Luận án Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp

1:10 không thấy xuất hiện sự lắng cặn này. Kết quả nghiên cứu khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong các pH khác nhau cho thấy mức độ hòa tan là phụ thuộc vào pH và tỷ lệ giữa CoQ10: β-CD (Bảng 3.6). Ở pH thấp (pH ≤ 5), mức độ hòa tan kém hơn so với ở pH 6 và 7. Mức độ hòa tan của tỷ lệ 1:1 và 1:3 kém trong tất cả các pH khảo sát (pH 2-7). Tỷ lệ 1:5 có khả năng hòa tan tốt ở pH 6- 7, giảm đi ở pH 2-5. Từ những kết quả nghiên cứu trên, tỷ lệ 1:5 CoQ10 - β-cyclodextrin được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ hòa tan của phức β-CDQ10 Thời gian (phút) 0 20 60 0 20 60 0 20 60 pH pH 2 pH 3 pH 4 T ỷ l ệ C o Q 1 0 /β - cl y cl o d ex tr in 1/1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1/3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1/5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1/10 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + pH pH 5 pH 6 pH 7 T ỷ l ệ C o Q 1 0 /β - cl y cl o d ex tr in 1/1 + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + ++ 1/3 + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + ++ 1/5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1/10 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 104 (+) xuất hiện nhiều kết tủa; (++) xuất hiện ít kết tủa; (+++) xuất hiện rất ít kết tủa hoặc không xuất hiện kết tủa 3.8.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10, β-CDQ10 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC, 37oC, 60oC) trong 144 giờ và hàm lượng CoQ10 được xác định lại sau mỗi 24 giờ . Kết quả được thể hiện trên hình 3.47. Hình 3.47. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi sau 144 giờ ở điều kiện nhiệt độ từ 4 – 60oC. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu với CoQ10 tự do và phù hợp với nghiên cứu của Fir và cộng sự (2009). Từ kết quả thu được có thể thấy phức CoQ10-CD không ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của CoQ10 trong phổ nhiệt độ nghiên cứu và có tính bền nhiệt cao, điều này có ý nghĩa cho quá trình tạo chế phẩm CoQ10, bảo quản cũng như ứng dụng của CoQ10 sau này. 3.8.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin Để xác định độ bền của CoQ10 trong phức β-CDQ10 dưới tác động của ánh sáng, β- CDQ10 được chiếu sáng bởi đèn huỳnh quang trong thời gian 144 giờ và chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời (ngày đêm) trong thời gian 72 giờ. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.48. 105 Hình 3.48. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 Kết quả cho thấy khi bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 16,4% sau 24 giờ và 45,4 % sau 144 giờ chiếu sáng (hình 3.48). Tuy nhiên mức độ giảm thấp hơn khoảng 2 lần so với CoQ10 tự do. Khi bị chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời theo ngày đêm, hàm lượng CoQ10 giảm nhanh hơn so với chiếu sáng huỳnh quang. Hàm lượng CoQ10 giảm đến 21% sau chỉ sau 24 giờ và khoảng 45% sau 96 giờ. Tương tự, sự tổn thất của CoQ10 trong phức β-CDQ10 thấp hơn CoQ10 ở trạng thái tự do. Như vậy, việc tạo phức với β-CD làm tăng đáng kể độ bền của CoQ10 dưới tác dụng của ánh sáng. Trong điều kiện tương tự, hàm lượng CoQ10 hoàn toàn không thay đổi khi CoQ10 được che tối hoàn toàn. Sự giảm nhanh hàm lượng CoQ10 khi bị chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời là do tác động của tia cực tím. Theo nghiên cứu của Fir và cộng sự CoQ10 bị phá hủy 27% dưới ánh sáng của tia cực tím sau 120 phút ở nhiệt độ phòng. Nghiên cứu trước đây cũng cho thấy CoQ10 bị phân hủy đến 80% sau 15 ngày chiếu sáng bởi ánh sáng tự nhiên [27]. 3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 Dựa vào các kết quả nghiên cứu tạo phức CoQ10 với β-cyclodextrin và trên cơ sở xây dựng tiêu chuẩn viên nang thực phẩm chức năng CoQ10. Quy trình công nghệ điều chế thực phẩm chức năng bổ sung dưới dạng viên nang cứng chứa CoQ10 được thể hiện trên hình 3.49. 106 Hình 3.49. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10 Thuyết minh quy trình: Công thức bào chế viên nang cứng chứa CoQ10: 80 mg phức CoQ10, 320 mg maltodextrin. Tạo phức CoQ10- β – cyclodextrin: CoQ10 được hòa tan trong ethanol ở 60oC trong 30 phút, β-cyclodextrin được hòa tan trong nước ở 80oC trong 30 phút, tỷ lệ ethanol/nước 1:1 (v/v) . Sau đó hỗn hợp CoQ10 và β-cyclodextrin được khuấy trộn trong 60 phút ở 60oC cho đồng nhất. Sấy phun: Hỗn hợp được sấy phun ở nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC, tốc độ phun sương. Phức β-CDQ10 dạng bột được thu nhận. Phối trộn: Trộn đều phức CoQ10 – β – cyclodextrin tỷ lệ 1:5 (mol/mol) với maltodextrin theo tỷ lệ thành phần trong công thức với thời gian ít nhất 15 phút. Nguyên liệu chế phẩm CoQ10 Tạo phức với β – cyclodextrin tỷ lệ 1:5 (mol/mol) Phối trộn, đóng viên nang, bao gói β – cyclodextrin Maltodextrin Sản phẩm viên nang cứng CoQ10 Sây phun Nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC 107 Đóng nang: Tách vỏ nang số 0 (vật liệu làm vỏ nang là gelatin) thủ công thành 2 phần đáy và nắp nang. Dàn đáy và nắp nang vào khay đóng nang. Đổ bột lên mặt khay và dàn đều bột nang vào các vỏ nang rồi nén bột nang. Đóng nắp nang ở khay vào đáy nang đã chứa bột nang, xiết chặt nắp nang vào đáy nang. Tháo nang khỏi thiết bị đóng nang và làm sạch nang. Bảo quản: Viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 được đóng gói ngay vào các túi thiếc hoặc lọ thuốc chuyên dụng hợp vệ sinh an toàn thực phẩm bảo quản ở nơi thoáng mát. 3.8.4. Phân tích đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10 3.8.4.1. Hình thức cảm quan Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu vàng, vị hơi ngọt, mùi đặc trưng. Hình 3.50. Viên nang thực phẩm chức năng bổ sung chứa CoQ10 3.8.4.2. Độ đồng đều khối lượng Tiến hành cân 20 viên nang lấy ngẫu nhiên, tính khối lượng trung bình của nang thuốc, khối lượng bột thuốc và vỏ viên nang. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng STT Khối lƣợng nang thuốc (g) Khối lƣợng nang rỗng (g) Khối lƣợng bột thuốc (g) % so với KLTB % Chênh lệch so với KLTB 1 0,5052 0,0979 0,4073 99,08 0,92 2 0,5168 0,098 0,4188 101,88 1,88 3 0,5146 0,0924 0,4222 102,70 2,70 4 0,5112 0,0936 0,4176 101,58 1,58 5 0,5011 0,0972 0,4039 98,25 1,75 6 0,5040 0,0973 0,4067 98,93 1,07 108 7 0,4863 0,0994 0,3869 94,12 5,88 8 0,5113 0,0953 0,416 101,20 1,20 9 0,5048 0,0992 0,4056 98,67 1,33 10 0,5197 0,0988 0,4209 101,27 1,27 11 0,5167 0,1004 0,4163 101,27 1,27 12 0,5279 0,0993 0,4286 104,26 4,26 13 0,5125 0,1001 0,4124 100,32 0,32 14 0,5124 0,0987 0,4137 100,64 0,64 15 0,5058 0,0979 0,4079 99,23 0,77 16 0,5161 0,1008 0,4153 101,03 1,03 17 0,5224 0,0971 0,4253 103,46 3,46 18 0,5121 0,1009 0,4112 100,03 0,03 19 0,4987 0,0996 0,3991 97,08 2,92 20 0,4841 0,0981 0,386 93,90 6,10 KLTB = 0,411 (g) Kết quả kiểm tra độ đồng đều khối lượng ở bảng 3.7 cho thấy, % chênh lệch khối lượng giữa các viên nang với khối lượng trung bình dao động từ 0,03 - 6,1%, trung bình % chênh lệch giữa các viên nang với khối lượng trung bình là 2,02. Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV thì giá trị cho phép là 7,5%. Do đó, từ kết quả này cho thấy viên nang chứa CoQ10 dạng thực phẩm chức năng được điều chế đã đảm bảo yêu cầu về độ đồng đều khối lượng. 3.7.4.3. Độ tan rã Tiến hành thử độ rã của 10 viên nang trong nước, thời gian rã được ghi lại. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả đo độ rã STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thời gian r (phút) 16 13 14 12 17 15 14 17 15 16 Từ bảng 3.8 cho thấy, thời gian rã của 10 viên nang thử nghiệm dao động từ 12 – 17 phút, trung bình là 14,9 phút. Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV thì thời gian rã tiêu chuẩn đối với viên nang là dưới 30 phút, do đó viên nang được tạo ra trong nghiên cứu này là hoàn toàn đảm bảo yêu cầu về độ rã. 109 3.8.4.4. Độ đồng đều hàm lượng CoQ10 Tiến hành xác định định lượng hàm lượng CoQ10 của 10 viên riêng lẻ bất kì. Chế phẩm đạt yêu cầu phép thử, nếu có không quá một đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới hạn 85 % đến 115 % và không có đơn vị nào có hàm lượng nằm ngoài giới hạn 75 % đến 125 % của hàm lượng trung bình. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả định lượng CoQ10 trong viên nang STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB Hàm lƣợng CoQ10 (mg) 11,32 10,86 11,25 11,31 11,04 11,07 10,76 10,86 10,62 10,87 11,00 % Chênh lệch so với HLTB 2,95 1,24 2,31 2,86 0,40 0,67 2,15 1,24 3,42 1,15 1,84 Kết quả định lượng hàm lượng CoQ10 trung bình của 10 viên là 11 mg (bảng 3.9). Độ lệch về hàm lượng CoQ10 của các viên nang so với giá trị hàm lượng trung bình dao động từ 0,4% - 4,42% và trung bình là 1,84%. So sánh với tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV, độ lệch trung bình của viên nang chứa CoQ10 là nhỏ hơn do đó các viên nang tạo ra trong nghiên cứu này là hoàn toàn đảm bảo yêu cầu về độ đồng đều hàm lượng. 3.8.4.5. Kiểm tra, phân các chỉ tiêu của viên nang thực phẩm chức năng Coenzyme Q10  Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc. Thử nghiệm này được thực hiện theo mô tả trong tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cụ thể đối với từng đối tượng vi sinh cần phân tích. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và phụ lục 11. Kết quả phân tích cho thấy các chỉ tiêu vi sinh đều nằm trong giới hạn cho phép của thực phẩm chức năng do đó viên nang dạng CoQ10 dạng thực phẩm chức năng được điều chế trong nghiên cứu này đảm bảo yêu cầu.  Kiểm tra giới hạn độc tố Hàm lượng độc tố Aflatoxin trong viên nang chứa CoQ10 được phân tích theo mô tả trong tiêu chuẩn AOAC 990.33. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và phụ lục 11. 110 Theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm chỉ tiêu độc tố Aflatoxin <5 ppb, do đó chỉ tiêu độc tố aflatoxin trong viên nang CoQ10 là hoàn toàn đáp ứng an toàn thực phẩm.  Kiểm tra giới hạn kim loại nặng Hàm lượng kim loại nặng trong viên nang chứa CoQ10 được phân tích theo mô tả trong tiêu chuẩn AOAC 991.10. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và phụ lục 11. Theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với chỉ tiêu kim loại nặng chì (≤3,0 ppm), thủy ngân (≤0,1 ppm), cadimi (≤1,0 ppm) do đó chỉ tiêu kim loại nặng chì, thủy ngân và cadimi trong viên nang CoQ10 là hoàn toàn đáp ứng an toàn thực phẩm. Bảng 3.9. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 TT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả Phƣơng pháp 1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g KPH TCVN 4884:2005 2 Coliforms CFU/g KPH TCVN 6848:2007 3 E. coli CFU/g KPH TCVN 7924-2:2008 4 S. aureus CFU/g KPH TCVN 4830-1:2005 5 Shigella spp CFU/25g KPH TCVN 7902:2008 6 B. cereus CFU/g KPH TCVN 4992:2005 7 Salmonella CFU/25g KPH TCVN 4829:2005 8 Tổng số bào tử nấm men, mốc CFU/g KPH TCVN 8275-2:2010 9 Aflatoxin G1 μg/kg KPH AOAC 990.33 10 Aflatoxin B1 μg/kg KPH 11 Aflatoxin G2 μg/kg KPH 12 Aflatoxin B2 μg/kg KPH 13 Chì μg/kg 0,120 AOAC 991.10 14 Thủy ngân μg/kg 0,040 15 Cadimi μg/kg 0,028 111 3.8.4.6. Đánh giá độc tính cấp của trên động vật thí nghiệm đối với viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10 Việc đánh giá độc tính cấp trên động vật thí nghiệm đối với viên nang chứa CoQ10 được thực hiện như mô tả trong phần phụ lục 11 và kết quả đạt được như sau:  Trọng lượng cơ thể chuột Trọng lượng cơ thể chuột ở nhóm chứng và các nhóm thử được xác định sau 7 ngày uống thử nghiệm. Tất cả chuột ở nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm đều tăng trọng bình thường (bảng 3.11 và phụ lục 11). Bảng 3.11. Bảng theo dõi trọng lượng chuột STT Nhóm chứng STT Nhóm 1 Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g) 1 18.7 28.4 11 21.8 34.2 2 18.4 29.9 12 18.7 28.5 3 20.3 24.9 13 20.6 29.6 4 19.6 25.1 14 20.3 30.3 5 19.5 28.1 15 19.9 29.9 6 20.9 29.0 16 21.3 28.8 7 20.3 26.5 17 19.7 30.6 8 19.5 28.5 18 21.1 27.5 9 21.3 28.3 19 21.5 25.8 10 21.8 33.4 20 21.8 28.1 STT Nhóm 2 STT Nhóm 3 Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g) 21 20.5 31.1 31 19.9 25.3 22 21.0 26.4 32 19.1 26.7 23 20.3 24.9 33 18.2 30.7 24 21.5 29.4 34 18.2 26.8 25 19.2 28.9 35 19 24.2 26 20.3 23.7 36 20.2 29.9 27 20.5 31.1 37 19.2 24.5 28 19.8 31.3 38 21.6 33.5 29 21.2 26.8 39 20.5 33.5 112 30 21.7 29.7 40 19.7 29.7 STT Nhóm 4 Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g) 41 20.2 25.0 46 20.4 26.5 42 20.8 28.8 47 20.7 28.7 43 20.5 30.8 48 21.1 26.9 44 19.3 25.0 49 21.4 33.4 45 20.1 30.4 50 21.7 29.8  Tiêu thụ thức ăn và nước uống của chuột - Nhóm chứng: Hoạt động và ăn uống bình thường. - Các nhóm thử: Sau khi uống thuốc và trong 7 ngày theo dõi nhóm thử không nhận thấy biểu hiện gì khác thường so với nhóm đối chứng.  Quan sát dấu hiệu ngộ độc - Không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc ở các nhóm thử trong thời gian theo dõi. - Không có chuột chết trong quá trình thử nghiệm. Kết luận: Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận sau: Cho chuột uống mẫu thử với mức liều từ 5 – 20 viên/kg chuột (gấp 20,8 – 83,3 lần liều tương đương trên người. Kết quả không nhận thấy biểu hiện khác thường so với nhóm chứng, không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt động và tăng trọng bình thường. Không xác định được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) vì mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm ở mức liều tối đa nhất có thể cho uống (phụ lục 11). 113 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án đ thu đƣợc những kết quả chính nhƣ sau: 1. Từ 12 chủng vi khuẩn phân lập được từ nốt sần cây hoa hồng huyện Tây Tựu – Hà Nội đã tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cao cho nghiên cứu tiếp theo. 2. Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dxs và dps mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất sinh tổng hợp CoQ10 cao. 3. Xác định được điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10: sucrose 5 %, cao ngô: 1%, nhiệt độ 28oC, pH đầu 8, OD cấp giống 0.8, thời gian 96 giờ, hàm lượng CoQ10 thu được đạt 127,18 mg/l. 4. Xây dựng được quy trình tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp: Ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, chiết bằng hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở 45oC, tinh sạch bằng hệ dung môi ethanol:hexane và cột silica, cô đặc chân không ở 45oC. 5. Đã xác định được một số đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng pH 6 – 9, bị phá hủy bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang, có khả năng chống oxy hóa thông qua khử gốc tự do DPPH (EC50 = 0,18 mM). Bước đầu chứng minh được CoQ10 có khả năng ức chế hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C và FL. 6. Đã tạo được phức CoQ10 - β-cyclodextrin để hòa tan tốt trong nước và ứng dụng trong sản xuất viên nang thực phẩm chức năng có hiệu quả. Kiến nghị: Tiếp tục khảo sát một số hoạt tính sinh học cũng như khả năng ứng dụng của CoQ10 trong thực phẩm chức năng như sữa tươi và đồ uống có bổ sung CoQ10. 114 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Nguyen Viet Phuong, Truong Quoc Phong, Đang Thi Thu (2013) Isolation and screening of CoQ10 producing Agrobacterium tumefaciens strains from nudules of rose trees in Viet Nam. International Workshop on Agricultural Engineering and Post-Havest Technology for Asia Sustainability (AEPAS), pp. 545 -551. 2. Nguyễn Việt Phương, Trương Quốc Phong, Đặng Thị Thu (2014) Nghiên cứu cải biến Agrobacterium tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52 số 6, pp. 721-734. 3. Nguyễn Việt Phương, Đặng Thị Thu, Trương Quốc Phong (2015) Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng Agrobacterium tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10. Tạp chí Sinh học, tập 37 số 1se, pp 105-110. 4. Trương Quốc Phong, Nguyễn Việt Phương, Ngô Thu Hường, Đặng Thị Thu (2015) Nghiên cứu hoạt tính sinh học Coenzyme Q10 và một số đặc tính của phức Coenzyme Q10 – cyclodextrin” Tạp chí Công nghệ Sinh học, tập 13 số 2A, pp. 597- 602. 5. Nguyen Viet Phuong, Dang Thi Thu, Luu Hong Son, Nguyen Thi Phuong Hanh, Truong Quoc Phong (2015) Extraction and property studies of coenzyme Q10 from recombinant Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 53 số 6. 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam IV. NXB Y Học, Hà Nội 2. Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009) Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập ở Việt Nam. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học số 5, pp. 8-14 3. Ngô Thị Xuyên, Lê Lương Tề (2006) Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và bệnh u sùi rễ hoa hồng tại một số tình miền Bắc Việt Nam. Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội 4. Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lương (2010) Phân loại và nghiên cứu điều kiện nuôi thích hợp cho sinh trưởng và tổng hợp coenzyme Q10 ở chủng nấm men PL5-2. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học sô 6, pp.7-13 Tiếng Anh 5. Alan.R. Gaby (1996) The Role of Coenzyme Q10 in Clinical Medicine. Alternative Medicine Review 6. Ashb.M. N, Acherman.S, Tzagoloff.A, Edwards.P. A (1992) COQ2 is a candidate for the structural gene encoding para-hydroxybenzoate:polyprenyltransferase. J Biol Chem, 267, pp. 4128–4136 7. Astray.G, Mejuto.J. C; Morales.J (2010) Factors controlling flavors binding constants to cyclodextrins and their applicaitons in foods. Food Research International, 43, pp. 1212-1218 8. Barker.J. L, Frost.J. W (2001) Microbial synthesis of p-hydroxybenzoic acid from glucose. Biotechnol Bioeng, 76, pp. 376–390 9. Brandt.U, Trumpower. B (1994) The protonmotive Q cycle in mitochondria and bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 29, pp. 165-197 10. Bule.M. V, Singhal.R. S, Kennedy.J. F, (2010) Microencapsulation of ubiquinone- 10 in carbohydrate matrices for improved stability. Carbohydrate Polymers, 82, pp. 1290-1296 11. Cao.X. L (2006) Purification of coenzyme Q10 from fermentation extract:High- speed counter-current chromatography versus silicagel column chromatography. Journal of Chromatography A, 1127 pp. 92–96 12. Carr.G., Exell.G (1965) Ubiquinone concentrations in Athiorhodaceae grown under various environmental conditions. Biochem, 96, pp. 688-692 116 13. Chen.Y. Z, Y.G, Fu.Y .J, Zhang.X, Yu.P, Sun.G. Y, Efferth.T (2010) Efficient lewis acid ionic liquid-catalyzed synthesis of the key intermediate of coenzyme Q10 under microwave irradiation. Molecules, 12, pp. 9486-9495 14. Chen.F.C., H. S. H., Hung.S. T., Chen.M. C., Lin.C. Y (1999) Leaf, stem and crown galls on perennial asters caused by Agrobacterium tumefaciens in Taiwan. Bot. Bull. Acad. Sin, 40, pp. 237-242 15. Cheng.B, Yuan.Q. P, Li.W. J (2010) Enhanced Production of Coenzyme Q10 by Overexpressing HMG-CoA Reductase and Induction with Arachidonic Acid in Schizosaccharomyces pombe. Appl Biochem Biotechnol 160, pp. 523–531 16. Cheong.S. R, Sang.Y. K., Jung.K, Hyeon. X, Suk.J. H (2008) Fermentation process for preparing Coenzyme Q10 by the recombinant Agrobacterium Tumefaciens. Patent Application Publication 17. Choi.J, R.Y, Park.Y, Seo.J (2009) Synergistic effects of chromosomal ispB deletion and dxs overexpression on coenzyme Q 10 production in recombinant Escherichia coli expressing Agrobacterium tumefaciens dps gene. J Biotechnol 144(1), pp. 64 – 69 18. Choi.J. H, R.Y. W, SeoJ. H (2005) Biotechnological production and applications of coenzyme Q10. Appl Microbiol Biotechnol 68, pp. 9-15 19. Choi.G. S., K.Y. S, Seo.J. H, Ryu.Y. W (2005) Restricted electron flux increases coenzyme Q10 productionin Agrobacterium tumefaciens ATCC4452. Process Biochemistry 40, pp. 3225–3229 20. Conklin.K. A (2000) Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects. Nutr Cancer 37(1), pp. 1–18 21. Crane.F. L, Lester.R. L, Widmer.C (1957) Isolation of a quinone from beef heart mitochondria. Biochim Biophys Acta, (25), pp. 220-221 22. Crane.F. L (2000) New functions for coenzyme Q. Protoplasma, 113, pp. 213:127 23. Cupp.M. J, TracyT. S (2003) Coenzyme Q10 (ubiquinone, ubidecarenone). Humana Press Inc, pp. 53–85 24. Dhanasettakorn.K (2008) Coenzyme Q10 content, composition, texture and physiochemical characteristics of pasta fortified with freeze dried beef heat. A Dissertation presented to the Faculty of the Graduate School at the University of Missouri Columbia. 117 25. Eisenreich.W, Bacher.A, Arigoni.D, Rohdich. F, (2004) Biosynthesis of isoprenoids via the non-mevalonate pathway. Cell Mol Life Sci, 61, pp. 1401–1426 26. European Pharmacopoeia 4 (2002) Monogragh of ubidecarenone. 1578(4) 27. Fir.M. M, Milivojevic.L, Zmitek.J. and Prosek.M (2009) Studies of CoQ10 and cyclodextrin complexes: solubility,thermo- and photo-stability. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 64 pp. 225-232 28. Fred.Z, Esther. B, Daniel.S (2006) Preparation and Properties of Coenzyme Q10 Nanoemulsions. Cosmetic Science Technology 29. Frederick.L. C (2001) Biochemical Functions of Coenzyme Q10. Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana 30. Fujita.Y. I, Onishi.M. T, Nishida.T (1982) A new efficient and stereoselective synthesis of ubiquinone-10. Bull. Chem. Soc. Jpn, 55, pp. 1325-1326 31. Gu.S. B, Yao.J. M, Yuan.Q. P., Xue.P. J, Zheng.Z. M (2006) Kinetics of Agrobacterium tumefaciens ubiquinone-10 batch production. Process Biochemistry 41 pp. 1908_1912 32. Gvozdjakova.A. K, Bartkovjakova.M (2005) Coenzyme Q10 supplementation reduces corticosteroids dosage in patients with bronchial asthma. Biofactors, 25(235-240) 33. Ha.S. J, K.S. Y, Seo.J. H, Moon.H. J, Lee.K. M, Lee.J. K (2007a) Controlling the sucrose concentration increases coenzyme Q10 production in fed-batch culture of Agrobacterium tumefaciens. Applied Microbiology and Biotechnology 76, pp. 109_116 34. Ha.S. J, K.S. Y, Seo.J. H, Oh.D. K., Lee.J. K (2007b) Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens. Appl Microbiol Biotechnol, 74, pp. 974-980 35. Hagerman.R. A, Anthony.M. J, Willis.R. A (2001) Solid-phase extraction of lipid from Saccharomyces cerevisiae followed by high-performance liquid chromatography analysis of coenzyme Q content. Analytical Biochemistry, 296, pp. 141-143 36. Hamano.Y, Dairi.T, Yamamoto.M, Kuzuyama.T, Itoh.N, Seto.H (2002) Growth- phase dependent expression of the mevalonate pathway in a terpenoid antibiotic- producing Streptomyces strain. Biosci Biotechnol Biochem 66, pp. 808–819 37. Hoppe.U, Bergemanna.J, Diembecka.W (1999) Coenzyme Q10, a cutaneous antioxidant and energizer. BioFactors, 9 pp. 371–378 118 38. Hsia.S. L, Narain.N. R, Li.J, Russell.K. J, Woan.K. W (2014) Topical Coenzyme Q10 formulations and methods of use. Publication USPA, editor. United States: University of Miami, (51) 39. Ikeda.M, Kagei.K (1979) Ubiquinone content of eight plant species in cell culture. Phytochemistry, 18, pp. 1577-1578 40. Islam.M. S, Akter.M. M, Rahman M. A, Rahman.M. M, Akhtar.M. M, Alam.M. F. (2010) Isolation of Agrobacterium tumefaciens Strains from Crown Gall Sample of Dicot Plants in Bangladesh. Current Research in Bacteriology 3, pp. 27-36 41. Jeya.M, Moon.H. J, Lee.J. L, Kim.I.W, Lee.J. K. (2010) Current state of coenzyme Q10 production and its applications. Microbiol Biotechnol 85, pp. 1653–1663 42. Katsuki.H, Bloch.K. (1967) Studies on the biosynthesis of ergosterol in yeast: formation of methylated intermediates. J Biol Chem, 242, pp. 222–227 43. Kim.S. J, Kim.M. D, Choi.J.H (2006) Amplification of 1-deoxy-D-xyluose 5- phosphate (DXP) synthase level increases coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli. Mol. Biotechnol, 72, pp. 982–985 44. Kommuru.T. R, Ashraf.M, Khan.M. A, Reddy.I. K (1999) Stability and bioequivalence studies of two marketed formulations of coenzyme Q10 in beagle dogs. Chem. Pharm. Bull, 47, pp. 1024–1028 45. Kondo (1971) Method of producing coenzyme Q10 by microorganisms. United States Patent 46. Kuratsu.Y, Hagino.H, Inuzuka.K (1984) Effect of ammonium ion on coenzyme Q10 fermentation by Agrobacterium species. Agric. Biol. Chem, 48, pp. 1347– 1348 47. Kuzuyama.T (2002) Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of isoprene units. Biosci Biotechnol Biochem, 66, pp. 1619–1627 48. Kwon.S. S, Nam.Y. S, Lee.J. S (2002) Preparation and characterization of coenzyme Q10-loaded PMMA nanoparticles by a new emulsification process based on microfluidization. Physicochemical and Engineering Aspects, 210, pp. 95-104 49. Langsjoen.P. H, Langsjoen.A (1999) Overview of the use of CoQ10 in cardiovascular disease. Biofactors, 9(2–4), pp. 273–84 50. Lee.J. K, Her.G, Kim.S. Y, Seo.J .H. (2004) Cloning and Functional Expression of the dps Gene Encoding Decaprenyl Diphosphate Synthase from Agrobacterium tumefaciens. Biotechnol. Prog, 20, pp. 51-56 51. Lipshutz.B. H, Mollard.P, Pfeiffer.S. S, Chrisman.W (2002) A short highly efficient synthesis of coenzyme Q10. J Am Chem Soc, 124, pp. 14282–14283 119 52. Liu.X, Wu.H, Ye.J, Yuan.Q, Zhang.H (2006) Cloning and characterization of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter capsulatus B10. Can. J. Microbiol 52, pp. 1141–1147 53. Mancini.A, De.M. L, Oradei.A (1994) Coenzyme Q10 concentrations in normal and pathological human seminal fluid. J Androl, 15(591-594) 54. Matsumura.M, Kobayashi.T, Aiba.S (1983) Anaerobic production of ubiquinone- 10 by Paracoccus dentrificans. Eur J ApplMicrobiol Biotechnol 17, pp. 85–89 55. Matthysse.A. G (2006) The genus Agrobacterium. Prokaryotes, 5(91-114) 56. McLennan.H, Degli.E. M (2000) The contribution of mitochondrial respiratory complexes to the production of reactive oxygen species. J Bioenerg Biomemb, 32, pp. 153–162 57. Mcneil.B, Harvey.L. M (2008) Practical Fermentation Technology, Strathclyde Fermentation Centre. Strathclyde University, UK 58. Meganathan.R (2001) Ubiquinone biosynthesis in microorganisms. FEMS Microbiol Lett 203, pp. 131–139 59. Melzer.M, Heide.L (1994) Characterization of polyprenyldiphosphate: 4- hydroxybenzoate polyprenyltransferase from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1212, pp. 93–102 60. Michael.R. S (2010) Coenzyme Q10 Biosynthesis in Plants. A dissertation submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 61. Min.J. H, Lee.J. S, Yang,J. D, Koo.S (2003) The Friedel-Crafts alkylation of a prenyl group stabilized by a sulfone moiety: Expeditious synthesis of ubiquinones and menaquinones. J. Org. Chem, 68, pp. 7925-7927 62. Miyake.Y, Shouzu.A, Nishikawa.M (1999) Effect of treatment with 3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on serum coenzyme Q10 in diabetic patients. Arzneimittelforschung, 49(324-329) 63. Molyneux.S. L (2006) Development of assays for Coenzyme Q10 and their application in clinical trials. A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University of Canterbury 64. Mu.F. S, Luo.M, Fu.Y. J, Zhang.X, Yu.P (2011) Synthesis of the Key Intermediate of Coenzyme Q10. Molecules 2011, 16, pp. 4097-4103 120 65. Munkholm.H, Hansen.H, Rasmussen.K (1999) Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure. Biofactors 9, pp. 285–9 66. Narendra.K. S, Puspha.A, Sujata.A. S, Bhavana.B. K (2012) Fermentation, media optimization studies for Coenzyme Q10 production by Saccharomyces cerevisiae. International research journal of pharmacy ISSN pp. 2230 – 8407 67. Nguyen Ba Kien, K.I. S, Lee.M. G, Kim.J. K (2010) Coenzyme Q10production in a 150-l reactor by a mutant strain of Rhodobacter sphaeroides. J Ind Microbiol Biotechnol 37, pp. 521–529 68. Okada.K, Kainou T, Tanaka.K, Nakagawa.T, Matsuda.H, Kawamukai.M (1998b) Molecular cloning and mutational analysis of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Gluconobacter suboxydans. Eur J Biochem 255, pp. 52– 59 69. Okada.K, Suzuki.K, Kamiya.Y, Zhu.X, Fujisaki.S, Nishimura.Y, Nishino.T, Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1996) Polyprenyl diphosphate synthase essentially defines the length of the side chain of ubiquinone. Biochim Biophys Acta 1302, pp. 217–223 70. Onoue.S, Uchida.A, Kuriyama.K (2012) Novel solid self-emulsifying drug delivery system of coenzyme Q10 with improved photochemical and pharmacokinetic behaviors. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 46, pp. 492-499 71. Overvad.K, Diamant.B, Holm.L, Holmer.G, Mortensen.S. A, Stender.S (1999) Q10 in health and disease. Europ J Clin Nutr, 53, pp. 764–70 72. Papas.A. M (1999) Other antioxidants”. Antioxidant status, diet, nutrition, and health. New York: CRC Press LLC, pp. 231–48 73. Park.Y. C, Kim.S. J, Choi.J. H, Lee.W .H, Park.K. M, Kawamukai.M, Ryu.Y. W,, Seo.J. H (2005) Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans. Appl Microbiol Biotechnol, 67, pp. 192–196 74. Quinn.P. J, Fabisiak. J (1999) Expansion of antioxidant function of vitamin E by coenzyme Q. Biofactors, 9(2–4), pp. 149–54 75. Ranadive.P, Mehta. A, George.S (2011) Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii-ATCC. International Journal of Chemical Engineering and Applications, 2 76. Ravada.S. R, Emani.L. R, Garaga.M. R, Meka. B, Golakoti. T (2209) Synthesis of coenzyme Q10. Am. J. Infect. Dis, 2, pp. 83-89 121 77. Redalieu.E, Nilsson.I. M, Farley.T. M., Folkers.K (1968) Determination and levels of Coenzyme Q10 in Human Blood. Analytical biochemistry 23 23 pp. 1132 - 1140 78. Rodriguez.A. R, Brenne.E, Lacoste.F (2008) Determination of Coenzyme Q10 and Q9 in vegetable oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, pp. 6241- 6245 79. Rohmer.M, Knani.M, Simonin.P, Sutter.B, Sahm.H (1993) Isoprenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate. Biochem J 295(Pt 2), pp. 517–524 80. Rüegg.R, Gloor.U, Goel.R.N, Ryser.G, Wiss.O, Isler.O (1959) Synthesis of bichinon and ubichinon. Helv. Chim. Acta, 42, pp. 2616-2621 81. Sauchet.N, Laplante.S (2006) Seasonal variation of Co-enzyme Q10 content in pelagic fish tissues from Eastern Quebec. Journal of Food Composition and Analysis 20, pp. 403-410 82. Scaglione.F, Barbieri.B, Lundstrom.B, Lund.B (1999) Coenzyme Q10 administration increases antibody titer in hepatitis B vaccinated volunteers–A single blind placebo–controlled and randomized clinical study. Biofactors, 9, pp. 351–7 83. Seo.J. M, Im.E. M, Nam.J. Y, Kim.S.O (2007) Increase of CoQ10 Production Level by the Coexpression of Decaprenyl Diphosphate Synthase and 1-Deoxy-D- xylulose 5-Phosphate Synthase Isolated from Rhizobium radiobacter ATCC 4718 in Recombinant Escherichia coli. J. Microbiol. Biotechnol, 17(6), pp. 1045–1048 84. Seo.M. J, Kim.S. O (2010) Effect of Limited Oxygen Supply on Coenzyme Q10 Production and Its Relation to Limited Electron Transfer and Oxidative Stress in Rhizobium radiobacter T6102. J. Microbiol. Biotechnol, 20(2), pp. 346–349 85. Serge.L, Nathalie.S, Piotr.B, (2009) Comparison of low-temperature processes for oil and coenzyme Q10 extraction from mackerel and herring. Eur. J. Lipid Sci. Technol, 111, pp. 135–141 86. Suzuki.K, Okada.K., Kamiya.Y, Zhu.X. F, Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1997) Analysis of the decaprenyl diphosphate synthase (dps) gene in fission yeast suggests a role of ubiquinone as an antioxidant. J Biochem 121, pp. 496–505 87. Takahashi.S, Nishino.T, Koyama.T (2003) Isolation and expression of Paracoccus denitrificans decaprenyl diphosphate synthase gene for production of ubiquinone- 10 in Escherichia coli. Biochem Eng J, 16, pp. 183–190 122 88. Terao.S, Kato.K, Shiraishi.M, Morimoto.H (1979) Synthesis of ubiquinones. 2. An efficient preparation of ubiquinone-10. J. Org. Chem, 44, pp. 868-869 89. Tian.Y (2010a) Improvement of cultivation medium for enhanced production of coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum. Biochemical Engineering Journal, 51, pp. 160–166 90. Tian.Y (2010b) Effects of Cell Lysis Treatments on the Yield of Coenzyme Q10 Following Agrobacterium tumefaciens Fermentation. Food Sci Tech Int, 16(2), pp. 0195–9 91. Urakami.T, Yoshida.T (1993) Production of ubiquinone and bacteriochlorophyll a by Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter sulfidophilus. J Ferment Bioeng 76(3), pp. 191-194 92. Valle.D, E.M. M (2004) Cyclodextrins and their uses. Process Biochemistry, 39, pp. 1033-1046 93. Watts.G. F, Playford.D.A, Croft.K. D (2002) Coenzyme Q10 improves endothelial dysfunction of the brachial artery in Type II diabetes mellitus. Diabetologia, 45(420-426) 94. Weber .C (2001) “Dietary intake and absorption of coenzyme Q10”, Coenzyme Q: molecular mechanisms in health and disease. New York: CRC Press LLC, pp. 209–26 95. Weber.C, Bysted.A, Holmer.G (1997) The coenzyme Q10 content of the average Danish diet. Int J Vit Nutr Res 67, pp. 123–9 96. Xia.Q, Wang.H (2011) Study on stability of Coenzyme Q10-loaded nanostructured lipid carriers. Integrated Ferroelectrics: An international Journal 129(1) pp. 208- 214 97. Yalcin.A, Kilinc.E, Sagcan.A, Kultursay.H (2004) Coenzyme Q10 concentrations in coronary artery disease. Clin Biochem 37, pp. 706–9 98. Yang.H. Y, Song.J. F (2006) High-sensitive determination of coenzyme Q10 in iodinate β – cylodextrin medium by inclusion reaction and catalytic polarography. Analytical Biochemistry, 348 99. Yoshida.H, Kotani. Y (1998) Production of ubiquinone-10 using bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol, 44, pp. 19–26 100. Yoshizawa.T, Toyofuka.H, Tachibana.K.,Kuroda.T (1982) Regioselective polyprenyl rearrangement of polyprenyl 2,3,4,5-tetrasubstituted phenyl ethers promoted by boron trifluoride. Chem. Lett, 8, pp. 1131-1134 123 101. Yuan.Y, Tian.Y, Yue.T (2012) Improvement of Coenzyme Q10 Production: Mutagenesis Induced by High Hydrostatic Pressure Treatment and Optimization of Fermentation Conditions. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 102. Zahiria.H. S (2006) Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway. Metabolic Engineering 8, pp. 406–416 103. Zahiria.H. S (2009) Effect of concomitant lycopene biosynthesis on CoQ10 accumulation in transformed Escherichia colistrains. 104. Zhang.D, Shrestha.B, Li.Z, Tan.T (2007) Ubiquinone-10 production using Agrobacterium tumefaciens dps gene in Escherichia coli by coexpression system. Mol. Biotechnol, 35(1), pp. 1-14 105. Zhang.Z, Inserra.P.F, Watson.R. R (1997) “Antioxidants and AIDS”. Antioxidants and disease prevention. New York: CRC Press LLC, pp. 31–43 106. Zhong.W, Fang.J, Liu.H, Wang.X (2009) Enhanced production of CoQ10 by newly isolated Sphingomonas sp. ZUTEO3 with a coupled fermentation–extraction process. J Ind Microbiol Biotechnol 36, pp. 687–693 107. Zhu X., Yuasa.M, Okada.K, Suzuki.K., Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1995) Production of ubiquinone in Escherichia coli by expression of various genes responsible for ubiquinone biosynthesis. J Ferment Bioeng 79, pp. 493 – 495 . 124 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Trình tự và đặc điểm gen 16S của A. tumefaciens TT4 LOCUS KR261089 1322 bp DNA linear BCT 10- OCT-2015 DEFINITION Agrobacterium tumefaciens strain TT4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION KR261089 VERSION KR261089.1 GI:936294395 KEYWORDS . SOURCE Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) ORGANISM Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex. REFERENCE 1 (bases 1 to 1322) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Isolation and screening of the coq10 producing Agrobacterium tumefaciens strains from nodules of rose trees in vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1322) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (23-APR-2015) Center for Research and Development in Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No 1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..1322 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." rRNA 1322 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 acgccccgca aggggagtgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaacatac cctttcctgc 61 ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac cgcatacgcc ctacggggga aagatttatc 121 ggggaaggat tggcccgcgt tggattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga 181 cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 241 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg 301 ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt caccgatgaa gataatgacg 361 gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg 421 ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt aagtcagggg 125 481 tgaaatcccg cagctcaact gcggaactgc ctttgatact gggtatcttg agtatggaag 541 aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg 601 gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 661 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc gggcagtata 721 ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt 781 aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 841 gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggta tgggcattgg agacgatgtc 901 cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 961 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag catttagttg 1021 ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1081 tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag tgggcagcga 1141 gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcac tctgcaactc 1201 gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc atgctgcggt gaatacgttc 1261 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttttacccg aaggtagtgc 1321 gc Phụ lục 2. Trình tự và đặc điểm gene dps LOCUS KJ619965 1077 bp DNA linear BCT 11- JUN-2014 DEFINITION Agrobacterium tumefaciens strain TT4 decaprenyl diphosphate synthase (dps) gene, partial cds. ACCESSION KJ619965 VERSION KJ619965.1 GI:647841698 KEYWORDS . SOURCE Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) ORGANISM Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex. REFERENCE 1 (bases 1 to 1077) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Reconstruction of Agrobacterium tumefaciens strain for enhancing coq10 producibility JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1077) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-MAR-2014) Center for Research and Development in Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..1077 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /isolation_source="rose nodule" /specimen_voucher="TT4" 126 /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." gene <1..1077 /gene="dps" CDS <1..1077 /gene="dps" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="decaprenyl diphosphate synthase" /protein_id="AIC32316.1" /db_xref="GI:647841699" /translation="LPHKASVFIVEFKFELESCPLGVVIPLEESKNKLASVKPLVDLT RPDMERVNQLILSKAGSDVQMIPEVANHLISSGGKRLRPMLTLASASMFGYEGDNHIK LATSVEFMHTATLLHDDVVDESDLRRGKSTARTIWGNQASVLVGDFLLGQAFRMMVDV GSLDALDVLSTAASVIAEGEVLQLSVAKNMETTEDDYLQVIRAKTAALFAAAAEVGPI VAKTDKATRSALKSYGMNLGLAFQLVDDVLDYGGKSADLGKNTGDDFREGKITLPVIL SYRRGTQDERAFWRNAIEKGESSDENLEKALGLITKYNGLGDTIGRATHYGTIARDAL APLPQSPWKDALLEVIDFCIERLN" ORIGIN 1 ttgccgcaca aggcatcagt ttttattgtc gaattcaaat tcgaactgga gtcctgtccc 61 ttgggcgtcg tcataccgct tgaagaaagc aaaaacaaac tcgcatccgt caagccgctt 121 gtcgacctga cccgccccga catggaacgg gtgaaccagc ttatcctttc caaggccggt 181 tccgacgtgc agatgatacc cgaggtggcc aaccacctca tctcgtcagg cggcaagcgc 241 ctgcggccga tgctgacgct cgcctcggcc tcgatgttcg gttacgaggg cgataatcac 301 atcaagctcg ccacgagcgt tgagttcatg cacacggcga cgcttctgca tgacgacgtg 361 gtggatgaaa gcgatctgcg tcgcggcaaa tccaccgcac gcaccatctg gggtaaccag 421 gcaagcgttc tcgtcggcga cttcctgctt ggccaggctt tccgcatgat ggtggatgtc 481 ggctctctcg atgccctcga cgtgctctcc accgccgcct cggtcatcgc cgagggtgag 541 gtgctgcagc tttcggtcgc caagaacatg gaaacgaccg aggacgatta tcttcaggtg 601 attcgcgcca agacggctgc cctcttcgcc gccgcggccg aagtcggccc catcgtcgcc 661 aagaccgaca aggcgacccg cagtgccctg aaatcttatg gcatgaatct cggcctcgcc 721 ttccagctgg tcgatgacgt cttggactat ggcggcaagt cggccgatct cggcaaaaac 781 acaggcgacg atttccgcga gggcaagatc accctgccgg tcatcctgtc ctatcgccgc 841 ggcacgcagg atgagcgcgc tttctggcgc aatgccatcg aaaaaggcga gagcagcgac 901 gagaacctcg aaaaggcgct cggcctgatc acaaaatata acggcctcgg tgatacgata 961 ggccgtgcaa cgcattatgg caccattgcc cgcgatgcgc ttgcaccgtt gccgcagagc 1021 ccctggaaag atgcgcttct ggaagtgatc gacttctgca tcgagcgtct caactga Phụ lục 3. Trình tự và đặc điểm gene dxs LOCUS KJ619966 1890 bp DNA linear BCT 11- JUN-2014 DEFINITION Agrobacterium tumefaciens strain TT4 1-deoxy-D-xylulose 5- phosphate synthase (dxs) gene, partial cds. ACCESSION KJ619966 VERSION KJ619966.1 GI:647841711 KEYWORDS . SOURCE Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) ORGANISM Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; 127 Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex. REFERENCE 1 (bases 1 to 1890) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Reconstruction of Agrobacterium tumefaciens strain for enhancing coq10 producibility JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1890) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-MAR-2014) Center for Research and Development in Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..1890 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /isolation_source="rose nodule" /specimen_voucher="TT4" /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." gene 1890 /gene="dxs" CDS 1890 /gene="dxs" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase" /protein_id="AIC32317.1" /db_xref="GI:647841712" /translation="LTGMPQTPLLDRVNFPSDLKEIDDRDLPELARELRDEMIDAVSK TGGHLGAGLGVVELTIAIHKVFNTPEDRLIFDVGHQCYPHKILTGRRDRIRTLRQEGG LSGFTRRAESEYDDFGAGHSSTSISAGLGMAVAAGLDGSDRKVIAVIGDGSMSAGMAF EALNNAGALDARLIVILNDNDMSIAPPTGAMSAYLARLASGRTYMGFRDFGKKLTAYL GKTIDRAITRAVTHARGYVTGGTLFEELGFYHIGPIDGHSFDHLLPVLRNVRDNQKGP VLIHVVTQKGKGYAPAEAAADKYHGVNKFDVITGAQAKAKPNAPSYTSVFAEALIQEA TLDEKIIGVTAAMPNGTGLDKMAELFPARTFDVGIAEQHAVTFAAGLAADGYKPFCAL YSTFLQRGYDQLVHDVAIQSLPVRFPIDRAGFVGADGPTHAGSFDTTFLATLPGMVVM AASDEAELKHMVRTAAAYDEGPISFRYPRGEGVGVEMPARGEILQIGKGRIIKEGTKV ALLSFGTRLAECLAAAEDLDAAGLPTTVADARFAKPLDLDLIRQLASHHEILVTVEEG SVGGFGAHVLHFMASGGLLDHGPKVRTLTLPDQWVEQAKPETMYANAGLDRAGIISTV FNALGQ" ORIGIN 1 ttgaccggaa tgccacagac accattgctt gaccgggtga attttccctc cgatctcaag 61 gagatcgatg atcgcgactt gccggaactg gcaagggaac tgcgcgacga gatgatcgat 128 121 gccgtgtcga aaaccggtgg gcatctgggt gccggccttg gtgtggtgga actgacgatt 181 gccatccaca aggtcttcaa cacgcccgaa gaccggctga tcttcgatgt cggacaccaa 241 tgttatccgc acaagatcct gaccggccgg cgggatcgca tccgcacgct gcggcaggaa 301 ggtggccttt ccggtttcac ccgccgtgcg gaaagcgaat atgacgattt cggcgccggc 361 cattcctcca cctccatttc cgccggtctc ggcatggcgg tggcggcggg cttggatggc 421 agcgaccgca aggtgatcgc tgtcatcggc gacggctcga tgtctgccgg tatggccttt 481 gaggcgctga acaatgccgg cgcgctcgat gcacgactga tcgtcatctt gaacgacaac 541 gacatgtcca ttgcgccgcc gacgggcgcg atgagcgcct atctggcgcg tctcgcttcc 601 ggccgcacct atatgggttt tcgcgatttc ggcaagaagc tcaccgccta tctcggcaag 661 acgatcgacc gcgccattac ccgcgccgtg acccatgcgc gcggttacgt gaccggcggc 721 accctgttcg aggagctcgg tttctatcac atcggcccga tcgacggtca ctccttcgac 781 cacctgttgc cggtgctgcg caatgtgcgc gacaaccaga aaggccctgt cctcatccat 841 gtggtgacac agaaaggcaa gggttatgcg ccggcggaag ccgcagcgga caaatatcac 901 ggcgtcaaca agttcgatgt catcaccggc gcgcaggcga aagccaagcc gaatgcgccg 961 agctatacca gcgtctttgc cgaggcgctg atccaggaag ccacgctcga tgagaaaatc 1021 atcggtgtga cggccgcgat gcccaacggt accggcctcg acaagatggc cgagctgttc 1081 ccggcgcgca ccttcgatgt cggcattgcc gaacagcatg ccgtcacctt tgcggcggga 1141 cttgcggctg acggttacaa gccgttctgc gcgctttatt ccaccttcct gcagcgcggt 1201 tacgaccagt tggtgcatga tgtggcaata cagagcctgc ccgtgcgttt cccgatcgac 1261 cgcgccggtt ttgtcggcgc cgacgggccg acccatgccg gctctttcga caccactttc 1321 ctcgccaccc tccccggcat ggtagttatg gcggcctcgg atgaggcgga gctgaaacat 1381 atggtccgca cggcggcggc ctatgacgaa ggcccgattt ccttccgtta tccgcgcgga 1441 gaaggtgtcg gcgttgaaat gcccgcacgc ggggagattc ttcagatcgg caagggtcgc 1501 atcatcaagg aaggcacgaa ggttgccctg ctttccttcg gaacccgcct tgcggaatgc 1561 ctggcggcgg ccgaagacct ggacgccgcc ggtcttccca cgacggttgc cgatgcgcgc 1621 ttcgccaagc cgctcgatct cgatctcatc cgccagctcg ccagccatca tgagattctg 1681 gtgacggtcg aggaaggctc ggtcggcggt ttcggcgcac atgtgctgca tttcatggca 1741 agtggcggcc tgctcgatca cggccccaag gtgcggacac tcacactgcc ggaccagtgg 1801 gtggaacagg ccaagccaga gaccatgtat gccaatgccg gcctcgaccg ggccggcatc 1861 atttccacgg tgttcaatgc gctcggccag Phụ lục 4. Đồ thị đường chuẩn DPPH (mM) 129 Phụ lục 5. Đồ thị đường chuẩn Coenzyme Q10 (mg/ml) Phụ lục 6. Đường chuẩn CoQ10 chuẩn theo HPLC Phụ lục 7. Nồng độ CoQ10 trung hòa gốc tự do DPPH STT Tên mẫu Nồng độ phần trăm trung hòa gốc tự do DPPH (%) EC 50 (mM) 0 mM 0,025 mM 0,05 mM 0,1 mM 0,2 mM 0,4 mM 0,8 mM Coenzyme Q10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp 100 84.31 76.15 62.72 41.01 14.54 9.17 0, 18 130 Phụ lục 8. Sơ đồ chi tiết quá trình tổng hợp CoQ10 ở vi sinh vật Con đƣờng MVA Con đƣờng MEP 131 Phụ lục 9. Các bảng số liệu về kết quả tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp Phụ lục 9.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp CoQ10 Nguồn cacbon Sucrose Lactose Manose Glucose Xylose Galactose CoQ10 (mg/l) 16.0 11.0 14.2 14.6 9.1 15.1 Phụ lục 9.2: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến sinh tổng hợp CoQ10 Nồng độ sucrose (%) 0 2.5 5.0 7.5 10 CoQ10 (mg/l) 6.2 13.97 18.42 13.33 10.79 Phụ lục 9.3: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp CoQ10 Nguồn nitơ Peptone Tryptone Cao malt Cao nấm men CSL (NH4)2SO4 Ure CoQ10 (mg/l) 14.96 18.10 20.09 18.68 26.68 17.95 13.55 Phụ lục 9.4: Ảnh hưởng nồng độ CSL đến sinh tổng hợp CoQ10 Nồng độ CSL (%) 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 CoQ10 (mg/l) 51.84 54.19 39.55 30.27 26.84 22.07 Phụ lục 9.5: Ảnh hưởng của pH đầu đến sinh tổng hợp CoQ10 pH 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 CoQ10 (mg/l) 34.97 54.27 54.07 66.54 68.82 Phụ lục 9.6: Ảnh hưởng của lượng giống đến sinh tổng hợp CoQ10 Lƣợng giống OD(660) 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 CoQ10 (mg/l) 67.80 90.09 100.30 103.82 108.76 100.66 91.89 58.69 132 Phụ lục 9.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh tổng hợp CoQ10 Nhiệt độ (oC) 20 25 28 30 37 CoQ10 (mg/l) 45.82 98.29 125.08 94.64 13.52 Phụ lục 9.10 : Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp CoQ10 Thời gian (giờ 0 24 48 72 96 120 144 CoQ10 (mg/l) 0 56.72 78.72 111.02 126 126.45 128.56 Phụ lục 10. Cây phân loại chủng A. tumefaciens Tt4 theo trình tự 16S. Cây phân loại được thiết lập theo phương pháp neighbour-joining sử dụng phần mềm ClustalW2 [www.ebi.ac.u/clustalw2]. Các ký tự và chữ số trước tên chủng là mã số của trình tự gene trên ngân hàng gen. 133 Phụ lục 11. Các kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin, an toàn vệ sinh thực phẩm, độc tính cấp của CoQ10