Luận án Nghiên cứu xác định dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ

t d-SPE với lượng 7,5 mg là cần thiết và phù hợp. 3.2.2.2. Nền mẫu dược liệu khô - Độ ẩm của mẫu khoảng 80% có thể cho hiệu suất chiết cao nhất khi xử lý bằng phương pháp QuEChERS. Do đó, mẫu khô được bổ sung thêm nước với tỷ lệ mẫu:nước (1:5) và khảo sát thời gian ngâm mẫu trong nước. Qua khảo sát cho thấy trong khoảng từ 0 đến 15 phút, thu được nồng độ các HCBVTV khảo sát là cao nhất. Do đó nhằm tiết kiệm thời gian, không cần thiết phải thực hiện ngâm mẫu trong nước trước khi chiết. - Lựa chọn loại đệm chiết: Thực hiện so sánh 3 quy trình tương tự như mẫu dược liệu tươi. Kết quả cho thấy trên nền mẫu dây thìa canh, pH của dịch chiết khá ổn định đối với cả 3 phương pháp; phương pháp không sử dụng đệm cho độ thu hồi tốt nhất. Tuy nhiên, trên nền mẫu lá giang (pH acid), phương pháp không dùng đệm cho hiệu quả rất thấp, 20/25 HCBVTV phân tích có độ thu hồi dưới 70%. Phương pháp dùng đệm citrat có độ thu hồi tốt hơn nhưng chưa đáp ứng được yêu cầu (14/25 HCBVTV có độ thu hồi dưới 70%). Phương pháp dùng đệm acetat cho pH ổn định nhất và độ thu hồi của các HCBVTV đều đáp ứng được yêu cầu. Mặt khác do nền mẫu dược liệu đa dạng về tính acid base, do đó việc sử dụng đệm acetat là cần thiết. -9- - Khảo sát muối chiết: Khảo sát bổ sung thêm NaCl nhằm tăng khả năng phân lớp giữa acetonitril với nước. Các mức NaCl từ 0 g; 0,5 g; 1,0 g; 1,5 g và 2,0 g đã được khảo sát. Việc sử dụng NaCl trong muối chiết có ảnh hưởng đến độ thu hồi của phương pháp, lượng NaCl tốt nhất là từ mức 1,5 g. Ngoài ra, khi tăng lượng NaCl thì pH của dịch chiết acetonitril giảm dần từ 5,88 (0 g) đến 5,63 (1,5 g) và 5,50 (2 g); màu sắc dịch chiết cũng nhạt dần cho thấy NaCl có vai trò quan trọng trong việc tách giữa hai pha nước và acetonitril. Do đó, việc thêm NaCl vào muối chiết với khối lượng 1,5 g/15 mL dịch chiết acetonitril là cần thiết. 3.2.2.3. Nền mẫu thực phẩm chức năng có thành phần dược liệu - Lựa chọn loại đệm chiết: Thực hiện thí nghiệm tương tự như đối với nền mẫu dược liệu khô, so sánh 3 quy trình chiết QuEChERS không sử dụng đệm, dùng đệm acetat và dùng đệm citrat. Theo kết quả thu được, hầu hết các chất đều cho hiệu suất cao hơn khi xử lý bằng quy trình 2. Kết quả này cũng phù hợp với hai nền dược liệu tươi và dược liệu khô. Do đó quy trình 2 được chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo. - Khảo sát thành phần d-SPE: Khảo sát lượng PSA từ 20, 30, 40, 50, 60 mg và khảo sát lượng GCB từ 0; 5; 7,5 và 10 mg cho 1 mililit dịch chiết. Các kết quả cho thấy, lượng PSA và GCB sử dụng có ảnh hưởng đến độ thu hồi của HCBVTV. Lượng PSA và GCB tối ưu lần lượt là 40 mg và 7,5 mg. 3.2.2.4. Nền mẫu chè Nền mẫu chè có sự khác biệt so với các loại dược liệu khác do thành phần chè có nhiều hợp chất như cafein, polyphenol và đặc biệt là tannin có thể gây ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết. Để loại các tạp chất, muối chì acetat ((CH3COO)2Pb) được thêm vào hỗn hợp muối chiết để kết tủa tannin, cafein. Khảo sát các lượng muối chì acetat từ 0 đến 2,0 g. Khi sử dụng chì acetat, hiệu suất chiết các HCBVTV đều tăng rõ rệt. Càng tăng lượng muối sử dụng, hiệu suất chiết càng tăng. Tuy nhiên, nếu lượng muối tăng quá 1,5 g cho thấy hiệu suất chiết giảm với đa số các HCBVTV nghiên cứu. Do đó, lượng muối chì acetat được sử dụng trong quy trình xử lý mẫu này là 1,5 g. 3.2.2.5. Đánh giá ảnh hưởng nền và vai trò của nội chuẩn Để đánh giá ảnh hưởng nền, thực hiện so sánh hệ số góc của hai đường chuẩn xây dựng trên nền dung môi và trên nền mẫu trắng (mẫu trắng được chiết theo quy trình để thu lấy dịch chiết, sau đo pha chuẩn trên dịch chiết thu được). Đường chuẩn sử dụng gồm 5 điểm chuẩn có nồng độ là 5, 10, 50, 100 và 200 µg/mL. Kết quả cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu khá khác nhau tuỳ từng HCBVTV thực vật và tuỳ thuộc vào nền mẫu. Do đó, đối với phương pháp phân tích đa dư lượng áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau thì cần phải có biện pháp để loại bỏ các ảnh hưởng nền này. Các kết quả cho thấy, nếu không sử dụng nội chuẩn ảnh hưởng nền khá lớn, có đến 14/25 hợp chất có ảnh hưởng nền lớn hơn ±20%. Khi định lượng theo nội chuẩn ảnh hưởng nền giảm rõ rệt, 23/25 hợp chất có ảnh hưởng nền nằm trong khoảng 20%, trong đó có khoảng 50% số chất có ảnh hưởng nền thấp dưới 5%. Trên nền mẫu chè, ảnh hưởng nền cũng thấp khi sử dụng nội chuẩn. Do đó, việc sử dụng nội chuẩn rất cần thiết nhằm loại trừ các sai số do nền mẫu. -10- 3.2.3. Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm dược liệu 3.2.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc Thực hiện phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Thời gian lưu của các HCBVTV trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic ở mẫu trắng ở khoảng thời gian của các píc nói trên. Hơn nữa, với mỗi chất phân tích đều có hai ion sản phẩm dùng để định tính và định lượng do đó sự có mặt của HCBVTV được chắc chắn thêm nhờ vào tỷ lệ các ion. Theo yêu cầu của các tổ chức phân tích trên thế giới như AOAC, Châu Âu, tỷ lệ của ion xác nhận chia cho ion định lượng thu được trên mẫu không được sai khác quá một mức cho phép nhất định. Nghiên cứu này đã xác định được tỷ lệ ion của các HCBVTV nghiên cứu. Như vậy, tính chọn lọc của phương pháp được đảm bảo ở mức cao. 3.2.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Đường chuẩn được chuẩn bị trên nền mẫu để loại trừ ảnh hưởng nền. Mẫu trắng được chiết theo quy trình để thu lấy dịch chiết, pha dung dịch chuẩn trên dịch chiết ở các nồng độ 0; 2; 10; 20; 50; 100 và 200 ng/mL. Nồng độ nội chuẩn giữ cố định là 100 ng/mL. Các mẫu trắng được sử dụng gồm có dược liệu tươi (mã đề), dược liệu khô (dây thìa canh), TPCN (dạng viên và dạng trà thảo dược) và mẫu chè búp Thái Nguyên. Các đường chuẩn xây dựng đều có hệ số tương quan trên 0,99 và độ chệch của các điểm nhỏ hơn 15% (nhỏ hơn 20% tại nồng độ thấp nhất) do đó trong khoảng nồng độ từ 2 đến 200 ng/mL có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng. Khoảng nồng độ này đã bao trùm được giá trị MRL của các HCBVTV do đó đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong thực tế. Trong nghiên cứu này, các nồng độ cao hơn không được khảo sát; đối với các mẫu có nồng độ cao hơn 200ng/mL, tiến hành pha loãng mẫu trước khi phân tích. 3.2.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ thấp (5 và 10 µg/kg tính trên mẫu; tương đương 1-2 µg/L trên dịch chiết) và xác định giá trị S/N. Dựa vào S/N để ước lượng các giá trị LOD, LOQ. Các kết quả cho thấy, đối với LC-MS/MS tất cả các chất có thể định lượng trên tất cả các nền mẫu nghiên cứu tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng giá trị MRL (10 µg/kg hay 0,01 mg/kg). LOD của các hợp chất trên thiết bị LC-MS/MS tốt hơn so với thiết bị GC- MS/MS. 3.2.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở ba mức nồng độ 2; 20 và 200 ng/mL đại diện cho ddierm đầu, giữa và cuối khoảng tuyến tính, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ (n = 6). Nồng độ tính tương đương trên mẫu cụ thể như sau: - Đối với mẫu dược liệu tươi: 0,002; 0,02 và 0,2 mg/kg - Đối với mẫu dược liệu và sản phẩm dược liệu khô: 0,01; 0,1 và 1 mg/kg. Các kết quả cho thấy CV% và R% dao động tuỳ từng HCBVTV và tùy từng loại nền mẫu; đa số các trường hợp đều có CV% dưới 15% và R% trong khoảng 80-110%. Điều này khẳng định phương pháp có độ lặp lại và độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu hiện nay của AOAC. -11- Ngoài ra, để đánh giá độ thu hồi, thực hiện thêm chuẩn trên nền mẫu thực (mẫu đã phát hiện có HCBVTV) gồm trinh nữ hoàng cung, cỏ ngọt, mã đề. Thêm các chuẩn của các HCBVTV đã được phát hiện vào mẫu, phân tích lặp lại 3 lần đối với cả mẫu trắng và mẫu thêm. Độ thu hồi đạt được trên nền mẫu thực khá tốt, tất cả các kết quả đều trên 70% với các khoảng nồng độ thêm chuẩn khác nhau từ 0,05 đến 0,5 mg/kg. 3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trên một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu 3.3.1. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi Dược liệu tươi được lấy tại vườn của một số vùng trồng dược liệu ở Hà Nội và Hưng Yên. Thời điểm lấy mẫu là ngay giai đoạn thu hoạch hoặc sau khi vừa thu hoạch xong. Số lượng mẫu đã lấy gồm 22 loại dược liệu, trong đó chủ yếu là các loại dược liệu lấy lá. Các kết quả cho thấy có 8/22 mẫu (khoảng 36%) đã được phát hiện có HCBVTV vượt MRL (0,01 mg/kg). Carbendazim và azoxystrobin là các HCBVTV được phát hiện nhiều nhất trong 3 mẫu và carbendazim cũng là hợp chất có hàm lượng cao nhất (0,39 mg/kg). 3.3.2. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô Các mẫu được liệu khô được lấy tại 3 địa điểm, với tổng số mẫu là 30 mẫu. Đa số các mẫu dược liệu đều không có nguồn gốc, được bày bán tại chợ thuốc Ninh Hiệp (Hà Nội) và các quầy thuốc đông y tại Lãn Ông (Hà Nội). Một số mẫu được lấy ở Hải Hậu (Nam Định) trong đó gồm các mẫu được công ty dược đặt hàng sản xuất (dây thìa canh, đinh lăng). Trong số 30 mẫu dược liệu được phân tích có 7 mẫu (khoảng 23%) có chứa HCBVTV, trong đó tần suất xuất hiện lớn nhất là các HCBVTV nhóm neonicotinoid với 4/7 mẫu. Các mẫu dược liệu được sản xuất theo tiêu chuẩn GACP đều không phát hiện thấy HCBVTV. 3.3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược - Tổng số mẫu được phân tích: 140 mẫu trong đó số mẫu phát hiện HCBVTV (nồng độ trên 0,01 mg/kg): 41 mẫu chiếm 29,3%. - Các HCBVTV phát hiện và số lượng như sau: chlorpyrifos: 12 mẫu, imidacloprid: 8 mẫu, cypermethrin: 7 mẫu, permethrin: 6 mẫu, acetamiprid: 6 mẫu, carbofuran: 5 mẫu, fenobucarb: 4 mẫu, azoxystrobin: 3 mẫu, dimethoat: 2 mẫu, abamectin: 2 mẫu, endosulfan sulfat: 2 mẫu và trichlorfon: 1 mẫu. Trong đó, riêng hợp chất endosulfan sulfat là HCBVTV nhóm clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng nhiều năm nay nhưng vẫn có mặt trong 2 mẫu với hàm lượng là 0,033 và 0,10 mg/kg. - Các mẫu TPCN được thống kê theo nhóm sản phẩm, ba nhóm sản phẩm được đánh giá gồm: nhóm sản phẩm dạng viên; nhóm sản phẩm dạng túi, trà; và nhóm sản phẩm dạng nước ép. Tỷ lệ HCBVTV phát hiện thấy trong các mẫu tương đối cao đặc biệt trong các nền mẫu trà thảo dược với tỷ lệ lên đến 40% tổng số mẫu. Nguyên nhân là do trong các nền mẫu trà hàm lượng thảo dược cao hơn các nền mẫu viên và nước ép; đồng thời quá trình xử lý (ảnh hưởng nhiệt, ẩm, ánh sáng) đối với các sản phẩm trà thảo dược khá ít nên HCBVTV bị phân huỷ ít trong quá trình chế biến so với sản phẩm dạng viên (trải qua quá trình đóng nang hoặc dập viên với sự có mặt của các tá dược khác) hoặc dạng nước ép (qua quá trình chiết với dung môi hoặc nước). -12- - Các mẫu TPCN được đánh giá theo nguồn gốc mẫu: nhập khẩu hoặc trong nước. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phát hiện nhiễm HCBVTV ở các mẫu nội địa cao hơn các mẫu nhập khẩu đặc biệt đối với nhóm trà thảo dược. Tỷ lệ phát hiện khá cao trong mẫu nhập khẩu (25-30%) cho thấy TPCN trà thảo dược nhập khẩu vẫn chứa đựng nguy cơ cao. Tỷ lệ phát hiện ở mẫu sản xuất trong nước cao hơn chưa khẳng định được nguyên nhân là từ dược liệu trong nước, vì nhiều loại TPCN được chế biến từ dược liệu nhập khẩu, đa số là từ Trung Quốc. 3.3.4. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh Các mẫu trà xanh được lấy tại các cửa hàng ở Hà Nội, tổng số mẫu là 20 mẫu. Có 10/20 mẫu có phát hiện HCBVTV, tuy nhiên hàm lượng khá thấp, dao động từ 0,004-0,15 mg/kg. Các HCBVTV nhóm neonicotinoid được phát hiện nhiều nhất bao gồm cả imidacloprid, acetamiprid và thiamethoxam. Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Về việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và chế biến dược liệu Qua nghiên cứu ở một số vùng dược liệu ở phía Bắc cho thấy đã có sự thay đổi về loại HCBVTV thường được sử dụng so với các nghiên cứu trước đây. Các HCBVTV nhóm neonicotinoid, macrocyclic lacton được sử dụng bên cạnh các HCBVTV nhóm lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat. 4.1.1. Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh 4.1.1.1. Địa điểm khảo sát Địa điểm được lựa chọn để khảo sát là các địa phương có vùng trồng cây thuốc và kinh doanh dược liệu phổ biến ở phía Bắc. Một số địa phương có vùng trồng dược liệu lớn như ở Hưng Yên, Hải Dương, Nam Định. Một số địa phương có vùng trồng chè xanh lớn gồm Phú Thọ, Thái Nguyên. Ngoài ra, một số cửa hàng ở Hà Giang được khảo sát thêm với mục đích tìm hiểu các HCBVTV được nhập khẩu theo con đường tiểu ngạch từ Trung Quốc. Hà Nội cũng là địa điểm được lựa chọn vì có nhiều địa điểm trồng cây thuốc và kinh doanh dược liệu tươi và khô. 4.1.1.2. Hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh - Có 75 loại HCBVTV được kinh doanh tại các địa chỉ đã khảo sát, trong đó có 9 loại có thành phần gồm 2 hoạt chất, và 2 loại có thành phần gồm 3 hoạt chất. Các loại HCBVTV được nhiều cửa hàng kinh doanh có thành phần chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid (imidacloprid, acetamiprid), nhóm macrocyclic lacton (abamectin, emamectin), nhóm phosphor hữu cơ (chlorpyrifos) và nhóm pyrethroid (cypermethrin). Kết quả này cho thấy xu hướng sử dụng HCBVTV hiện nay, đó là sử dụng các HCBVTV ít độc hơn và phối hợp nhiều thành phần trong cùng một loại thuốc. Trong số này, các hợp chất nhóm phosphor hữu cơ và nhóm pyrethroid đã được quan tâm từ lâu, nhưng các hợp chất nhóm neonicotinoid và nhóm macrocyclic lacton vẫn chưa được quan tâm. Hiện nay, yêu cầu về công bố sản phẩm của Bộ Y tế chỉ xác định 4 nhóm chính là nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat và pyrethroid. -13- - Về số lượng hoạt chất được sử dụng, trong tổng số 39 hoạt chất có 9 hoạt chất (20 tên thương mại) nhóm phosphor hữu cơ cho thấy nhóm này vẫn đang được sử dụng phổ biến nhất. Ngoài ra, các nhóm carbamat, neonicotinoid, pyrethroid, macrocyclic lacton cũng là các nhóm phổ biến (từ 10-12 tên thương mại). Không có hoạt chất nhóm clor hữu cơ được kinh doanh. Kết quả này cùng với số lượng cơ sở kinh doanh, một lần nữa khẳng định xu hướng sử dụng HCBVTV hiện nay. Các loại HCBVTV có độc tính cao thuộc nhóm clor hữu cơ đã được loại bỏ hoàn toàn. - Trong 75 loại HCBVTV, có 56 loại là thuốc trừ sâu (74,7%), 9 loại thuốc trừ nấm (12,0%) và 8 loại thuốc trừ cỏ (10,7%), chỉ có 1 loại thuốc tăng trưởng (acid giberellic) và 1 loại thuốc trừ chuột (kẽm phosphid). Như vậy, mục đích việc sử dụng HCBVTV trong nông nghiệp nói chung và trong trồng cây thuốc nói riêng nhằm trừ sâu hại. - Việc khảo sát dựa trên cơ sở phiếu hỏi và danh sách HCBVTV của cửa hàng kinh doanh. Tuy nhiên, có một số loại HCBVTV không được bán tại các cửa hàng vật tư nông nghiệp mà chỉ được mua bán truyền tay. Việc tìm hiểu các loại HCBVTV này phải thông qua những người dân địa phương. Các loại HCBVTV thu thập được đều không có thông tin về hoạt chất và hàm lượng bằng tiếng Việt hay tiếng Anh. Các hoạt chất này chỉ được xác định sau khi phân tích tại PTN. Các sản phẩm này đều thuộc nhóm phosphor hữu cơ, tuy nhiên có thể còn nhiều sản phẩm tương tự đã được sử dụng. Điều này cho thấy, việc quản lý sử dụng HCBVTV còn gặp nhiều khó khăn. 4.1.2. Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc - Theo kết quả khảo sát sơ bộ có 28 loại HCBVTV với 23 hoạt chất được sử dụng, trong đó 9 loại HCBVTV có 2 thành phần và 1 loại HCBVTV có 3 thành phần. Tất cả các hoạt chất này đều phù hợp với các hoạt chất đã được khảo sát tại các cửa hàng kinh doanh HCBVTV. Những hoạt chất này (trừ acid giberellic là chất tăng trưởng) được ưu tiên lựa chọn để đưa vào nghiên cứu phân tích. - Trong số các HCBVTV được sử dụng, nhóm phosphor hữu cơ được dùng nhiều nhất (25% số thuốc và 18% số hoạt chất). Kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát tại các cửa hàng kinh doanh HCBVTV nhưng thấp hơn so với nghiên cứu trước đây của Trần Việt Hùng (36% số thuốc và 37% số hoạt chất). Sự khác biệt là do xu hướng sử dụng các HCBVTV mới thuộc các nhóm neonicotinoid (14% số thuốc và 13% số hoạt chất) và macrocyclic lacton (18% số thuốc và 9% số hoạt chất). Các nhóm khác bao gồm nhóm pyrethroid, nhóm carbamat, nhóm strobin - Trong số các hoạt chất được sử dụng, không có hoạt chất nằm trong danh mục cấm sử dụng hay danh mục hạn chế sử dụng ở Việt Nam. So với kết quả phân tích HCBVTV, có 2 mẫu phát hiện HCBVTV trong danh mục cấm sử dụng (endosulfan sulfat) và 5 mẫu phát hiện HCBVTV trong danh mục hạn chế sử dụng (carbofuran). Có thể thấy rằng, bên cạnh việc sử dụng các HCBVTV có nguồn gốc rõ ràng, còn tồn tại những loại HCBVTV được truyền tay và chưa được kiểm soát. - Các HCBVTV đã được sử dụng cho 24 loại dược liệu khác nhau, đa số đều là thân thảo với các bộ phận dùng chính là lá và hoa. Có 21/28 loại HCBVTV được sử dụng để trừ sâu hại. Điều này phù hợp với nguy cơ bị sâu hại của các bộ phận dùng nói trên. -14- 4.2. Về phương pháp phân tích dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm dược liệu Luận án đã đóng góp một phương pháp phân tích mới áp dụng để phân tích HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu. Phương pháp dựa trên kỹ thuật chiết QuEChERS và phân tích bằng sắc ký lỏng và sắc ký khí khối phổ hai lần có thể áp dụng để phân tích đồng thời nhiều HCBVTV hơn các phương pháp thông thường hiện nay. Hơn nữa, phương pháp mới cũng có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện nay theo Dược điển của các nước, đó là giảm thời gian phân tích, quy trình đơn giản dễ thực hiện, giảm chi phí phân tích, giảm ảnh hưởng đến môi trường và sức khoẻ của kiểm nghiệm viên, đồng thời vẫn đạt được độ chính xác theo yêu cầu. 4.2.1. Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 4.2.1.1. Lựa chọn HCBVTV cho nghiên cứu phân tích Trên cơ sở khảo sát về tình hình kinh danh HCBVTV và sử dụng HVBVTV trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu, các HCBVTV có chứa nguy cơ lớn nhất được lựa chọn để phân tích bao gồm: - Các hoạt chất được sử dụng nhiều trong trồng cây thuốc gồm có abamectin, acetamiprid, acetochlor, atrazin, azoxystrobin, carbaryl, carbendazim, chlorpyrifos, cypermethrin, dimethoat, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, permethrin, tebuconazol, thiamethoxam, trichlorfon. - Một số hoạt chất thường gặp nhất có trong thành phần các thuốc được kinh doanh phổ biến (trừ các hoạt chất ở trên): aldicarb, chlorothalonil, edifenphos, methiocarb, methomyl, profenofos, propoxur. - Một số hoạt chất có trong thành phần của các thuốc không nguồn gốc: acephat, dichlorvos, carboxin. - Một số hợp chất cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng: aldrin, endosulfan sulfat carbofuran. Các HCBVTV được lựa chọn để nghiên cứu có sự khác biệt rõ so với các nghiên cứu trước đây Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ không được lựa chọn chính do kết quả khảo sát cho thấy không còn được sử dụng. Trong 32 hợp chất được nghiên cứu, có 7 HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ, 7 HCBVTV nhóm carbamat, 3 HCBVTV nhóm neonicotinoid, 2 HCBVTV nhóm pyrethroid, 2 HCBVTV nhóm macrocyclic lacton, 2 HCBVTV nhóm clor hữu cơ và một số HCBVTV thuộc các nhóm khác. Trong danh mục cấm sử dụng còn nhiều HCBVTV nhóm clor hữu cơ, tuy nhiên do nguy cơ nhiễm nhóm này khá thấp nên chỉ có aldrin và endosulfan sulfat được lựa chọn nhằm đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp trên nhóm HCBVTV này. Ngoài ra, một số HCBVTV khác cũng được sử dụng, tuy nhiên do thiếu chất chuẩn nên chưa được thực hiện phân tích. Các chất này bao gồm: buprofezin, fenitrothion, cyhalothrin và acid gibberellic. Trong số 32 HCBVTV được lựa chọn, có 7 HCBVTV cho hiệu quả phân tích tốt hơn với GC, một số HCBVTV có thể phân tích đồng thời bằng GC và LC, còn đa số hợp chất cần sử dụng LC để phân tích. 4.2.1.2. Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu -15- Dược liệu rất đa dạng về chủng loại, tuy nhiên để phù hợp với các đối tượng có nguy cơ nhiễm HCBVTV nhất, các loại dược liệu có bộ phận dùng chính là lá, thân thảo được lựa chọn. Hai loại dược liệu tươi được sử dụng để thẩm định phương pháp là mã đề và bồ công anh. Hơn nữa, quy trình chiết HCBVTV trên mẫu dược liệu tươi và các mẫu khô có sự khác biệt, dược liệu khô được khảo sát riêng. Để đánh giá ảnh hưởng của pH nền mẫu đến quy trình chiết, hai loại dược liệu khô là dây thìa canh (môi trường trung tính) và lá giang (môi trường acid) được lựa chọn để khảo sát. Sản phẩm từ dược liệu được nghiên cứu này là thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược. Trong các loại TPCN, sản phẩm dạng trà thảo dược chứa nguy cơ nhiễm HCBVTV lớn nhất do có quy trình sản xuất đơn giản (chủ yếu là xay nhỏ và đóng gói). Trà mướp đắng đã được sử dụng để thẩm định phương pháp. Ngoài ra, để đánh giá khả năng áp dụng phương pháp trên các nền mẫu dược liệu chứa nhiều tannin hay polyphenol, chè xanh (khô) đã được sử dụng. Việc lựa chọn các đối tượng mẫu rất đa dạng cho thấy khả năng áp dụng rộng của phương pháp QuEChERS được nghiên cứu trên dược liệu. 4.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát và lựa chọn được các điều kiện tối ưu của phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS áp dụng trên các nền mẫu dược liệu và sản phẩm dược liệu. Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam, phương pháp QuEChERS được nghiên cứu để xác định dư lượng HCBVTC trên nền mẫu dược liệu. Các kết quả cho thấy phương pháp có nhiều ưu điểm so với các phương pháp hiện nay được quy định tại Dược điển Việt Nam: - Phương pháp có thể áp dụng trên dải rộng nhiều loại HCBVTV trên nhiều loại nền mẫu dược liệu có bản chất khác nhau. Theo các kết quả thu được ở chương 3, độ thu hồi của hầu hết các HCBVTV nghiên cứu nằm trong khoảng từ 80-110%; độ thu hồi của tất cả các HCBVTV nghiên cứu đều trong khoảng 70-120%. Do đó, phương pháp có thể ứng dụng để sàng lọc nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích. - Bên cạnh việc sàng lọc, phương pháp đã được ứng dụng để định lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu. Các kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ chính xác tốt và độ nhạy đáp ứng được yêu cầu. - Phương pháp sử dụng ít dung môi (15 mL acetonitril), không sử dụng các dung môi có tính độc hại cao do đó một mặt giảm ảnh hưởng đến sức khỏe kiểm nghiệm viên, giảm các ảnh hưởng đến môi trường, mặt khác tiết kiệm chi phí phân tích. - Sử dụng kỹ thuật làm sạch với chiết phân tán pha rắn, không cần thực hiện làm sạch bằng sắc ký cột như quy định theo Dược điển Việt Nam. Quy trình chiết nhanh, tổng thời gian xử lý 1 lô 6 mẫu chỉ chưa đến 30 phút mà vẫn đảm bảo được hiệu quả làm sạch mẫu cũng như độ chính xác của phương pháp. - Phương pháp QuEChERS hướng đến khả năng chiết xuất đồng thời nhiều HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhau ở nhiều nồng độ khác nhau trong cùng một lần xử lý mẫu. Phương pháp QuEChERS được nghiên cứu và tối ưu trên nền mẫu rau quả, tuy nhiên khi áp -16- dụng trên nền mẫu dược liệu cần phải có những điều chỉnh thích hợp để đạt được hiệu suất chiết tốt nhất. 4.2.2.1. Lượng mẫu ban đầu Nhằm mục đích giảm thiểu dung môi, giảm các bước chiết phương pháp QuEChERS hướng đến giảm lượng mẫu ban đầu. Các phương pháp trước đó thường sử dụng khoảng 20- 50 g mẫu (đối với mẫu tươi). Phương pháp QuEChERS chỉ sử dụng ≤ 15 g mẫu. Việc giảm lượng mẫu giúp quá trình chiết được thực hiện dễ dàng hơn, giảm lượng dung môi, hoá chất sử dụng. Tuy nhiên, khi giảm lượng mẫu, đòi hỏi quá trình đồng nhất phải tốt để phần mẫu đem phân tích đủ đại diện cho mẫu. Để đảm bảo độ đồng nhất, một lượng mẫu đủ lớn (khoảng 1 kg trở lên) cần được cắt và nghiền nhỏ bằng dụng cụ xay nghiền thích hợp. Đối với các loại dược liệu tươi, lượng mẫu được sử dụng là 15 g trong ống ly tâm 50 mL vì để đảm bảo đủ không gian còn lại cho quá trình lắc khi thêm dung môi và muối chiết. Đối với các mẫu dược liệu khô, cần phải bổ sung nước để đảm bảo độ ẩm của mẫu trong vòng khoảng 70-90%. Việc thêm nước cho phép các dung môi tiếp xúc tốt hơn với mẫu và đảm bảo quá trình tách lớp giữa dịch nước và dung môi hữu cơ khi cho thêm muối. Lượng mẫu được lựa chọn đối với các nền mẫu khô là 3 g và tiến hành thêm nước với tỷ lệ mẫu : nước là 1 : 5 (v/v). So với một số nghiên cứu tương tự trên các nền mẫu khô, các tác giả cũng bổ sung thêm nước vào một lượng mẫu nhất định (từ 2-3 g) và với tỷ lệ mẫu : nước thông thường là 1 : 5 (v/v). Về thời gian ngâm các mẫu khô trong nước, kết quả cho thấy sau 15 phút từ khi lắc mẫu với nước, hàm lượng HCBVTV có xu hướng giảm dần. Nguyên nhân của hiện tượng này có lẽ do một số HCBVTV bị chuyển hoá trong môi trường nước hoặc do nước làm hoà tan nhiều hợp chất khác từ nền mẫu gây ảnh hưởng đến khả năng chiết HCBVTV. 4.2.2.2. Dung môi chiết và loại dung dịch đệm Acetonitril là dung môi cho hiệu quả tốt nhất trong QuEChERS do có nhiều ưu điểm hơn một số dung môi khác như aceton và ethyl acetat. Thứ nhất, acetonitril có thể trộn lẫn với nước nhưng có thể tách lớp với nước khi thêm các muối. Thứ hai, acetonitril không kéo theo nhiều tạp chất như lipid hoặc protein, muối nên dịch chiết mẫu sạch hơn. Hơn nữa, acetonitril là dung môi phù hợp với cả sắc ký lỏng và sắc ký khí. Nói chung, đa số các HCBVTV có thể chiết được bằng acetonitril theo phương pháp QuEChERS. Tuy nhiên, đối với các HCBVTV phụ thuộc pH hoặc kém bền trong môi trường kiềm hoặc acid lại cho độ thu hồi thấp khi không sử dụng đệm. Có thể dùng đệm acetat hoặc citrat. Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, cần phải sử dụng đệm để đảm bảo có được hiệu suất chiết cao trên các nền mẫu có tính acid. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây, điển hình là kết quả của Lehotay và cộng sự khi nghiên cứu trên nền rau quả. 4.2.2.3. Nội chuẩn Các nghiên cứu cho thấy, phương pháp QuEChERS cho kết quả tốt mà không cần sử dụng nội chuẩn. Tuy nhiên, để tránh những ảnh hưởng chưa biết trong quá trình chiết, nội chuẩn đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Trong kỹ thuật sắc ký khối phổ, nội chuẩn tốt nhất là nội chuẩn đồng vị của từng HCBVTV. Trong thực tế, không thể dùng đồng vị cho tất các các HCBVTV. -17- Triphenylphosphat (TPP) qua khảo sát có thể được dùng để làm nội chuẩn do chất này có những tính chất tương tự phần lớn các HCBVTV. Với các kết quả thu được, TPP có thể được sử dụng làm nội chuẩn trong phương pháp QuEChERS. 4.2.2.4. Muối chiết Cả ba phiên bản của phương pháp QuEChERS đều sử dụng muối MgSO4 khan với lượng 0,4 g cho mỗi mililit dịch chiết acetonitril (6 g cho 15 mL dịch chiết). MgSO4 đóng vai trò quan trọng trong tách lớp giữa acetonitril và nước. Thực tế sau khi ly tâm, vẫn còn một lượng nước trong lớp dung môi acetonitril (khoảng 8% xác định được bằng NMR), lượng nước này có vai trò hoà tan các HCBVTV phân cực và chiết HCBVTV không phân cực không tan trong hỗn hợp dung môi ban đầu (acetontril-nước khoảng 1:1). Các nghiên cứu của Anastassiades và cộng sự trên nhiều loại muối khác nhau gồm LiCl, MgCl2, NaCl, NaNO3, Na2SO4, MgSO4 cho thấy MgSO4 cho hiệu quả tốt nhất. Các nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng đồng thời MgSO4 và NaCl với tỷ lệ 4:1 cho hiệu quả chiết tốt nhất. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ MgSO4 và NaCl cũng được giữ cố định 4:1. Natri acetat được thêm vào muối chiết, tuy nhiên vai trò thực sự của nó là tạo hệ đệm với acid acetic có trong thành phần của dung môi acetonitril. Hệ đệm acetat này có vai trò đảm bảo pH của dịch chiết ban đầu (dịch chiết acetonitril) trong khoảng từ 4,5-5,0 là pH tối ưu để chiết phần lớn HCBVTV. 4.2.2.5. Làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn Chiết phân tán pha rắn (d-SPE) là bước làm sạch tạo nên hiệu quả của phương pháp QuEChERS. Trong đó, chất hấp phụ PSA đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm sạch. PSA là một chất hấp phụ trao đổi anion yếu trên nền silica dùng để hấp phụ các acid béo, acid hữu cơ. Vì có chứa nhóm amin bậc hai, PSA có tác dụng tốt hơn aminopropyl trong việc làm sạch. Theo kết quả thu được, lượng PSA được sử dụng là 40 mg cho nền mẫu dược liệu và sản phẩm dược liệu. Khi tăng PSA có thể làm tăng hiệu quả chiết nhưng để tiết kiệm chi phí, lượng PSA 40 mg đã được chọn. Kết quả này không có nhiều khác biệt so với các nghiên cứu trước đây. Lượng PSA sử dụng trong phương pháp QuEChERS ban đầu là 25 mg với mỗi mililit dịch chiết. Sau đó, Lehotay tăng PSA lên 50 mg trên mỗi mililit dịch chiết. Đối với các mẫu chứa nhiều acid béo như ngũ cốc, Mastovska còn sử dụng lượng PSA đến 150 mg cho mỗi mililit dịch chiết. Trong bước d-SPE, MgSO4 khan có vai trò loại lượng nước còn dư trong dịch chiết acetonitril. Lượng MgSO4 được sử dụng là 150 mg cho mỗi mililit dịch chiết. Theo nghiên cứu của Lehotay, lượng nước có chứa trong dịch chiết acetonitril khoảng 8%. Nếu sử dụng 150 mg MgSO4 khan, lượng nước trong dịch chiết cuối cùng khoảng 1-2%. Đây là tỷ lệ chấp nhận được khi phân tích trên GC. Việc sử dụng thêm GCB có tác dụng làm sạch các sterol, clorophyl và các chất có cấu trúc phẳng. GCB do vậy cũng lưu giữ các thuốc trừ sâu có cấu trúc phẳng. Sử dụng 7,5 mg GCB với mỗi mililit dịch chiết cho độ thu hồi khoảng 70% với các thuốc trừ sâu dạng phẳng trong khi loại được khoảng 90% clorophyl. Thực tế, khi tăng GCB cao hơn, hiệu quả làm sạch thu -18- được tốt hơn nhưng hiệu suất đa số HCBVTV lại giảm. Do đó, sử dụng 7,5 mg GCB cho mỗi mililit dịch chiết là phù hợp nhất. 4.2.2.6. Sử dụng muối chì acetat trong xử lý mẫu chè Một đóng góp quan trọng trong nghiên cứu này là việc sử dụng muối chì acetat để kết tủa tannin trong nền mẫu chè, giúp giảm ảnh hưởng nền nhờ đó tăng hiệu suất chiết HCBVTV. Việc sử dụng chì acetat có thể được mở rộng trên các loại dược liệu có chứa nhiều tannin khác. Đây là là một kết quả mới chưa thấy báo cáo trong các nghiên cứu trước đây. Nguyên lý của quy trình xử lý này là ion Pb2+ sẽ tạo phức với tannin tạo thành chì (II) tannat, phức này kết tủa và được loại khỏi pha lỏng nhờ quá trình ly tâm. Pb2+ dư hòa tan vào pha nước và được tách khỏi dung môi chiết (acetonitril) nhờ phân bố lỏng lỏng với các muối MgSO4 và NaCl. Do đó, lượng dư Pb2+ không ảnh hưởng đến phân tích trên thiết bị. Để đánh giá hiệu quả của việc xử lý mẫu với chì acetat, có thể sử dụng giá trị ảnh hưởng nền (%ME). Kết quả so sánh ảnh hưởng nền theo phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền theo nghiên cứu của Raski trên nền mẫu chè cho thấy có nhiều HCBVTV cho ảnh hưởng nền thấp hơn theo phương pháp nghiên cứu, trong khi đó chỉ có 2 HCBVTV cho ảnh hưởng nền thấp hơn theo phương pháp của Raski. Do đó, có thể thấy rằng việc sử dụng chì acetat đã góp phần làm sạch mẫu tốt hơn đối với nền mẫu chè. 4.2.3. Về phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ Các phương pháp xác định HCBVTV hiện nay theo quy định của Dược điển Việt Nam chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký khí với các detector NPD và ECD. Việc sử dụng đồng thời cả hai kỹ thuật sắc ký khí và sắc ký lỏng khối phổ đã mở rộng rất đáng kể phạm vi áp dụng trên nhiều loại HCBVTV hơn. 4.2.3.1. Sắc ký lỏng khối phổ Quá trình phân tích bằng LC-MS/MS gồm hai giai đoạn: tách bằng LC và xác định bằng MS/MS. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo đã được sử dụng với pha tĩnh là cột C18 và pha động là hỗn hợp methanol và acid acetic 1% trong nước. Đây là các điều kiện phân tích sắc ký lỏng rất cơ bản và có thể dễ dàng áp dụng. Chế độ gradient đã được nghiên cứu nhằm tách được các chất phân tích khỏi nền mẫu đồng thời đưa điều kiện pha động về trạng thái ban đầu để phân tích các mẫu tiếp theo. Với các điều kiện này, có nhiều HCBVTV chưa tách khỏi nhau hoàn toàn. Tuy nhiên, việc sử dụng detector MS/MS có tính chọn lọc rất cao đã giúp tách các HCBVTV về tín hiệu. Trong MS/MS, mỗi HCBVTV khi được ion hoá, có thể tạo thành nhiều loại ion khác nhau tuỳ thuộc vào kỹ thuật ion hoá và chế độ ion dương hay âm. Phương pháp nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ion hoá ESI, chế độ ion dương thông thường tạo được ion phân tử là [M+H]+ ngoài ra, có thể tạo thành một số ion khác như [M+CH3OH]+, [M+Na]+ Mỗi ion phân tử khi đi qua tứ cực thứ hai lại được bắn phá để tạo thành các ion sản phẩm, hai ion được lựa chọn là hai ion có cường độ cao nhất. Khi sử dụng các detector thông thường như UV-VIS, FL thì hiệu quả tách của sắc ký lỏng đóng vai trò rất quan trọng. Tuy nhiên, khi sử dụng detector khối phổ đặc biệt là khối phổ hai lần thì hiệu quả tách của sắc ký lỏng ít ảnh hưởng đến kết quả do tính chọn lọc cao của -19- detector MS. Mỗi HCBVTV được đặc trưng bởi các ion phân tử, ion sản phẩm khác nhau do đó, mặc dù trong sắc ký lỏng có thể không hoàn toàn tách khỏi nhau, nhưng qua khối phổ tín hiệu của các chất được tách khỏi nhau hoàn toàn. Trong phương pháp đã xây dựng, một số HCBVTV rửa giải khá gần nhau như trichlorfon và dichlorvos; carboxin và carbaryl; isoprocarb và atrazin; edifenphos, tebuconazol và TPP, tuy nhiên hiệu quả tách bằng khối phổ vẫn đảm bảo. Chế độ gradient trong phương pháp có vai trò tách các HCBVTV khỏi những thành phần của nền mẫu, trong đó các thành phần có tính phân cực cao thường rửa giải ở giai đoạn đầu (0-3 phút) và các thành phần ít phân cực được rửa giải ở giai đoạn cuối. Việc tách khỏi các thành phần nền giúp giảm ảnh hưởng của nền mẫu đối với quá trình ion hoá và kéo theo là độ chính xác của khối phổ. Trong phương pháp đã xây dựng, thời gian lưu của các HCBVTV dao động từ 4-14 phút, trong đó đa số các hợp chất được rửa giải từ 7-11 phút; điều này giúp phần nào giảm được ảnh hưởng nền. Mặc dù về lý thuyết, sắc ký lỏng khối phổ có thể ứng dụng để phân tích được hầu hết HCBVTV. Tuy nhiên đối với một số hợp chất rất phân cực thì khó lưu giữ khi sử dụng sắc ký pha đảo. Ngược lại đối với các hợp chất không phân cực, thì quá trình ion hoá không thực hiện được. Có thể sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác như APCI, APPI tuy nhiên việc áp dụng rất khó khăn vì cần quá trình chuyển nguồn dung môi. Đối với HCBVTV, theo nghiên cứu của Alder và cộng sự cho thấy có 49 HCBVTV trong số 500 HCBVTV không cho tín hiệu đối với LC-MS/MS khi sử dụng nguồn ion hoá ESI ở cả hai chế độ ion dương và âm. Do đó, để có thể phân tích được các HCBVTV này, cần phối hợp thêm các kỹ thuật phân tích khác trong đó GC-MS/MS là lựa chọn tốt nhất. 4.2.3.2. Sắc ký khí khối phổ Trong vài thập kỷ gần đây, sắc ký khí với các detector ECD, NPD hay MS đã được nhiều tác giả nghiên cứu để phân tích HCBVTV cho thấy khả năng ứng dụng tốt đối với các HCBVTV nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và pyrethroid. Tuy nhiên, bản thân sắc ký khí không thể phân tích trực tiếp được tất cả các HCBVTV. Đối với các chất khó bay hơi, các chất bền nhiệt hay các hợp chất có độ phân cực cao rất khó để thực hiện phân tích bằng GC. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật GC-MS/MS với nguồn ion hoá EI, bộ phân tích khối ba tứ cực được sử dụng cho thấy có thể phân tích khá nhiều HCBVTV. Nhiều HCBVTV có thể phân tích đồng thời bằng cả LC-MS/MS và GC-MS/MS. So với GC-MS/MS, kỹ thuật LC-MS/MS có thể cho độ nhạy tốt hơn ít nhất là 5 lần. Nếu áp dụng trên các nền mẫu khô, cần phải làm giàu mẫu trước khi phân tích bằng GC-MS/MS để đáp ứng được mức MRL 0,01 mg/kg (10 µg/kg). Trong nghiên cứu này đối với các HCBVTV có thể phân tích được đồng thời bằng cả hai kỹ thuật, LC-MS/MS được ưu tiên lựa chọn do ưu điểm về độ nhạy. Tuy nhiên, đối với các phòng thí nghiệm không được trang bị thiết bị LC- MS/MS có thể sử dụng GC-MS hoặc GC-MS/MS đối với các HCBVTV này. 4.2.4. Về kết quả thẩm định phương pháp 4.2.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc Cả hai kỹ thuật LC-MS/MS và GC-MS/MS đều có tính đặc hiệu cao, sự có mặt của bất kỳ HCBVTV nào cũng được khẳng định chắc chắn thông qua ion phân tử và hai ion sản phẩm. -20- Theo quyết định 657/2002 của Uỷ ban Châu Âu, tính đặc hiệu có thể được đánh giá thông qua số điểm nhận dạng (IP) và tỷ lệ các ion định tính và định lượng. Số điểm IP cần phải đạt là 4 điểm. Trong đó, mỗi ion mẹ được tính là 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm. Như vậy, theo các kết quả thu được số điểm IP có thể đạt được trong phương pháp này là từ 4-5 điểm, đáp ứng được yêu cầu đề ra. Tỷ lệ các ion định tính và định lượng cũng được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu. Tỷ lệ ion trên mẫu thử so với tỷ lệ ion trên chuẩn đã được sử dụng trong đánh giá phương pháp theo phần mềm đi kèm từng thiết bị. Do đó, tính đặc hiệu của phương pháp phân tích được đảm bảo tốt hơn. 4.2.4.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Trong khoảng nồng độ từ 2 đến 200 ng/mL (tương đương trên các nền mẫu tươi là từ 2-200 µg/kg và nền mẫu khô là từ 10-1000 µg/kg), tất các các chất phân tích nghiên cứu đều cho thấy độ tuyến tính đạt yêu cầu. Khoảng nồng độ này đã bao trùm được giá trị MRL của các HCBVTV do đó đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong thực tế. Trong nghiên cứu này, đối với các mẫu có nồng độ cao hơn 200 ng/mL, tiến hành pha loãng dịch chiết mẫu trước khi phân tích. Đường chuẩn phân tích các HCBVTV được xây dựng trên nền mẫu nhằm loại trừ các ảnh hưởng nền. Tuy nhiên, không thể xây dựng đường chuẩn trên tất cả các nền mẫu nghiên cứu. Do đó, các nền mẫu đại diện cho từng nhóm sản phẩm được xây dựng. Khi ứng dụng các đường chuẩn này cho các sản phẩm khác trong nhóm, các sai số nếu có được giảm thiểu thông qua việc sử dụng nội chuẩn. 4.2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thu được trong nghiên cứu này khá tương đồng với các kết quả của các nghiên cứu trên thế giới. Các tác giả đều cố gắng, bằng cách này hay cách khác, đạt được khả năng phân tích tại nồng độ 0,01 mg/kg. Trong nghiên cứu này, tất cả các chất phân tích đều có thể định lượng được tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng mức 0,01 mg/kg. Các kết quả cũng cho thấy LC-MS/MS cho thấy có nhiều thuận lợi hơn so với GC-MS/MS vì có độ nhạy tốt hơn và thời gian phân tích ngắn hơn. Đối với GC-MS/MS để đảm bảo khả năng phân tích tốt tại nồng độ 0,01 mg/kg cần trải qua quá trình làm giàu. Mẫu được làm giàu 5 lần trước khi tiêm vào GC-MS/MS. 4 mL dịch chiết được sử dụng trong bước làm sạch d- SPE (600 mg MgSO4 khan, 160 mg PSA và 30 mg GCB), sau đó 2,5 mL dịch chiết được lấy ra, thổi khô bằng dòng khí N2 ở 40 oC và hoà cặn trong 0,5 mL acetonitril chứa 1% acid acetic sau đó tiêm vào GC-MS/MS. Một số nghiên cứu trước đây cũng sử dụng kỹ thuật cô mẫu để đảm bảo độ nhạy cần thiết. Ngoài ra, một số tác giả sử dụng các bộ tiêm mẫu thể lớn như bộ tiêm mẫu PTV, có thể tiêm đến 5 µL mẫu. 4.2.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi Các kết quả về độ lặp lại và độ thu hồi trên các nền mẫu khác nhau, tại 3 nồng độ thấp (0,01 mg/kg), trung bình (0,1 mg/kg) và cao (1 mg/kg) cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt và độ thu hồi đáp ứng được yêu cầu. Kết quả này khá tương đồng so với các nghiên cứu trước đây. Kết quả so sánh độ lặp lại (thông qua RSD%) và độ thu hồi (R%) của phương pháp -21- nghiên cứu so với một số nghiên cứu gần đây sử dụng cùng kỹ thuật phân tích và phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS cho thấy độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp QuEChERS nghiên cứu rất tốt. Tuy nhiên đây là một phương pháp phân tích đa dư lượng, do đó đối với một số HCBVTV vẫn còn cho độ thu hồi chưa đạt yêu cầu. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp nghiên cứu khá tương đồng so với các kết quả của một số nghiên cứu trước đây trên thế giới. 4.3. Về dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu Tỷ lệ phát hiện HCBVTV trên các mẫu dược liệu tươi được lấy tại một số vùng trồng lân cận Hà Nội vượt giới hạn MRL 0,01 mg/kg là 36% (8/22 mẫu), trong khi đó tỷ lệ phát hiện HCBVTV trên các mẫu dược liệu khô được lấy tại các chợ dược liệu chính ở Hà Nội là 30% (8/27 mẫu). Dược liệu tươi có tỷ lệ phát hiện cao hơn do chưa trải qua quá trình chế biến gồm việc phơi, sấy Tuy nhiên, do nguồn gốc các mẫu dược liệu khô bao gồm cả dược liệu được nhập khẩu từ nước ngoài (phần lớn là Trung Quốc), nên chưa đủ cơ sở để đánh giá mỗi liên hệ giữa dư lượng HCBVTV trong dược liệu tươi và dược liệu khô. Tỷ lệ phát hiện trung bình khoảng 30% cho thấy một tỷ lệ khá lớn dược liệu có chứa HCBVTV. Tuy nhiên, cỡ mẫu phân tích còn nhỏ do đó chưa thể đánh giá toàn diện về chất lượng dược liệu trên thị trường hiện nay. Đây là lần đầu tiên một số nhóm HCBVTV mới đã được nghiên cứu và phân tích trong dược liệu và sản phẩm dược liệu. Các nghiên cứu trước đây chỉ xác định các HCBVTV nhóm clor hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid. Nghiên cứu này đã cho thấy các HCBVTV được phát hiện chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid (imidacloprid và acetamiprid). Ngoài ra cypermethrin, chlorpyrifos, carbendazim và carbofuran cũng được phát hiện trên nhiều mẫu. Kết quả này có sự khác biệt so với nghiên cứu trước đây của Trần Việt Hùng năm 2005, các HCBVTV được phát hiện chính là DDT, cypermethrin và trichlorfon. Điều này cho thấy xu hướng sử dụng HCBVTV có sự thay đổi, đòi hỏi việc phân tích và yêu cầu quản lý cũng phải thay đổi để có thể kiểm soát tốt hơn dư lượng HCBVTV trong dược liệu nói riêng và nông nghiệp nói chung. So với một số nghiên cứu về dược liệu ở Trung Quốc, tỷ lệ mẫu phát hiện HCBVTV khá lớn. Nghiên cứu của Chen và cộng sự đã phát hiện dư lượng HCBVTV trong 95/138 mẫu phân tích, chiếm 69%. Các HCBVTV được phát hiện với tần suất nhiều nhất bao gồm carbendazim, carbofuran, propoxur, triazophos và acetamiprid. Như vậy, ngoại trừ triazophos, các thành phần còn lại được phát hiện khá tương đồng với kết quả thu được trong nghiên cứu này. Một nghiên cứu khác của Nguyen và cộng sự trên dược liệu của Hàn Quốc, cho thấy chỉ có 4,9% (11/224) mẫu dược liệu có dư lượng HCBVTV. Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ sử dụng GC-MS/MS nên không phát hiện được một số HCBVTV phân tích bằng LC-MS/MS, điển hình là các HCBVTV nhóm neonicotinoid (imidacloprid, acetamiprid). Đối với các sản phẩm dược liệu, nghiên cứu này chỉ xác định HCBVTV trong một số loại TPCN dạng viên, dạng trà và dạng nước ép. Đây là các sản phẩm được sử dụng ngay không qua qua trình chế biến như đun nấu nên nguy cơ đối với sức khoẻ cao hơn. Tỷ lệ phát hiện cao (29,3%), đặc biệt sản phẩm trà thảo dược (40%) cho thấy thực sự đây là một mối lo ngại đối với người sử dụng. -22- Trong các mẫu TPCN, còn phát hiện thấy HCBVTV đã bị cấm (endosulfan sulfat) hay HCBVTV hạn chế sử dụng (carbofuran). Một số mẫu phát hiện thấy hàm lượng rất cao của chlorpyrifos và cypermethrin, permethrin. Đây là các HCBVTV truyền thống đã được sử dụng rất phổ biến từ trước đến nay. Những HCBVTV này đang được BYT kiểm soát (Bộ Y tế quy định kiểm soát HCBVTV thuộc 4 nhóm: clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat và pyrethroid). Tuy nhiên, ngoài các HCBVTV truyền thống này, còn phát hiện thấy một số HCBVTV mới điển hình là nhóm neonicotinoid (acetamiprid, imidacloprid). Các HCBVTV này vẫn chưa được kiểm soát đúng mức, do đó cần có những chế tài phù hợp để kiểm soát các loại HCBVTV mới này. Chè xanh là một loại nông sản rất phổ biến ở Việt Nam và cũng là một loại dược liệu đặc biệt. Tỷ lệ mẫu chè xanh được phát hiện thấy HCBVTV rất cao (chiếm đến 50%). Hiện nay, chè Việt Nam không hoặc rất khó xuất khẩu được vào các thị trường khó tính như châu Âu, Nhật Bản và Mỹ do chưa kiểm soát được dư lượng HCBVTV. Nhiều lô chè của Việt Nam đã bị các nước này trả lại do nhiễm HCBVTV, do nhiễm hai HCBVTV là imidacloprid và acetamiprid. Điều này phù hợp với các kết quả nghiên cứu này, khi phần lớn các HCBVTV chính được phát hiện trên chè thuộc nhóm neonicotinoid gồm có imidacloprid, acetamiprid và thiamethoxam. Các HCBVTV được người trồng chè sử dụng để diệt rầy xanh và bọ cánh đỏ trên chè. Như vậy, các nhà quản lý cần có định hướng để điều chỉnh thói quen sử dụng các HCBVTV trên chè. Về giá trị MRL trên dược liệu và các sản phẩm dược liệu, hiện nay theo Dược điển Việt Nam mới chỉ quy định cho 32 hợp chất, trong đó chủ yếu là các HCBVTV nhóm clor hữu, phosphor hữu cơ và pyrethroid. Phần lớn các HCBVTV hiện nay không còn được sử dụng nữa. Còn quy định 46/2007 của Bộ Y tế chỉ áp dụng đối với các sản phẩm rau quả, thực phẩm. Trong nghiên cứu này, giá trị MRL mặc định (0,01 mg/kg) được chúng tôi sử dụng với mục tiêu hướng đến sự hài hoà với các quy định hiện nay trên thế giới. Khi tham gia vào tổ chức thương mại thế giới, Việt Nam cần đáp ứng được các yêu cầu của các nước. Do đó, việc áp dụng một giá trị MRL mặc định theo như quy định của nhiều nước trên thế giới là cần thiết và phù hợp. Mức MRL mặc định này khá thấp, do đó tỷ lệ phát hiện HCBVTV vượt MRL trên các sản phẩm nghiên cứu khá cao. Qua nghiên cứu về hàm lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm dược liệu, luận án đã có những đóng góp tuy còn khiêm tốn về hảm lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên một số nhóm HCBVTV mới như neonicotinoid, macrocyclic lacton được phát hiện và định lượng. Việc phát hiện nhiều HCBVTV mới trong dược liệu cho thấy cần tăng cường công tác hậu kiểm đối với các HCBVTV này bên cạnh việc thiết lập mức MRL mặc định cho dược liệu và các sản phẩm dược liệu. -23- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả như sau: 1. Qua khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu tại một số địa phương miền Bắc nước ta, nhận thấy: - Các HCBVTV được buôn bán phổ biến gồm 39 hoạt chất với 75 tên thương mại được trong đó nhóm phosphor hữu cơ, nhóm neonicotinoid và nhóm pyrethroid là sẵn có nhất. - Có 23 hoạt chất với 28 tên thương mại được sử dụng chính ở các vùng trồng dược liệu trong đó nhóm phosphor hữu cơ, nhóm neonicotinoid, nhóm pyrethroid được sử dụng phổ biến nhất. 2. Đã nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và một số sản phẩm dược liệu - Đã xác định được các điều kiện LC-MS/MS phù hợp để phân tích đồng thời 25 HCBVTV. Các HCBVTV được tách bằng sắc ký lỏng pha đảo với pha tĩnh C18 theo gradient pha động; phát hiện và định lượng bằng MS/MS với nguồn ion hoá ESI, chế độ ion dương, mỗi chất phân tích được lựa chọn một ion phân tử để tiếp tục phân mảnh tạo ra hai ion sản phẩm cần thiết. - Đã tối ưu được các điều kiện GC-MS/MS để phân tích 7 HCBVTV. Các HCBVTV được tách bằng GC; phát hiện và định lượng bằng MS/MS với nguồn ion hoá EI, mỗi chất phân tích được lựa chọn một ion phân tử để tiếp tục phân mảnh tạo ra hai ion sản phẩm cần thiết. - Đã khảo sát được điều kiện chiết HCBVTV trên các nền mẫu khác nhau theo nguyên lý của phương pháp chiết QuEChERS. Hệ đệm acetat với pH từ 4,5-5,0 được sử dụng nhằm đảm bảo hiệu suất chiết trên các nền mẫu khó. GCB được sử dụng cùng với PSA và MgSO4 trong bước d-SPE để tăng khả năng làm sạch mẫu. Lượng chất hấp phụ phù hợp của GCB là 7,5 mg, còn của PSA là 40 mg cho mỗi mililit dịch chiết. Đối với các dạng mẫu khô, cần bổ sung thêm nước với tỷ lệ nước : mẫu (5:1). - Đối với mẫu có nhiều tanin, chì acetat được sử dụng để tăng khả năng loại tạp và thu được dịch chiết mẫu sạch hơn, giúp giảm ảnh hưởng nền. - Đã đánh giá ảnh hưởng của tất cả các nền mẫu đối với kết quả, việc sử dụng nội chuẩn đóng vai trò quan trọng để giảm các ảnh hưởng của nền mẫu dưới 20%. - Đã thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao, có khả năng định lượng các HCBVTV tại nồng độ thấp hơn MRL 0,01 mg/kg; có độ chính xác đạt yêu cầu với độ lặp lại < 20% và độ thu hồi từ 70-120% cho tất cả các chất; trong đó phần lớn các chất có độ lặp lại < 15% và độ thu hồi từ 80-110%. 3. Đã sơ bộ đánh giá dư lượng của 32 HCBVTV trên các nền mẫu gồm dược liệu tươi, dược liệu khô, TPCN có thành phần thảo dược và chè. Có khoảng 30% số mẫu được phát hiện thấy HCBVTV với hàm lượng vượt MRL 0,01 mg/kg. Các mẫu chè và mẫu TPCN dạng trà túi lọc được phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm cao hơn, lần lượt là 50% và 40%. -24- KIẾN NGHỊ - Các cơ quan ban ngành cần có biện pháp nâng cao nhận thức của người dân về HCBVTV và cách sử dụng chúng trong trồng nông sản và dược liệu. - Cần bổ sung, hoàn thiện các quy định về mức MRL đối với dược liệu và các sản phẩm dược liệu, đặc biệt là TPCN. Quy định về mức MRL cần hướng đến xu hướng hội nhập quốc tế, trong đó quy định về mức MRL mặc định là rất cần thiết. - Cần thiết phải quy định về kiểm soát một số HCBVTV mới hiện nay chưa được chú ý, trong đó điển hình nhất là một số HCBVTV nhóm neonicotinoid. Song song, cần phải tăng cường giám sát, hậu kiểm về dư lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm dược liệu. - Tiếp tục nghiên cứu phân tích dư lượng các HCBVTV khác trong các loại dược liệu và sản phẩm dược liệu khác nhau.  DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Văn Hùng, Trần Thị Thúy, Thái Nguyễn Hùng Thu (2013), "Xác định đa dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược bằng sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ", Tạp chí Phân tích hóa, lý và sinh học, tập 18, 3/2013, 69-77. 2. Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Hoàng Thị Thúy Hằng, Thái Nguyễn Hùng Thu (2013), “Xác định đa dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi bằng phương pháp QuEChERS và sắc ký lỏng khối phổ”, Tạp chí Dược học, 11/2013 (451), 15-20. 3. Trần Cao Sơn, Lê Thị Hồng Hảo, Thái Nguyễn Hùng Thu (2014),"Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong một số thực phẩm chức năng dạng trà thảo dược tại 6 tỉnh miền Bắc Việt Nam năm 2013", Tạp chí Dược học, 5/2014 (457), 37-41. 4. Trần Cao Sơn, Đoàn Hạnh Dung, Lê Thị Hồng Hảo, Thái Nguyễn Hùng Thu (2014), "Xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô bằng QuEChERS và sắc ký lỏng ghép nối khối phổ", Tạp chí Dược học, 8/2014 (460), 13-18. 5. Son Cao Tran, Hao Hong Thi Le, Thu Hung Thai-Nguyen (2014), “Determination of Pesticide Multi-residues in Green Tea using a Modified QuEChERS Extraction and Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Technique”, Acta Alimentaria, Accepted 4/4/2014, ISSN 0139-3006.