Luận văn Khảo sát thành phần hóa học của cây phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir. thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae)

Hoàng Đôn Hòa). Chữa đại tiện ra máu: cây Phèn đen cả cành và lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống (Bách gia trân tàng). Chữa chảy máu nướu răng: lá Phèn đen phối hợp với lá Long não và lá Xuyên tiêu phơi khô, chế thành viên rồi ngậm. Trị rắn cắn: lá Phèn đen tươi nhai nát nuốt hết nước rồi lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn. 5 1.2.2. Các nghiên cứu về dược tính của một số loài thuộc chi Phyllanthus Ở Quảng Tây Trung Quốc, cây Phyllanthus reticulatus Poir. (Euphorbiaceae) là một loại thuốc được sử dụng để chống viêm khớp và điều trị bệnh thấp khớp [48]. Năm 1997, E. Omulokoki và cộng sự [14] đã sử dụng dịch chiết từ lá của loài Phyllanthus reticulatus Poir. để khảo sát khả năng chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum ở nồng độ thử nghiệm cho kết quả IC50 < 10µg/ml. Năm 2010, một số báo cáo đã chứng minh rằng các chất chiết xuất của lá cây Phyllanthus reticulatus Poir. có tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn gây độc tế bào và bảo vệ gan [49]. • Dược tính của một số cây khác cùng chi: Năm 1961, Phòng Đông Y - Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) cho thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Salmonella typhi (0,9 cm), Shigella flexneri (1,1cm), Shigella sonnei (0 cm), Shigella shigae (1cm), Bacillus subtilis (0,4 cm), Escherichia coli (0 cm) [7]. Năm 1988, Blunberg và cộng sự [5] đã nghiên cứu tác dụng của hai loài cây chó đẻ răng cưa, Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri trên các bệnh nhân viêm gan siêu vi B. Kết quả cho thấy có 22/37 bệnh nhân âm tính sau 30 ngày điều trị bằng hai loài chó đẻ răng cưa trên. Các tác giả còn chứng minh cây Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B. Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự [7] công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan mãn tính. Chế phẩm LIV/94 được sản xuất từ 3 loại thảo dược: chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.), cây chua ngút (Embelia ribes Burn) và cỏ nhọ nồi (Ecliptaprostrata L.) được dùng để điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002). Kết quả nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân. Bên cạnh đó, năm 2007 các nhà khoa học Ấn độ đã khảo sát khả năng chống oxi hóa từ dịch chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus 6 debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus. Kết quả cho thấy các dịch chiết này đều thể hiện tính kháng oxi hóa [21]. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đắng). Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [10]. Năm 1976, Wai-Haan Hui và cộng sự [40] đã cô lập được 21-α- hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61), β-sitosterol (43), friedelin-1β,22β-diol (58) và glochidonol (60) khi nghiên cứu trên loài Phyllanthus reticulatus Poir. Năm 1981, Joshi và cộng sự [47] đã cô lập được các hợp chất kém phân cực như friedelin (57), betulin (55) và β-sitosterol (43) từ rễ và thân cây Phyllanthus reticulatus Poir. Năm 2009, Phan Văn Dân [7] khảo sát thành phần hóa học cây Phyllanthus reticulatus Poir. Kết quả cho thấy rằng cây Phyllanthus reticulatus Poir.có chứa các hợp chất β-sitosterol (43), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44), 2- acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (76). Năm 2012, J. Xiong Ma và cộng sự [50] đã phân lập được hai arylnaphthalene lignan glycoside từ dịch chiết methanol của cây Phyllanthus reticulatus Poir. đó là reticulatusides A (40) và reticulatusides B (41). Ngoài ra, tác giả còn đề cập tới sự hiện diện của syringaresinol (42) trong cây này. Do chưa có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) nên chúng tôi trình bày thành phần hoá học của một số cây khác cùng chi. 1.3.1. Phyllanthus acidus Năm 1966, Sengupta và cộng sự [32] phân lập được hai pentacyclic triterpenoid, đó là: phyllanthol (74) và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) (51). 7 1.3.2. Phyllanthus acuminatus Năm 1984-1985, Pettit và cộng sự [27,28] đã tách được phyllanthostatin 1 (32), phyllanthostatin 2 (33), phyllanthostatin 3 (34), phyllanthostatin 4 (35) và phyllanthostatin 5 (36). Năm 1990, Pettit và cộng sự [26] cũng đã cô lập được phyllanthostatin 6 (37) . 1.3.3. Phyllanthus amarus L. Năm 1995, Yeap Foo [22] phân lập được acid amariinic (45). Năm 1996, Peter J. Houghton và cộng sự [25] đã tách được 2 alkaloid mới là isobubbialine (4) và epibubbialine (2) cùng với 3 alkaloid đã biết là phyllanthine (11), securinine (13) và nor-securinine (9). Cấu trúc của chúng được xác định dựa vào phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ MS và NMR. Năm 2005 và 2007, Herbert Kolodziej và Farah Naaz [15,17] cô lập được acid shikimic (88) và epigallocatechin gallate (16). Năm 2008, Thales R.Cipriani và cộng sự [38] phân lập được acid thiobarbituric (14) và acid ascorbic (77). 1.3.4. Phyllanthus discoides Năm 1973, Manskevà cộng sự [23] đã tách được phyllanthin (38) và 2 alkaloid là phyllanthine (11) và phyllantidine (12). Năm 1983,Aripova và cộng sự [33] đã cô lập được phyllalbine (10). Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] phân lập được 14,15- dihydroallosecurinine-15β-ol (1) tinh thể màu vàng da cam. 1.3.5. Phyllanthus emblica L. Năm 1992, Kumar Roy và cộng sự [20] đã cô lập được acid ascorbic (77). Năm 1995, Mekkawy [13] phân lập được putranjivain A (50). Năm 1996, Ghosal [16] đã tách được phyllanemblinin A (48) là chất bột màu trắng, emblicanin-A (46) và emblicanin-B (47). Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] đã cô lập được acid 2-O- galloylgalactaric (80) và acid galloylmalic (81). Năm 2000, Zhang và cộng sự [45] đã tách được prodelphinidin A1 (49). 8 Năm 2002, Zang và cộng sự [46] đã phân lập được 1-([2-O-β-D- glucopyranoside]-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82) ở dạng tinh thể và 1-({2-O-[D-apiofuranosyl)-(16)-D-glucopyranoside]}-4,6- dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (83) là chất vô định hình màu vàng. Năm 2006, Ying-Jun Zhang [43] đã tách được acid phyllaemblic (87). Năm 2008, Xiaoli Liuvà cộng sự [42] đã phân lậptừ dịch chiết methanol được quercetin (22) và catechin (15), đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa cao. 1.3.6. Phyllanthus flexuosus Năm 1993, Tanaka và các cộng sự [37] đã phân lập được 5 triterpenoid có tên gọi như sau: olean-12-en-3β,15α-diol (70); lup-20(29)-en-3β,24-diol (66); olean-12-en-3β, 24-diol (71); oleana-11,13(18)-dien-3β,24-diol (73), olean-12- en-3β,15α,24-triol (72), betulin (55) và lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67). 1.3.7. Phyllanthus fratermus Năm 1988, Shunyo Matsunaga và cộng sự [35] công bố đã tách được acid trichadenic B (75). Năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự [29] đã tách được acid indole-3-butyric (5), acid 1-naphthaleneacetic (84). 1.3.8. Phyllanthus myrtifolius Năm 1999, Chen Lui và cộng sự [12] đã phân lập và nhận danh được 4-O- brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos (78) . 1.3.9. Phyllanthus niruroides Năm 1996, Babady Bila và cộng sự [9] đã phân lập được một hợp chất mới thuộc nhóm alkaloid là niruroidine (2,7-diepimer) (8). 1.3.10. Phyllanthus niruri L. Năm 1986, Joshi và cộng sự [19] đã tách được nirurine (7) và 4-methoxy- nor-securinine (6). Năm 1991, Satyanarayana và Venkateswarlu [31] đã tách được 4 diarylbutane lignin: 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin (24), 5- 9 desmethoxyniranthin (25), linnanthin (39) và cuối cùng là demethylenedioxyniranthin (26). Năm 2007, tại vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh từ phần dịch chiết ethylacetate đã phân lập được hai chất là: 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7- trihydroxy-5-ethoxy-1-one (79) và 5,7,8-trihydroxy-9,10-peroxy-4- ethoxybenzo[2,3-d]coumarin (89) [3]. Năm 2008, Shakil và Pankaj [34] đã tách được 2 flavanone: 8-(3- methyl- but-2-enyl)-2-phenylchroman-4-one (21) và 2-(4-hydroxyphenyl)-8-(3-methyl- but-2-enyl)-chroman-4-one (19) có khả năng làm thuốc chữa bệnh gút (gout) và bệnh thận. 1.3.11. Phyllanthus oxyphyllus Năm 2003, Sutthivaiyakit và cộng sự [36] đã tách được: acid 29-nor-3,4- seco-friedelantriterpen (68) và guaiane (85). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ IC50= 0.017 ± 0.001 mM. 1.3.12. Phyllanthus polyanthus Năm 2008, Vuyelwa J.N. và cộng sự [39] đã tìm ra được một số triterpenoid gồm: (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (54), lupenone (63) và (20S)-3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (53). 1.3.13. Phyllanthus sellowianus Năm 2002, Hnatyszyn [18] đã phân lập được rutin (23) và isoquercitrin (20). 1.3.14. Phyllanthus simplex Năm 1998, Rajkishor S. Negi và Thawra M. Fakhir [30] đã phân lập được (14-hydroxy-4-methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) (3) và phyllanthin (38). Chất (3) đã và đang được sử dụng làm thuốc Tây y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ biến trên thị trường. 1.3.15. Phyllanthus tenellus Theo luận văn cao học của Phan Văn Dân [7], năm 1971, 1972, 1974, các tác giả lần lượt là Asakawa, Bick và Bilia đã phân lập được tenellus-1 (17) và tenellus-2 (18). 10 1.3.16. Phyllanthus urinaria Năm 2000, Zhang L.Z. và cộng sự [44] đã tách được một số triterpenoid như: lupeol acetate (64), β-amyrin (51), β-amyrylglucosid (52) vàlupeol (62). Năm 2003, Chang và cộng sự [11] đã cô lậpđược 2,3-desmethoxy seco- isolintetralin diacetate (27), linnanthin (39), phyllanthin (38), hypophyllanthin (28), niranthin (29), nirtetralin (30) và phyltetralin (31). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng cách thuỷ giải và dựa vào các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Năm 2005, Wanxing Weivà cộng sự [41] đã phân lập được acid pentahydroxybenzoic (86). 1.3.17. Phyllanthus watsonii Năm 1992, Matsunaga và Tanaka [24] đã tách được hợp chất triterpen: 26- Nor-D:A-friedooleanane (69) cùng với một số hợp chất khác là: lupenyl palmitate (65), friedelin (57), epi-friedelanol (56), glochidone (59), glochidonol (60), lupeol (62) và lup-20(29)-en-3β,24-diol (66). Các công thức cấu tạo một số hợp chất trong chi Phyllanthus • Các alkaloid N H O O H OH H N H O O H OH 14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol (1) Epibubbialine (2) N O O H3CO OH N H O O OH H (14-Hydroxy-4-methoxy-13,14- Isobubbialine (4) dihydronorsecurinine) (3) 11 N H COOH N O CH3 O O Acid indole-3-butyric (5) 4-Methoxy-nor-securinine (6) N O O H N O H O H H H OH H N O O Nirurine (7) Niruroidine (8) nor-Securinine(9) O OH H3CO O NCH3 N O O H3CO Phyllalbine (10) Phyllanthine (11) N O O O H H N O O N H NH O S O Phyllantidine (12) Securinine(13) Acid thiobarbituric (14) • Các flavonoid OOH OH OH OH OH O OH OH O OH OH OH O OH OH OH Catechin (15) Epigallocatechin gallate(16) 12 OH OH OH O O O O OH OH O O OOH OOH OH OH Flavonoide tenellus-1 (17) OH OH OH O O O O O OH O O OOH OOH OH OH O OH OH OH Flavonoide tenellus-2 (18) O O CH3CH3 OH 1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1'' 2'' 3'' 1' 2' 3' 4' 5' 6' OOH OH O O OH OH O OH OH OH OH Isoquercitrin (20) 2-(4-Hydroxyphenyl)-8-(3-metyl- but-2-enyl)-chroman-4-one (19) 13 O O CH3CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1'' 2'' 3'' 1' 2' 3' 4' 5' 6' OOH OH O OH OH OH Quercetin (22) OOH OH O O OH OH O OH OH OH O OCH3 OH OH OH Rutin(23) • Các lignan O O OCH3 OCH3 CH2OH CH2OH O O OCH3 OCH3 CH2OCH3 CH2OCH3 2,3-Desmethoxy seco-isolintetralin (24) 5-Desmethoxyniranthin (25) OCH3 OCH3 CH2OCH3 CH2OCH3OH OH OCH3 CH2OCOCH3 CH2OCOCH3 O O OCH3 OCH3 Demethylenedioxyniranthin (26) 8-(3-Methyl-but-2-enyl)-2- phenylchroman-4-one (21) 2,3-desmethoxyseco- isolintetralin diacetate(27) 14 H3CO CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 O O H3CO CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 O O Hypophyllanthin (28) Niranthin (29) CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H3CO O O CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H3CO H H H H3CO Nirtetralin (30) Phyltetralin (31) O O CH3 O O O O O O OH O CH3 CH3 O O OH O OH CH3 CH3 O O O CH3 O O O O O O O CH2OH O OH O OH CH3 CH3 O CH3 O OH Phyllanthostatin 1(32) Phyllanthostatin 2(33) 15 O O CH3 O CH2OH OH O O O O O OH CH3 O OH O OH CH3 CH3 O CH3 O O O CH3 O O O O O O O OH CH3 O OH O CH3 CH3 O CH3 O OH Phyllanthostatin 3(34) Phyllanthostatin 4(35) O O CH3 O O O O O O OH O CH3 O OH O CH3 CH3 O OH CH3 O O O CH3 O O O O O O OH OH CH2OH O OH OH CH3 OH Phyllanthostatin 5 (36) Phyllanthostatin 6 (37) CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H3CO H3CO H H OCH3 OCH3 CH2OCH3 CH2OCH3H3CO H3CO OCH3 Phyllanthin (38) Linnanthin (39) 16 O O H3CO H3CO O O O O OH OH OH O O HOH2C OH OH Reticulatusides A(40) O O O H3CO O O O O OH CH2OH OH OH O OH OH OH Reticulatusides B(41) O O HH H3CO OH H3CO OCH3 OH OCH3 Syringaresinol (42) 17 • Các steroid CH3 OH CH3 H CH3 CH3 CH3 H H CH3 H β-Sitosterol(43) CH3 O CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 H H HO OH OH CH2OH OH β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44) • Các tannin OH OH OH OH OH OH O O O O O O O O OH OH OH O O O OH OHO O CH3 O OH OH OH OH OH OH OH OH CO CO O O O O O O OH OH OH O OH OH OH O Acid amariinic (45) Emblicanin-A (46) 18 O OH OH OH OH CO CO O O O HOH2C OH O OH OH OH O Emblicanin-B (47) Phyllanemblinin A (48) OHOH OH CO CO OH OH OH O O O O O O OH OH OH CO CO CO O OH OH O OH H OH O O OH OH OH OH O OH OH OH OH O OH OH OH OH OH OH Prodelphinidin A1 (49) Putranjivain A (50) OH OH OH OH OH OH CO CO O O O O O O O O OH OH OH OH OH OH 19 • Các triterpenoid OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H O CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O CH2OH OH OH OH β-Amyrylglucosid (52) CH3 H H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH2 CH3 CH3 OO CH3 CH3 H H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH2 CH3 CH3 OO CH3 (20S)-3α-Acetoxy-24- (20S)-3β-Acetoxy-24- methylenedammaran-20-ol (53) methylenedammaran-20-ol (54) β-Amyrin (51) 20 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2OH H CH3 CH2 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H H CH3 OH O OH CH3 H CH3 CH3 CH3 Friedelin-1β,22β-diol (58) CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH2 CH3CH3 O H CH3 H CH3 O CH3CH3 OH CH3 H CH3 H CH3 CH2 Glochidone (59) Glochidonol (60) Betulin(55) Epi-friedelanol (56) Friedelin (57) 21 O CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH3 H O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 CH3 CH3 O Lupenone (63) Lupeol acetate (64) O CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H O CH3 H H Lupenyl palmitate (65) Lupeol (62) 21-α-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61) 22 OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 CH3 OH Lup-20(29)-en-3β,24-diol (66) Lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67) HOOC CH3 CH2 CH3 CH3 CH3 HCH3 CH3 CH2 O CH3 CH3 COOH CH3 CH3 CH3 CH3 H H OH H H H Acid 29-nor-3,4-seco-friedelantriterpen (68) 26-Nor-D:A-friedooleanane (69) OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 H OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H Olean-12-en-3β,15α-diol (70) Olean-12-en-3β, 24-diol (71) OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H OH OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH Olean-12-en-3β,15α,24-triol (72) Oleana-11,13(18)-dien-3β,24-diol (73) 23 OH H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 HOOC HH H Phyllanthol (74) Acid trichadenic B (75) • Các chất khác O O NH CH3NH O O O O OHOH H OHH OH Acid ascorbic (77) O OH O OH OH OH O OH OH OH OH OH OH O O O O O OH OH OH O O O O 4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl- D-glucopyranos (78) 2-Acetamido-3-phenylpropyl 2- benzamido-3-phenylpropanoate (76) 24 OH O OH OH OC2H5 O O O OH OH OH OH OH OH OH OH O Acid 2-O-galloylgalactaric (80) OH OH O O O O OH OH OH CH3 O O CH3 OOH OH OH OH OH OH Acid galloylmalic (81) CH3 O O CH3 OOH OH OH OH OH O O OH OH OH O OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O OH OH OH OH OH O OH O O O CH3 O OH OH O H O OH Guaiane (85) Acid pentahydroxybenzoic (86) 1-({2-O-[(D-apiofuranosyl)-(1-6)-D- glucopyranoside]}-4,6-dihydroxyphenyl)- 2-metylpropan-1-one (83) 1-([2-O-β-D-glucopyranoside]-4,6- dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82) 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5- ethoxy-1-one (79) Acid phyllaemblic (87) Acid 1-naphthaleneacetic (84) 25 COOH OH OH OH OOH OH OH O O O OCH2CH3 Acid shikimic (88) 5,7,8 - trihydroxy-9,10-peoxy-4- ethoxybenzo[2,3-d] coumarin (89) Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 26 CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 27 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong khảo sát thành phần hóa học là lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được thu hái tại huyện Tân Uyên, Bình Dương, vào tháng 7/2012. Mẫu cây đã được GS.TS Võ Văn Chi nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus reticulatus Poir.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.1.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn, đem sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.2. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hoá chất Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck dùng cho cột sắc ký. Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc ký cột. Sắc ký bảng mỏng loại 25DC – Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F 254 , Merck. Sắc ký bảng mỏng loại 25DC, RP-18, Merck. Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: ether dầu hoả, ethanol, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol và nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng H2SO4 30%. 2.2.2. Thiết bị Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. Các cột sắc ký. Máy cô quay chân không hiệu Heidolph. Bếp cách thuỷ. Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. Cân điện tử. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 28 2.3. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất Sử dụng SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp-18 kết hợp SKLM. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 30%. 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh. 2.4. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (m = 26.00 kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (534.00 g). Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate thu được cao ether dầu hoả (52.00 g), cao ethyl acetate (118.00 g). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 1. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 29 Sơ đồ 1. Qui trình điều chế cao ether dầu hoả và ethyl acetate (EA) 2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Thực hiện SKC silica gel trên cao ethyl acetate (118,00 g) với hệ dung môi rửa giải ED:EA có độ phân cực tăng dần từ 20% - 100% ethyl acetate. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.1 - EA.4), được trình bày trong bảng 1. Cao ether dầu hoả ED (52,00 g) Cao ethyl acetate EA (118,00 g) - Chiết lỏng-lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung môi Cao ethanol (534.00 g) Bã khô Dịch ethanol Cô quay thu hồi dung môi Bột lá, thân và rễ phèn đen m = 26.00kg - Ngâm dầm trong ethanol - Lọc Ethanol Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 30 Bảng 1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA) Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.1 ED:EA = 4:1 86,00 Vệt dài Chưa khảo sát EA.2 ED:EA = 7:3 7,90 Nhiều vết, tách không rõ Chưa khảo sát EA.3 ED:EA = 1:1 2,53 Nhiều vết Chưa khảo sát EA.4 EA = 100% 2,65 Nhiều vết, tách rõ khảo sát Ghi chú: ED(ether dầu hỏa), EA(ethyl acetate) 2.5.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.4 của bảng 1 Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.4 (2.65 g) của bảng 1, với hệ dung môi giải ly C:Me có độ phân cực lần lượt tăng dần từ 0 – 20% Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.4.1 - EA.4.4), được trình bày trong bảng 2. Bảng 2: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 1 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.4.1 C (100 %) 221 mg Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát EA.4.2 C: Me (9.8: 0.2) 180 mg Nhiều vết, tách rõ Chưa khảo sát EA.4.3 C: Me (9.8: 0.2) 81 mg Vết tím rõ, lẫn dơ Khảo sát EA.4.4 C: Me (9.0: 1,0) 660 mg Hai vết dính nhau Khảo sát Ghi chú: C (chlorofom), Me(methanol), EA(ethyl acetate) 2.5.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.4.3 của bảng 2 Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.4.3 (81 mg) của bảng 2, với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần từ 0 – 20 % Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 31 Kết quả thu được 3 phân đoạn (EA.4.3.1 - EA.4.3.3), được trình bày trong bảng 3. Bảng 3: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.4.3 của bảng 2 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.4.3.1 C (100%) 33 mg Nhiều vết dơ, mờ Không khảo sát EA.4.3.2 C (100%) 7mg Một vết tròn, màu tím Khảo sát, thu được chất S1 EA.4.3.3 C: Me (9.0: 1.0) 16 mg Vết dơ, mờ Không khảo sát Ghi chú: C (chlorofom), Me(methanol), EA(ethyl acetate) Nhận xét: Từ phân đoạn EA.4.3 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo thứ tự EA.4.3.1-EA.4.3.3. Kiểm tra sắc ký lớp mỏng trên phân đoạn EA.4.3.2 với hệ dung môi C: Me (9.5: 0.5), thuốc thử hiện hình H2SO4 30 % cho một vết rõ, màu tím, Rf= 0.7.Kết tinh lại trong chloroform, thu được chất bột, màu trắng (7.00 mg). Ký hiệu là S1. 2.5.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.4.4 của bảng 2 Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.4.4 (660 mg) của bảng 2, với hệ dung môi giải ly C: Me từ (0- 10% Me). Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.4.4.1 - EA.4.4.4), được trình bày trong bảng 4. Chất S1 Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 32 Bảng 4: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.4.4 của bảng 3 Phân đoạn Dung môi Giải ly Trọng lượng (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.4.4.1 C: Me (9.8: 0.2) 87 mg Nhiều vết dơ, mờ Không khảo sát EA.4.4.2 C: Me (9.5:0.5) 105 mg Hai vết dính nhau,vết trên đậm hơn Khảo sát thu đươc T1 EA.4.4.3 C: Me (9.0: 0.1) 134 mg Hai vết dính nhau,vết dưới đậm hơn Chưa khảo sát EA.4.4.4 C: Me (7.0: 0.3) 91 mg Hai vết dính nhau mờ, lẫn dơ Không khảo sát Ghi chú: C (chlorofom), Me(methanol), EA(ethyl acetate) Nhận xét: Từ phân đoạn EA.4.4 của bảng 3, sắc kí cột thu được 4 phân đoạn sắp xếp theo thứ tự EA.4.4.1-EA.4.4.4 Kết quả sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn EA.4.4.2 cho hai vết dính nhau,vết trên đậm màu hơn. Thực hiện sắc kí cột silica gel pha đảo nhiều lần trên phân đoạn này, giải ly bằng dung môi (Me: H2O). có độ phân cực giảm dần. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc ký lớp mỏng của pha đảo.Những lọ cho sắc ký lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn. Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏnghệ dung môi Me: H2O (7.0: 3.0), thuốc thử hiện hình H2SO4 30%,chỉ thu được 1 vết rõ, màu đen, Rf = 0,65. Kết tinh lại trong methanol, thu được tinh thể hình kim màu trắng (17 mg). Hợp chất này được ký hiệu là T1. Phân đoạn EA.4.4.2 Dung môi giải ly: C: Me (9.0: 1.0) chất T1 Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 33 Sơ đồ 2: Sơ đồ cô lập các chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate trong cây Phèn đen Sắc ký lớp mỏng nhiều lần Giải ly C: Me (9.5: 0.5) S1 (7mg) - Sắc ký cột silica gelpha đảo - Giải ly: Me: H2O (6.0: 4.0) T1 (17mg) Phân đoạn EA.4.3.1 33.00 mg Phân đoạn EA.4.3.2 14.00 mg Phân đoạn EA.4.3.3 16.00 mg Phân đoạn EA.4.4.3 134.00mg Phân đoạn EA.4.4.2 105.00 mg Phân đoạn EA.4.4.1 87.00 mg - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: C (100%) - Cô quay thu hồi dung môi Phân đoạn EA.4.1 221.00 mg Phân đoạn EA.4.2 180.00 mg Phân đoạn EA.4.3 81.00 mg Phân đoạn EA.4.4 660.00 mg - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: C:Me - Cô quay thu hồi dung môi Cao ethyl acetate EA (118,00 g) - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: C:Me - Cô quay thu hồi dung môi Phân đoạn EA.2 7,90 g Phân đoạn EA.1 86,00 g Phân đoạn EA.3 2,53 g Phân đoạn EA.4 2,65 g - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: C100 - Cô quay thu hồi dung môi Phân đoạn EA.4.4.4 91.00 mg Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 34 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 35 3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất T1 Chất T1 (17 mg) thu được từ phân đoạn EA.4.4.2 của sơ đồ 2, có những đặc điểm sau: - Hợp chất ở dạng tinh thể màu trắng. -Sắc ký lớp mỏng cho một duy nhất với Rf = 0.65 trong hệ dung môi giải ly Me: H2O (7.0: 3.0), hiện hình bằng đèn UV và phun thuốc thử H2SO4 30%, cho vết màu đen. - Phổ 1H-NMR (MEOD), (phụ lục 1.1a, 1.1b, 1.1c), δH 7.70 (1H, d, =CH- ,J = 16.0 Hz, H7”); 6.95 (2H, d, H6 ); 6.54 (1H, d, J = 16.0 Hz, H8”); 5.08 (1H, d, J = 7.0 Hz, H1''); 4.79 (1H, d, =CH-, J = 7.0 Hz, H1'); 4.75 ( 1H, d, J=7.0 Hz, H1’); 4.57 (2H, d, -O-CH2- , H6’). - Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT - NMR ( MEOD ), (phụ lục 1.2; 1.3), δC 168.3 (>C=O, C9”); 146.4 (=CH-, C7”); 103.8 (-O-CH-O, C1' ); 74.8, 77.9, 71.9 (-CH-OH, C2’, C3’, C4’). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon khác được trình bày trong bảng 5. - Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 1.4,1.5a, 1.5b, 1.6, 1.6a, 1.6b).  Biện luận cấu trúc phổ T1 Phổ 1H-NMR (MeOD) xuất hiên hai proton olefin cộng hưởng tại δH 7.70 (1H, d, =CH-, J = 16.0 Hz, H7”); 6.54 (1H, d, J = 16.0 Hz, H8”) và 5 proton gắn trên vòng benzene cộng hưởng ở δH 7.59 (2H, m), 7.42 (3H, m). Hai proton olefin có hằng số ghép J =16.0 Hz nên nối đôi có cấu hình trans. Phổ đồ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của một vòng benzene mang hai nhóm thế ở vị trí 1; 4 [δH 6.95 (2H, d, J= 8.0 Hz); 6.66 (2H, d, J= 8.0 Hz)], 1 proton anomer ở δH 4.75 (1H, d, J =7.0 Hz, H1’), các proton gắn trên carbon mang oxygen của phân tử đường cộng hưởng trong vùng δH 3.45-4.56. Phổ 13C kết hợp với DEPT - NMR ( MeOD, phụ lục 1.2, 1.3), cho thấy T1 có 21 nguyên tử carbon. Trong đó, có 4 carbon loại >CH-O-, 11 carbon loại =CH-, một carbon loại >C=O, 1 carbon loại –CH2-O, 2 carbon loại >C=O. Một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 168.3 ( C9”); hai carbon olefin và các carbon của vòng benzen cộng hưởng ở δC 116.6-153.9. Tín hiệu cộng hưởng của phân Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 36 tử đường 6 carbon bao gồm một carbon anomer δC 103.8, 4 carbon >CH-O- (δC77.9, 75.4, 74.8, 71.9) và một nhóm –CH2-O- tại δC 64.9. Phổ HSQC cho thấy tương quan từ proton đến carbon qua 1 nối giúp xác định sự gắn kết của proton trên các carbon tương ứng. Hai proton olefin ở δH 7.70 và 6.54 tương quan lần lượt đến 2 carbon tại δC 146.6 và 119.6. Hai cặp proton ghép cặp ortho ở δH 6.95 (2H, d, J=8.0 Hz) và 6.66 (2H, d, J=8.0 Hz) tương quan lần lượt đến carbon ở δC 119.6 và δC 116.6. Tương quan HSQC còn thể hiện từ proton anomer δH 4.76 đến carbon ở δC 103.8. Proton của nhóm methylen mang oxygen ở δH 4.57 và 4.54 tương quan với carbon tại δC 64.0 (C6’). Từ các dữ liệu phồ nghiệm trên cho phép dự đoán T1 có cấu trúc gồm 2 đơn vị vòng thơm, 1 phân tử đường 6 carbon, một nối đôi CH=CH và một nhóm >C=O Tương quan HMBC từ proton olefin ở δH 7.70 đến các carbon tại δC 135.5 (carbon tứ cấp); 129.7; 119.6 và 168.4 (>C=O, C6’). Proton olefin tại δH 6.54 có tương quan HMBC đến carbon ở δC 135.5. Như vậy cấu trúc T1 có 1 đơn vị cinnanoyl. Proton anomer tại δH 4.74 có tương quan HMBC đến carbon tứ cấp ở δC 152.2; hai proton thơm ghép cặp ortho tại δH 6.59 cũng cho tương quan HMBC với carbon ở δC 152.2. Hai proton thơm ghép cặp ortho còn lại tại δH 6.66 (d, J= 8.0 Hz) có tương quan HMBC đến carbon tại δC 152.2. Do đó phân tử đường gắn vào vòng thơm còn lại tại C1 (δC 152.2). Hai proton gắn trên carbon methylen mang oxygen (–CH2-O, C6’) của phân tử đường ở δH 4.55 và 4.37 có tương quan HMBC đến carbon tại δC 168.3 (>C=O, C9”), nên vị trí C6’ của đường sẽ gắn vào cinnamonyl qua liên kết ester. Việc phân tích các dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất T1 và so sánh đối chiếu với dữ liệu phổ nghiệm của 6’- cinnamoylarbutin [53] cho thấy có sự tương đồng nên T1 được đề nghị là 6’-cinnamoylarbutin. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 37 3.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất S1 Chất S1 (7.00 mg) thu được từ phân đoạn EA.4.3.2 của sơ đồ 2, có những đặc điểm sau: - Hợp chất ở dạng bột màu trắng. - Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất với Rf = 0.7 trong hệ dung môi giải ly C: Me (9.5: 0.5), hiện hình bằng đèn UV và phun thuốc thử H2SO4 30%, cho vết màu tím. - Phổ 1H-NMR (CDCL3), (phụ lục 2.1a; 2.1b, 2.1c) δH ppm 7.96 (1H, d, =CH-,J = 9.5Hz, ); 7.09 (1H, s); 6.96 (1H, d, J=1.5); 6.84 (1H, s); 6.81 (1H, d, J=8.0); 6.09 (2H, O-CH2-O, ). - Phổ 13C kết hợp với DEPT - NMR ( CDCL3 ), (phụ lục 2.2, 2.2a, 2.2b, 2.3). δC ppm 169.92 (>C=O); 152.26; 150.45 (=C-O-); 123.74; 110.83; 108.3; 106.54; 101.4 (=CH-); 101.02 (-O-CH2-O ); 75.95; 72; 64.85(-CH-O); 56.2 (O-CH3); 21.24 (CH3-C=O). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon khác được trình bày trong bảng 6. - Phổ COSY, HSQC, HMBC, phụ lục 2.4a; 2.4b; 2.5a; 2.5b; 2.5c; 2.6, 2.6a.  Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR cho thấy hợp chất S1 có các proton gắn trên vòng benzene cộng hưởng trong vùng δH 6,09-7,97. Trong đó, 4 proton cho tín hiệu cộng OH O OH O OH CH2 O OH H OH 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4'5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' 8'' 9'' Hình 3 tương quan HMBC của hợp Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 38 hưởng dưới dạng mũi đơn ở δH 7,97 (1H, s) 7,95 (1H, s) và 7,09 (2H, s). Phổ đồ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai vòng benzene mang nhóm thế ở 1,3.4 bao gồm các proton ở δH 6.96 (2H, d, J= 8.0 Hz), 6.81 (2H, d, J= 8.0 Hz) và 6.83 (2H, s). Hai proton anomer cộng hưởng ở δH 4,83 (1H, d, J=7,5 Hz) và 4,78 (1H, d, J=7,5 Hz), các proton gắn trên carbon mang oxygen cộng hưởng ở vùng δH 5,42 -5,56 và 3,52- 5,14. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy proton methyl của nhóm –OAc cộng hưởng ở δH 2,24. Phổ 13C- NMR (CDCl3, 125 MHz, phụ lục 2.2, 2.2a, 2.2b) hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 2.3) cho thấy các mũi cộng hưởng gồm carbon carbonyl >C=O (δC 169,9); các carbon của vòng benzene và một carbon methylendioxygen (δC 101,4); một carbon methylen mang oxygen (δC 67,5), nhóm –OAc (δC 21,2) và phân tử đường. Trong số các carbon của vòng benzen có 5 carbon mang hydrogen [δC 123,7 (C-6’); 110,8 (C-2’); 108,3 (C-5’); 106,5 (C-3); 101,0 (C-6)]; 4 carbon mang oxygen [δC 152,2 (C-5); 150,4 (C-4); 147,7 (C-3’, C-4’)]; 6 carbon tứ cấp [δC 136,9 (C-7’); 131,0 (C-1, C-8); 128,4 (C-1’); 127,2 (C-2)]. Phần đường có hai phân tử đường gồm hai carbon anomer (δC 105,7; 105,2); hai carbon methylen mang oxygen (δC 66,6 và 64,8) cùng với 6 carbon >CH-O- (δC 75,9; 72,6; 72,5; 70,5; 70,2; 67,2). Các tương quan trong phổ HSQC giúp xác định các proton gắn trên các carbon tương ứng. Theo đó, bốn proton ở δH 6,09 (2H, s) và 6,04 (2H, s) cho tương quan HSQC đến một carbon methylendioxygen δC 101,4. Bốn proton ở 5,42 -5,56 cũng cho tương quan đến một carbon ở δC 67,5. Hai proton gắn trên vòng benzene δH 7,97(1H, s); 7,95 (1H, s) cho tương quan HSQC với một carbon δC 101,0 (C-6) và hai proton ở 7,09 (2H, s) cũng cho tương quan với một carbon ở δC 106,5. Kết hợp với các tương quan HSQC còn lại của các proton gắn trên vòng benzene có thể dự đoán rằng hợp chất S1 có cấu trúc đối xứng hoặc là hỗn hợp hai chất có cấu trúc tương đồng. Phổ HMBC cho thấy tương quan từ hai cặp proton ở δH 6,09 (2H, s) và 6,04 (2H, s) đến carbon tại δC 147,7; bốn proton ở δH 6,83 (2H, s) và 6,96 (2H, d, J=8,0 Hz) cũng cho tương quan đến δC 147,7. Ngoài ra, proton nhóm – Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 39 CH2-O- ở δH 5,42 -5,56 cho tương quan đến các carbon ở δC 169,9 (C-9’); 144,0 (C-7’) và 131,1 (C-8’). Các tương quan của các proton thơm được thể hiện trong hình 4, 5. Ngoài ra lần lượt proton của nhóm methoxy ở δH 3.37 (6H, s), 4.02/4.03 (6H,s) tương quan HMBC đến carbon δC 150.2 (C4) và 152.2 (C5). Từ các dữ liệu trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ của các dẫn xuất của diphyllin cho thấy có sự tương hợp, nên chúng tôi đề nghị phần S1 là hỗn hợp hai glycoside có một phần aglycon giống nhau là diphyllin. Mỗi cấu trúc trong hỗn hợp có một phân tử đường arabinose hoăc xylose Tương quan HMBC từ proton anomer ở δH 4,83 (1H, d, J=7,5 Hz, H- 1”a) tới carbon tại δC 144,0 cho phép xác định hợp chất thứ nhất (S1a) có phân tử đường gắn vào aglycon vị trí C-7 qua liên kết oside. Proton anomer H-1’’a cho tương quan COSY với H-2’’a ở δH 4,11 . Các tương quan còn lại giúp xác định được phân tử đường. Proton H-3’’a ở δH 4,91 (1H, dd) có hằng số ghép J = 10.0/3.5 Hz cho thấy phân tử đường này là đường arabinose. Hằng số ghép của proton anomer là 7,5 Hz nên đường arabinose có cấu hình α-L. Do C-3’’a cộng hưởng về vùng từ trường thấp hơn so với C-3 của đường arabinose, C-4’’a lại dịch chuyển về vùng từ trường cao hơn đồng thời H-3’’a cũng cộng hưởng ở vùng từ trường thấp nên chúng tôi đề nghị tại vị trí C3”a của phân tử đường arabinose có gắn nhóm OAc. Tương quan HMBC từ proton anome ở δH 4,78 (d, J=7,5Hz, H-1”b) của phân tử đường còn lại đến carbon tại δC 144,0 , cho phép xác định hợp chất thứ 2 (S1b) có phân tử đường gắn vào aglycon tại vị trí C-7. Kết hợp các dữ liệu phổ HSQC, COSY, HMBC cho thấ phân tử đường trong hợp chất S1b là α-L-arabinose (H-1’’b có J = 7,5Hz, H-4’’b cộng hưởng dưới dạng mũi đơn rộng), phân tử đường arabinose này có nhóm-OAc gắn vào vị trí C-4’’b (δC 70, δH 5,14) Do không có dữ liệu phổ của hợp chất giống với S1a và S1b nên chúng tôi so sánh dữ liệu phổ của S1a và S1b với hợp chất 4-O-α-L - arabinopyranosyldiphyllin [54] nhận thấy có sự tương đồng, ngoại trừ trong cấu trúc của hợp chất S1a và S1b có thêm nhóm acetoxy gắn vào phân tử Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 40 đường nên chúng tôi đề nghị S1 là hỗn hợp của 4,5-dimethoxy-3’,4’- methylenedioxy-7-O-(3”-O-acetyl arabinopyranosyl) 2,7’-cyclolign-7,7’-dien- 9,9’-lactone và 4,5-dimethoxy-3’,4’-methylenedioxy-7-O-(4”-O-acetyl arabinopyranosyl)-2,7’-cyclolign-7,7’-dien-9,9’-lactone. O C O O O H3CO H3CO O O O OH C O CH3 OH 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 9 6 O O C O O O H3CO H3CO O OH O C O CH3OH 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 9 6 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' Hình 4. Tương quan HMBC của hợp chất S1a Hình 5. Tương quan HMBC của hợp chất S1b Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 41 Bảng 5: Số liệu phổ NMR của T1 Vị trí Hợp chất T1 (MEOD) Hợp chất so sánh [54] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) HMBC (1H13C) δC (ppm) 1 152.2 152.3 2 6.95, d (8.0) 119.9 3; 4; 5 118.6 3 6.66, d (8.0) 116.6 1; 5 116.6 4 153.9 153.9 5 6.66, d (8.0) 116.6 1; 3 116.6 6 6.95, d (8.0) 119.9 3; 4; 5 118.6 1' 4.75, d (7.0) 103,8 1; 2’; 3’ 103.6 2' 3.45, ma 74.8 1’; 3’ 74.9 3' 3.48, ma 77.9 1’; 2’; 4’ 77.9 4' 3.45,(8.0; 9.5) 71.9 3’; 5’; 6’ 71.8 5' 3.67, ddd (9.5; 6.5; 2.0) 75.4 4’; 6’ 75.4 6' 4.55, dd,(12.0; 2.0) 4.37,dd, (12.0; 6.5) 64.9 4’; 5’, 9” 64.9 1'' 135.6 135.7 2'' 7.59, ma 129.3 3”; 4”; 6”; 7’’ 130.1 3'' 7.42, ma 130.2 1”; 5” 129.3 4'' 7.42, ma 131.3 2”; 6” 131.6 5'' 7.42, ma 130.2 1’’; 6’’; 3’’ 129.3 6'' 7.59, m a 129.7 2”; 1’’ 130.1 7'' 7.70, d (15.0) 146.4 1”; 2’’; 6”; 8”;9” 146.6 8'' 6.54, d (15.0) 118.7 1”; 7’’; 9’’ 119.6 9'' 168.3 168.4 a: Tín hiệu bị chồng chập Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 42 Bảng 6: Số liệu phổ NMR của S1 Vị trí Chất S1a (CDCl3) Chất S1b (CDCl3) Hợp chất so sánh (DMSO) [54] δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm) 1 - 131.1 - 131.1 129.6 2 - 127.2 - 127.2 126.6 3 7.09, s 106.5 7.09, s 106.5 107.9 4 - 150.4 - 150.4 149.9 5 - 152.2 - 152.2 151.4 6 7.95, s 101.0 7.95, s 101.0 101.8 7 - 144.0 - 147.0 144.5 8 - 131.1 - 131.1 128.9 9 5.42- 5.56 67.5 5.42- 5.56 67.5 67.0 1’ - 128.4 - 128.4 128.2 2’ 6.83 110.8 6.83 110.8 110.7 3’ - 147.7 - 147.7 146.8 4’ - 147.7 - 147.7 146.9 5’ 6.96,d, (8.0) 108.3 6.96, d, (8.0) 108.3 104.8 6’ 6.81, d (8.0) 123.7 6.81, d (8.0) 123.7 123.5 7’ - 136.9 - 136.9 134.4 8’ - 119.5 - 119.5 118.6 9’ 169.9 - 169.9 169.0 -OCH2-O 6.09, s 6.04, s 101.4 6.09, s 6.04, s 101.4 4-OMe 3.7, s 56.4 3.7, s 5-OMe 4.03b, s 56.0 4.02b, s 1” 4.83, d (7.5) 105.7 4.78, d, (7.5) 105.2 105.4 2” 4.32, m 70.2 4.11, m 72,6 70.8 3” 4.91,dd (10.0/3.5) 75.9 4.09, m 72.5 72.2 4” 4.11,m 67.2 5.14, br s 70.5 67.2 5” 4.06; 3.55 66.6 3.54; 4.09 64.8 65.7 b: tín hiệu có thể trao đổi lẫn nhau Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 43 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 44 4.1. KẾT LUẬN Việc khảo sát thành phần hóa học của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) thu hái tại xã Bạch Đằng - Tân Uyên – Bình Dương đã thu được những kết quả như sau: Từ phân đoạn EA.4.4.2 (sơ đồ 2) cao ethylacetatel, sử dụng các phương pháp trích ly, chiết xuất, đã cô lập được hợp chất với kí hiệu T1. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc T1 là 6’-O’-cinnamoylarbutin (Hình 6). Từ phân đoạn EA.4.3.2 (sơ đồ 2) cao ethylacetatel, sử dụng các phương pháp trích ly, chiết xuất, đã cô lập được hợp chất với kí hiệu S1. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc S1 là hỗn hợp 2 glycoside (S1a, S1b) O O C O O O H3CO H3CO O O OH C O CH3 OH 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 9 6 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' O O C O O O H3CO H3CO O OH O C O CH3OH 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 9 6 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 4,5-Dimethoxy-3’,4’-methylenedioxy-7- O-(3”-O-acetyl arabinopyranosyl) 2,7’- cyclolign-7,7’-dien-9,9’-lactone OH O OH O OH CH2 O OH H OH 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4'5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' 8'' 9'' 6’-O’-cinnamoylarbutin 4,5-Dimethoxy-3’,4’-methylenedioxy-7- O-(4”-O-acetyl arabinopyranosyl) 2,7’- cyclolign-7,7’-dien-9,9’-lactone Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 45 4.2. ĐỀ XUẤT Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn chúng tôi chưa nghiên cứu. Trong khóa luận này, chúng tôi chỉ mới tiến hành phân lập với cao hexane và ethylacetate. Ngoài ra, còn cao khác nhau và nhiều phân đoạn còn lại chúng tôi chưa khảo sát. Vì vậy, thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu những loại cao và phân đoạn còn lại, đồng thời tiến hành thử hoạt tính sinh học đối với các loại cao và các hợp chất đã cô lập được. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO  TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Phan Văn Dân (2009), “Nghiên Cứu Thành Phần Hoá Học Có Trong Cây Phèn Đen (PhyllanthusReticulatusPoir. Euphorbiaceae)”, 12-13 và 35-40. [2] Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Nghiên cứu hoạt chất sinhhọc từ cây chó đẻ than xanh (Phyllanthusniruri L. Euphorbiaceae)”, Tạp chí Dược học số 9 ,năm 43, 12-15. [3] Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Nghiên cứu hóa thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthusurinaria L. Euphorbiaceae)”. Tạp chí dược học số 369,năm 47, 15-18. [4] Lê Trần Đức (1997),“Cây thuốc Việt Nam”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 724-725 [5] Đỗ Tất Lợi (1997), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học Hà Nội, 65-67. [6] Đỗ Tất Lợi (2000), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 550-551. [7] Nguyễn Thượng Phong(2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc của một số loài Phyllanthus ở Việt Nam”,Tạp chí dược liệu số 6, 72-75. [8] Trần Đình Thắng, Bùi Quang Chính, HoàngVăn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng (2007), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic từ câychó đẻ răng cưa”, Tạp ch í Dược học số 371, năm 47, 14-17.  TÀI LIỆU TIẾNG ANH [9] Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine-type alkaloid from Phyllanthusniruroides”, Phytochemistry, 41(5), 1441-1443. [10] Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus”, Pharmacology, Medicinal Research Reviews, 18, 4, 225-258. [11] Chang, C.-C., Lien, Y.-C, Liu, K.C.S.C., and Lee, S.-S.(2003), “Lignans from Phyllantusurinaria”,Phytochemistry 63, 7, 825-833. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 47 [12] Chen Lui (1999), “A new flavanone isolated from RhizomaSmilacisGlabrae and the structural requirements of its derivatives for preventing immunological hepatocyte damage”, Planta Med., 65, p.43-46. [13] El-Mekkawy (1995), “Inhibitory effects of Egyptian folk medicines on human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase”. The Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 43, p.641-648. [14] E. Omulokoli, B. Khan, S.C. Chhabra (1997), “Antiplasmodial activity of four Kenyan medicinal plants”, Journal of Ethnopharmacology, 56, p.133- 137. [15] Farah Naaz, SaleemJaved, M.Z. Abdin (2007), “Hepatoprotective effect of ethanolic extract ofPhyllanthusamarusSchum. etThonn”, Ethnopharmacology, 113(3), p.503-509. [16] Ghosal (1996), “Active constituents of EmblicaOfficinalis: part 1. The chemistry and antioxidativeeffcts of two new hydrolysable tannins, emblicanin A and B”.Indian Journal of Chemistry 35B, 9, p.941-948. [17] Herbert Kolodziej (2005), “Tannins and related compounds induce nitric oxide synthase and cytokines gene expressions in Leishmania major”, Bioorganic, 13(23), p.6470-6476. [18] Hnatyszyn, (2002), “The hypoglycemic effect ofPhyllanthussellowianus fractions”, Phytomedicine, 9(6), p.556-559. [19] Joshi (1986), “Crystalline compounds of the roots of Phyllanthusniruri”. Journal of the Indian Chemical society, 58,p.102-103. [20] Kumar Roy, H. Dhir, A. Sharma (1992), “Modification of metal-induced micronuclei formation in mouse bone marrow erythrocytes", Toxicology Letters, 62(1), p.9-17. [21] Kumaran, Karunakaran (2007), “In vitro antioxidant activities of methanol extracts of fivePhyllanthusspecies from India”, Food Science, 40(2), p.344-352. [22] L. Yeap Foo (1995), “Amariinic acid and related ellagitannins from Phyllanthusamarus”, Phytochemistry, 39(1), 217-224. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 48 [23]Manske R. H. F (192525), “The Alkaloids chemistry and physiology”, Phytochemistry, 15, 428. [24] Matsunaga, Tanaka (1992), “26-Nor-D:A-friedooleananetriterpenes from Phyllanthuswatsonii”, Phytochemistry, 32(1), 165-170. [25] Peter J. Houghton, Tibebe Z. Woldemariam (1996), “ Two securinega- type alkaloids from Phyllanthusamarus”, Phytochemistry, 43(3), 715-717. [26] Pettit GR, Schaufelberger DE, Nieman RA, Dufresne C, Saenz-Renauld JA (1990), “Antineoplastic agents, 177. Isolation and structure of phyllanthostatin 6”, 53(6), 1406-1413. [27] Pettit GR, Cragg GM, (1984),“Antineoplastic Agents 104. Isolation and Structure of the Phyllanthus-AcuminatusEuphorbiaceae Glycosides”.Journal of Organic Chemistry,49, 4258-66. [28] Pettit GR, Cragg GM, Suffness M (1985), “Phyllanthostatin 1 PhyllanthosideOrthoacid Rearrangement”. Journal of Organic Chemistry,50, 5060-5063. [29] Rajasubramaniam, PardhaSaradhi (1997), “ Rapid multiplication of Phyllanthusfraternus: a plant with anti-hepatitis viral activity”, Industrial Crops and Products, 6(1), 35-40. [30] Rajkishor S. Negi, Thawra M. Fakhir (1998), “ An alkaloid from Phyllanthus simplex”, Phytochemistry, 27(9), 3027-3028. [31]Satyanarayana, Venkateswarlu (1991), “Isolation, structure and synthesis of new diarylbutanelignansfrom Phyllanthusniruri”, Tetrahedron, 47(42), 8931-8940. [32] Sengupta, Mukhopadhyay (1966), “Terpenoids and related compounds- VII :Triterpenoids of Phyllanthusacidusskeels”, Phytochemistry, 5(3), 531- 534. [33] S. F. Aripova (1983), “Tropane alkaloids of two species of plantsof the Phyllanthusdiscoides”, 16, 677. [34] Shakil, Pankaj (2008), “Nematicidalprenylatedflavanones from Phyllanthusniruri”, Phytochemistry, 63(3), 759-764. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 49 [35] ShunyoMatsunaga, Reiko Tanaka, (1988), “Revised structure of trichadenic acid B”, Tetrahedron Letters, 29(37), 4751-4754. [36] Sutthivaiyakit, Nakorn N. (2003), “ A new guaianesesquiterpene from the roots of Phyllanthusoxyphyllus”, Tetrahedron, 59(50), 9991-9995. [37] Tanaka, K. Masuda and S. Matsunaga (1993), “ Lup-20(29)-en-3β,15α- diol and ocotillol-II”, Phytochemistry, 32(2), 472-474. [38] Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger (2008), “ Acidicheteroxylans from medicinal plants and their anti-ulcer activity”,CarbohydratePolymers, 74(2), 274-278. [39] Vuyelwa J. N., Neil R. C. (2008), “ Triterpenoids from the African tree Phyllanthus polyanthus”, Phytochemistry Letters, 1(1), 11-17. [40] Wai-HaanHui, Man-Moon Li, Kam-Moon Wong (1976), “A new compound, 21α-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one and other triterpenoids from Phyllanthusreticulatus”, Phytochemistry, 5(15), 797-798. [41] Wanxing Wei, Yuanjiang Pan (2005), “Carboxylic acids from Phyllanthusurinaria”, Chemistry of Natural Compounds, 41(1), 17-20. [42] Xiaoli Liu, Chun Cui, M. Zhao (5/2008), “Antioxidant activity of methanolic extract of emblica fruit”, Journal of Food, 21(3), 219-228. [43] Ying-Jun Zhang (2006). “A novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of Phyllanthusemblica”, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Japan, 1-14. [44] Zhang L. Z., Guo Y. J. (2000), “Studies on chemical constituents of PhyllanthusurinariaL.”, ZhongguoZhong Yao ZaZhi, 10(25), 615-617. [45] Zhang, Y. J., Tanaka, T., and Iwamoto (2000), “Novel Norsesquiterpenoids from the roots of Phyllanthusemblica”,Journal of Natural Products, 63, 11, 1507-1511. [46] Zhang (2002), “Two new acylatedflavanone glycosides from the leaves and branches of Phyllanthusemblica”, Chem. Pharm. Bull., 50, 841. [47] Joshi KC, Singh P, Mehra A. (1981), “Crystalline components of the roots of Phyllanthusreticulatus”, J IndChemSoc,58, 102–103. Khóa luận tốt nghiệp Lương Thị Thủy 50 [48]The Health Bureau of Guangxi Province (1974), “Compilation of Medicinal Herbs in Guangxi”, II, Guangxi People Press, Nanning, p. 1588 [49]Ming-Sheng Lana, Jian-Xiong Ma, Chang-Heng Tan, Song Wei, and Da- Yuan Zhu (2010),“Chemical Constituents of Phyllanthusreticulatus”, Helvetica ChimicaActa, 93, 2276. [50]Jian-Xiong Ma , Ming-Sheng Lan , Shi-Jin Qu, Jun-Jie Tan, Hong- FengLuo, Chang-Heng Tan & Da-Yuan Zhu (2012),“Arylnaphthalenelignan glycosides and other constituents from Phyllanthusreticulatus”, Journal of Asian Natural Products Research, 14, 1073-1077. [51]Kotaro Takahashi, Toshie Nakagawa (1966), “Studies on constituents of medicinal plants, the stereochemistry of paulowin and isopaulowin”, Chem . Pharm . Bull. , 14(6), 641-647. [52]Robert S. Ward (1997), “Lignan, neolignan and related compounds”, Nat. Prod. Rep. , 14, 43-74. [53] Nobuyoshi Nakajima, Kohji Ishihara, Stingo Maysumura Hiroki Hamada, Kaoru Nakamura, Tsutomu Fruya (1997), “ Lipase-catalyzed Synthesis of Arbrtin cinnamate in organic solvent and application of transesterfication o stabilize plant pigments”, Biosci.Biotech.Biochem, 61 (11), 1926-1927. [54] Ya Zhao, Chunyan Ni, Yuting Zhang, Li Zhu (2012), “Synthesis and bioevaluation of diphyllin glycoside as novel Anti cancer Agents”, Arch. Pharm. Chem. Life Sci, 345, 622-628.