1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD): xem bảng 3.9. ESI-MS: m/z 447,3 [M-H]-. Quercetin (CC.04) có dạng bột màu vàng chanh, điểm nóng chảy 313 – 314oC, tan tốt trong các dung môi ethanol, diethylether, hexane, chloroform. Chất hiện màu dưới ánh sáng tử ngoại UV 254 và bằng H2SO4 10%, với Rf = 0.3 trong Metanol / nước 3/2.C15H10O7 (M=302.24).1H- và 13C-NMR (500 MHz, MeOD): xem bảng 3.10. ESI- MS: m/z 301,0 [M-H]-. Catechin (CC.05)có dạng bột màu nâu, tan trong clorofom và metanol, hiện màu dưới ánh sáng tử ngoại UV 254.C15H14O6 (M=290.27).1H- và13C-NMR (500 MHz, CD3OD): xem bảng 3.11. ESI-MS: m/z 291,0 [M+H]+. Eucalypin (CC.06) chất bột màu vàng chanh, m.p. 198-200o, tan tốt trong chlorofom, có Rf=0.5 in hệ dung môi n-hexan/EtOAc 2/1 (v/v). C19H18O5(M= 326.34).1H- và 13C- NMR (500 MHz, CDCl3) xem bảng 3.12. 8-Demethyleucalypin (CC.07) dạng chất rắn màu trắng, tan trong clorofom, hiện màu dưới ánh sáng tử ngoại UV 254, có Rf = 0.50 trong hỗn hợp dung môi H/D/A 4/1/0.1. C18H16O5(M=312.32). 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CDCl3) xem bảng 3.13. 47 Myrtucommulone B(CC.08) Pale yellow powder, soluble in chloroform, methanol, EtOAc. Rf = 0.70 in n-hexane/EtOAc. C24H30O6(M=414.2042). 1H- và 13CNMR (CDCl3, 500 MHz) xem bảng 3.14. HR-ESI-TOF-MSm/z 415.2080 [M+H]+ (calcd for C24H31O6: 415.2115). Callistenone B (CC.09): Chất rắn màu vàng nhạt, tan trong chloroform, methanol, EtOAc. Rf= 0.70 trong n-hexane/EtOAc. C25H32O6 (M = 428.2199).1H- và 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) : xem bảng 3.15.HR-ESI-TOF-MS: m/z = 429.2235 [M+H]+ (calcd for C25H33O6: 429.2272). Axit gallic (CC.10): màu rắn trắng, tan tốt trong dung môi hữu cơ. 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD):. Methyl gallate (CC.11)màu rắn trắng, tan tốt trong dung môi hữu cơ.1H- và 13C- NMR (500 MHz, CD3OD): Gallomyrtucommulone A (CC.12): Chất rắn màu trắng ngà, tan tốt trong dung môi hữu cơ.C27H38O13 (M = 570.2312). 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD): xem bảng 3.16. HR-MS: m/z 569.2308 ([M-H]+, tính toán cho CTPT: C27H37O13, 569.2334) và m/z 605.2070 ([M+Cl]+, tính toán cho CTPT: C27H38O13Cl, 605.2001). Callocitrinone A (CC.13): (mới) chất rắn không màu, tan tốt trong MeOH, CHCl3. Chất có Rf= 0.4 trong hỗn hợp dung môi MeOH / nước 3/2 (v/v).C27H38O14 (M= 586.2261). 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD): xem bảng 3.17.. HR-ESI-MS: m/z = 586.2442 ([M]+), peak m/z = 567.2143 (tính toán cho C27H35O13 ([M-H2O-H]-, 567.2077). Callocitrinone B (CC.14): Chất rắn màu trắng, tan tốt trong dung môi hữu cơ.MeOH, CHCl3. Chất có Rf= 0.4 trong hỗn hợp dung môi MeOH / nước 3/2 (v/v). C28H40O13 (M= 584.2469). 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CD3OD): xem bảng 3.17.HR-MS: m/z 583.2472 ([M-H]+, tính toán cho CTPT: C28H39O13, 583.2391); m/z 619.2237 ([M+Cl]+, tính toán cho CTPT: C28H40O13Cl, 619.2157). Tetratriacontan- 1- ol (CC.15): chất bột màu trắng, tan tốt trong chloroform, không hiện màu dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, có Rf=0.33 trong n- hexane/acetone 6/1. C34H70O (M=494.5426).1H-NMR (500 MHz, CDCl3): xem bảng 3.18. ESI-MS:493.3 [M-H]-. 48 Blumenol A (CC.16): dạng bột trắng, tan trong MeOH, chloroform, nhiệt độ nóng chảy 113-115oC. 1H- và 13C-NMR (500 MHz, MeOD): xem bảng 3.19. -Sistosterol (CC.17): Tinh thể hình kim, không màu, không mùi. 1H- và 13C-NMR (500 MHz, CDCl3): xem bảng 3.6. Betulinic acid (CC.18): chất bột màu trắng, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như chlorofom, methanol, acetone. C30H48O3 456.70.1H-và 13C-NMR (CDCl3/MeOD, 500 MHz): xem bảng 3.20. 3-acetylolean-18-en-28-oic acid (CC.19) dạng bột màu trắng, tan tốt trong chloroform, có Rf = 0.33 trong n-hexane-acetone (6/1). C32H50O4498.37091. 1H- và 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz,): xem bảng 3.21. 3-hydroxy-urs-11-en- 13(28)-olide (CC.20) chất rắn không màu, tan trong methanol, có giá trị Rf=0.33 trong hỗn hợp H/A 5/1 (v/v).C30H46O3 454.34. 1H- và 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz): xem bảng 3.22. Diospyrolide (CC.21): chất rắn màu trắng, tan trong dichloromethane, chloroform, không hiện màu dưới ánh sáng tử ngoại UV 254, có Rf=0.4 trong hệ dung môi n-hexan / acetone 3/1 (v/v) và 0.75 trong dichloromethane / acetone 10/1 (v/v). C27H42O3 414.31348. 1H- và 13C-NMR (CDCl3, 500 MHz): xem bảng 3.23. Ursolic acid (CC.22): dạng bột màu trắng, tan tốt trong chlorform và methanol, kết tinh lại thành dạng sợi mảnh trong cồn tuyệt đối. Chất có Rf=0.70 trong n-hexane / EtOAc 1/2 (v/v).C30H48O3, 456.36033.1H- và 13C-NMR (CDCl3/MeOD, 500 MHz): xem bảng 3.24. Anthacin A (1,3,7,9,10-pentahydroxy-4,8-dimethoxy-anthracenyl-5-O-β-D- Glucopyrannoside) (CC.23): chất rắn màu trắng, tan trong các dung môi như metanol, aceton, EtOAc. Chất có Rf= 0.6 trong hệ dung môi C/M/W 3/1/0.1. 1H- và 13C-NMR (500 MHz, DMSO): xem bảng 3.25. Anthacin B (1,3,7,9-tetrahydroxy-4,8-dimethoxy-anthracenyl-5-O-β-D- Glucopyrannoside) (CC.24): chất rắn màu trắng, tan tốt trong clorofom, Rf = 0.5 trong C/M/W 3/1/0.1. 1H- và 13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6): xem bảng 3.25. Protocatechuic acid (CC.25): Chất rắn trắng, tan trong dung môi hữu cơ như methanol, acetone, chloroform.1H-và 13C-NMR (500 MHz, MeOD): xem bảng 3.26. 49 Endoperoxide G3 (CC.26): Chất rắn trắng, tan trong dung môi hữu cơ clorofom, aceton. 1H-và 13C-NMR (500 MHz, MeOD): xem bảng 3.27. 2,6,10-bisabolatriene (CC.27): dạng chất dầu, không màu, tan tốt trong chloroform, có Rf= 0.4 trong hỗn hợp dung môi n-hexan-diclometan (20/1). 1H-và 13C-NMR (500 MHz, CDCl3): xem bảng 3.28.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf
Luận văn liên quan