Qua thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án, chúng tôi đã đạt được những kết
quả sau:
1. Đã tổng hợp các chất mang dendrimer PAMAM đến thế hệ G3.0 từ lõi
ethylendiamin và mạch nhánh là methyl acrylat có khối lượng phân tử 6.962,5 g/ml bằng
phương pháp GPC so với khối lượng lý thuyết của G3.0 là 6.908,9 g/mol, với độ lệch là
0,78 %. Cấu trúc của sản phẩm được chứng minh bằng phương pháp FTIR, MS, 1HNMR, GPC và tính toán khối lượng phân tử trên cơ sở dữ liệu của phổ 1H-NMR, hình
thái và kích thước bằng TEM và DLS
2. Đã biến tính thành công dendrimer G3.0 với PEG 5.000 và pluronic F127 12.600
Da. Cấu trúc sản phẩm được chứng minh bằng FTIR, 1H-NMR, GPC
3. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp theo ICH (Hội nghị quốc tế về hài hòa
hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người) xác định các hoạt chất AZT,
3TC, TDF và RTV đơn và xác định đồng thời AZT,3TC; TDF, RTV bằng phương pháp
HPLC - PDA
4. Đã dẫn truyền thành công các hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV lên hệ
G3.0@mPEG tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@mPEG với khả năng dẫn
truyền thấp nhất là AZT (7,18 %), cao nhất RTV (13,86 %). Với hệ ARV@G3.0@F127
với khả năng dẫn truyền thấp nhất là AZT (7,36 %), cao nhất ARV (14,78 %). Sản phẩm
của hệ dẫn truyền đơn được kiểm tra bằng phổ FTIR và kích thước bằng DLS. Với hệ
dẫn truyền thuốc phối hợp, khả năng dẫn truyền của AZT, 3TC, TDF và RTV lần lượt
là 4,17 %, 4,20 %, 7,39 % và 9,96 % thấp hơn dẫn truyền đơn. Tuy nhiên, tổng lượng
thuốc được dẫn truyền cao hơn dẫn truyền đơn.
Sử dụng hệ G3.0@F127 dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV hiệu quả
hơn hệ G3.0@mPEG đặc biệt với các chất ít tan như TDF, RTV
169 trang |
Chia sẻ: huydang97 | Ngày: 27/12/2022 | Lượt xem: 519 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ Nano Dendrimer Polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
0,82 87,37 89,81
Bảng 3.34. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF-
RTV@G3.0@mPEG
Thời gian
–giờ
pH 1,2 (%) pH 4,5 (%) pH 6,8 (%) pH 7,4 (%)
TDF RTV TDF RTV TDF RTV TDF RTV
1 24,56 23,03 20,22 22,71 21,39 21,08 19,63 17,38
3 34,09 30,70 29,50 30,12 29,48 27,73 28,33 26,59
5 40,72 39,27 38,05 37,54 36,90 34,07 34,53 35,59
7 49,13 47,07 46,22 45,77 45,83 47,81 40,43 42,25
9 59,52 58,09 56,75 54,23 55,49 52,36 46,59 50,39
11 66,97 69,43 64,83 67,88 65,90 65,48 55,07 55,81
13 78,07 76,87 77,74 77,82 71,47 69,82 68,90 64,51
95
15 93,64 87,86 88,06 86,46 82,01 79,65 81,93 72,46
17 - - - - 90,54 86,53 85,77 79,92
19 - - - - - - - 86,47
Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn % AZT (I), % 3TC (J), % TDF (K) và % RTV (L) giải
phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ARV@G3.0@PEG
Bảng 3.35. Kết quả giải phóng AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT,
3TC@G3.0@F127
Thời gian
–giờ
pH 1,2 (%) pH 4,5 (%) pH 6,8 (%) pH 7,4 (%)
AZT 3TC AZT 3TC AZT 3TC AZT 3TC
1 23,87 26,06 24,86 25,36 22,24 23,61 22,04 23,61
3 33,06 35,52 31,98 34,71 31,95 34,67 32,64 34,67
5 41,67 43,82 43,13 44,78 39,53 41,30 35,72 41,30
7 54,32 59,03 52,22 55,05 52,35 51,64 51,24 51,64
9 65,45 69,72 63,70 69,21 62,80 59,66 60,08 59,66
11 74,63 78,57 72,77 77,85 67,52 68,29 69,92 68,29
13 90,17 95,66 89,23 91,72 77,90 77,74 76,29 77,74
15 - - - - 87,85 89,76 85,34 89,76
96
Bảng 3.36. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF,
RTV@G3.0@F127
Thời gian
–giờ
pH 1,2 (%) pH 4,5 (%) pH 6,8 (%) pH 7,4 (%)
TDF RTV TDF RTV TDF RTV TDF RTV
1 21,33 19,30 20,71 18,40 19,18 17,77 19,55 18,08
3 30,01 27,08 26,59 26,69 27,36 26,56 25,76 28,34
5 37,69 36,09 36,96 29,56 32,49 34,27 37,08 36,08
7 44,68 43,21 44,87 37,01 40,48 41,77 42,64 40,76
9 59,20 55,98 54,19 44,85 51,38 50,72 52,20 47,15
11 68,30 66,44 61,61 55,44 61,04 58,56 58,01 53,72
13 75,76 72,89 71,72 64,04 66,28 64,69 64,44 57,28
15 83,08 80,43 76,27 72,43 78,00 72,04 73,18 66,88
17 89,91 87,36 82,12 82,35 84,81 79,64 82,16 72,04
19 - - 90,87 87,27 92,05 84,07 90,67 80,55
21 - - - - - 88,95 - 86,04
Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn % AZT (M), % 3TC (N), % TDF (O) và % RTV (P) giải
phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp ARV@G3.0@F127
Từ kết quả Bảng 3.33 đến Bảng 3.36, Hình 3.25, Hình 3.26 cho thấy:
97
Môi trường pH 1,2 và pH 4,5:
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích hoạt
chất khá đồng đều: môi trường pH 1,2 đạt 97,37 % (AZT) và 99,84 % (3TC) sau 13 giờ;
môi trường pH 4,5 đạt 90,15 % (AZT) và 92,66 % (3TC) sau 13 giờ, điều này được giải
thích có thể do cả hai thuốc đều là thuốc dễ tan trong nước.
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@F127 có tốc độ phóng thích hoạt
chất tương tự hệ dẫn truyền thuốc AZT, 3TC@G3.0@mPEG: môi trường pH 1,2 đạt
97,37 % (AZT) và 99,84 % (3TC); môi trường pH 4,5 đạt 90,17 % (AZT) và 95,66 %
(3TC) sau 13 giờ.
Không có sự khác biệt giữa 2 hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT,
3TC@G3.0@mPEG và AZT, 3TC@G3.0@F127 do đều có tương tác ưa nước của hoạt
chất AZT và 3TC (cả hai hoạt chất này đều tan tốt trong môi trường nước) với nhóm -
NH-, -OH, của phân tử polyme [98] của hệ dẫn truyền.
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích
hoạt chất chậm thơn so với hệ AZT, 3TC@G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 1,2 đạt
93,64 % (TDF) và 87,86 % (RTV) sau 15 giờ; môi trường pH 4,5 đạt 88,06 % (TDF) và
86,46 % (RTV) sau 15 giờ điều này được giải thích do thuốc TDF và RTV xếp nhóm ít
tan (TDF) và gần như không tan (RTV).
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@F127 có tốc độ phóng thích hoạt
chất chậm thơn so với hệ TDF, RTV@G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 1,2 đạt
89,91 % (TDF) và 87,36 % (RTV) sau 17 giờ; điều này được giải thích do thuốc TDF
và RTV thuộc nhóm ít tan (TDF) và gần như không tan (RTV) nên sẽ có các tương tác
kỵ nước trong cấu trúc của phân tử F127 với thuốc [106], kết quả thuốc được giữ chặt
hơn nên tốc độ phóng thích chậm hơn.
Môi trường pH 6,8 và pH 7,4
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích
hoạt chất khá đồng đều: môi trường pH 6,8 đạt 88,21 % (AZT) và 90,82 % (3TC) sau
15 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 87,37 % (AZT) và 89,81 % (3TC) sau 15 giờ, so với môi
trường pH 1,2 và pH 4,5 thì tốc độ phóng thích của AZT và 3TC chậm hơn 2 giờ.
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích
hoạt chất chậm thơn so với hệ AZT, 3TC@G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 6,8 đạt
90,54 % (TDF) và 86,53 % (RTV) sau 17 giờ.
98
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, 3TC@G3.0@F127: môi trường pH 6,8 đạt
87,85 % (AZT) và 89,76 % (3TC) sau 15 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 85,34 % (AZT) và
89,76 % (3TC) sau 15 giờ, so với môi trường pH 1,2 và pH 4,5 thì tốc độ phóng thích
của AZT và 3TC chậm hơn 2 giờ.
Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@F127 có tốc độ phóng thích
hoạt chất chậm thơn so với hệ TDF, RTV@ G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 6,8
đạt 90,05 % (TDF) sau 19 giờ và 88,95 % (RTV) sau 21 giờ; môi trường pH 7,4 đạt
90,67 % (TDF) sau 19 giờ và 86,04 % (RTV) sau 21 giờ.
So với kết quả phóng thích hoạt chất trong hệ dẫn truyền đơn Bảng 3.37. cho
thấy:
Môi trường pH 1,2 và pH 4,5 của hệ dẫn truyền đơn AZT@G3.0@mPEG,
3TC@G3.0@mPEG, AZT@G3.0@F127, 3TC@G3.0@F127 và hệ dẫn truyền kết hợp
AZT, 3TC@G3.0@mPEG là tương đương nhau, phóng thích ≥ 85,0 % hoạt chất sau 13
giờ và ở môi trường pH 6,8 và pH 7,4 là 15 giờ. Tương tự cho hệ TDF@G3.0@mPEG,
RTV@G3.0@mPEG, TDF,RTV@G3.0@mPEG sau 15 giờ phóng thích ≥ 85,0 % ở pH
1,2 và pH 4,5 và 17 giờ TDF, RTV@G3.0@F127 so với hệ dẫn truyền đơn
RTV@G3.0@F127 ở pH 1,2 và pH 4,5 lần lượt là 19 giờ và 21 giờ, kết quả cho thấy
tốc độ phóng thích của TDF ít thay đổi trong hệ đơn và hệ phối hợp. Tuy nhiên, với
RTV phóng thích nhanh hơn trong hệ kết hợp với TDF, do có sự hiện diện của TDF kéo
theo RTV (thuốc kém tan hơn) phóng thích nhanh hơn [107] so với khi chỉ có RTV
trong hệ dẫn truyền đơn.
Kết quả này lặp lại tương tự với hệ kết hợp TDF, RTV@G3.0@F127 so với hệ dẫn
truyền đơn TDF@G3.0@F127 và RTV@G3.0@F127 ở pH 6,8 và pH 7,4. Cụ thể pH
7,4 hệ TDF@G3.0@F127 là 21 giờ; hệ RTV@G3.0@F127 là 25 giờ; hệ TDF,
RTV@G3.0@F127 là 19 giờ (TDF) và 21 giờ (RTV).
Bảng 3.37. Thời gian phóng thích ARV hệ dẫn truyền đơn và hệ dẫn truyền kết hợp
Hệ dẫn truyền Thời gian (giờ) phóng thích ≥ 85,0 % hoạt chất
pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8 pH 7,4
AZT@G3.0@mPEG .13 13 15 15
3TC@G3.0@mPEG 13 13 15 15
TDF@G3.0@mPEG 15 15 17 17
RTV@G3.0@mPEG 15 15 19 21
99
AZT@G3.0@F127 13 13 15 17
3TC@G3.0@F127 13 13 15 17
TDF@G3.0@F127 17 19 19 21
RTV@G3.0@F127 19 21 23 25
AZT, 3TC@G3.0@mPEG 13 13 15 15
TDF, RTV@G3.0@mPEG 15 15 17 17-TDF
19-RTV
AZT, 3TC@G3.0@F127 13 13 15 17
TDF, RTV@G3.0@F127 17 17 19-TDF
21-RTV
19-TDF
21-RTV
3.6. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
3.6.1. Kết quả thử độc tính tế bào
Bảng 3.38. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên hệ G3.0, G3.0@mPEG và G3.0@F127
Nồng độ
ppm
Tỷ lệ tế bào sống (%)
G3.0 G3.0@F127 G3.0@mPEG
0 101,20 ± 3,24 105,80 ± 2,60 98,00 ± 2,32
5 94,70 ± 1,64 - -
25 82,30 ± 1,64 - -
50 70,60 ± 2,22 101,60 ± 3,37 97,60 ± 0,85
100 48,30 ± 5,5 96,40 ± 2,73 99,30 ± 0,06
200 39,90 ± 2,63 95,80 ± 0,66 97,40 ± 0,93
400 26,10 ± 1,31 86,50 ± 2,05 90,90 ± 0,97
800 6,60 ± 4,66 81,10 ± 1,04 86,50 ± 0,94
100
G3.0
G3.0@mPEG
G3.0@F127
Hình 3.27. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên dendrimer G3.0, G3.0@mPEG và
G3.0@F127
Bảng 3.39. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên các hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp
Nồng độ
ppm
Tỷ lệ tế bào sống (%)
3TC@G3.0
@mPEG
RTV@G3.0@F
127
TDF@G3.0@
F127
TDF-
RTV@G3.0@
F127
3TC@G3.0@
mPEG
0 99,70 ± 2,38 103,30 ± 3,12 102,9 ± 3,17 98,80 ± 4,73 102,40 ± 2,29
50 99,70 ± 1,99 102,70 ± 2,88 102,10 ± 2,98 102,60 ± 2,37 102,80 ± 4,47
100 102,40 ± 0,14 101,50 ± 2,75 97,60 ± 1,30 100,20 ± 4,42 101,90 ± 2,50
200 93,80 ± 1,34 85,10 ± 1,41 93,30 ± 0,86 94,00 ± 1,41 95,30 ± 0,82
400 91,10 ± 0,99 76,10 ± 0,63 87,60 ± 0,58 85,90 ± 0,42 91,10 ± 1,15
800 87,40 ± 1,33 70,90 ± 0,86 79,60 ± 0,97 80,40 ± 1,30 84,10 ± 1,17
101
3TC@G3.0@mPEG
RTV@G3.0@F127
DF-RTV@G3.0@F127
AZT@G3.0@F127
TDF@G3.0@F127
Hình 3.28. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết
hợp ARV@G3.0@F127, ARV@G3.0@mPEG
Hình 3.299. Biểu đồ cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp
Từ kết quả Tỷ lệ tế bào sống Bảng 3.38, Bảng 3.39 cho thấy:
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 200 400 800
Tế
b
ào
s
ố
n
g
(%
)
Nồng độ (ppm)
3TC@G3.0 @mPEG RTV@G3.0@F127 TDF@G3.0@F127
TDF-RTV@G3.0@F127 3TC@G3.0@mPEG
102
Tỷ lệ sống sót của tế bào giảm từ 101 % xuống 6,6 %, khi nồng độ G3.0 trong môi
trường nuôi cấy tăng từ 0 đến 800 ppm. Sau khi biến tính bề mặt G3.0 với F127 hoặc
PEG, tỷ lệ sống của nguyên bào sợi được cải thiện đáng kể. Ở nồng độ 800 ppm (nồng
độ cao nhất trong thử nghiệm), trên 80 % nguyên bào sợi sống sót so sánh với mẫu
chứng. Theo ISO 10993-5:1999 hay tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam TCVN 7391-5:2005
về tính an toàn của vật liệu trong y tế, có thể kết luận vật liệu G30@F127 và
G3.0@mPEG có tính tương hợp sinh học cao, và vật liệu có tiềm năng ứng dụng trong
lĩnh vực dược phẩm.
Đối với các mẫu được dẫn truyền hóa thuốc, ở nồng độ thử nghiệm dưới 200 ppm,
phần trăm nguyên bào sợi sống sót đều trên 80 %. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ, sức sống
của nguyên bào sợi giảm dần. Đặc biệt với mẫu mang thuốc RTV, tỷ lệ sống của tế bào
giảm còn 70 % ở nồng độ 800 ppm. Dựa trên kết quả khảo sát độc tính chất mang, có
thể kết luận nguyên nhân gây chết tế bào là do thuốc mang trong hệ.
Từ kết quả về cảm ứng chết của tế bào Hình 3.27 và Hình 3.28 nhận thấy:
Dựa trên kết quả về độc tính, để kiểm tra tính an toàn của sản phẩm sau dẫn truyền
hóa thuốc ARV đơn và ARV phối hợp, phương pháp nhuộm kép AO/PI được sử dụng.
Theo kết quả trên hình, nguyên bào sợi sau 24 giờ được ủ G3.0, chất nhuộm PI đi
vào tế bào, cường độ tín hiệu huỳnh quang mạnh, chứng tỏ tế bào đang trong quá trình
chết. Kết quả này phù hợp với kết quả MTT.
Đối với các mẫu biến tính, G3.0@mPEG và G3.0@F127, nguyên bào sợi bắt màu
xanh, cường độ của bước sóng 700 nm không ghi nhận được. Ở trường hợp sử dụng 2
bước sóng đồng thời 525 nm/700 nm, tín hiệu huỳnh quang ở 525 nm (màu xanh) át
hoàn toàn, chứng tỏ tế bào sống và khỏe mạnh trong điều kiện môi trường nuôi cấy có
bổ sung G3.0@mPEG hoặc G3.0@F127. Nói cách khác, độc tính của G3.0 được loại
bỏ sau khi biến tính bề mặt.
Bên cạnh đó, đánh giá về độc tính của hệ chất mang thuốc: Tất cả các mẫu nguyên
bào khi ủ với mẫu mang thuốc, nguyên bào sợi phát triển theo đúng hình thái học của
chúng, không có sự biến đổi về nhân. Thêm vào đó, mật độ tế bào bắt huỳnh quang của
AO trội hơn hẳn so với PI, do đó có thể kết luận, các thuốc được mang trong hệ
G3.0@PEG và G3.0@F127 không gây ảnh hưởng đến tế bào lành.
3.6.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế pepsin
Bảng 3.40. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV chuẩn đối với pepsin
103
AZT 3TC TDF RTV
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00
0,0377 92,95
± 0,20
0,0439 96,10
± 0,16
0,0159 99,80
± 0,87
0,0141 85,61
± 0,35
0,0754 88,15
± 0,07
0,0878 95,71
± 0,04
0,0318 98,54
± 0,15
0,0282 78,50
± 0,91
0,1130 82,96
± 0,38
0,1318 95,75
± 0,10
0,0477 98,90
± 0,17
0,0423 65,32
± 0,96
0,1507 75,48
± 0,06
0,1757 95,77
± 0,22
0,0636 97,66
± 0,05
0,0564 53,11
± 1,29
0,1884 68,76
± 0,43
0,2196 98,61
± 0,20
0,0795 99,70
± 0,49
0,0705 41,60
± 0,57
0,2261 63,68
± 0,05
0,2635 99,01
± 0,04
0,0954 98,66
± 0,08
0,0845 28,49
± 0,50
0,2638 60,91
±0,20
- - - - - -
0,3014 59,55
± 0,29
- - - - - -
0,3391 58,74
± 0,18
- - - - - -
Bảng 3.41. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV@G3.0@mPEG đối với pepsin
AZT@G3.0@mPEG 3TC@G3.0@mPEG TDF@G3.0@mPEG RTV@G3.0@mPEG
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
Nồng độ
(mM)
% hoạt độ
còn lại
0 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00
0,0379 93,93
± 0,25
0,0447 98,27
± 0,11
0,0157 99,17
± 0,48
0,0139 87,14
± 1,12
0,0758 88,59
± 0,07
0,0893 99,04
± 0,25
0,0313 99,72
± 0,53
0,0277 80,15
± 1,10
0,1137 85,57
± 0,06
0,1340 98,82
± 0,02
0,0470 98,51
± 1,02
0,0416 65,86
± 0,66
0,1516 77,68
± 0,06
0,1787 97,23
± 0,67
0,0627 98,20
± 1,24
0,0555 56,28
± 0,68
0,1895 74,25 0,2233 99,37 0,0783 99,98 0,0694 44,89
104
± 0,34 ± 0,37 ± 1,48 ± 0,71
0,2274 67,23
± 0,12
0,2680 97,22
± 0,31
0,0940 98,36
± 0,75
0,0832 39,29
± 0,22
0,2653 62,65
± 0,11
- - - - - -
0,3032 61,23
± 0,08
- - - - - -
0,3411 60,42
± 0,08
- - - - - -
Hình 3.30. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế của ARV đối với pepsin
Từ kết quả thử nghiệm khả năng ức chế pepsin theo phương pháp Anson cải tiến
của các ARV nhận thấy:
- Hoạt tính ức chế pepsin giữa của các hoạt chất khi chưa dẫn truyền và sau khi
dẫn truyền là tương đương nhau, sau dẫn truyền hoạt chất vẫn giữ được hoạt tính
ức chế pepsin được thể hiện thông qua phần trăm hoạt độ còn lại là như nhau.
- AZT: AZT thuộc nhóm thuốc ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid
và nucleotid (NRTI) nhưng vẫn có hoạt tính ức chế pepsin. Ở nồng độ 0,038 mM
AZT, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 92,62 % (ức chế khoảng 7 % hoạt
105
độ của pepsin) và ở nồng độ 0,226 mM AZT phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin
là 64,06 % (ức chế 36 % hoạt độ của pepsin). Điều này cho thấy, AZT tuy thuộc
nhóm NRTI nhưng vẫn có khả năng ức chế pepsin tuy nhiên khả năng ức chế
pepsin không mạnh do đặc tính này không điển hình của nhóm NRTI
- 3TC và TDF thuộc nhóm thuốc ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid
và nucleotid (NRTI). Ở nồng độ 0,264 mM đối với 3TC và 0,233 mM đối với
TDF, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin lần lượt là 99,01 % và 98,59 %. Do
đó 3TC và TDF hoàn toàn không có hoạt tính ức chế pepsin.
- RTV thuộc nhóm thuốc ức chế men protease (PI). Ở nồng độ 0,014 mM RTV,
phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 84,95 % (ức chế khoảng 15 % hoạt độ
của pepsin), ở nồng độ 0,056 mM RTV phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là
50,95 % (ức chế khoảng 50 % hoạt độ của pepsin) và ở nồng độ 0,085 mM RTV,
phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 25,20 %. Điều này cho thấy, RTV có khả
năng ức chế pepsin mạnh hơn AZT. Kết quả nồng độ IC50 của RTV được dẫn
truyền hóa là 0,056 Mm
- Navia và cộng sự từ các phòng thí nghiệm Merck là nhóm đầu tiên có được cấu
trúc tinh thể của PR HIV [48]. Dựa trên sự hiện diện của trình tự acid amin đặc
trưng, Asp-Thr-Gly, nó được đề xuất bởi Toh et al. vào năm 1985 cho rằng
protease của HIV có thể thuộc về họ protease aspartic. Điều này đã được xác
nhận thông qua sự ức chế pepstatin A, một chất ức chế chọn lọc protease aspartic.
Vì trình tự protease của HIV không có nhiều hơn 99 acid amin và chỉ chứa một
của bộ ba bắt buộc Asp-Thr-Gly, người ta cho rằng dạng hoạt động của HIV
protease là một đồng phân tử (dạng dimer) của 198 acid amin. Giả thuyết này sau
đó đã được xác nhận bằng phương pháp xác định tinh thể học tia X [82].
- Protease của HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của virus
HIV. Nó cắt các chuỗi poly peppeptide gag, gag-pol tại những vị trí đặc hiệu để
tạo thành các protein cấu trúc và enzym cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu
protease HIV bị ức chế, các hạt virus vẫn nảy chồi từ màng tế bào, nhưng các
protein bên trong chúng không ở dạng trưởng thành và hoạt động, do đó virus
không lây nhiễm. Vì vậy, protease HIV-1 được xem như một trong các đích quan
trọng trong phát triển thuốc chống HIV thông qua khả năng ức chế enzym.
Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartat, có dạng dimer và mang những đặc
106
điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác. Các protease
HIV-1 và pepsin đều có trình tự nhận biết Asp-Thr-Gly. Nhìn chung, chúng có
cấu trúc bậc nhất tương tự nhau, đều bị ức chế bởi pepstatin A và bị bất hoạt khi
đột biến xảy ra ở vùng hoạt tính chứa Aso [108]. Do đó, pepsin có thể được dùng
như một enzym đích để sàng lọc các chất ức chế protease HIV-1[109], [110-111].
- Hệ sau dẫn truyền thuốc AZT, 3TC, TDF và RTV có hoạt tính ức chế pepsin
tương đương với hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV tinh khiết khi chưa dẫn
truyền
107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án, chúng tôi đã đạt được những kết
quả sau:
1. Đã tổng hợp các chất mang dendrimer PAMAM đến thế hệ G3.0 từ lõi
ethylendiamin và mạch nhánh là methyl acrylat có khối lượng phân tử 6.962,5 g/ml bằng
phương pháp GPC so với khối lượng lý thuyết của G3.0 là 6.908,9 g/mol, với độ lệch là
0,78 %. Cấu trúc của sản phẩm được chứng minh bằng phương pháp FTIR, MS, 1H-
NMR, GPC và tính toán khối lượng phân tử trên cơ sở dữ liệu của phổ 1H-NMR, hình
thái và kích thước bằng TEM và DLS
2. Đã biến tính thành công dendrimer G3.0 với PEG 5.000 và pluronic F127 12.600
Da. Cấu trúc sản phẩm được chứng minh bằng FTIR, 1H-NMR, GPC
3. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp theo ICH (Hội nghị quốc tế về hài hòa
hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người) xác định các hoạt chất AZT,
3TC, TDF và RTV đơn và xác định đồng thời AZT,3TC; TDF, RTV bằng phương pháp
HPLC - PDA
4. Đã dẫn truyền thành công các hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV lên hệ
G3.0@mPEG tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn ARV@G3.0@mPEG với khả năng dẫn
truyền thấp nhất là AZT (7,18 %), cao nhất RTV (13,86 %). Với hệ ARV@G3.0@F127
với khả năng dẫn truyền thấp nhất là AZT (7,36 %), cao nhất ARV (14,78 %). Sản phẩm
của hệ dẫn truyền đơn được kiểm tra bằng phổ FTIR và kích thước bằng DLS. Với hệ
dẫn truyền thuốc phối hợp, khả năng dẫn truyền của AZT, 3TC, TDF và RTV lần lượt
là 4,17 %, 4,20 %, 7,39 % và 9,96 % thấp hơn dẫn truyền đơn. Tuy nhiên, tổng lượng
thuốc được dẫn truyền cao hơn dẫn truyền đơn.
Sử dụng hệ G3.0@F127 dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV hiệu quả
hơn hệ G3.0@mPEG đặc biệt với các chất ít tan như TDF, RTV
5. Đã khảo sát khả năng giải phóng các hoạt chất của AZT, 3TC, TDF và RTV khi
được dẫn truyền đơn và dẫn truyền kết hợp. Hệ dẫn truyền đơn ARV@G3.0@mPEG
giải phóng ≥ 85,0 % thấp nhất pH 1,2 (AZT, 13 giờ), cao nhất pH 7,4 (RTV, 21 giờ).
Hệ dẫn truyền đơn ARV@G3.0@F127 giải phóng ≥ 85,0 %, thấp nhất pH 1,2 (AZT, 13
giờ), cao nhất pH 7,4 (RTV, 25 giờ). Hệ dẫn truyền kết hợp AZT, 3TC@G3.0@F127
108
thấp nhất pH 1,2 (13 giờ); cao nhất pH 7,4 (15 giờ). Hệ TDF, RTV@G3.0F127, thấp
nhất pH 1,2 (17 giờ); cao nhất sau pH 7,4 (21 giờ)
6. Đã khảo sát độc tính của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0, G3.0@mPEG và
G3.0@F127 cho thấy: G3.0 gây độc tế bào, G3.0@mPEG và G3.0@F127 độc tính
không còn. Bên cạnh đó, đánh giá về độc tính của hệ chất mang thuốc các thuốc được
mang trong hệ G3.0@PEG và G3.0@F127 không gây ảnh hưởng đến tế bào lành.
7. Đã thử hoạt tính ức chế pepsin hệ sau dẫn truyền thuốc cho thấy: AZT có khả
năng ức chế pepsin tuy nhiên khả năng ức chế pepsin không mạnh do đặc tính này không
điển hình của nhóm NRTI; 3TC hoàn toàn không có hoạt tính ức chế pepsin, RTV có
khả năng ức chế pepsin mạnh hơn AZT. Kết quả nồng độ IC50 của RTV là 0,056 Mm
KIẾN NGHỊ
Trong thời gian tới, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị sau:
Tiếp tục nghiên cứu in vivo trên hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG và
ARV@G3.0@F127 và thử độc tính tế bào với dòng tế bào đại thực bào hoặc tế bào miễn
dịch.
Nghiên cứu bào chế hạt nano kết hợp giữa lipid - polymer mang thuốc ARV (có
thể sử dụng polymer polyvinylpyrrolidon – PVP để bao thuốc RTV, bên ngoài là acid
béo stearic và poly ethylen glycol (PEG). Sản phẩm được đánh giá qua sự hấp thụ trên
tế bào thần kinh
Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học, độ ổn định của hệ dẫn truyền thuốc
ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127
109
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Vu Minh Thanh, Thi Hiep Nguyen, Tuong Vi Chan, Uyen-Thi Phan Ngoc, Minh
Nhat Ho, Thi Thinh Nguyen, Yen Nguyen Tram Chau, Van Thu Le, Ngoc Quyen
Chan, Cuu Khoa Nguyen, Dai Hai Nguyen, Low systemic toxicity nanocarriers
fabricated from heparin-mPEG and PAMAM dendrimers for controlled drug
release. Materials Science & Engineering C, 82 (2018) 291-298, IF = 5,33
(Q1)
2. Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Cửu Khoa, Thẩm định quy trình xác định đồng thời
Zidovudin và Lamivudin trên hệ chất mang nano dendrimer G3.0-
F127@AZT/3TC bằng phương pháp HPLC-PDA, Tạp chí Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, 63 (5), 5.2021, 29-34
3. Thi Thinh Nguyen, Bao Phu Nguyen, Dinh Tien Dung Nguyen, Ngoc Hoi
Nguyen, Dai Hai Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Retrovirus Drugs-Loaded
PEGylated PAMAM for Prolonging Drug Release and Enhancing Efficiency in
HIV Treatment, Polymers, 2022, 14, 114, IF = 4,329 (Q1)
110
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Global HIV & AIDS statistics. AIDS Statistics - 2019
https://www.unaids.org/en/resources/fact (Truy cập ngày 15/12/2021)
2. Cục phòng, chống HIV/AIDS - Bộ Y tế. Dịch HIV/AIDS có gì thay đổi trong năm
2021. https://vaac.gov.vn/dich-hiv-aids-co-gi-thay-doi-trong-nam-2021.html (Truy
cập ngày 29/07/2022)
3. https://ykhoaphuocan.vn/thuvien/duoc-thu/Saquinavir (Truy cập ngày 29/07/2022)
4. Nguyễn Cửu Khoa (2015), Dendrimer Tổng hợp và ứng dụng trong Y – Dược, trang
54 - 235
5. Ning Li, Hao Cai, Lei Jiang, Jiani Hu, Ashika Bains, Jesse Hu, Qiyong Gong, Kui
Luo, and Zhongwei Gu, Enzyme-sensitive and amphiphilic PEGylated dendrimer-
paclitaxel prodrug-based nanoparticles for enhanced stability and anticancer
efficacy. ACS applied materials & interfaces, 2017. 9(8): p. 6865-6877.
6. https://healthvietnam.vn/thu-vien/tai-lieu-tieng-viet/vi-sinh-vat/virus-hiv-aids
(Truy cập ngày 29/07/2022).
7. Tế bào lympho TCD4 và bệnh HIV/AIDS. https://www.vinmec.com/vi/tin-
tuc/thong-tin-suc-khoe/suc-khoe-tong-quat/te-bao-lympho-tcd4-va-benh-hivaids
(Truy cập ngày 29/07/2022).
8. Cục phòng, chống HIV/AIDS (2016), Cẩm nang Hướng dẫn sử dụng thuốc điều trị
HIV/AIDS, trang 18 - 60.
9. Julie S. Eggleton; Shivaraj Nagalli, Highly active Antiretroviral Therapy (HAART)
(2022).
10. Bộ Y tế (2021), Quyết định 5968/QĐ-BYT ngày 31/12/2021 về việc ban hanh
Hướng dẫn điều trị và chăm sóc HIV/AIDS, Trang 34-47.
11. Allyne cristina Grando, Nilza Nascimento Guimaraes, Ana Paula de Souza,
Mauricio Lehmann, Kenya Silva Cunha, Rafael Rodrigues Dihl, Assessment of
complex genomic alterations induced by AZT, 3TC and the combination AZT+3TC.
Drug and chemical Toxicology (2020); 43(4).
12. Tung-Che Hung, Guan-Jhou Chen, Shu-Hsing Cheng, Jhen-Hong Chen, Jheng-Lun
Eei, Chien-Yu Cheng, Chien-Ching Hung, Dual therapy with ritonavir-boosted
111
protease inhibitor (PI) plus lamivudine versus triple therapy with ritonavir-boosted
PI plus two nucleos(t)ide reverse-transcriptase inhibitor in HIV-infected patients
with viral suppression. Journal of Microbiology, Immunology and Infection (2019)
52.
13. Appakkudal R. Anand, Swaminathan Sethuraman, Uma Maheswari Krishnan,
Targeting strategies for delivery of anti-HIV drugs, Journal of Controlled Release,
2014. 192: p. 271-283.
14. World Health Organization (2022), HIV drug resistance Available online
https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hiv-drug-resistance (Truy cập
ngày 3/12/2022).
15. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV
(2022). Available online https://clinicalinfo.hiv.gov/en/guidelines/hiv-clinical-
guidelines-adult-and-adolescent-arv/overview (Truy cập ngày 03/12/2022).
16. Christa Buckheit Sturdevant, Sarah B. Joseph, Gretja Schnell, Richard W. Price,
Ronald Swanstrom, Serena Spudich, Compartmentalized Replication of R5 T Cell
Tropic HIV-1 in the Central Nervous System Early in the Course of Infection,
Journals PLOS Pathog, 2015, 11(3).
17. Gaurav Agarwal, Shilpi Agarwal, PK Kara and Shagun Goyal, Oral Sustained
Release Tablets: An overview with a special emphasis on Matrix Tablet, American
Journal of Advanced Drug Delivery, 2017. 5(4): p. 064-076.
18. Cost is Primary Driver of Medication non-Adherence rates (2022)
https://healthitanalytics.com/news/cost-is-a-primary-driver-of-medication-non-
adherence-rates (Truy cập ngày 3/12/2022).
19. Nihad Al-Hashimi, Nazish Begg, Raid G. Alany. Hany Hassanin, Amr Elshaer,
Oral Modified Release Multiple - Unit Particulate Systems: Compressed Pellets,
Micropaticles and Nanoparticles. Pharmaceutics (2018). 10 (4), 176.
20. D.G. Myszka, R.W. Sweet, P. Hensley, M. Brigham-Burke, P.D. Kwong, W.A.
Hendrickson, R. Wyatt, J. Sodroski, M.L. Doyle, Energetics of the HIV gp120–CD4
binding reaction, Proc. Natl. Acad. Sci. 97(2000) 9026–9031.
21. Jing Pu, Qian Wang, Wei Xu, Lu Lu and Shibo Jiang, Development of Protein- and
Peptide-Based HIV Targeting gp120 or gp41, Viruses 2019, 11, 705.
112
22. Shaik, M.M.; Peng, H.; Lu, J.; Rits-Volloch, S.; Xu, C.; Liao, M.; Chen, B.
Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature 2019,
565, 318–323.
23. Starcich, B.R.; Hahn, B.H.; Shaw, G.M.; McNeely, P.D.; Modrow, S.; Wolf, H.;
Parks, E.S.; Parks, W.P.; Josephs, S.F.; Gallo, R.C.; et al., Identification and
characterization of conserved and variable regions in the envelope gene of HTLV-
III/LAV, the retrovirus of AIDS. Cell 1986, 45, 637–648.
24. Huang, C.C.; Tang, M.; Zhang, M.Y.; Majeed, S.; Montabana, E.; Stanfield, R.L.;
Dimitrov, D.S.; Korber, B.; Sodroski, J.; Wilson, I.A.; et al., Structure of a V3-
containing HIV-1 gp120 core. Science 2005, 310, 1025–1028.
25. Zhou, T.; Georgiev, I.; Wu, X.; Yang, Z.Y.; Dai, K.; Finzi, A.; Kwon, Y.D.; Scheid,
J.F.; Shi, W.; Xu, L.; et al., Structural basis for broad and potent neutralization of
HIV-1 by antibody VRC01. Science 2010, 329, 811– 817.
26. Sattentau, Q.J.; Moore, J.P. The role of CD4 in HIV binding and entry. Philos.
Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1993, 342, 59–66.
27. Traunecker, A.; Luke, W.; Karjalainen, K. Soluble CD4 molecules neutralize
human immunodeficiency virus type 1. Nature 1988, 331, 84–86.
28. Daar, E.S.; Li, X.L.; Moudgil, T.; Ho, D.D. High concentrations of recombinant
soluble CD4 are required to neutralize primary human immunodeficiency virus type
1 isolates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 6574– 6578.
29. Schooley, R.T.; Merigan, T.C.; Gaut, P.; Hirsch, M.S.; Holodniy, M.; Flynn, T.;
Liu, S.; Byington, R.E.; Henochowicz, S.; Gubish, E.; et al., Recombinant soluble
CD4 therapy in patients with the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and
AIDS-related complex. A phase I-II escalating dosage trial. Ann. Int. Med. 1990,
112, 247–253.
30. Haim, H.; Si, Z.; Madani, N.; Wang, L.; Courter, J.R.; Princiotto, A.; Kassa, A.;
DeGrace, M.; McGee-Estrada, K.; Mefford, M.; Soluble CD4 and CD4-mimetic
compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a shortlived activated state.
PLoS Pathog. 2009, 5.
31. Orloff, S.L.; Kennedy, M.S.; Belperron, A.A.; Maddon, P.J.; McDougal, J.S. Two
mechanisms of soluble CD4 (sCD4)-mediated inhibition of human
113
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infectivity and their relation to primary
HIV-1 isolates with reduced sensitivity to sCD4. J. Virol. 1993, 67, 1461–1471.
32. Allan, J.S. Receptor-mediated activation of immunodeficiency viruses in viral
fusion. Science 1991, 252, 1322–1323.
33. Schutten, M.; Andeweg, A.C.; Bosch, M.L.; Osterhaus, A.D. Enhancement of
infectivity of a non-syncytium inducing HIV-1 by sCD4 and by human antibodies
that neutralize syncytium inducing HIV-1. Scand. J. Immunol. 1995, 41, 18–22.
34. Jacobson, J.M.; Lowy, I.; Fletcher, C.V.; O’Neill, T.J.; Tran, D.N.; Ketas, T.J.;
Trkola, A.; Klotman, M.E.; Maddon, P.J.; Olson, W.C.; et al. Single-dose safety,
pharmacology, and antiviral activity of the human immunodeficiency virus (HIV)
type 1 entry inhibitor PRO 542 in HIV-infected adults. J. Infect Dis. 2000, 182,
326–329.
35. Allaway, G.P.; Davis-Bruno, K.L.; Beaudry, G.A.; Garcia, E.B.; Wong, E.L.;
Ryder, A.M.; Hasel, K.W.; Gauduin, M.C.; Koup, R.A.; McDougal, J.S.; et al.,
Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that
neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res. Hum. Retrovir. 1995, 11, 533–
539.
36. Gauduin, M.C.; Allaway, G.P.; Olson, W.C.; Weir, R.; Maddon, P.J.; Koup, R.A.
CD4-immunoglobulin G2 protects Hu-PBL-SCID mice against challenge by
primary human immunodeficiency virus type 1 isolates. J. Virol. 1998, 72, 3475-
3478.
37. Trkola, A.; Pomales, A.B.; Yuan, H.; Korber, B.; Maddon, P.J.; Allaway, G.P.;
Katinger, H.; Barbas, C.F. 3rd; Burton, D.R.; Ho, D.D.; et al. Cross-clade
neutralization of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by
human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-IgG. J. Virol. 1995, 69, 6609–
6617.
38. Jacobson, J.M.; Israel, R.J.; Lowy, I.; Ostrow, N.A.; Vassilatos, L.S.; Barish, M.;
Tran, D.N.; Sullivan, B.M.; Ketas, T.J.; O’Neill, T.J.; Treatment of advanced
human immunodeficiency virus type 1 disease with the viral entry inhibitor PRO
542. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48, 423–429
39. Chong, H.; Wu, X.; Su, Y.; He, Y. Development of potent and long-acting HIV-1
fusion inhibitors. AIDS 2016, 30, 1187–1196 (33).
114
40. Ashkenazi, A.; Viard, M.; Unger, L.; Blumenthal, R.; Shai, Y. Sphingopeptides:
Dihydrosphingosine-based fusion inhibitors against wild-type and enfuvirtide-
resistant HIV-1. FASEB J 2012, 26, 4628–4636. (34).
41. Urbanowicz, R.A.; Lacek, K.; Lahm, A.; Bienkowska-Szewczyk, K.; Ball, J.K.;
Nicosia, A.; Cortese, R.; Pessi, A. Cholesterol conjugation potentiates the antiviral
activity of an HIV immunoadhesin. J. Pept. Sci. 2015, 21, 743–749 (35).
42. Wexler-Cohen, Y.; Ashkenazi, A.; Viard, M.; Blumenthal, R.; Shai, Y. Virus-cell
and cell-cell fusion mediated by the HIV-1 envelope glycoprotein is inhibited by
short gp41 N-terminal membrane-anchored peptides lacking the critical pocket
domain. FASEB J. 2010, 24, 4196–4202. 936)
43. Jiang, S.; Lin, K.; Strick, N.; Neurath, A.R. HIV-1 inhibition by a peptide. Nature
1993, 365, 113 (31).
44. Pan, C.; Cai, L.; Lu, H.; Qi, Z.; Jiang, S. Combinations of the first and next
generations of human immunodeficiency virus (HIV) fusion inhibitors exhibit a
highly potent synergistic effect against enfuvirtide-sensitive and-resistant HIV type
1 strains. J. Virol. 2009, 83, 7862–7872 (32)
45. Lim, S.B.; Banerjee, A.; Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of
lipid-based nanocarriers. J. Control. Release. 2012, 163, 34–45
46. Chong, H.; Xue, J.; Xiong, S.; Cong, Z.; Ding, X.; Zhu, Y.; Liu, Z.; Chen, T.; Feng,
Y.; He, L.; et al. A lipopeptide HIV-1/2 fusion inhibitor with highly potent in vitro,
ex vivo and in vivo antiviral activity. J. Virol. 2017, 91.
47. Ding, X.; Zhang, X.; Chong, H.; Zhu, Y.; Wei, H.; Wu, X.; He, J.; Wang, X.; He,
Y. Enfuvirtide (T20)-based lipopeptide is a potent HIV-1 cell fusion inhibitor:
Implications for viral entry and inhibition. J. Virol. 2017, 91.
48. US FDA. Drug approval package: Edurant; 2011.
49. Cohen CJ, Andrade-Villanueva J, Clotet B, et al., Rilpivirine versus efavirenz with
two background nucleoside or nucleotide reverse A. I. Rana et al. transcriptase
inhibitors in treatment-naive adults infected with HIV-1 (THRIVE): a phase 3,
randomised, non-inferiority trial. Lancet. 2011;378(9787):229–37.
50. Molina J-M, Cahn P, Grinsztejn B, et al., Rilpivirine versus efavirenz with tenofovir
and emtricitabine in treatment-naive adults infected with HIV-1 (ECHO): a phase
3 randomised double-blind active-controlled trial. Lancet. 2011;378(9787):238–46
115
51. Hoeben E, Borghys H, Looszova A, Bouche M-P, van Velsen F, Baert L.
Pharmacokinetics and disposition of rilpivirine (TMC278) nanosuspension as a
long-acting injectable antiretroviral formulation. Antimicrob Agents Chemother.
2010;54(5):2042–50.
52. Verloes R, Deleu S, Niemeijer N, Crauwels H, Meyvisch P, Williams P. Safety,
tolerability and pharmacokinetics of rilpivirine following administration of a long-
acting formulation in healthy volunteers. HIV Med. 2015;16(8):477–84.
53. McGowan I, Siegel A, Engstrom J, et al. Persistence of rilpivirine following single
dose of long‐acting injection. J Int Aids Society. 2016;19.
54. Yoshinaga T, Kobayashi M, Seki T, et al. Antiviral characteristics of GSK1265744,
an HIV integrase inhibitor dosed orally or by long-acting injection. Antimicrob
Agents Chemother. 2015;59(1):397–406.
55. Spreen W, Min S, Ford S, et al. Pharmacokinetics, safety, and monotherapy
antiviral activity of GSK1265744, an HIV integrase strand transfer inhibitor. HIV
Clin Trials. 2013;14(5):192–203.
56. Spreen W, Ford SL, Chen S, et al. GSK1265744 pharmacokinetics in plasma and
tissue after single-dose long-acting injectable administration in healthy subjects. J
Acquir Immune Defc Syndr. 2014;67(5):481–6
57. Nayak D, et al., Stavudine loaded gelatin liposomes for HIV therapy: Preparation,
characterization and in vitro cytotoxic evaluation. Mater Sci Eng C Mater Biol
Appl, 2017 73: p. 406–416.
58. Kraft JC, et al., Emerging Research and Clinical Development Trends of Liposome
and Lipid Nanoparticle Drug Delivery Systems. Journal of Pharmaceutical
Sciences, 2014 103(1): p. 29–52.
59. Kinman L, et al., Lipid-drug association enhanced HIV-1 protease inhibitor
indinavir localization in lymphoid tissues and viral load reduction: a proof of
concept study in HIV-2287-infected macaques. J. Acquir Immune Defic Syndr,
2003 34(4): p. 387–97.
60. Duan J, et al., Evaluation of atazanavir and darunavir interactions with lipids for
developing pHresponsive anti-HIV drug combination nanoparticles. J Pharm Sci,
2014 103(8): p. 2520–9.
116
61. Naseri N, Valizadeh H, and Zakeri-Milani P, Solid Lipid Nanoparticles and
Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application. Advanced
Pharmaceutical Bulletin, 2015 5(3): p. 305–313.
62. Javan F, et al., Encapsulation of ritonavir in solid lipid nanoparticles: in-vitro anti-
HIV-1 activity using lentiviral particles. Journal of Pharmacy and Pharmacology,
2017 69(8): p. 1002–1009.
63. . K SJ, et al., Gelatin modified lipid nanoparticles for anti-viral drug delivery. Chem
Phys Lipids, 2017 207(Pt A): p. 24–37.
64. Dubey V, et al., Enhanced transdermal delivery of an anti-HIV agent via ethanolic
liposomes. Nanomedicine, 2010 6(4): p. 590–6.
65. Chu GJ and Murad A, A case of ethanol-induced systemic allergic dermatitis.
Contact Dermatitis, 2017 76(3): p. 182–184.
66. Aggarwal R, Sahoo PK, Ethosomes: The Novel Drug Delivery Carriers, Sch. Acad.
J. Pharm., Jun 2018; 7(6): 266-273.
67. Khalil NM, et al., Potential of polymeric nanoparticles in AIDS treatment and
prevention. Expert Opin Drug Deliv, 2011 8(1): p. 95–112.
68. Zhilin Chen , Boris Julg. Therapeutic Vaccines for the Treatment of HIV. Journal
Pre-proy 2020.
69. Tomáš Hanke, Aiming for protective T-cell responses: a focus on the first
generation conserved-region HIV consv vaccines in preventive and therapeutic
clinical trials. Expert Review of Vaccines (2019).
70. Nguyễn Thị Trâm Châu (2015), Nghiên cứu biến tính các dendrimer PAMAM bằng
biopolymer ứng dụng mang thuốc, Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu, Học Viện
Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
71. Li, N., et al., Enzyme-sensitive and amphiphilic PEGylated dendrimer-paclitaxel
prodrug-based nanoparticles for enhanced stability and anticancer efficacy. ACS
applied materials & interfaces, 2017. 9(8): p. 6865-6877.
72. Pasut G, Sergi M, Veronese FM. Anti-cancer PEG-enzymes: 30 years old, but still
a current approach. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:69–78.
73. Brocchini S, Godwin A, Balan S, Choi J, Zloh M, Shaunak S. Disulfide bridge
based PEGylation of proteins. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:3–12.
117
74. Eto Y, Yoshioka Y, Mukai Y, Okada N, Nakagawa S. Development of PEGylated
adenovirus vector with targeting ligand. International Journal of Pharmaceutics
2008;354:3–8.
75. Huynh L, Neale C, Pomès R, Allen C. Computational approaches to the rational
design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery.
Nanomedicine 2012;8:20–36.
76. Payne RW, Murphy BM, Manning MC. Product development issues for PEGylated
proteins. Pharmaceutical Development and Technology 2011;16:423–40.
77. Abuchowski A, Van Es T, Palczuk NC, Davis FF. Alteration of immunological
properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol.
Journal of Biological Chemistry 1977;252:3578–81.
78. Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF. Effect of covalent
attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine
liver catalase. Journal of Biological Chemistry;252:3582–6.
79. Li C, Wallace S. Polymer-drug conjugates: recent development in clinical
oncology. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:886–98.
80. Pasut G, Veronese FM. Polymer–drug conjugation, recent achievements and
general strategies. Progress in Polymer Science 2007;32:933–61.
81. Andrew M. Bodratti and Paschalis Alexandridis. Formulation of Poloxamers for
Drug Delivery. J. Funct. Biomater. 2018, 9, 11.
82. Alexandridis, P.; Hatton, T.A. Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-
poly(ethylene oxide) block copolymer surfactants in aqueous solutions and at
interfaces: Thermodynamics, structure, dynamics, and modeling. Colloids Surf. A
Physicochem. Eng. Asp. 1994, 96, 1–46.
83. Nguyễn Ngọc Thể (2021), Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt
tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (Heparin,
Fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học , Luận án Tiến sĩ Hóa hữu cơ,
Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
84. P. Dinesh Kumar, P.Vijayaraj Kumar, T. Panneer Selvam and K.R.S. Sambasiva
Rao. Prolonged Drug Delivery System of PEGylated PAMAM Dendrimers with a
Anti-HIV Drug. Research in Pharmacy 3(2): 08-17, 2013.
118
85. Mohammad R Aghasadeghi , Hossein Heidari, Seyed M Sadat, Shiva Irani, Safieh
Amini, Seyed D Siadat, Mohammad E Fazlhashemy, Rezvan Zabihollahi, Seyed M
Atyabi, Seyed B Momen, Mohammad S Khosraavy, Mehdi Davari, Tahmineh
Darvish Mohammadi, Mohammad Doroudian, Mehdi S Ardestani. Lamivudine –
PEGylated chitosan: a novel effective nanosized antiretroviral agent. Curr HIV
Res.2013 Jun; 11(4):309-20.
86. Esmaeel Mohammadi Pargoo,Mohammad Reza Aghasadeghi,Kazem
Parivar,Mehri Nikbin, Pooneh Rahimi,Mehdi Shafiee Ardestan. Lamivudine-
conjugated and efavirenz – loaded G2 dendrimers: Novel anti-retroviral nano drug
delivery systems. IET Nanobiotechnology Jun 2021.
87. Hồ Minh Nhật (2020), Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer Poly (amidoamine)
mang thuốc chống ung thư (Carboplatin và Oxaliplatin), Luận án Tiến sĩ Khoa học
vật liệu, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
88. Viện Kiểm nghiệm An toan Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp
trong phân tích hóa học và vi sinh vật.
89. ICH Harmonised Tripartite Guideline validation of Analytical Procedures: Text
and Methodology Q2(R1) (1994)
90. The United States Pharmacopeia 2021 (USP 44)
91. Le Hang Dang, Phuong Doan, Tran Thi Yen Nhi, Dinh Trung Nguyen, Bich Tram
Nguyen, Thi Phuong Nguyen, Ngoc Quyen Tran. Multifunctional injectable
pluronic-cystamine-alginate-based hydrogel as a novel cellular delivery system
towards tissue regeneration. Intternational journal of Biological Macromolecules,
Volume 185, 31August 2021, 592-603
92. ATCC.BJ https://www.atcc.org/products/crl-
2522#:~:text=BJ%20cells%20are%20fibroblasts%20established,Applications%20
include%20toxicology%20research.&text=Discounts%2 (Truy cập ngày 3/12/2022
93. Enzymatic Assay of Pepsin (3.4.23.1)
https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/protocol/protein-
biology/enzyme-activity-assays/enzymatic-assay-of-pepsin (Truy cập ngày
3/12/2020)
119
94. Van-Dung Nguyen, Hong-Loan Thi Nguyen¸ Linh-Chi Do, Vu Van Tuan, Phuong
Thien Thuong and Tuan-Nghia Phan. A New Saponin with Anti-HIV-1 Protease
Activity from Acacia pennata. Natural Product Communication Vol.13 (4) 2018,
411-414
95. Nguyễn Văn Dũng, Lương Thị Kim Châu, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Thị
Phương, Phương Thiện Thương, Phan Tuấn Nghĩa, Bùi Phương Thuận (2015). Hoạt
tính ức chế pepsin và protease HIV-1 của các cao chiết và hoạt chất Acid maslinic
từ dược liệu. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học Tự nhiên và
Công nghệ, Tập 31, Số 2 (2015) 18-27
96. Ho, M.N.; Bach, L.G.; Nguyen, D.H.; Nguyen, C.H.; Nguyen, C.K.; Tran, N.Q.;
Nguyen, N.V.; Thi, T.T.H. PEGylated PAMAM dendrimers loading oxaliplatin with
prolonged release and high payload without burst effect. Biopolymers 2019, 110.
97. Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa
Nguyen, Ngoc Quyen Tran, 1H NMR spectroscopy as an effective method for
predicting molecular weight of polyaminoamine dendrimers and their derivatives.
International Journal of Polymer Analysis and Characterization, 2015. 20(1): p. 57-
68.
98. B. L. Schwartz, A. L. Rockwood, R. D. Smith, D. A. Tomalia, R. Spindler,
Detection of high molecular weight starburst dendrimers by electrospray ionization
mass spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry, 1995. 9(15):
1552-1555.
99. R.J., Hood, J.T. Watson, and A.D. Jones. Resolution and mass accuracy of
highmass ions in TOF mass spectrometry: Applications to PAMAM dendrimers.
54th Annual Conference on Mass Spectrometry, Seattle, Washington, 2006.
100. K. Madaan, S. Kumar, N. Poonia, V. Lather, D. Pvaita. Dendrimers in drug
delivery and targeting: drug-dendrimer interactions and toxicity issues. Journal of
Pharmacy and Bioallied Sciences, 2014. 6(3): 139-150.
101. Luong, D.; Kesharwani, P.; Deshmukh, R.; Amin, M.C.I.M.; Gupta, U.; Greish,
K.; Iyer, A.K. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating
toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 2016, 43,
14–29.
120
102. Ho, M.N.; Bach, L.G.; Nguyen, D.H.; Nguyen, C.H.; Nguyen, C.K.; Tran, N.Q.;
Nguyen, N.V.; Thi, T.T.H. PEGylated PAMAM dendrimers loading oxaliplatin
with prolonged release and high payload without burst effect. Biopolymers 2019,
110.
103. Ahmed, R.; Aucamp, M.; Ebrahim, N.; Samsodien, H. Supramolecular assembly
of rifampicin and PEGylated PAMAM dendrimer as a novel conjugate for
tuberculosis. J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2021, 66.
104. Lin-Vien, D.; Colthup, N.B.; Fateley, W.G.; Grasselli, J.G. The Handbook of
Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules; Academic
Press: London, UK, 1991.
105. Sonam Choudhary, Lokesh Gupta, Santa Rani, Kaushalkuma Dave, Umesh
Gupta. Impact of dendrimers on solubility of hydrophobic Drug. Front Pharmacol,
2017, 8:261
106. M A Navia, P M Fitzgerald, B M McKeever, C T Leu, J C Heimbach, W K
Herber, I S Sigal, P L Darke, J P Springer. Three-dimensional structure of aspartyl
protease from human immunodeficiency virus HIV-1, Nature 1989 Feb
16;337(6208):615-20
107. Bazzo, Giovana Carolina; Mostafa, Dina; França, Maria Terezinha; Pezzini,
Bianca Ramos; Stulzer, Hellen Karine (2019). How tenofovir disoproxil fumarate
can impact on solubility and dissolution rate of efavirenz?. International Journal of
Pharmaceutics, 118597.
108. Anthony D. Richards, Lowri H. Phylip, William G.Farmerie, Paula
E.Scarborough, Alicia Alvarez, Ben M,Dunn, Ph-Herve Hire, Libuse pavlickova,
Vladimir Kostka, and John Kay. Sensitive, Solube Chromogenic Subtrates for HIV-
1 proteinase. The Journal of Biological chemistry Vol.265, No.14, Issue of May 16,
pp.7733-7736, 1990
109. Alterman, M. Design and Synthesis of HIV-1 Protease Inhibitor; Acta
Universitatis Upsaliensis: Uppsala, Sweden, 2001.
110. Gaber, R.; Majerle, A.; Jerala, R.; Benˇcina, M. Noninvasive high-throughput
single-cell analysis of HIV protease activity using ratiometric flow cytometry.
Sensors 2013, 13, 16330–16346.
121
111. Oluwaseun Ogunwuy, Namita Kumari, Kahli A. Smith, Oleg Bolshakov, Simeon
Adesina, Avele Gugssa, Winston A. Anderson, Sergei Nekhai, Emmanuel, O.
Akala, Antiretroviral Druds-Loaded Nanoparticles Fabricated by Dispersion
Polymerization with Potential for HIV/AIDS Treatment. Infect Dis (Auckl), 2016;
9: 21-32
122
PHỤ LỤC
123
PHỤ LỤC 1.
PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM G-0.5, G0.0, G0.5, G1.0,
G1.5, G2.0, G2.5, G3.0
Phổ IR dendrimer PAMAM G-0.5
124
Phổ IR dendrimer PAMAM G0.0
125
Phổ IR dendrimer PAMAM G0.5
126
Phổ IR dendrimer PAMAM G1.0
127
Phổ IR dendrimer PAMAM G1.5
128
Phổ IR dendrimer PAMAM G2.0
129
Phổ IR dendrimer PAMAM G3.0
130
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G-0.5
131
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.0
132
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.5
133
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.0
134
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.5
135
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.0
136
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.5
137
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0
138
Phổ GPC của dendrimer PAMAM G3.0
139
PHỤ LỤC 2.
PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM
BIẾN TÍNH VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127
Phổ 1H-NMR mPEG-NPC
140
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@mPEG
141
Phổ GPC của dendrimer PAMAM G3.0@mPEG
142
Phổ 1H-NMR của HO-F127-NPC
143
Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@F127
144
PHỤ LỤC 3
KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TDF, RTV VÀ
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TDF, RTV
Tính tuyến tính
Kết quả khảo sát tính tuyến tính của TDF
Nồng độ C (µg/ml) 2,72 67,93 135,87 271,74 407,61
Diện tích pic S 13989 309796 738331 1468549 2167338
(mAu.s)
Phương trình hồi qui
ŷ = 5385,8396x – 14622,2039
Hệ số tương quan r = 0,9995
Kết quả khảo sát tính tuyến tính của RTV
Nồng độ C (µg/ml) 2,63 65,67 131,34 262,68 394,02
Diện tích pic S 16839 469233 942161 1881293 2827375
(mAu.s)
Phương trình hồi qui
ŷ = 7178,0380x - 1983,4253
Hệ số tương quan r = 1,0000
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng
độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với
các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở cho các nghiên cứu
dẫn truyền hóa thuốc và phóng thích thuốc in vitro
y = 5385.840x - 14622.204
R² = 00.999
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
- 100 200 300 400 500
D
iệ
n
t
íc
h
p
ic
Nồng độ (µg/ml)
y = 7178.038x - 1983.425
R² = 01.000
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
- 100 200 300 400 500D
iệ
n
t
íc
h
p
ic
Nồng độ (µg/ml)
145
Độ chính xác
Kết quả khảo sát độ lặp của TDF và RTV
TDF RTV
Thử Lượng cân
g
Diện tích
Pic (mAu.s)
Hàm lượng
%
Diện tích
Pic (mAu.s)
Hàm lượng
%
1 0,0621 533105 8,04 943024 10,57
2 0,0630 549955 8,18 977888 10,81
3 0,0625 550793 8,26 977767 10,89
4 0,0628 550419 8,21 975882 10,82
5 0,0635 550231 8,12 976029 10,70
6 0,0620 549625 8,31 976219 10,96
Trung bình 8,19 10,79
RSD (%) 1,16 1,29
Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của TDF và RTV
TDF RTV
Thử Lượng cân
g
Diện tích
Pic (mAu.s)
Hàm lượng
%
Diện tích
Pic (mAu.s)
Hàm lượng
%
1 0,0627 529766 7,99 936398 10,41
2 0,0632 529812 7,85 938480 10,36
3 0,0612 529294 8,10 938897 10,70
4 0,0615 529180 8,06 936405 10,62
5 0,0621 528635 7,98 938411 10,54
6 0,0628 529619 7,90 936538 10,40
Trung bình 7,98 10,50
RSD (%) 1,18 1,30
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp đạt độ chính xác có RSD < 2,0 %
(n=12): TDF có RSD 1,18 % và RTV có RSD là 1,30 %
146
Độ đúng
Kết quả khảo sát độ đúng của TDF
Mức Lượng
chuẩn
Nồng
độ
Diện tích
pic
(mAu.s)
Nồng độ
chuẩn
Tỷ
lệ
Trung
bình
RSD
thêm
mg
chuẩn
µg/ml
tìm lại
µg/ml
phục hồi
% %
%
80 % 10,85 107,96 589592 109,47 101,40
10,80 107,46 589229 109,40 101,81 101,35 0,48
10,91 108,55 589562 109,47 100,84
100 % 13,60 135,32 738154 137,05 101,28
13,58 135,12 740101 137,42 101,70 101,41 0,25
13,61 135,42 738387 137,10 101,24
120 % 16,32 162,38 883469 164,04 101,02 100,82 0,17
16,35 162,68 883046 163,96 100,78
16,37 162,88 883208 163,99 100,68
Kết quả khảo sát độ đúng của RTV
Mức
Lượng
chuẩn
Nồng
độ
Diện tích
pic
Nồng độ
chuẩn
Tỷ
lệ
Trung
bình
RSD
thêm
mg
chuẩn
µg/ml
tìm lại
µg/ml
phục hồi
% %
%
80 % 10,50 105,00 755329 105,23 100,22
10,55 105,50 753794 105,01 99,54 99,75 0,41
10,57 105,70 754826 105,16 99,49
100 % 13,20 132,00 945840 131,77 99,82
13,22 132,20 941420 131,15 99,21 99,37 0,40
13,25 132,50 942419 131,29 99,09
120 % 16,00 160,00 1129909 157,41 98,38
15,96 159,60 1130985 157,56 98,72 98,73 0,35
15,90 159,00 1130813 157,54 99,08
147
PHỤ LỤC 4
SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN AZT TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127
148
149
PHỤ LỤC 5
SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN 3TC TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127
150
151
PHỤ LỤC 6
SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN TDF TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127
152
153
PHỤ LỤC 7
SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN RTV TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127
154