Luận án Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu Canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus Carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân

g vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình 4.2.7 có thể đưa ra nhận xét như sau: Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1, và Y2: 3 cặp yếu tố tương tác đôi (BC, BD, CD) ảnh hưởng lớn hơn 3 cặp yếu tố còn lại (AB, AC, AD). Trong 3 cặp yếu tố (BC, BD, CD) thì thứ tự ảnh hưởng mạnh đến hàm Y1 được sắp xếp lần lượt BD > BC > CD. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) và (2). 105 4.2.7. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất Quá trình chiết xuất sinh khối cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng) đều đạt giá trị lớn nhất. Để thực hiện điều này, tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 11.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Với các mục tiêu đặt ra là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng cáo nhất, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: + Hàm lượng canthaxanthin Y1 (mức 4) + Hàm lượng carotenoid tổng Y2 (mức 3) Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 cho ta 1 giải pháp tương ứng với 1 bộ số liệu công nghệ. Bộ thông số công nghệ tối ưu được trình bày ở bảng 4.2.4 Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.2.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1= 15.07 (mg/g) và Y2=18.26 (mg/g). Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.2.8. Theo đó với giải pháp này thì đạt được yêu cầu sau: - Đối với 4 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng - Mục tiêu về hàm canthaxanthin đạt 97.81% nguyện vọng - Mục tiêu về hàm lượng carotenoid tổng đạt 98.13% nguyện vọng - Nguyện vọng tổng thể đạt 97.94%. Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực A B C D Nhiệt độ chiết siêu âm (0C) Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Thời gian chiết (phút) Công suất chiết siêu âm (W) 0.01 0.23 -0.02 0.27 35 9.5 90 145 106 Hình 4.2.8. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất Hình 4.2.9. Điều kiện tối ưu các biến công nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1 và Y2 Kết quả trên được thực nghiệm lại với quá trình chiết canthaxanthin với quy mô phòng thí nghiệm được trình bày ở hình sau: Kết hợp 107 Hình 4.2.10. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong phòng thí nghiệm Kết quả thực nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 14.9 ± 0.12 (mg/g) và hàm lượng tổng carotenoid: 18.1 ± 0.17 (mg/g) sau quá trình chiết siêu âm đạt xấp xỉ kết quả dự đoán của mô hình. Sự khác biệt giữa điều kiện thực nghiệm và mô hình có thể do sự không ổn định của các điều kiện chiết xuất. 4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin Kết quả từ 100g bột sinh khối khô ban đầu, trải qua các công đoạn chiết xuất và phân lập đã thu được 125mg canthaxanthin tinh sạch. Các dữ kiện hoá lý cho phép khẳng định hợp chất phân lập được chính là canthaxanthin có độ tinh sạch tới 98.5%. Hình 4.2.11. Công thức hóa học của hợp chất canthaxanthin Hợp chất này có các thông số hóa lí sau: + Phổ khối ESI-MS: m/z = 565 [M+H]+ + Công thức phân tử: C40H52O2 + Trạng thái: chất rắn màu đỏ + Điểm nóng chảy: 2112130C + Hấp thụ cực đại ở bước sóng λmax=470 nm 108 + Khả năng hoà tan: Không tan trong nước, tan tốt trong acetone, chloroform. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được xác định trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Brucker 500 MHz tại viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.86 (2H, m, H-2,2’), 2.51 (2H, m, H-3,3’), 6.25 (2H, m, H-7,7’), 6.36 (2H, d, H-8,8’), 6.27 (2H, m, H-10,10’), 6.68 (2H, m, H-11,11’), 6.40 (2H, d, H-12,12’), 6.29 (2H, m, H-14,14’), 6.65 (2H, m, H-15,15’), 1.20 (6H, s, H-16,16’), 1.20 (6H, s, H-17,17’), 1.88 (6H, s, H-18,18’), 2.00 (6H, s, H-19,19’), 2.18 (6H, s, H-20,20’) 13C NMR: δ 198.7 (C=O), 160.9 (C-6,6’), 141.1 (C-8,8’), 139.3 (C-12,12’), 136.6 (C- 13,13’), 134.8 (C-9,9’), 134.3 (C-10,10’), 133.6 (C-14,14’), 130.5 (C-15,15’), 129.9 (C-5,5’), 124.7 (C-11,11’), 124.2 (C-7,7’), 160.9 (C-6,6’), 37.7 (C-2,2’), 35.7 (C-1,1’), 34.3 (C-3,3’), 27.7 (C-16,16’), 27.7 (C-17,17’), 13.7 (C-18,18’), 12.7 (C-20,20’), 12.5 (C-19,19’). Hình 4.2.12. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch Hình 4.2.13. Canthaxanthin sạch Hình 4.2.14. Sắc ký lớp mỏng canthaxanthin Dựa vào sắc ký đồ HPLC ta có thể thấy, với điều kiện chạy máy (như ở mục phương pháp nghiên cứu) thì canthaxanthin xuất hiện ở thời gian lưu là Rt =12.27 phút. Dựa vào diện tích peak đã xác định được độ tinh sạch của sản phẩm đạt 98.5%. 4.3. Tổng hợp và ứng dụng liposome 4.3.1. Quá trình tổng hợp và các đặc điểm của liposome chứa canthaxanthin và α- tocopherol 109 Liposome được tạo ra bằng phương pháp hydrat hóa màng mỏng đã được thiết lập sau đó là ép đùn. Các đặc tính hóa lý của mẫu liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol và hệ thống liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol đã được nghiên cứu. Như thể hiện trong hình 4.3.1, kích thước trung bình của liposome đối chứng là 105.53 ± 9.02 (trung bình ± SD; n = 3) trong khi kích thước trung bình của liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol là 97.33 ± 4.64 và 103.80 ± 6.95 (trung bình ± SD; n = 3), tương ứng. Trong trường hợp liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol, kích thước trung bình của liposome có nồng độ canthaxanthin IC = 0.1%, IC = 0.5% và IC = 1% là 109.70 ± 6.36; 105.10 ± 8.41 và 109.20 ± 5.66 (trung bình ± SD; n = 3). Chỉ số polydispersity (PDI), một chỉ số về tính đồng nhất phân tán, của tất cả các liposome có công thức dao động từ 0 đến 0.2, cho thấy rằng các thành phần hoạt tính được phân tán đồng nhất trên các liposome. Giá trị PDI của liposome chứa α-tocopherol thấp nhất là 0.150 ± 0.044 (trung bình ± SD; n=3). Tất cả các liposome khác có giá trị PDI cao hơn nhưng vẫn thấp hơn 0.2. Không có sự khác biệt đáng kể về kích thước trung bình và PDI giữa liposome đối chứng và canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol. Hình 4.3.1. Kích thước trung bình và giá trị PDI của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng canthaxanthin và α-tocopherol ở các tỉ lệ IC = 0,1%; IC = 0,5% và IC = 1%. K íc h t h ư ớ c tr u n g b ìn h ( m m ) Liposome lecithin Liposome canthaxanthin Liposome α-tocopherol Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=0.1% Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=0.5% Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=1% Kích thước trung bình Chỉ số đồng nhất phân tán 110 Hiệu suất quá trình đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) của liposome chứa canthaxanthin lần lượt là 59.6 ± 2.3% (trung bình ± SD; n = 3) và 2.39 ± 0.23% (trung bình ± SD; n = 3) (Bảng 4.3.1). Hiệu quả bao bọc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol giảm khi tăng nồng độ canthaxanthin trong lecithin liposome. Giá trị EE% của liposome chứa canthaxanthin tại IC = 0.1%, IC = 0.5% và IC = 1% lần lượt là 85.3 ± 2.1; 72.9 ± 1.8 và 55.3 ± 2.6. Bảng 4.3.1. Giá trị EE và DL của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol liposome với các tỉ lệ IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1%. Các số là kết quả của các phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Liposome EE (%) DL (%) Liposome đối chứng - - Liposomes chứa canthaxanthin 59.6 ± 2.3 2.39 ± 0.23 Liposome chứa α-tocopherol - - Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 0.1% 85.3 ± 2.1 1.87 ± 0.35 Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 0.5% 72.9 ± 1.8 2.09 ± 0.13 Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 1% 55.3 ± 2.6 2.23 ± 0.21 Vai trò của lớp lipid trong việc bảo vệ các vật liệu bên trong của liposome được nhấn mạnh bởi thực tế là các thành phần hoạt tính như carotenoid dễ dàng phân hủy trong môi trường vi mô có tính axit và do ảnh hưởng của các enzym. Quá trình giải phóng invitro của canthaxanthin từ liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol với IC=0.1%; IC=0.5% và IC=1% trong PBS ở pH 7.4 được thể hiện trong hình 4.3.2. Trong vòng 4 giờ đầu tiên, sự giải phóng canthaxanthin từ các liposome mà không có α-tocopherol dường như nhanh hơn các liposome khác. Ngược lại, liposome chứa canthaxanthin ở IC=0.1% cho thấy tốc độ giải phóng chậm hơn, bền vững, đạt 0.46 sau 4 giờ. Ngoài ra, việc tăng nồng độ canthaxanthin được nạp vào dường như làm giải phóng canthaxanthin nhanh hơn trong vòng 1 giờ đầu tiên. Sau 4 giờ ủ, khoảng 68% canthaxanthin được giải phóng khỏi liposome chứa 1% canthaxanthin. Những dữ liệu này cho thấy rằng canthaxanthin có thể được bao bọc tốt trong liposome và được giải phóng trong một thời gian dài. 111 Hình 4.3.2. Thí nghiệm invitro giải phóng canthaxanthin từ liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol tại IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1% trong PBS ở pH 7.4 T ố c đ ộ g iả i p h ó n g Liposome canthaxanthin Thời gian (h) Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=1% Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=0.5% Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=0.1% 112 Canthaxanthin + α-tocopherol (1/9; w/w) Hỗn hợp A Hỗn hợp B Hỗn hợp C Liposome thô Liposome thành phẩm Khuấy trộn đồng nhất 1. Bổ sung 2 ml CH2Cl2 2. Bổ sung lecithin 3. Khuấy trộn đồng nhất Cô quay đuổi dung môi 1. Bổ sung 4 ml nước cất 2. Bóc màng 1. Đùn ép 50 lần qua màng kích thước lỗ 100 nm 2. Để lạnh 40C, 12 giờ 4.3.2. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol Hình 4.3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol Thuyết minh quy trình Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây. Một cách ngắn gọn, hỗn hợp canthaxanthin và 113 α-tocopherol có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2 ml diclometan cùng với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu (IC=mcanthaxanthin/mlipid, % wt / wt) của canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%, 0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo thành liposome có chứa canthaxanthin. Để có được kích thước cố định, liposome được đưa qua màng polycác bonate 100 nm trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu liposome thành phẩm cuối cùng được đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh 12 giờ ở 40C trong bóng tối. Tất cả các mẫu khác (liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được chuẩn bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng. 4.3.3. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin Việc nuôi cá hồi vân được thực hiện vào mùa đông để đảm bảo các điều kiện sinh trưởng và nhiệt độ nước thích hợp. Oxy hòa tan trong thí nghiệm được kiểm soát và dao động từ 7.1 đến 10.9 mg/l, với mức trung bình là 8.2mg/l [111; 112]. Ban đầu, trọng lượng của cá là 309.43±12.98 g trước khi được nuôi và không có sự khác biệt giữa các nhóm. Trọng lượng ướt trung bình của cá được ghi lại hàng tháng trong quá trình thử nghiệm cho ăn và một lần trước khi lọc. Trong quá trình thí nghiệm, cá vẫn khỏe mạnh và tỷ lệ chết là 0%. Vào cuối thử nghiệm, cá được cho ăn với chế độ ăn có bổ sung 1g/kg canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol (IC=0.5%) cho thấy trọng lượng trung bình cao hơn đáng kể so với các nhóm đối chứng thí nghiệm khác (p<0.05) (hình 4.3.3). Cá hồi vân được nuôi bằng chế độ ăn bổ sung canthaxanthin ở 20mg/kg (chế độ ăn IV) cho thấy trọng lượng ướt thấp hơn đáng kể (p <0.05) sau hai, ba và bốn tháng so với các nhóm khác. Phát hiện này phù hợp với báo cáo của Murphy và cộng sự khi tăng liều lượng canthaxanthin cho ăn dẫn đến tăng trọng lượng thấp hơn ở cá hồi vân [112]. Trọng lượng cuối cùng của cá ở các nhóm được cho ăn với khẩu phần bổ sung 1g/kg lecithin hoặc 100mg/kg α-tocopherol cao hơn, mặc dù không có ý nghĩa thống kê (p> 0.05), so với những con được nuôi bằng khẩu phần ăn công nghiệp thông thường. Trong trường hợp các nhóm được cho ăn với chế độ ăn bổ sung canthaxanthin và α-tocopherol trên liposome (Chế độ ăn VII, IX và X), mức tăng trọng của chúng cao hơn khi tăng nồng độ canthaxanthin từ 0.1% lên 0.5% nhưng gần như không tăng khi tiếp tục tăng nồng độ canthaxanthin từ 0.5 ÷ 1% (chênh lệch không đáng kể). 114 Các kết quả hiện tại tương tự như các báo cáo trước đây chỉ ra rằng việc đưa các carotenoid như canthaxanthin hoặc astaxanthin vào thức ăn cho cá ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn của cá hồi nước ngọt hoặc cá vẹt [47]. Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng báo cáo rằng carotenoid có thể tăng cường sự tăng trưởng bằng cách hoạt động như hormone thụ tinh nhưng cho đến nay, chức năng sinh học của carotenoid trong cá vẫn chưa được xác nhận. Hình 4.3.4. Sự thay đổi trọng lượng của các nhóm cá hồi vân được nuôi bằng các chế độ ăn khác nhau. Bảng 4.3.2 cho thấy kết quả về thành phần cơ của cá hồi vân sau 3 tháng nuôi với các chế độ ăn khác nhau. Không có sự khác biệt đáng kể giữa 10 nhóm xử lý ở tất cả các chỉ tiêu (protein thô, lipid thô, tro và độ ẩm). Những phát hiện này không phù hợp với các báo cáo trước đây chứng minh rằng thiếu hụt canthaxanthin trong chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng đến tiêu hóa và hấp thụ lipid. Cụ thể, người ta thấy rằng việc bổ sung carotenoid trong chế độ ăn uống đã ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa và hấp thụ lipid ở chuột. Tương tự đối với thủy sản, Brizio ghi nhận rằng canthaxanthin ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa lipid ở cá. Tuy nhiên, ảnh hưởng của canthaxanthin và α- tocopherol đối với thành phần cơ cá vẫn còn nhiều tranh cãi và phức tạp, và cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu cơ chế của chúng. T rọ n g l ư ợ n g c á ư ớ t (k g ) T h ờ i g ia n c h o c á ăn ( th án g ) Các chế độ nuôi cá hồi vân (CĐ: chế độ ăn) CĐ I CĐ II CĐ III CĐ IV CĐ V CĐ VI CĐ VII CĐ IIX CĐ IX CĐ X 115 Bảng 4.3.2. Thành phần của cơ cá hồi vân sau 3 tháng thí nghiệm (n=3, đơn vị: % khối lượng ướt) Thí nghiệm Protein thô Lipid thô Tro Độ ẩm Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại 20.19 ± 1.15 6.79 ± 1.10 1.83 ± 0.12 73.79 ± 1.73 Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1 g/kg lecithin 18.89 ± 1.12 7.43 ± 1.09 1.75 ± 0.37 73.25 ± 0.81 Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100 mg/kg α- tocopherol 19.22 ± 1.32 7.42 ± 1.04 1.57 ± 0.22 72.21 ± 0.64 Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 20mg/kg canthaxanthin 20.07 ± 2.37 8.67 ± 2.33 1.72 ± 0.17 71.57 ± 1.12 Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100 mg/kg α- tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin 19.86 ± 1.86 7.51 ± 1.56 1.68 ± 0.34 73.13 ± 0.79 Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg α- tocopherol trên liposomes 20.25 ± 1.06 6.32 ± 1.18 1.23 ± 0.23 72.13 ± 1.46 Chế độ VII Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%) 19.29 ± 1.19 7.29 ± 1.24 1.97 ± 0.28 70.22 ± 0.91 Chế độ VIII Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=0.1%) 19.57 ± 1.28 7.12 ± 1.06 1.72 ± 0.21 73.15 ± 0.94 Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=0.5%) 20.25 ± 2.17 8.13 ± 2.43 1.65 ± 0.12 74.75 ± 1.02 Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=1%) 19.26 ± 1.69 7.91 ± 1.96 1.83 ± 0.24 71.03 ± 0.94 Các số liệu là kết quả của các phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SE. 4.3.3. Màu sắc cơ của cá hồi Khi bắt đầu thí nghiệm, màu sắc cơ thịt cá đồng đều giữa các nhóm thí nghiệm với điểm màu dao động từ 20.1 đến 20.9. Sau 1 tháng nuôi, màu sắc bắt đầu có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (p<0.05). Điểm cao nhất (27.0) được ghi nhận ở nhóm 116 được nuôi bằng chế độ ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin (Chế độ ăn V), theo sau là chế độ ăn IV và chế độ ăn IX (26.9). Mức thấp nhất là 23.1 được ghi nhận trong chế độ ăn I, không có canthaxanthin. Sau 2 tháng, sự khác biệt về màu sắc của cơ trở nên rõ ràng hơn. Tuy nhiên, về cuối thử nghiệm, sự cải thiện về điểm màu ít hơn, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đó. Kết quả này tương tự với các nghiên cứu trước đây với việc bổ sung astaxanthin và canthaxanthin với tỷ lệ 40:40mg/kg thức ăn. Điều này phù hợp với nghiên cứu được thực hiện bởi Choubert và Torrissen rằng màu sắc của cơ cá sẽ không tăng dần và đạt đến độ bão hòa, ngay cả khi tăng nồng độ hoặc cho ăn lâu hơn [25]. Bảng 4.3.3. Giá trị đo màu của philê lấy từ cá hồi vân được thí nghiệm bằng các chế độ ăn khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau một, hai và ba tháng cho ăn thử nghiệm (n=3) Thí nghiệm Ban đầu Tháng thứ nhất Tháng thứ hai Tháng thứ ba Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại 20.56 ± 0.88 23.11 ± 1.10 24.67 ± 1.10 25.00 ± 1.41 Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg lecithin 20.33 ± 0.71 23.22 ± 1.20 24.78 ± 1.20 25.22 ± 1.39 Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α- tocopherol 20.56 ± 1.13 23.22 ± 1.00 24.44 ± 1.00 25.11 ± 1.27 Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 20mg/kg canthaxanthin 20.89 ± 0.78 26.67 ± 1.00 28.33 ± 1.00 29.78 ± 1.20 Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α- tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin 20.11 ± 0.78 27.00 ± 1.1 29.11 ± 0.80 30.56 ± 1.01 Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg α- tocopherol loaded liposomes 20.44 ± 1.01 23.33 ± 0.70 24.89 ± 1.10 25.11 ± 1.54 Chế độ VII Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%) 20.33 ± 1.00 25.89 ± 0.80 28.11 ± 0.80 29.11 ± 0.78 Chế độ VIII Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=0.1%) 20.33 ± 1.00 25.00 ± 1.40 27.11 ± 1.30 28.78 ± 1.30 Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes 20.67 ± 1.00 26.67 ± 0.70 28.89 ± 0.80 30.00 ± 0.71 117 (IC=0.5%) Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α- tocopherol trên liposomes (IC=1%) 20.44 ± 1.13 26.89 ± 0.80 29.33 ± 1.10 30.22 ± 1.39 Giá trị màu sắc cho mỗi cơ đã được ba nhà nghiên cứu thống nhất. Các số liệu là kết quả của các phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SE. Chế độ I Chế độ II Chế độ III Chế độ IV Chế độ V Chế độ VI Chế độ VII Chế độ VIII Chế độ IX Chế độ X Hình 4.3.5. Màu sắc cơ của cá khi kết thúc thí nghiệm Hàm lượng canthaxathin tích lũy trong cơ của cá ở các thí nghiệm khác nhau sau 90 ngày nuôi được thể hiện trong Hình 4.3.5. Sau 90 ngày nuôi, cá được ăn các chế độ khác nhau cho thấy hàm lượng canthaxanthin tích lũy trong cơ là khác nhau (p<0.05). Hàm lượng canthaxanthin trong cơ cao nhất (2.91mg/kg) ở nhóm với chế độ ăn bổ sung 1g/kg canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol (IC=0.5%), tiếp theo là chế độ ăn bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposome (IC=1%) (2.90mg/kg), chế độ ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin (2.75mg/kg). Hàm lượng canthaxanthin trong cơ thấp nhất là nhóm được cho ăn chế độ ăn thương mại có bổ sung 1g/kg lecithin (0.99mg/kg). Tuy nhiên, giữa chế độ ăn IX và chế độ ăn V, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về lượng canthaxanthin. 118 Hình 4.3.6. Hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu cơ Theo Torrissen và cộng sự, sự phân bố canthaxanthin trong cơ cá hồi vân tỷ lệ thuận với tỷ lệ canthaxanthin bổ sung trong thức ăn [25]. Tuy nhiên, với việc bao gồm canthaxanthin ở nồng độ cao hơn 50mg/kg, sự tích tụ của canthaxanthin trong cơ cá hồi vân giảm dần và dừng lại khi đạt đến độ bão hòa. Sự tích lũy canthaxanthin trong thịt cá tăng lên khi có mặt của α-tocopherol trong thức ăn (chế độ ăn V), phù hợp với kết quả báo cáo của Choubert đề xuất rằng, so với chỉ cho ăn bằng canthaxanthin, việc sử dụng liposome được hình thành từ lecithin và α-tocopherol có thể làm giảm lượng canthaxanthin cần thiết để đạt được cùng một kết quả. Với chế độ ăn trực tiếp canthaxanthin (V) cần 20mg canthaxanthin và 100mg α- tocopherol/kg thức ăn thì hàm lượng canthaxanthin trong cơ thịt cá hồi chỉ tương đương liposome có chứa 1g canthaxanthin và α-tocopherol. Ta nhận thấy rõ sự khác biệt khi dùng trực tiếp canthaxanthin và dùng liposome có chứa canthaxanthin. 119 KẾT LUẬN Luận án đã thực hiện được những kết quả bao gồm: 1. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn - Đã khảo sát được các thành phần dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của chủng P.carotinifaciens VTP20181 gồm: ➢ NH4SO4 0.8 (g/l) ➢ KH2PO4 4.5 (g/l) ➢ MgSO4 1 (g/l) ➢ Biotin 0.1 (g/l) ➢ Monosodium Glutamate 6.47 (g/l) ➢ CoCl2 2 (mg/l) ➢ FeSO4 1 (g/l) ➢ Bột nấm men 30 (g/l) ➢ Sucrose 17.5 (g/l) ➢ Sodium malate (C4H4Na2O5) 1.89 (g/l) ➢ NaCl 17.5 (g/l) - Tối ưu hóa được điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn với các thông số sau: ➢ pH 7.2 ➢ Nhiệt độ 26 (0C) ➢ Thời gian 61,32 (h) ➢ Tỷ lệ giống 7,97 (%) ➢ Tốc độ lắc 290 (rpm) ➢ Hàm lượng canthaxanthin 8.66 ± 0.17 (mg/g sinh khối khô) ➢ Hiệu suất tạo canthaxanthin 15.88 ± 1.22 (mg Cx/lít) - Xây dựng được quy trình sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn chủng P.carotinifaciens VTP20181 với quy mô 100 lít/mẻ. 2. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin bằng phương pháp siêu âm - Tối ưu hóa được điều kiện chiết xuất canthaxanthin bằng phương pháp siêu âm sau quá trình sinh tổng hợp với các thông số sau: 120 ➢ Nhiệt độ 35.0 (0C) ➢ Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/9.5 (v/w) ➢ Thời gian chiết 90 (Phút) ➢ Công suất siêu âm 145 (W) ➢ Hàm lượng Canthaxanthin 15.07 (mg/g cao chiết) ➢ Hàm lượng Caroteniod 18.26 (mg/g cao chiết) - Xây dựng được quy trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi khuẩn ưa mặn. 3. Nghiên cứu tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và bổ sung vào thức ăn cho cá hồi vân - Tổng hợp được liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol với các tính chất sau: + Kích thước trung bình của liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α- tocopherol là 97.33 ± 4.64 và 103.80 ± 6.95 (trung bình ± SD; n = 3). + Giá trị PDI của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol thấp nhất là 0.150 ± 0.044 (trung bình ± SD; n=3). - Xây dựng được quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α- tocopherol quy mô phòng thí nghiệm. - Ứng dụng chế phẩm liposome trong nuôi cá hồi, kết quả thu được như sau: + Về tốc độ tăng trường, tỷ lệ sống: không có sự khác nhau. + Màu sắc và sự phân bố canthaxanthin trong cơ của cá được nuôi bằng khẩu phần có chứa 1g/kg liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol (IC = 0.5%) tương tự như ở cá được nuôi bằng khẩu phần công nghiệp có bổ sung 20mg/kg canthaxanthin. - Kết quả nghiên cứu cho thấy tính khả thi của việc sử dụng kỹ thuật liposome trong sản xuất chất bổ sung chế độ ăn cho cá hồi vân. 121 KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và chiết xuất canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn trên quy mô công nghiệp (3000 lít/mẻ). 2. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá thêm các chế độ ăn cho cá hồi vân có bổ sung liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol với các chế độ khác nhau, nhằm tối ưu hóa sản phẩm thức ăn cho cá hồi vân. NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đã tối ưu hóa được quy trình sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn. 2. Đã tối ưu hóa được quy trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối có sử dụng công nghệ chiết siêu âm. 3. Tổng hợp được liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol 4. Đã tiến hành nghiên cứu thức ăn cho cá hồi có bổ sung liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol 122 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN BÀI BÁO QUỐC TẾ 1. Tran Quoc Toan, Dang Viet Anh, Pham Quoc Long, Nguyen Phi Hung, Trinh Thu Huong, Tran Thuy Ha, Do Van Thinh, Le Van Khoi, Ngo Xuan Long, Phan Tri Nhut, Pham Thi Hai Ha, Do Van Manh and Nguyen Thanh Duong. “Effects of Dietary Inclusion of Canthaxanthin and α-tocopherol Loaded Liposome on Growth and Mucsle Pigmentation of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)”. Hindawi Journal of Food Quality 2021 (2021), Article ID 6653086, 11 pages. (ISI – Q2). 2. Duy Le Xuan, Toan Tran Quoc, Anh Dang Viet, Hung Nguyen Phi, Huong Trinh Thi Thu, Long Pham Quoc, Dat Nguyen Manh, Le Do Thi Thuy, Pham Dung Thuy Nguyen, Nhan Nguyen Phu Thuong, Manh Do Van. “Optimization of canthaxanthin extraction from fermented biomass of Paracoccus carotinifacuens VTP20181 bacteria strain isolated in Vietnam”. Foods and raw materials. (2021). 9(1), 117-125. BÀI BÁO TRONG NƯỚC 3. Trần Thị Mai Hương, Đỗ Văn Thịnh, Cao Thị Linh Chi, Lê Văn Khôi, Đặng Việt Anh, Trần Quốc Toàn, Trần Thị Thủy Hà. “Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm canthaxanthin có nguồn gốc từ vi khuẩn ưa mặn vào thức ăn đến sinh trưởng và màu sắc thị cơ cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss)”. Tạp chí Khoa học và Nông nghiệp Việt Nam số 11 năm 2020. 4. Đặng Việt Anh, Trần Quốc Toàn, Lê Xuân Duy, Nguyễn Mạnh Đạt, Đỗ Thị Thủy Lê, Trần Thị Thúy Hà, Đỗ Văn Thịnh, Lê Văn Khôi, Phạm Quốc Long. “Process extraction and isolation of Canthaxanthin from saline bacteria biomass Paracoccus Carotinifation VTP20181 isolated in Vietnam”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ biển - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Tập 20 số 4 năm 2020. 5. Đặng Việt Anh, Nguyễn Minh Châu, Trần Quốc Toàn, Phạm Quốc Long, Lê Văn Trọng, Trần Hoàng Quyên, Đỗ Thị Thủy Lê, Nguyễn Mạnh Đạt. “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin từ vi khuẩn Paracoccus Carotinifation VTP20181”. Tạp chí Dinh dưỡng và thực phẩm. Tập 17 - số 1 - tháng 3 - năm 2021 SÁNG CHẾ 6. Tên sáng chế: “Quy trình sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn”, số đơn: 1-2019-05322. Cục Sở hữu trí tuệ - Bộ Khoa học và Công nghệ. Đã chấp nhận đơn hợp lệ theo quyết định số: 108548/QĐ-SHTT ngày 02 tháng 12 năm 2019. 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Peng, J., Yuan, J. P., & Wang, J. H. (2012). Effect of diets supplemented with different sources of astaxanthin on the gonad of the sea urchin Anthocidaris crassispina. Nutrients, 4(8), 922–934. 2. Nagendraprabhu, P., & Sudhandiran, G. (2011). Astaxanthin inhibits tumor invasion by decreasing extracellular matrix production and induces apoptosis in experimental rat colon carcinogenesis by modulating the expressions of ERK-2, NFkB and COX-2. Invest New Drugs 3. Pashkow, F. J., Watumull, D. G., & Campbell, C. L. (2008a). Astaxanthin: A novel potential treatment for oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease. The American Journal of Cardiology, 101(10), S58– S68. 4. Fassett, R. G., & Coombes, J. S. (2012). Astaxanthin in cardiovascular health and disease. Molecules. 17(2): 2030–2048. 5. Kang, J. O., Kim, S. J., & Kim, H. (2001). Effect of astaxanthin on the hepatotoxicity, lipid, peroxidation and antioxidative enzymes in the liver of CCl4-treated rats. National library of medicine. 6. Uchiyama, K., Naito, Y., Hasegawa, G., Nakamura, N., Takahashi, J., & Yoshikawa, T. (2002). Astaxanthin protects β-cells against glucose toxicity in diabetic db/db mice. Redox Report, 7(5), 290–293. 7. W. Müller, J. Vergauwen, M. Eens, J.D. Blount (2012). Environmental effects shape the maternal transfer of carotenoids and vitamin E to the yolk. Front Zool., 9, p. 17. 8. Kazuhiro, O., Kenji, S., Satoshi, K., Tomomi, N., Nobuhisa, M., Kazunaga, Y., et al. (2003). Effects of astaxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 44(6), 2694–2701. 9. Sajilata M. G, Singhal R. S, Kamat M.Y (2008), The Carotenoid Pigment Zeaxanthin—A Review. Comp. Rev. Food Sci. Food Saf. 7, 29. 10. Saperstein S., Starr M.P., (1954) The ketonic carotenoid canthaxanthin isolated from a colour mutant of Corynebacterium michiganense. Biochem. J., 57: 273. 11. Haxo F., (1950). Carotenoids in the mushroom Cantharellus cinnabarinus. Botan. Gaz., 112: 228-232. 12. Czygan F.C., (1968). Sekundär-Carotinoide in Grünalgen. I. Chemie, Vorkommen und Faktoren welche die Bildung dieser Polyene beeinflussen. Acta Mikrobiol., 61: 81-102. 13. Thommen H., Wackernagel H., (1964) Zum Vorkommen von Keto- Carotinoiden in Crustacean. Naturwiss., 51: 87-88. 124 14. Katayama T., Miyahara T., Tanaka Y., Sameshima M., (1973). Carotenoids in the yellow-golden carp, Cyprinus carpio. Kagoshima Daigaku Suisan Gakubu Kiyo, 22: 39-45. 15. Czeczuga B., (1973). Carotenoids and vitamin A in some fish from the coastal region of the black sea. Hydrobiol., 41: 113-125. 16. Harker M., Hirschberg J., Oren A. (1998). Paracoccus marcusii sp. nov., an orange gram-negative coccus. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 543-548. 17. Dobson, S. J., and P. D. Franzmann. 1996. Unification of the genera Deleya and the species Paracoccus halodenitrificans into a single genus. Bacteriol. 46 550– 558 18. Teizi Urakami, 1* Jin Tamaoka, *Ken-Ichiro Suzuki, 3 and Kazuo Komagata2. International Journal of systematic bateri~logy, Apr. 1989, p. 116-121 Copyright, International Union of Microbiological Societies. Vol. 39, No. 2. Paracoccus alcaliphilus sp. nov., an Alkaliphilic and Facultatively Methy lo trop hic Bacterium. 19. Nei F. Saunders,1 Jorrit J. Hornberg, 1 Willem N.M. Reijnder, 1 Hans V. Westerhoff, 1 Simon De Vries,2 And ob J.M Van Spanning1 (2000). The NosX and NirX Proteins of Paracoccus denitrificans Are Functional Homologues: Their Role in Maturation of Nitrous Oxide Reductase. *Journal of Bacteriology, 0021-9193/00/$04.0010 Sept. 2000, p. 5211–5217 Vol. 182, No. 18 Copyright © 2000, American Society for Microbiology 20. H. Stouthamer. (1991). Metabolic Regulation Including Anaerobic Metabolism in Paracoccus denitrificans. Journal of Bioenergetics and Biomembranes volume 23, pages163–185. 21. Sarah L. Jordan · Ian R. McDonald · Anna J. Kraczkiewicz-Dowjat· Donovan P. Kelly · Frederick A. Rainey · J. Colin Murrell · Ann P. Wood. (1997). Autotrophic growth on carbon disulfide is a property of novel strains of Paracoccus denitrificans. Archives of Microbiology volume 168, pages225–236. 22. Yoko Katayama1, Akira Hiraishi1, Hiroshi Kuraishi3. First Published: (01 June 1995). Paracoccus thiocyanatus sp. nov., a new species of thiocyanate-utilizing facultative chemolithotroph, and transfer of Thiobacillus versutus to the genus Paracoccus as Paracoccus versutus comb. nov. With emendation of the genus. MICROBIOLOGY Volume 141, Issue 6. 23. Tsubokura A, Yoneda H, Mizuta H. (1999) Paracoccus carotinifaciens sp. nov., a new aerobic gram-negative astaxanthin-producing bacterium. Int J Syst Bacteriol, 49, 277-282. 24. Seyed Mohammad Taghi, Gharibzahedi, Seyed Hadi Razavi, Seyed Mohammad Mousavi (2013). Microbial canthaxanthin: Perspectives on biochemistry and biotechnological production. Eng. Life Sci. 2013, 13, 408– 417. 125 25. Vreeland, R. H., C. D. Litchfield, E. L. Martin, and E. Elliot. (1980). Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 30:485–495. 26. Quesada, E., V. Bejar, M. J. Valderrama, and A. Ramos-Cormenzana. (1987). Growth characteristics and salt requirement of Deleya halophila in a defined medium. Curr. Microbiol. 16:21–25. 27. Khodaiyan, F., Razavi, S. H., Mousavi, S. M., (2008). Optimization of canthaxanthin production by Dietzia natronolimnaea HS-1 from cheese whey using statistical experimental methods. Biochem. Eng. J. 2008, 40, 415–422. 28. Khodaiyan, F.,Razavi, S. H., Emam-Djomeh,Z., Mousavi, S.M.A. et al., (2007). Effect of culture conditions on canthaxanthin production by Dietzia natronolimnaea HS-1. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17, 195–201. 29. Nasri Nasrabadi, M. R., Razavi, S. H., (2010). High levels lycopene accumulation by Dietzia natronolimnaea HS-1using lycopene cyclase inhibitors in a fed-batch process. Food Sci. Biotechnol.2010, 19, 899–906. 30. Liu, B., Lee, Y. (2000). Secondary carotenoids formation by the green alga Chlorococcum sp.. Journal of Applied Phycology 12, 301–307 (2000). https://doi.org/10.1023/A:1008185212724. 31. Kim, D.-Y., Vijayan, D., Praveenkumar, R., Han, J.-I., Lee, K., Park, J.-Y., Chang, W.-S., Lee, J.-S., Oh, Y.-K., (2015). Cell-wall disruption and lipid/astaxanthin extraction from microalgae: Chlorella and Haematococcus. Bioresour. Technol. 199, 300–310. 32. Chan, M.M.C., Ho, S.S.H., Lee, D.D.J., Chen, C.C.Y., Huang, C.C., Chang, J.S., (2013). Characterization, extraction and purification of lutein produced by an indigenous microalga Scenedesmus obliquus CNW-N. Biochem. Eng. J. 78, 24–31. 33. Taucher, J., Baer, S., Schwerna, P., Hofmann, D., Hümmer, M., Buchholz, R., Becker, A., (2016). Cell Disruption and Pressurized Liquid Extraction of Carotenoids from Microalgae. Thermodyn. Catal. 7, 1–7. 34. Hu, Y.-R., Wang, F., Wang, S.-K., Liu, C.-Z., Guo, C., (2013). Efficient harvesting of marine microalgae Nannochloropsis maritima using magnetic nanoparticles. Bioresour. Technol. 138, 387–390. 35. Utomo, R.P., Chang, Y.-R., Lee, D.-J., Chang, J.-S., (2013). Lutein recovery from Chlorella sp. ESP-6 with coagulants. Bioresour. Technol. 139, 176-180. 36. Lee, S.-H., Qian, Z.-J., Kim, S.-K., (2010). A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats. Food Chem. 118, 96–102. 37. Li, Y., Fabiano-Tixier, A. S., Tomao, V., Cravotto, G., & Chemat, F. (2013). Green ultrasound-assisted extraction of carotenoids based on the bio-refinery 126 concept using sunflower oil as an alternative solvent. Ultrasonics Sonochemistry, 20(1), 12–18. https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2012.07.005. 38. Irna, C., Jaswir, I., Othman, R., & Jimat, D. N. (2018). Comparison between highpressure processing and chemical extraction: Astaxanthin yield from six species of shrimp carapace. Journal of Dietary Supplements, 15(6), 805–813. https://doi.org/ 10.1080/19390211.2017.1387885. 39. Hiranvarachat, B., & Devahastin, S. (2014). Enhancement of microwave- assisted extraction via intermittent radiation: Extraction of carotenoids from carrot peels. Journal of Food Engineering, 126, 17–26. https://doi.org/10.1016/j. jfoodeng.2013.10.024. 40. Sahena, F., Zaidul, I. S. M., Jinap, S., Karim, A. A., Abbas, K. A., Norulaini, N. A. N., et al. (2009). Application of supercritical CO2 in lipid extraction - a review. Journal of Food Engineering, 95(2), 240–253. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2009.06.026 41. Deenu, A., Naruenartwongsakul, S., Kim, S.M., (2013). Optimization and economic evaluation of ultrasound extraction of lutein from Chlorella vulgaris. Biotechnol. Bioprocess Eng. 18, 1151–1162. 42. Kadam, S.U., Tiwari, B.K., O’Donnell, C.P., (2013). Application of novel extraction technologies for bioactives from marine algae. J. Agric. Food Chem. 61, 4667–4675. 43. Halim, R., Danquah, M.K., Webley, P. a., (2012a). Extraction of oil from microalgae for biodiesel production: A review. Biotechnol. Adv. 30, 709–732. 44. Park, J.-Y., Park, M.S., Lee, Y.-C., Yang, J.-W., (2015). Advances in direct transesterification of algal oils from wet biomass. Bioresour. Technol. 184, 267–275. 45. J. Mason, T., Chemat, F., & Vinatoru, M. (2011). The extraction of natural products using ultrasound or microwaves. Current Organic Chemistry, 15(2), 237–247. https://doi. org/10.2174/138527211793979871. 46. Pico, Y. (2013). Ultrasound-assisted extraction for food and environmental samples. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 43, 84–99. https://doi.org/10.1016/j. trac.2012.12.005. 47. T.J. Mason, J.P. Lorimer (Eds.). (2002). Applied Sonochemistry: Uses of Power Ultrasound in Chemistry and Processing. Wiley-VCH Verlag, Germany (2002), pp. 25-74. 48. M. Toma, M. Vinatoru, L. Paniwnyk, T.J. Mason. (2001). Investigation of the effects of ultrasound on vegetal tissues during solvent extraction. Ultrason. Sonochem., 8 (2001), pp. 137-142 49. C.J. Martin, A.N.R. Law. (1983). Design of thermistor probes for measurement of ultrasound intensity distributions. Ultrasonics, 21 (1983), pp. 85-90. 127 50. X. Wei, M. Chen, J. Xiao, Y. Liu, L. Yu, H. Zhang, Y. Wang. (2010). Composition and bioactivity of tea flower polysaccharides obtained by different methods. Carbohydr. Polym., 79 (2010), pp. 418-422. 51. H.M. Santos, C. Lodeiro, J.-L. Capelo-Martínez. (2009). The power of ultrasound. J.- Capelo-Martínez (Ed.), Ultrasound in Chemistry: Analytical Applications, Wiley-VCH Verlag, Germany (2009), pp. 1-16 52. H. Li, L. Pordesimo, J. Weiss. (2004). High intensity ultrasound-assisted extraction of oil from soybeans. Food Res. Int., 37 (2004), pp. 731-738. 53. W. Wang, X. Ma, Y. Xu, Y. Cao, Z. Jiang, T. Ding, X. Ye, D. Liu. (2015). Ultrasound-assisted heating extraction of pectin from grapefruit peel: optimization and comparison with the conventional method. Food Chem., 178 (2015), pp. 106-114. 54. J.P. Lorimer, T.J. Mason’ (1987). Sonochemistry. Part 1-The physical aspects. Chem. Soc. Rev., 16 (1987), pp. 239-274. 55. Y. Sun, D. Liu, J. Chen, X. Ye, D. Yu. (2011). Effects of different factors of ultrasound treatment on the extraction yield of the all-trans-β-carotene from citrus peels. Ultrason. Sonochem., 18 (2011), pp. 243-249 56. M.D. Esclapez, V. Sáez, D. Milán-Yáñez, I. Tudela, O. Louisnard, J. González- García. (2010). Sonoelectrochemical treatment of water polluted with trichloroacetic acid: from sonovoltammetry to pre-pilot plant scale. Ultrason. Sonochem., 17 (2010), pp. 1010-1020 57. G. Cravotto, L. Boffa, S. Mantegna, P. Perego, M. Avogadro, P. Cintas. (2008). Improved extraction of vegetable oils under high-intensity ultrasound and/or microwaves. Ultrason. Sonochem., 15 (2008), pp. 898-902 58. D.J. Flannigan, K.S. Suslick. (2010). Inertially confined plasma in an imploding bubble. Nat. Phys., 6 (2010), pp. 598-601 59. M. Sališová, Š. Toma, T.J. Mason. (1997). Comparison of conventional and ultrasonically assisted extractions of pharmaceutically active compounds from Salvia officinalis. Ultrason. Sonochem., 4 (1997), pp. 131-134. 60. Z.-S. Zhang, L.-J. Wang, D. Li, S.-S. Jiao, X.D. Chen, Z.-H. Mao. (2008). Ultrasound-assisted extraction of oil from flaxseed. Sep. Purif. Technol., 62 (2008), pp. 192-198 61. Q.-A. Zhang, Z.-Q. Zhang, X.-F. Yue, X.-H. Fan, T. Li, S.-F. Chen. (2009). Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction from autoclaved almond powder. Food Chem., 116 (2009), pp. 513-518. 62. Bangham, A. D.; Horne, R. W.; Glauert, A. M.; Dingle, J. T.; Lucy, J. A. (1962). "Action of saponin on biological cell membranes". Nature. 196 (4858): 952.955. Bibcode:1962 Natur.196..952B. doi:10.1038/196952a0. PMID 13966357. S2CID 4181517. 128 63. Bangham A.D.; Standish M.M.; Weissmann G. (1965). "The action of steroids and streptolysin S on the permeability of phospholipid structures to cations". J. Molecular Biol. 13 (1): 253–259. doi:10.1016/s0022-2836(65)80094- 8. PMID 5859040. 64. Sessa G.; Weissmann G. (1970). "Incorporation of lysozyme into liposomes: A model for structure-linked latency". J. Biol. Chem. 245 (13): 3295– 3301. doi:10.1016/S0021-9258(18)62994-1. PMID 5459633. 65. YashRoy R.C. (1990). "Lamellar dispersion and phase separation of chloroplast membrane lipids by negative staining electron microscopy" (PDF). Journal of Biosciences. 15 (2): 93–98. doi:10.1007/bf02703373. S2CID 39712301. 66. Geoff Watts (2010-06-12). "Alec Douglas Bangham". The Lancet. 375 (9731): 2070. doi:10.1016/S0140-6736(10)60950-6. S2CID 54382511. Retrieved 2014- 10-01. 67. Kimball's Biology Pages, Archived 2009-01-25 at the Wayback Machine "Cell Membranes." 68. Jump up to:a b c Cevc, G (1993). "Rational design of new product candidates: the next generation of highly deformable bilayer vesicles for noninvasive, targeted therapy". Journal of Controlled Release. 160(2): 135– 146. doi:10.1016/j.jconrel.2012.01.005. PMID 22266051. 69. Torchilin, V (2006). "Multifunctional nanocarriers". Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (14): 1532–55. doi:10.1016/j.addr.2006.09.009. PMID 17092599. 70. Jump up to:a b Barenholz, Y; G, Cevc (2000). Physical chemistry of biological surfaces, Chapter 7: Structure and properties of membranes. New York: Marcel Dekker. pp. 171–241. 71. Gomezhens, A; Fernandezromero, J (2006). "Analytical methods for the control of liposomal delivery systems". TrAC Trends in Analytical Chemistry. 25 (2): 167–178. doi:10.1016/j.trac.2005.07.006. 72. Bertrand, Nicolas; Bouvet, CéLine; Moreau, Pierre; Leroux, Jean-Christophe (2010). "Transmembrane pH-Gradient Liposomes to Treat Cardiovascular Drug Intoxication". ACS Nano. 4 (12): 7552– 8. doi:10.1021/nn101924a. PMID 21067150. 73. 62. doi:10.1080/08982100802354665. PMID 18770074. S2CID 137500401. 74. Meure, LA; Knott, R; Foster, NR; Dehghani, F (2009). "The depressurization of an expanded solution into aqueous media for the bulk production of liposomes". Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 25 (1): 326– 37. doi:10.1021/la802511a. PMID 19072018. 75. Dogra, N; Choudhary, R; Kohli, P; Haddock, JD; Makwana, S; Horev, B; Vinokur, Y; Droby, S; Rodov, V (11 March 2015). "Polydiacetylene nanovesicles as carriers of natural phenylpropanoids for creating antimicrobial 129 food-contact surfaces". Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (9): 2557–65. doi:10.1021/jf505442w. PMID 25697369 76. Yoko Shojia; Hideki Nakashima (2004). "Nutraceutics and Delivery Systems". Journal of Drug Targeting. 77. Williamson, G; Manach, C (2005). "Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. II. Review of 93 intervention studies". The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (1 Suppl): 243S– 255S. doi:10.1093/ajcn/81.1.243S. PMID 15640487. 78. Bender, David A. (2003). Nutritional Biochemistry of Vitamins. Cambridge, U.K. 79. 27. doi:10.1080/08982100802465941. PMID 18951288. S2CID 98836972. Jump up to:a b Stryer S. (1981) Biochemistry, 213 80. López, Rubén R.; Ocampo, Ixchel; Sánchez, Luz-María; Alazzam, Anas; Bergeron, Karl-F.; Camacho-León, Sergio; Mounier, Catherine; Stiharu, Ion; Nerguizian, Vahé (2020-02-25). "Surface Response Based Modeling of Liposome Characteristics in a Periodic Disturbance Mixer". Micromachines. 11 (3): 235. doi:10.3390/mi11030235. ISSN 2072- 666X. PMC 7143066. PMID 32106424. 81. Tokuda, M.; Takeuchi, M. (1995). Effects of Excess Doses of a-Tocopherol on the Lipids and Function of Rainbow Trout Liver. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, J Nutr Sci Vitaminol 1995, 41, 25–32, doi:10.3177/jnsv.41.25. 82. Box, G.E.P.; Wilson, K.B. (1951). "On the Experimental Attainment of Optimum Conditions". Journal of the Royal Statistical Society, Series B. 13 (1): 1–45. doi:10.1111/j.2517-6161.1951.tb00067.x. 83. George E. P (2006). Box Almost Anything: Improving Ideas and Essays, Revised Edition (Wiley Series in Probability and Statistics) 84. Nguyễn Minh Tuyển (2005), Quy hoạch thực nghiệm. Nhà Xuất Bản Khoa học và Kỹ thuật. 85. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi. (2007). Xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm trong nghiên cứu Hóa học. Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2007 86. Segdwick S.D (1995). Trout farming handbook 4th edition. Fishing News Books Ltd., Farnham. 160p. 87. Gibson, R.J. & Haedrich, R.L. (1988). The exceptional growth of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) in the city waters of St. John’s, Newfoundland, Canada. Polish Archives of Hydrobiology, 35, 385– 407 88. Bromage N. R. & C. J. Shepherd (1990). Fish, their requirements and site evaluation. In: Shepherd, C. J. & Bromage, N.R. (eds), Intensive Fish Farming. BSP Professional Books, Oxford. 17-49 130 89. Hardy, R.W., Fornshell, G.C.G. & Brannon, E.L. (2000). Rainbow trout culture. In: R. Stickney (ed.) Fish Culture, pp. 716-722. John Wiley & Sons, New York, USA. 90. Hinshaw, J. M. (1999). Trout production: feeds and feeding methods. Southern Regional Aquaculture Center. 91. Satia, B. P. (1974). Quantitative protein requirements of rainbow trout. Progr. Fish. Cult. 36: 80-85 92. Steffens, W. (1989). Protein digestion. In: Principle of fish nutrition. Ellis Harwood, Chichester, pp. 47-51. 93. Austreng E. (1978) Digestibility determination in fish using chromic oxide marking and analysis of contents from different segments of the gastro- intestinal tract. Aquaculture 13, 265-272 94. Tacon A. G. J, J. V. Haastler, P. B. Featherstone, K. Kerr & Jackson A. J. (1983). Studies on the utilization of full fat soybean and solvent extracted soybean in a complete diet for rainbow trout, Bull Jpn. Sot. Sci. Fish. 49: 1437- 1443.’ 95. McLaren, B.A., Keller, E., O'Donnell, D.J. and Elvehjem, C.A., (1947). The nutrition of rainbow trout. I. Studies of vitamin requirements. Archives of Biochemistry and 178.Biophysics, 15, 169 96. Halver J.E. (2002) The vitamins. In: Fish Nutrition, 3rd edn (ed. by J.E. Halver & R.W. Hardy), pp. 61–141. Academic Press, San Diego, CA. 97. Nguyễn Việt Nam. (2012). Hiện Trạng và tiềm năng phát triển cá nước lạnh Việt Nam. Báo cáo tham luận tại Hội Thảo phát triển nuôi trồng thủy sản nước lạnh Việt Nam. 20/2012. 98. Đinh Văn Trung. (2009). Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi thương phẩm cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) và cá tầm (Acippenser baeri)”. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1. 99. Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Tiến Hóa. (2013). "Ảnh hưởng của thức ăn có bổ sung astaxanthin và canthaxanthin với tỷ lệ khác nha đến màu sắc thịt cá hồi vân" (Oncorhynchus mykiss). Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 100. Trình Mai Duy Lưu, Lê Hồng Phúc, Kiều Phương Nam, Ngô Đại Nghiệp. (2010). "Sàng lọc và nghiên cứu các chủng có khả năng tổng hợp canthaxanthin". Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8 (3B): 1601- 1608, 2010. 101. E Li, R Mira de Orduña. (2010). A rapid method for the determination of microbial biomass by dry weight using a moisture analyser with an infrared heating source and an analytical balance. Letters in applied microbiology 131 102. Dan Qiu & Wen-Li Zhu & Cheng-Ke Tang & Li-Fang Shi & Hao-Qi Gao. (2013). Identification of the Composition of Isomeric Canthaxanthin Sample by NMR, HPLC, and Mass Spectrometry. Food Anal. Methods. 103. Martin G. L., Skovlund B., Michael E.N, Bjarne K.E., Line H.C., Stina F. (2012). Classication of Astaxanthin Colouration of Salmonid Fish using Spectral Imaging and Tricolour Measurement. IMM-Technical Report-2012-08 104. Cyplik, P., et al. (2007). Effect of macro/micro nutrients and source over the denitrification rate of Haloferax denitrificans archaeon. Enzyme and Microbial Technology, 2007. 40(2): p. 212-220. 105. Calegari-Santos, R., et al. (2016+). Carotenoid Production by Halophilic Archaea Under Different Culture Conditions. Curr Microbiol, 2016. 72(5): p. 641-51. 106. Bae, S. and M. Shoda. (2004). Bacterial cellulose production by fed- batch fermentation in molasses medium. Biotechnol Prog, 2004. 20(5): p. 1366- 71. 107. Zhang, H. (2017). Thin-Film Hydration Followed by Extrusion Method for Liposome Preparation. In Liposomes: Methods and Protocols; D’Souza, G.G.M., Ed.; Methods in Molecular Biology; Springer: New York, NY, 2017; pp. 17–22 ISBN 9781493965915. 108. Fraser, P.D., Miura, Y., Misawa, N. (1997). In vitro characterization of astaxanthin biosynthetic enzymes. J. Biol. Chem. 272, 6128-6135. 109. Misawa, N. (2011). Carotenoid β-ring hydroxylase and ketolase from marine bacteria-promiscuous enzymes for synthesizing functional xanthophylls. Marine drugs, 2011. 9(5): p. 757-771. 110. Martín, J.F., E. Gudiña, and J.L. Barredo. (2008). Conversion of β- carotene into astaxanthin: Two separate enzymes or a bifunctional hydroxylase- ketolase protein. Microbial Cell Factories, 2008. 7(1): p. 3. 111. Onukwufor, J.O.; Wood, C.M. (2018). The osmorespiratory compromise in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): The effects of fish size, hypoxia, temperature and strenuous exercise on gill diffusive water fluxes and sodium net loss rates. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 2018, 219–220, 10–18, doi: 10.1016/j.cbpa.2018.02.002. 112. Murphy, P.; Houston, A.H. (1977). Temperature, photoperiod, and water–electrolyte balance in rainbow trout, Salmo gairdneri. Can. J. Zool. 1977, 55, 1377–1388, doi: 10.1139/z77-180.