Luận văn Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm chất kháng sinh của chủng Trichoderma cf.aureoviride sau đột biến

Cách thực hiện Dịch nuôi cấy các chủng NS trong các điều kiện tối ưu được lọc để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men, điều chỉnh pH tới 7.0 – 7.5. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lổ trên môi trường thạch dùng để nuôi cấy các chủng nấm gây bệnh. Cấy chấm điểm các chủng nấm gây bệnh đối xứng qua lổ thạch. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch thu được vào các lổ khoan. Đối chứng là các đĩa chỉ cấy chấm điểm các chủng nấm gây bệnh đối xứng qua lổ thạch. Quan sát sự phát triển của nấm gây bệnh và xác định hoạt tính đối kháng của dịch KS thô đối với các chủng nấm gây bệnh cây trồng theo quy ước sau: +: hệ sợi nấm bệnh bị ức chế, không mọc được - : hệ sợi nấm bệnh mọc bao trùm cả lỗ thạch CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát đặc điểm của chủng Trichoderma cf.aureoviride và kết quả gây đột biến chủng T. cf.aureoviride bằng tia tử ngoại (tia UV) 3.1.1. Đặc điểm của chủng Trichoderma cf.aureoviride a/ Hình thái: Chủng Trichoderma cf.aureoviride được nuôi cấy chấm điểm trên môi trường thạch MT1, ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày. Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc chủng NS nghiên cứu nhận thấy: Khuẩn lạc tròn, lúc đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh lục. Bề mặt khuẩn lạc xốp, mép KL hình tia, không xuất hiện giọt tiết. Tốc độ phát triển của khuẩn lạc nhanh, đường kính KL đạt 8cm sau 3 ngày, sau thời gian 5-6 ngày khuẩn lạc mọc kín mặt đĩa petri. Mặt trái KL không tiết sắc tố. A B Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng T. cf.aureoviride (A: mặt trên, B: mặt dưới KL sau 7 ngày) Khuẩn ty không màu, phân nhánh, có vách ngăn, không có tế bào màng dày, kích thước của khuẩn ty tương đối đồng đều. Cuống sinh bào tử ngắn, phân nhánh, bào tử trần liên kết. Bào tử hình cầu, màu xanh xuất phát từ đầu trên thể bình, không màu, tập hợp thành các khối tròn ở miệng thể bình, không nhày. Hình 3.2. Hình thái vi thể của chủng T. cf.aureoviride b/ Khả năng sinh CKS Chủng ban đầu T. cf.aureoviride được nuôi cấy trên môi trường lỏng MT 2 đã vô trùng sau thời gian 5 ngày lọc để thu sinh khối và dịch lên men. Kết quả khảo sát sinh trưởng của chủng này là 0,4g và hoạt tính ĐK với B.subtilis là rất mạnh (25,0 mm). Hình 3.3. Hoạt tính ĐK với B. subtilis của chủng gốc T. cf.aureoviride 3.1.2. Kết quả gây đột biến chủng T. cf.aureoviride bằng tia tử ngoại Chủng T. cf.aureoviride được gây đột biến bằng tia tử ngoại theo phương pháp 2.2.1. Sau khi gây đột biến, tiến hành thu các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri (sau đây tạm gọi mỗi khuẩn lạc là một chủng sau đột biến). Qua 4 lần gây đột biến, tổng cộng thu được 75 chủng khác nhau. Các chủng này được tiến hành kiểm tra lại hoạt tính kháng sinh để xác định tác động của tia UV trên chủng gốc. Từ 75 chủng, sau khi kiểm tra hoạt tính nhận thấy có 40 chủng hoạt tính kháng sinh thay đổi và có đến 27 chủng mất hoạt tính kháng sinh (D - d = 0 mm) chiếm tỉ lệ 40,3%. Kết quả ảnh hưởng của tia tử ngoại đối với chủng T. cf.aureoviride được tóm tắt trong bảng 3.1. như sau: Bảng 3.1. Tổng hợp ảnh hưởng của tia tử ngoại đến hoạt tính kháng sinh của các chủng STT Thời gian tác động Số lượng chủng thu được Số lượng chủng mất hoạt tính Số lượng chủng có hoạt tính tăng Số lượng chủng có hoạt tính giảm 1 2 phút 16 7 5 4 2 4 phút 14 5 1 8 3 6 phút 18 8 0 10 4 8 phút 15 8 0 7 5 10 phút 12 7 3 2 6 Tổng cộng 75 35 9 31 Khả năng đối kháng với VSV của các chủng được mô tả ở bảng 3.1 sau. Bảng 3.2. Khả năng đối kháng VSV kiểm định của các chủng đột biến và chủng gốc STT Thời gian tác động Ký hiệu chủng Hoạt tính KS (D-d,mm) E. coli B. subtilis Đối chứng T. cf.aureoviride - 25 1 2 phút ĐB223 - 23 2 ĐB228 - 11 3 ĐB224 - 21 4 ĐB225 - 21 5 ĐB227 - 17 6 ĐB2.23 - 29 7 ĐB2.22 - 29 8 ĐB2.210 - 27 9 ĐB2.27 - 28 1 4 phút ĐB241 - 13 2 ĐB242 - 19 3 ĐB2.41 - 24 4 ĐB2.42 - 27 5 ĐB2.43 - 17 6 ĐB2.44 - 18 7 ĐB2.46 - 24 8 ĐB2.47 - 21 9 ĐB2.49 - 15 1 6 phút ĐB261 - 22 2 ĐB263 - 18 3 ĐB264 - 20 4 ĐB267 - 11 5 ĐB2611 - 08 6 ĐB2612 - 14 7 ĐB2613 - 15 8 ĐB2616 - 23 9 ĐB2618 - 20 10 ĐB2619 - 19 1 8 phút ĐB281 - 19 2 ĐB282 - 21 3 ĐB283 - 07 4 ĐB284 - 13 5 ĐB285 - 14 6 ĐB286 - 17 7 ĐB287 - 23 1 10 phút ĐB101 - 23 2 ĐB102 - 22 3 ĐB108 0.4 32 4 ĐB104 - 24 5 ĐB106 - 25 Qua kiểm tra khả năng đối kháng của các chủng đối với VSV kiểm định, chủng ĐB108 có hoạt tính ĐK với B.subtilis thay đổi theo chiều hướng tăng cao nhất (32,0mm), hoạt tính ĐK này mạnh hơn chủng gốc ban đầu là T. cf.aureoviride (25,0mm). Mặt khác, chủng này còn xuất hiện khả năng đối kháng E.coli nhưng ở mức yếu. Do đó, trong các chủng đột biến, chọn chủng ĐB108 cùng với chủng ĐB2.23 cũng là chủng có hoạt tính tăng so với chủng gốc (29,0mm so với 25,0mm) và chủng ĐB283 - là chủng có đặc điểm hình thái KL biến đổi rõ ràng - để khảo sát đặc điểm hình thái của chúng. @ Đặc điểm hình thái chủng ĐB108: Để nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng ĐB108, tiến hành nuôi cấy chủng này trên môi trường thạch MT1, ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày, quan sát sự phát triển của khuẩn lạc. Khuẩn lạc chủng ĐB108 có hình tròn, lúc đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh lục nhạt. Bề mặt khuẩn lạc cũng có dạng xốp, phát triển thành những vòng tròn đồng tâm, mép KL hình tia, trên bề mặt khuẩn lạc không xuất hiện giọt tiết. Tốc độ phát triển của khuẩn lạc nhanh, đường kính KL đạt 7-8 cm sau 3 ngày, sau thời gian 5-6 ngày khuẩn lạc mọc kín mặt đĩa petri. Chủng ĐB108 không tiết sắc tố. A B Hình 3.4. Hình thái đại thể chủng ĐB108 (A: mặt trên B: mặt dưới sau 6 ngày) Sợi nấm chủng ĐB108 có vách ngăn, phân nhánh, khuẩn ty không màu, không có tế bào màng dày, kích thước của khuẩn ty tương đối đồng đều. Cuống sinh bào tử ngắn, phân nhánh, bào tử trần liên kết. Bào tử hình cầu, màu xanh xuất phát từ đầu trên thể bình, không màu, tập hợp thành các khối tròn ở miệng thể bình, không nhày. Hình 3.5. Hình thái vi thể chủng ĐB108 Khả năng sinh CKS của chủng ĐB108 thể hiện qua khảo sát hoạt tính kháng sinh cao hơn nhiều so với chủng ban đầu, đạt kích thước vòng vô khuẩn là 32,0mm, chủng ban đầu là 25,0mm. @ Đặc điểm hình thái chủng ĐB2.23 Khuẩn lạc chủng ĐB2.23 lúc đầu có màu trắng, hình tròn, về sau chuyển sang màu xanh lục nhạt. Tốc độ phát triển của khuẩn lạc nhanh, đường kính KL đạt 6,5-7cm sau 3 ngày, khuẩn lạc sau thời gian 5-6 ngày đã mọc kín mặt đĩa petri. Chủng này cũng không hình thành sắc tố. Bề mặt khuẩn lạc cũng có dạng xốp, phát triển thành những vòng tròn đồng tâm, mép KL hình tia, trên bề mặt khuẩn lạc không xuất hiện giọt tiết. So với chủng T. cf.aureoviride ban đầu, chủng ĐB2.23 không có nhiều sai khác về hình thái. Về năng suất sinh tổng hợp CKS, chủng này có hoạt tính rất cao (29,0mm), cao hơn so với 25,0mm của chủng ban đầu. A B Hình 3.6. Hình thái đại thể chủng ĐB2.23 (A: mặt trên, B: mặt dưới) Hình 3.7. Hình thái vi thể chủng ĐB2.23 @ Đặc điểm hình thái chủng ĐB283 Khuẩn lạc chủng ĐB 283 có tốc độ phát triển chậm, sau thới gian 6 ngày khuẩn lạc chưa bao phủ hết đĩa petri. Bề mặt khuẩn lạc lồi lõm, nhiều vùng không đồng nhất về màu, từ màu trắng đến màu xanh lục đều có trên bề mặt khuẩn lạc. mép khuẩn lạc hình tia, không đồng đều. không xuất hiện sắc tố và giọt tiết. A B Hình 3.8. Hình thái đại thể chủng ĐB283 (A: mặt trên ,B: mặt dưới sau 6 ngày) Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, không có màng dày. Cuống sinh bào tử ngắn, bào tử hình elip, một mặt lõm vào, màu lục nhạt. A B Hình 3.9. Hình thái vi thể chủng ĐB283 (A: khuẩn ty, B: bào tử) So với chủng T. cf.aureoviride ban đầu, chủng ĐB283 là chủng có nhiều sự sai khác về hình thái KL, hình dạng bào tử. Tuy nhiên, năng suất sinh tổng hợp CKS của chủng này giảm rất nhiều so với chủng ban đầu (7,0mm so với 25,0mm). Sau khi khảo sát đặc điểm hình thái và hoạt tính ĐK của các chủng. Chủng ĐB108 có sự thay đổi khả năng sinh CKS theo chiều dương, chủng này được chọn trong các chủng đột biến để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh CKS cùng với chủng gốc T. cf.aureoviride. 3.2. Khảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của các chủng a/ Ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh tổng hợp CKS Các loại môi trường khác nhau có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của các chủng NS. Để xác định môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng cũng như hoạt tính đối kháng của các chủng NS nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy hai chủng này trên các loại môi trường khác nhau trong thời gian là 5 ngày. Sau đó, thu sinh khối và dịch KS thô. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính kháng sinh của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 Môi trường Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 MT 1 0,45 0,47 19,00 23,00 MT 2 0,43 0,53 26,00 26,40 MT 3 0,51 0,38 10,30 22,80 YEA 0,67 0,51 22,00 25,00 MEA 0,73 0,70 30.50 30,00 PGA 0,83 0,85 29,00 35,00 D 0,58 0,43 19,00 21,00 Czapek 0,27 0,50 10,00 13,00 Czapek- Dox 0,32 0,30 20,00 13,00 Hình 3.10. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính KS của chủng T. cf.aureoviride PGA MEA Hình 3.11. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính KS của chủng ĐB108 Hình 3.12. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 Qua kết quả trên cho ta thấy chủng T. cf.aureoviride sinh trưởng tốt nhất trong môi trường PGA và có hoạt tính đối kháng cao nhất trong môi trường MEA, đối với chủng ĐB108, trong môi trường PGA thì quá trình sinh trường và hoạt tính KS cao nhất. Môi trường PGA chứa nguồn cacbon là tinh bột phù hợp cho sinh trưởng của cả hai chủng nên trong MT này chúng đều có khả năng sinh trưởng cao nhất. Ngoài ra, trong MT này còn chứa nhiều hợp chất phù hợp cho sinh trưởng của hai chủng như các vitamin trong khoai tây. Tuy nhiên, khả năng hình thành CKS của mỗi chủng khác nhau, có thể các chất trong PGA MEA cao malt và pepton phù hợp cho chủng gốc T. cf.aureoviride tạo CKS và chủng ĐB108 thích hợp với chất có nguồn gốc từ khoai tây. Hình 3.13. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính ĐK của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 b/ Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như NS, cacbon tham gia trong hầu hết các cấu trúc của tế bào. Các hợp chất cung cấp cacbon có ý nghĩa quan trọng hàng đầu đối với sự sống của tế bào VSV. Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các chủng nghiên cứu, tiến hành nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trên môi trường MEA, chủng ĐB108 được nuôi cấy trên môi trường PGA nhưng nguồn cacbon được thay thế lần lượt là CMC, succrose, fructose, glucose, rỉ đường, maltose, galactose, lactose, tinh bột. Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày, lọc dịch nuôi cấy. Thu sinh khối, cân để xác định khả năng sinh trưởng và thử hoạt tính ĐK bằng phương pháp đục lổ. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau đến sinh trưởng và sinh CKS của T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Nguồn cacbon Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 CMC 0,52 0,35 30,00 26,00 Succrose 0,41 0,46 27,00 32,00 Fructose 0,50 0,50 31,00 31,00 Glucose 0,37 0,51 30,50 31,30 Rỉ đường 0,44 0,45 33,00 37,00 Maltose 0,34 0,43 28,80 32,00 Galactose 0,42 0,45 34,00 32,70 Lactose 0,39 0,45 31,50 33,00 Tinh bột 0,42 0,49 30,00 30,30 Hình 3.14. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Biểu đồ trên chỉ ra rằng các nguồn cacbon khác nhau đều thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108. Tuy nhiên, ở chủng ban đầu nguồn CMC cho sinh khối cao hơn so với các nguồn cacbon khác, ở chủng ĐB108 thì nguồn cacbon glucose cho sinh khối cao hơn các loại cacbon còn lại. Do chủng ban đầu sống trong môi trường rừng ngập mặn nên nguồn cacbon là CMC (celullose) phù hợp hơn các nguồn cacbon là đường chuẩn khác. Ở chủng đột biến, có sự thay đổi về đặc điểm sinh hóa nên glucose trở nên thích hợp cho sinh trưởng của chủng này. Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Hoạt tính kháng sinh của chủng đột biến ĐB108 và chủng ban đầu T. cf.aureoviride thay đổi ít theo nguồn cacbon. Điều này phù hợp với kết quả sinh trưởng của hai chủng, cũng như nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp (2010) về sự phát triển và hình thành sản phẩm trao đổi chất bậc hai của Trichoderma trên các nguồn cacbon khác nhau. Theo kết quả trên đồ thị, chủng T. cf.aureoviride có hoạt tính KS mạnh nhất khi phát triển trong MT có nguồn cacbon là galactose, chủng ĐB108 có hoạt tính KS mạnh nhất đối với nguồn cacbon là rỉ đường, điều này được giải thích là do rỉ đường có nhiều thành phần khác như các vitamine, khoáng chất cần thiết cho việc trao đổi chất, hình thành chất KS của chủng này. Do đó, trong các thí nghiệm khảo sát hoạt tính ĐK của các chủng NS tiếp theo, chúng tôi sử dụng galactose là nguồn cacbon cho chủng ban đầu T. cf.aureoviride và sử dụng rỉ đường cho chủng đột biến ĐB108. c/ Ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS Khả năng chịu mặn là đặc điểm quan trọng của các chủng NS rừng ngập mặn. Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố này đến sự sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của 2 chủng NS nghiên cứu, chúng tôi nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trong môi trường MEA và chủng ĐB108 trong môi trường PGA có độ mặn thay đổi từ 0,0%; 2,0%; 2,5%; 3,0%; 3,5%; 4,0%; 4,5%; 5,0%; 5,5%. Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày, lọc thu dịch lên men, cân sinh khối và thử hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả sinh trưởng và hoạt tính ĐK được trình bày trong bảng 3.5 Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS ở các độ mặn khác nhau Độ mặn (NaCl,%) Sinh khối (g) Hoạt tính ĐK (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 0,0 0,40 0,83 18,00 21,0 2,0 0,42 0,92 19,00 15,00 2,5 0,58 0,93 21,00 9,00 3,0 0,60 0,74 22,00 5,00 3,5 0,80 0,72 11,00 7,00 4,0 0,65 0,41 0,00 2,00 4,5 0,66 0,50 0,00 0,00 5,0 0,58 0,58 0,00 0,00 5,5 0,42 0,55 0,00 0,00 Hình 3.16. Biểu đồ ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Hình 3.17. Ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng hình thành CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Qua đồ thị chúng ta nhận thấy, ở chủng ban đầu, hoạt tính tăng khi nồng độ muối tăng từ 0,0% đến 3,0%. Từ nồng độ NaCl 3,5% trở đi, hoạt tính KS của chủng giảm mạnh, ở 4,0% hoạt tính KS của chủng mất hoàn toàn. Điều này phù hợp vì chủng này được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ nơi đây thường xuyên có nước biển lên xuống theo thủy triều, nồng độ muối môi trường cũng thường dao động quanh giá trị 3,0-4,0%. Khả năng sinh trưởng của chủng gốc kém khi nồng độ NaCl thấp, khi độ mặn tăng dần thì quá trình sinh trưởng của chủng này tăng, sinh khối của chủng đạt cao nhất khi nồng độ muối là 3,5%. Đối với chủng đột biến, hoạt tính kháng sinh thể hiện cao nhất ở nồng độ 0,0% do đột biến làm mất đi khả năng chịu mặn của chủng ĐB108 so với chủng gốc. Hoạt tính của chủng ĐB108 giảm dần khi nồng độ muối tăng, từ nồng độ 4,5% chủng mất hoạt tính KS, giá trị này cao hơn so với chủng ban đầu. Độ mặn của môi trường nuôi cấy nấm sợi có ảnh hưởng khác nhau đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp CKS của cả hai chủng NS nghiên cứu. Đối với chủng T. cf.aureoviride, giá trị nồng độ NaCl trong môi trường thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS không có sự chênh lệch lớn, còn ở chủng ĐB108, hai giá trị này có sự thay đổi rất lớn. Điều này có thể giải thích do tác động của tia UV làm thay đổi đặc tính của chủng đột biến so với chủng gốc ban đầu. d/ Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS Nitơ cùng với cacbon tham gia trong các thành phần cấu trúc nên tế bào VSV, giúp tế bào hoàn thiện mọi chức năng của hoạt động sống. Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các chủng nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể MT 1 nhưng nguồn NaNO3 được thay lần lượt bằng cao thịt, cazein, bột đậu, NH4Cl, NH4NO3, NaNO2, NH4H2PO4 với hàm lượng tương đượng. Sau thời gian nuôi cấy, lọc dịch nuôi cấy thu sinh khối và dịch lên men để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và khả năng sinh CKS của 2 chủng nghiên cứu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Nguồn nitơ Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 Bột đậu 0,90 0,83 29,00 29,00 Pepton 0,76 0,67 31,20 34,00 Casein 0,64 0,57 28,30 31,80 Cao thịt 0,82 0,86 31,00 31,00 (NH4)2HPO4 0,45 0,56 30,00 30,00 NH4NO3 0,47 0,50 31,00 33,00 NH4Cl 0,53 0,41 29,00 29,30 NaNO3 0,39 0,48 23,00 31,00 NaNO2 0,34 0,40 28,00 26,50 Hình 3.18. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Hình 3.19. Đồ thị ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng hình thành CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Từ biểu đồ cho thấy nguồn nitơ hữu cơ có tác dụng tốt đối với sinh trưởng của cả hai chủng nấm nghiên cứu, nguồn nitơ vô cơ cũng được sử dụng nhưng sự sinh trưởng kém hơn so với nguồn nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ như bột đậu nành, casein do ngoài việc cung cấp nitơ cho sự phát triển của nấm còn bổ sung thêm một lượng các vitamine và khoáng nên có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của các chủng nấm tốt hơn. Đối với khả năng sinh tổng hợp CKS, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ có tác động gần giống nhau, mức chênh lệch giữa các nguồn nitơ khác nhau là không lớn lắm. Như vậy, nitơ có ảnh hưởng khác nhau đối với quá trình sinh trưởng và tổng hợp CKS của chủng chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108. Dựa vào kết quả trên, trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sử dụng pepton trong MT nuôi cấy các chủng NS nghiên cứu. e/ Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 pH môi trường nuôi cấy VSV nói chung, nuôi cấy NS nói riêng rất quan trọng, mỗi loại NS có khả năng sinh trưởng và phát triển ở các pH môi trường khác nhau. Để xác định pH thích hợp cho các chủng nấm nghiên cứu, chúng tôi sử dụng môi trường MT 1 dịch thể được điều chỉnh ở các mức pH khác nhau: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 7,5; 8,0; 8,5 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N để nuôi cấy hai chủng nấm nghiên cứu. Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày ở nhiệt độ phòng, lọc thu sinh khối để cân và dịch lên để thử hoạt tính KS bằng phương pháp đục lổ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính ĐK của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 pH Sinh khối (g) Hoạt tính ĐK (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 3.5 0,33 0,36 26,00 30,70 4.0 0,34 0,37 25,80 31,30 4.5 0,32 0,42 26,30 28,70 5.0 0,40 0,47 26,00 32,30 5.5 0,38 0,39 26,30 29,00 6.0 0,36 0,43 28,00 30,00 6.5 0,44 0,45 27,30 27,00 7.0 0,42 0,36 26,50 32,50 7.5 0,39 0,40 25,30 28,30 8.0 0,40 0,46 24,50 28,00 8.5 0,33 0,42 24,00 28,30 Hình 3.20. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Hình 3.21. Đồ thị ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Kết quả cho thấy chủng T. cf.aureoviride và có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS ở môi trường có phổ pH tương đối rộng, hoạt tính KS thể hiện khá từ pH = 3 đến 7,5; hoạt tính KS đạt cực đại ở pH = 6,0; chủng đột biến cũng có phổ pH cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS rộng và đạt cực đại ở pH = 7,0. Tuy nhiên, quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng này không ổn định như ở chủng ban đầu, điều này có thể do mức độ ổn định của chủng đột biến chưa cao. Giá trị pH các chủng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS như trên là phù hợp với giá trị pH thích hợp cho nấm sợi là từ khoảng 3 – 6 (Theo Nguyễn Đức Lượng, 2004) f/ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng đến cường độ phát triển của VSV cũng như của NS. Mỗi loại VSV có đều có nhiệt độ phát triển phù hợp. Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh CKS của các chủng Trichoderma nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng này trong môi trường MT 1 dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 23, 26, 29, 31, 33, 360C trong thời gian 5 ngày. Đối chứng được để ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi, lọc thu sinh khối để cân và dịch lên để thử hoạt tính KS . Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Nhiệt độ (oC) Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 Đối chứng (nhiệt độ phòng) 0,43 0,51 30,57 32,57 20 0,23 0,19 28,12 30,00 23 0,25 0,27 29,43 31,17 26 0,38 0,28 31,74 34,17 29 0,42 0,42 31,91 29,75 31 0,51 0,58 27,67 30,83 33 0,47 0,63 16,67 28,00 36 0,21 0,19 0,00 0,00 Hình 3.22. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Hình 3.23. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Từ biểu đồ và đồ thị trên cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp CKS của 2 chủng đều tương đối giống nhau. Nhiệt độ thích hợp cho chủng ban đầu là từ 26 – 30oC, chủng đột biến ĐB108 là khoảng từ 23 – 28oC. Nguyên nhân do chủng gốc sống trong MT tự nhiên của rừng ngập mặn cần Giờ, nơi có nhiệt độ trung bình trong năm từ 24 - 27oC. Đối với chủng đột biến, điểm tối ưu về nhiệt độ là 26oC, đây là nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các loài vi nấm. 3.3. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi chọn môi trường MEA (nguồn cacbon là galactose, nguồn nitơ là bột đậu nành, nồng độ muối là 3,0%, pH môi trường là 6,0, nhiệt độ nuôi cấy là 290C) để nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride; chọn môi trường PGA với nguồn cacbon – rỉ đường, nồng độ muối – 0,0%, pH môi trường là 7,0, nhiệt độ nuôi cấy là 260C để nuôi cấy chủng đột biến ĐB108. Động thái quá trình lên men sinh CKS của hai chủng được trình bày trong bảng 3.9. Như chúng ta đã biết, quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng Trichoderma phụ thuộc vào từng chủng và có liên quan đến khả năng sinh tổng hợp CKS của mỗi chủng. Kết quả bảng 3.9 cho thấy sinh khối và hoạt tính KS của cả hai chủng nghiên cứu đều bắt đầu tăng nhanh từ giờ thứ 48 của quá trình lên men. Đối với chủng T. cf.aureoviride quá trình sinh trưởng đạt cực đại vào giờ 108, chủng đột biến ĐB108 có quá trình sinh trưởng cũng đạt cực đại vào giờ thứ 108. Sau đó, sự sinh trưởng của hai chủng đều giảm nhưng mức độ giảm không nhiều. Sự sinh trưởng của hai chủng vẫn được duy trì trong một thời gian dài. Lượng sinh khối bị giảm không đáng kể. Điều này cho thấy các loài nấm thuộc chi Trichoderma có khả năng sinh trưởng tốt trong nhiều điều kiện, kể cả khi môi trường có nguồn dinh dưỡng hạn chế. Bảng 3.9. Động thái lên men của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Thời gian (giờ) T. cf.aureoviride Chủng ĐB108 pH của dịch nuôi cấy Hoạt tính kháng B. subtilis (mm) Sinh khối khô (mg/ml) pH của dịch nuôi cấy Hoạt tính kháng B. subtilis (mm) Sinh khối khô (mg/ml) 0 6,00 - - 7,00 - - 12 5,72 - - 6,73 - - 24 5,70 - - 5,16 - - 36 5,44 - 4,20 5,13 - 4,40 48 5,40 15,2 7,20 5,04 26,1 7,86 60 6,73 29,4 8,20 4,93 35,4 10,02 72 6,37 31,4 9,60 4,91 36,5 10,63 84 6,77 31,8 9,85 5,03 38,8 12,10 96 6,68 34,4 10,93 4,97 39,5 13,20 108 6,56 30,2 13,10 5,08 39,7 14,20 120 6,84 28,9 12,20 5,55 42,1 13,40 132 6,81 28,4 11,02 5,24 39,8 13,00 144 6,62 27,3 11,80 5,49 37,2 12,82 156 6,69 24,4 11,76 6,17 36,3 12,60 168 6,84 23,4 10,89 5,73 35,1 12,55 180 6,37 20,2 10,93 6,15 33,9 11,97 192 6,27 15,5 10,68 5,35 28,2 11,24 Chú thích: (-) không có hoạt tính ĐK Hình 3.22. Đồ thị động thái lên men của chủng T. cf.aureoviride Hình 3.23. Đồ thị động thái lên men của chủng đột biến ĐB108 Theo đồ thị, khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 đều bắt đầu sau 48 giờ lên men và tăng nhanh từ giờ thứ 72 đến giờ thứ 96 đối với chủng ban đầu, chủng đột biến ĐB108 có hoạt tính kháng sinh tăng nhanh kéo dài từ giờ thứ 60 đến giờ thứ 120. Sau khi đạt cực đại, hoạt tính kháng sinh của cả hai chủng đều giảm dần nếu tiếp tục nuôi cấy. Như vậy, pha sinh trưởng của chủng ban đầu T. cf.aureoviride xảy ra chậm hơn so với pha sinh CKS, đối với chủng đột biến thì quá trình này ngược lại. Trong quá trình lên men, pH của dịch nuôi cấy giảm dần trong 48 -72 giờ đầu, sau đó pH duy trì tương đối ổn định. pH của dịch nuôi cấy giảm do sự hình thành của các acid hữu cơ trong giai đoạn đầu của quá trình trao đổi đất dẫn đến quá trình tổng hợp CKS, khi quá trình tổng hợp CKS đi vào ổn định thì pH của dịch nuôi cấy ổn định, sự thay đổi lúc này tương đối nhỏ. Kết quả khảo sát khả năng ĐK với VSV kiểm định của chủng ban đầu và chủng đột biến trước và sau khi tối ưu hóa được trình bày trong bảng 3.10. Từ kết quả đó, chúng tôi xác định được sau khi tối ưu hóa, hoạt tính ĐK của cả hai chủng đều tăng. Mức tăng giữa chủng đột biến ĐB108 với chủng ban đầu như sau: trong điều kiện chưa tối ưu tăng 14,8% và trong điều kiện tối ưu tỉ lệ này là 22,4%. Tỉ lệ tăng này là phù hợp để có thể nâng cao chất lượng chủng giống trong ứng dụng thực tiễn (Theo Phương Phú Công – 2004). Bảng 3.10. So sánh khả năng sinh tổng hợp CKS của hai chủng nghiên cứu trước và sau khi tối ưu Chủng Hoạt tính KS (D-d,mm) Mức độ tăng Đối chứng Tối ưu T. cf.aureoviride 30,5 34,4 1,13 lần ĐB108 35,0 42,1 1,23 lần % tăng của chủng đột biến 14,8% 22,4% 3.4. Khảo sát đặc điểm dịch KS thô 3.4.1. Độ bền nhiệt Các CKS có bản chất chủ yếu là protein nên nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của chúng. Việc xác định độ bền nhiệt của CKS là một trong những yếu tố quan trọng để có thể ứng dụng CKS trong thực tiễn. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trên môi trường MEA, chủng đột biến ĐB108 trên môi trường PGA với các thành phần tối ưu. Dịch chiết KS thô thu từ hai chủng được giữ trong môi trường có nhiệt độ 400C, 600C, 800C, 1000C trong thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Thử hoạt tính KS trên vi khuẩn B. subtilis theo phương pháp đục lỗ. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.11. Bảng 3.11. Độ bền nhiệt của KS trong dịch lên men của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 Chủng Thời gian Nhiệt độ (0C) Hoạt tính ĐK (D-d,mm) 10 phút 30 phút 60 phút T. cf.aureoviride Đối chứng 36,17 40 36,50 37,80 36,80 60 36,80 37,80 37,3 80 35,80 36,00 34,30 100 37,30 33,30 35,00 ĐB108 Đối chứng 40,50 40 39,50 41,50 39,30 60 39,80 39,50 42,00 80 38,30 41,30 37,50 100 37,80 39,30 37,30 Qua bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy các dịch chiết KS thô này đều bền với nhiệt độ, hoạt tính KS ít thay đổi khi ở nhiệt độ cao như 1000C trong thời gian 60 phút. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Phan Thanh Phương (2007) về độ bền nhiệt của dịch chiết KS thô ở các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ (hoạt tính KS của các chủng NS không giảm khi nhiệt độ môi trường là 1210C trong thời gian 60 phút). Khả năng bền nhiệt của dịch chiết KS thô tạo điều kiện thuận lợi trong khâu tách chiết, tinh chế, sử dụng trong công nghiệp, trong sản xuất phân bón và bảo quản. 3.4.2. Độ bền pH Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng nấm nghiên cứu trong các điều kiện tối ưu. Sau đó, lọc để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men. Dịch chiết kháng sinh thô được điều chỉnh ở các giá trị pH từ 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 và để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ. Sau đó điều chỉnh về giá trị pH = 7, xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ. Kết quả độ bền nhiệt của dịch KS được trình bày trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Độ bền pH của KS trong dịch lên men của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 pH Hoạt tính ĐK (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 Đối chứng 36,20 40,50 3,0 35,40 38,50 4,0 36,20 39,60 5,0 35,90 39,80 6,0 35,80 40,10 7,0 36,10 39,80 8,0 35,30 38,90 9,0 35,10 36,70 Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy KS trong dịch lên men có độ bền cao với các giá trị pH, sự thay đổi của pH có tác động không nhiều đến việc đối kháng với VSV kiểm định của dịch lên men. Điều này có thể cho phép ứng dụng dịch lên men và kháng sinh có trong đó trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Hình 3.26. Đồ thị ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS trong dịch lên men của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 3.4.3. Độ bền thời gian Nuôi cấy các chủng nấm nghiên cứu trong các điều kiện tối ưu. Sau đó, lọc để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men, điều chỉnh pH dịch này về giá trị 7,0 – 7,5. Dịch chiết kháng sinh thô được giữ ở nhiệt độ 40C. Sau thời gian 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần kiểm tra hoạt tính hoạt tính KS bằng phương pháp đục lổ. Bảng 3.13. Độ bền thời gian của KS trong dịch lên men của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 Thời gian (ngày) Hoạt tính ĐK (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 0 36,17 40,50 7 37,20 41,00 14 35,70 38,40 21 36,20 35,50 28 30,80 30,30 35 29,70 28,90 42 22,10 20,60 Hình 3.27. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến độ bền của dịch KS thô của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 0 ngày 21 ngày 42 ngày Hình 3. 28. Độ bền thời gian của dịch KS thô chủng T. cf.aureoviride 0 ngày 21 ngày 42 ngày Hình 3. 29. Độ bền thời gian của dịch KS thô chủng ĐB108 Qua kết quả trên, ta thấy dịch lên men của cả hai chủng NS nghiên cứu đều có hoạt tính ĐK cao trong 3 tuần đầu, từ tuần thứ 4 trở đi hoạt tính KS của cả hai dịch lên men đều giảm. Tuy nhiên, trên đồ thị ta thấy hoạt tính của 2 dịch lên men đều còn ở mức khá sau 5 tuần, điều này chứng tỏ CKS có trong dịch lên men bền với thời gian. Đây là đặc tính giúp chúng ta có thể bảo quản và sử dụng CKS này thuận lợi vì hoạt tích KS của dịch lên men bền trong thời gian dài (42 ngày vẫn còn thể hiện hoạt tính KS). 3.4.4. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ Các chủng nấm nghiên cứu được nuôi trong các điều kiện tối ưu. Sau đó, chúng tôi tiến hành lọc để loại bỏ sinh khối và thu dịch lên men. Bổ sung thêm các loại dung môi Ehtyl acetate, Cloroform, Diethyl ether, n-Hexan, n-Butanol theo tỉ lệ 1 : 1. Lắc các bình tam giác 200 vòng/phút trong 6 giờ để CKS hòa tan vào dung môi. Kiểm tra hoạt tính KS của dung môi và dịch lên men sau khi lắc bằng phương pháp đục lổ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 Bảng 3.14. Hoạt tính của dung môi và dịch lên men sau khi lắc 6 giờ Loại dung môi sử dụng Hoạt tính ĐK (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 Dung môi sau khi lắc Dịch lên men sau khi lắc Dung môi sau khi lắc Dịch lên men sau khi lắc Đối chứng 21,0 27,02 Ethyl acetate 23,67 0,00 24,50 26,83 Cloroform 17,00 19,83 18,67 27,33 Diethyl ether 11,33 17,33 2.950 16,50 n-Hexan 0,00 19,17 0,00 26,50 n-Butanol 16,67 14,50 27,83 26,83 Hình 3.30. Đồ thị thể hiện hoạt tính KS của dung môi và dịch lên men sau lắc 6 giờ của chủng T. cf.aureoviride Hình 3.31. Đồ thị thể hiện hoạt tính KS của dung môi và dịch lên men sau lắc 6 giờ của chủng đột biến ĐB108 Hình 3.32. Hoạt tính KS của dung môi ethyl acetate và dịch lên men sau khi lắc 6 giờ của chủng T. cf.aureoviride Dung môi Dung dịch Dung dịch Dung môi Hình 3.33. Hoạt tính KS của dung môi diethyl ether và dịch lên men sau khi lắc 6 giờ của chủng đột biến ĐB108 (tỉ lệ 1 : 1) Sau khi kiểm tra kết quả tạo vòng vô khuẩn của dung môi và dịch lên men sau khi lắc trong thời 6 giờ, chúng tôi nhận thấy: - Đối với chủng T. cf.aureoviride, khi sử dụng ethylacetate thì toàn bộ KS có trong dịch lên men hòa tan trong dung môi, đối với dịch lên men sau khi lắc với dung môi thì không cò hoạt tính kháng sinh. Như vậy, KS trong dịch lên men của chủng ban đầu T. cf.aureoviride chúng ta có thể sử dụng ethylacetate làm dung môi tách chiết. - Đối với chủng đột biến ĐB108, các loại dung môi đều có khả năng hòa tan CKS trong dịch lên men, trừ n–hexan, trong đó dietyl ether sau khi lắc với dịch lên men có khả năng hình thành vòng vô khuẩn lớn nhất với VSV kiểm định. Tuy nhiên, dung dịch lên men sau khi lắc vẫn có khả năng hình thành vòng vô khuẩn, điều này chứng tỏ dịch lên men vẫn còn CKS. Do đó, chúng tôi tiến hành thử các tỉ lệ thể tích dung môi/dịch lên men khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.16 Từ bảng này, so sánh hoạt tính ĐK ở các tỉ lệ dung môi và dịch lên men khác nhau, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ dung môi diethyl ether : dịch lên men = 4 : 1 có khả năng hòa tan chất KS có trong dịch lên men tốt nhất vì giấy lọc tẩm dung môi tạo vòng vô khuẩn lớn nhất. Tỉ lệ này là phù hợp để thực hiện việc tách chiết CKS có trong dịch lên men bằng dung môi hữu cơ. Kết quả được thể hiện trong bàng 3.15. Bảng 3.15. Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lên men sau khi lắc của chủng ĐB108 Tỉ lệ (dung môi: dịch lên men) Hoạt tính KS của chủng ĐB108 (D-d,mm) Dung môi sau khi lắc Dịch lên men sau khi lắc 1 : 1 38,52 18,53 2 : 1 39,83 10,58 3 : 1 39,33 6,33 4 : 1 39,78 0,00 3.5. Tác dụng của dịch chiết KS thô với các VSV kiểm định 3.5.1. Tác dụng của dịch chiết KS thô với các nấm gây bệnh cây trồng Dịch lọc nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu được lọc để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men, điều chỉnh pH tới 7.0 – 7.5. sử dụng phương pháp 2.4.6 để thử tác dụng của dịch chiết KS thô với các nấm gây bệnh cây trồng. Kết quả được trình bày trong bảng sau: Bảng 3.16. Hoạt tính đối kháng của dịch KS thô với nấm gây bệnh cây trồng Nấm gây bệnh cây trồng Khả năng ĐK của dịch KS thô T. cf.aureoviride ĐB108 Fusarium oxysporum - - Phythophthora sp. - - Sclerotium sp. - - Rhizoctonia sp. - - Dịch chiết KS thô của cả hai chủng nghiên cứu đều không có khả năng kháng các loại nấm gây bệnh cây trồng trong thí nghiệm. Điều này có thể giải thích do chất KS của hai chủng này không có tác dụng đối kháng với các chủng nấm gây bệnh cây trồng. Nguyên nhân có thể do cơ chế đối kháng của hai chủng Trichoderma này đối với tác nhân gây bệnh cây trồng là tổng hợp của nhiều cơ chế khác nhau, do đó khi chỉ có tác động của dịch lên men không đủ yếu tố ngăn chặn sự phát triển của nấm gây bệnh cây trồng. 3.5.2. Tác dụng của dịch chiết KS thô với các tác nhân gây bệnh cho người Các chủng nấm nghiên cứu được nuôi trong các điều kiện tối ưu. Sau đó, chúng tôi tiến hành lọc để loại bỏ sinh khối và thu dịch lên men. Sử dụng phương pháp 2.4.6 để xác định hoạt tính đối kháng của dịch KS thô đối với một số chủng nấm gây bệnh cho người. Bảng 3.17. Hoạt tính đối kháng của dịch KS thô với tác nhân gây bệnh cho người VSV gây bệnh cho người Khả năng ĐK của dịch KS thô (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 Candida albicans 20,15 24,30 Staphylococcus aureus 14,50 24,70 Pseudomonas aeoginosa - - Klesbsia sp. 20,20 22,5 Từ kết quả bảng 3.17 cho thấy dịch KS thô có khả năng ức chế một số chủng VSV gây bệnh trên người. Dịch lên men của chủng nghiên cứu có khả năng ức chế được tác nhân gây bệnh kháng KS. Đây là một đặc điểm quý của các chủng NS nghiên cứu. trong đó, khả năng kháng S. aureus của chủng ĐB108 tăng lên rất nhiều so với chủng ban đầu (24,7mm so với 14,5mm), khả năng kháng C.albicans của chủng ĐB108 cũng tăng cao so với chủng ban đầu. Từ đó, chúng ta có thể ứng dụng CKS từ dịch lên men để ức chế các VSV gây bệnh. Hình 3.34. Khả năng kháng Candida albicans của dịch lên men chủng T. cf.aureoviride A B Hình 3.35. Khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng KS của chủng ĐB108 (A) và chủng T. cf.aureoviride (B) A B Hình 3.36. Khả năng kháng Klesbsia sp. của chủng T. cf.aureoviride (A) và chủng ĐB108 (B) PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. KẾT LUẬN: 1. Khảo sát đặc điểm hình thái của chủng gốc ban đầu Trichoderma cf.aureoviride và khảo sát khả năng sinh CKS của nó, đây là chủng có khả năng sinh CKS rất mạnh. (D-d = 27mm). 2. Gây đột biến chủng Trichoderma cf.aureoviride bằng tia UV. thu được 75 chủng sau đột biến. Kết quả khảo sát khả năng sinh CKS của các chủng sau đột biến như sau: có 9/75 chủng có hoạt tính KS tăng (chiếm 12%), 31/75 chủng có hoạt tính bằng hoặc giảm (chiếm 41,3%) và có 35/75 chủng mất khả năng sinh CKS (chiếm 46,7%). Như vậy, tia UV có tác động đến khả năng sinh CKS của chủng ban đầu, trong đó chiều hướng chung làm giảm hoặc làm mất khả năng sinh CKS của chủng ban đầu. 3. Qua khảo sát và chọn lọc các chủng nấm sợi đột biến có khả năng tổng hợp chất kháng sinh cao hơn chủng ban đầu đã chọn được chủng ĐB108 có khả năng sinh tổng hợp CKS cao hơn chủng ban đầu từ 14,8% được chọn để nghiên cứu tiếp. 4. Đã khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đối với khả năng tổng hợp chất kháng sinh của các chủng đã chọn lọc: − Chủng T. cf.aureoviride: môi trường là MEA, nồng độ muối NaCl là 3.0%, nguồn cacbon là galactose, nguồn nitơ là bột đậu nành, độ pH là 6,0, nhiệt độ là 29oC. − Chủng đột biến ĐB108: môi trường là PGA, nồng độ muối NaCl là 0.0%, nguồn cacbon là rỉ đường, nguồn nitơ là cao thịt, độ pH là 7,0, nhiệt độ là 26oC. 5. Dung môi ethyl acetate ở tỉ lệ dung môi: dịch lên men = 1 : 1 đã đảm bảo hòa tan hầu hết CKS trong dịch lên men của chủng T. cf.aureoviride, còn đối với chủng đột biến ĐB108 thì dung môi thích hợp là diethyl erther ở tỉ lệ dung môi: dịch lên men = 4 : 1. 6. Đã khảo sát tính chất của dịch KS thô từ môi trường lên men của các chủng, kết quả như sau: − Dịch lên men của cả hai chủng, chủng ban đầu T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 đều bền với nhiệt độ, pH đảm bảo hoạt tính của dịch lên men không thay đổi là từ 4,0 – 8,0, sau thời gian 14 ngày thì hoạt tính của dịch lên men bắt đầu giảm nhưng đến ngày 42 vẫn còn hoạt tính mạnh (D-d > 20,0mm). − Dịch lên men thô của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 đều không ức chế được sự phát triển của các nấm gây bệnh cây trồng trên đĩa petri. Chúng có khả năng ức chế, tạo vòng vô khuẩn đối với Candida albicans, Staphylococcus aureus và Klesbsia sp. trong điều kiện thí nghiệm. Trong đó, hoạt tính của dịch lên men đối với Candida albicans của cả hai chủng đều mạnh. II. ĐỀ NGHỊ: Tiếp tục thử nghiệm tác dụng của dịch lên men CKS với Candida albicans trong thực tiễn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM. 2. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật. 3. Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục. 5. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật (tập 3), NXB Khoa học và Kỹ thuật, trang 356-369 6. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2000), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục 7. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật-tập 1,2, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm Hà nội, trang 196-203, 270 8. Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế (1999), Nấm mốc và phương pháp phòng chống, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 9. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục. 10. Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Vi sinh học, trang 15-26, 45-50. 11. Bùi Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, trang 66-68, 113-115 12. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát một số hệ enzyme thủy phân amylase, cellulose, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ miền Đông Nam Bộ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường đại học KHTN-Đại học Quốc gia TP. HCM, trang 13. Đinh Minh Hiệp (2010), Nghiên cứu enzyme chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với nấm gây bệnh ở thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trang. 3-19. 14. Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008), Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của các Chủng nấm Trichoderma đối với 3 loài nấm gây bệnh cây trồng (Rhizotocnia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, trang 93-99 15. Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Nguyễn Tiến thắng, Ngô Kế Sương (2007), Khảo sát hoạt tính các enzyme chitinase, -glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease của các chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2007, NXB Khoa học và Kỹ thuật, trang 708-710 16. Đinh Minh Hiệp, Phạm Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008), Thu nhận chitinase từ chủng Trichoderma TĐ14 và khảo sát khả năng kháng vi nấm Camdida albicans, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV, trang 48-51 17. Nguyễn Đức Lượng (CB), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học – Tập 2 (Thí nghiệm vi sinh vật học), NXB Đại học Quốc gia. 18. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh vật – Tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP. HCM. 19. Trần Thị Thanh (2007), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, trang 20. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục. 21. Trần Thanh Thủy (2009), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở-Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. 22. Trần Linh Thước, Phạm Phú Phùng, Lê Duy Thắng (2000), Thực tập vi sinh vật, Tủ sách Đại học KHTN-ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 23. Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ TP. HCM, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM. 24. Nguyễn Thị Nhã Vy (2009), Nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất đối VSV gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM . Tài liệu tiếng Anh 25. Agarwal and al (2011), Isolation of seed borne mycoflora of chickpea and its in vitro evaluation by some known bioagents, International journal of pharmacy & life sciences, Vol. 2, Issue 7: July: 2011, pp.899-902 26. Biljana Gveroska, Jugolslav Ziberoski (2011), The influence of Trichoderma harzianum on reducing root rot disease in tobacco seedling caused by Rhizoctonia solani, International Journal of Pure and Applied Sciences and Technology, 2(2), pp.1-11 27. Claydon N., Allan M., Hanson J.R. and Avent A.G. (1987), Antifungal alkyl pyrones of Trichoderma harzianum, Trans. Br. Mycol. Soc. 88: pp.503-513 28. Dennis C., Webster J. (1971), Antagonistic properties of species-group of Trichoderma II: production of volatile antibiotics, Trans. Br. Mycol. Soc. 57: pp.41- 48 29. Di Pietro A., Lorito M., Hayes C.K., Broadway R.M. and Harman G.E., (1993), Endochitinase from Gliocladium virens: isolation, characterization and synergistic antifungal activity in combination with gliotoxin, Phytopathology 83: pp.308-313 30. Druzhinina S.I., Kubicek P.C (2005), Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from species aggregates to species clusters? Invited Review, Journal Zeihjang universite Science Biology 6: pp.100-112 31. Druzhinina S.I., Kopchinskiy G.A., Kubicek P.C (2006), The first 100 Trichoderma species characterized by molecular data, Mycoscience 47: pp.55-64 32. Flatch J., Pilet P.E., Jolles P. (1992), What’s new in chitinase research? Experientiel 48: pp. 701-716 33. Ghisalberti E.L. and Sivasithamparam K. (1991), Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp., Soil Biol. Biochem. 23: pp. 1011-1020 34. Grondona I., Hermosa R., Jejeda M., Gomis M.D., Mateos P.F., Bridge P.I., Monte E. and Garcia-Acha I. (1997), Physiologycal and biochemical characterization of Trichoderma harzianum, a biocontrol agent against soilborne fungal plant pathogenst, Appl. Environ microbial 63 (8): pp.3189-3198 35. Howell C.R. and Stipanovic R.D. (1995), Mechanisms in the biocontrol of Rhizoctonia solani – induced cotton seedling disease by Gliocladium virens: antibiotics, Phytopathology 85: pp.469-472 36. Hye Min Lee, Zakaullah Khan, Sang Gyu Kim, Nam-In Beak and Young Ho Kim (2011), Evaluation of the Biocontrol potential of some medicinal plant materials alone and in combination with Trichoderma harzianum against Rhizotocnia solani AG 2-1, plant pathology journal, 27(1): pp. 68-77 37. Itamar soares de Melo, Jane L.Faull (2000), Parasitism of Rhizotocnia solani by strains of Trichoderma spp., Scientia Agricola, vol. 57, No.1, pp.67-78 38. Katsuhiko Ando and al (2004), Sampling and isolation methods of fungi, Department of biotechnology, National Institute of Technology and Evaluation. 39. Kullnig C., Mach R., Lorito M., Kubicek C. (2000), Enzyme diffusion from Trichoderma atroviride (T. harzianum P1) to Rhizotocnia solani is a prerequisite for triggering of Trichoderma ech24 gene expression before mycoparasitic contact, Appl Environ Microbiol. 66: pp.2232-2234 40. Lorito M., Hayes C.K., Di Pietro A., Woo S.L., Harman G.E. (1994), Purification, characterization and synergistic activity of a glucan 1,3-glucosidase and an N- acetyl-β-glucosaminidase from Trichoderma harzianum, Phytopathology 84: pp.398- 405 41. Mahendra Rai and Paul Dennis Bridge, Applied Mycology, CABI North American Office, pp.216-233 42. Maoa W., Lewisa J.A., Lumsdena R.D., Hebbara K.P. (2000), Biocontrol of selected soilborne diseases of tomato and pepper plants, Crop Protect 17: pp.535-542 43. Marija Avramović (2010), Analysis of the genetic potential of the spongederived fungus Penicillium chrysogenum E01-10/3 for polyketide production, Bonn 2010 44. Mohammad Akrami, Hadi Golzary and Masoud Ahmadzadeh (2011), Evaluation of different combinations of Trichoderma species for controlling Fusarium rot of lentil, African Jounal of Biotechnology Vol.10 (14), pp.2653-2658. 45. Monteiro V.N., do Nascimento Silva R., Steindrorff A.S., Costa F.T., Noronha E.F., Ricart C.A., de Sousa M.V., Vainstein M.H., Ulhoa C.J. (2010), New insights in trichoderma harzianum antagonism of fungal plant pathogens by secreted protein analysis, Curr Microbiol. 61 (4): pp.298-305 46. Pan S.Q., Ye S.X., Kue J. (1991), A technique for detection of chitinase, β-1,3- glucanase and protein patterns after a single separation using polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectrofocusing, Phytopathology 81: pp.43-50 47. Papavizas G.C. (1985), Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology and potential for biocontrol, Annu Rev. Phytopathol 26: pp.23-54 48. Patamaporn Pruksakorn, Masayoshi Arai, Liu Liu and al. (2009), Action-mechanism of trichoderin A, an anti-dormant mycobacterial aminolipopeptide from marine sponge-derived Trichoderma sp., Biological and Pharmaceutical bulletin. 49. Petr Karlovsky (2008) The effect of fungal secondary metabolites, Springer-verlag Berlin Heidelberg, pp. 129-133 50. Prasun K.M. and Kanthadai R. (1997), Effect of temperature on antagonistic and biocontrol potential of shape Trichoderma sp. on Scerotium rolfsii, Mycopathologia 139 (3): pp.151-255 51. Robert A. Samson and al (1984), Introduction food-borne fungi, CBS, Institute of the Royal Nerlands Academy of Art and Sciences. 52. Samuel G.J. (2006), Trichoderma : systematic, the sexual state and ecology, Phytopathology 96: pp. 195-206 53. Samuel G.J., Suarez C., Solis K., Holmes K.A., Thomas S.E., Ismaiel A. and Evans H.C. (2006), Trichoderma theobromicola and T. paucisporum: two new spiecies isolate from cacao in South America, Mycological research 110: pp.381-392 54. Sheila A.Okoth, Jane A.Otadoh, James O.Ochanda (2011), Improved seedling emergence and growth of maize and beans by Trichoderma harzium, Tropical and Subtropical Agroecosystems, vol 13(2011): pp. 65-71 55. Vipin Kumar, Akhtar Haseeb and R. U. Khan (2011), Comparative Efficacy of Bioinoculents, Organic mendments and Pesticides Against Rhizoctonia solani Alone on Tomato CV. K-25 under Pot Conditions, World Journal of Agricultural Sciences 7 (6): pp.648-652. 56. Wang Tianhong, Long Hao, Zhang Yingkuan (2010), Isolation of Trichoderma reesei PyrG negative Mutant by UV mutagenesis and its application in transformation ( Tài liệu từ Internet 57. 58. 59. 60. 61. 62.