Luận văn Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI Đặng Thị Hiền NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA CHẾ PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ dƣợc phẩm và Bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC Hà Nội, năm 2016 Công trình đã đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội. Bộ môn Vật lý - Hóa lý Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm, nghiên cứu dược và trang thiết bị Y tế quân đội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Trần Linh PGS.TS. Nguyễn Văn Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường Họp tại: Vào hồi giờ ngày tháng năm 2016. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Đại học Dược Hà Nội. CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ADC Acid diclofenac AIC The Akaike information criterion AUC The area under the curve (Diện tích dưới đường cong) AUMC Area under the first moment curve (Diện tích dưới đường cong ở thời điểm đầu). BCS Biopharmaceutical Classification System (Bảng phân loại sinh dược học) CĐDH Chất đồng diện hoạt CDH Chất diện hoạt Cmax Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa) CTBC Công thức bào chế CTCL Chỉ tiêu chất lượng CTTƯ Công thức tối ưu DC Dược chất DD Dung dịch ĐNH Đồng nhất hóa FDA Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc – thực phẩm) GP Giải phóng GPDC Giải phóng dược chất HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) HQC High quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ cao) IPM Isopropyl myristat IVIVC In vitro – in vivo correlation (tương quan in vitro – in vivo) KTG Kích thước giọt LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ) LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC Lower quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp) MCT Medium-chain triglycerides (triglycerid có acid béo mạch trung bình) MQC Middle quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình) MRT Mean residence time (Thời gian lưu trung bình) MT Môi trường MTPT Môi trường phân tán NaDC Natri diclofenac NNT Nano nhũ tương PdI Polydispersity index (chỉ số đa phân tán) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SKD Sinh khả dụng TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TEM Transmission electron microscopy (Hiển vi điện tử truyền qua) Tmax Maximum time (Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa) 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Công nghệ nano đã và đang tạo ra một cuộc cách mạng lớn trong bào chế thuốc hiện đại. Sử dụng công nghệ nano để thiết kế các hệ phân phối thuốc mới đã tạo nên sự phát triển của ngành y học, hứa hẹn những tiến bộ đột phá trong điều trị và chẩn đoán. Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp dược phẩm Việt Nam, các chế phẩm được bào chế theo công nghệ nano vẫn còn mới mẻ và chưa được ứng dụng vào sản xuất. Diclofenac là một DC điển hình của nhóm NSAIDs, có khả năng ngăn chặn sự co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm viêm và đau trong tổn thương biểu mô giác mạc sau phẫu thuật. Diclofenac là một dược chất có độ hòa tan kém, các chế phẩm thuốc nhỏ mắt diclofenac hiện có trên thị trường chủ yếu ở dạng dung dịch có hiệu quả điều trị không cao. NNT là một trong số các hệ bào chế có cấu trúc nano đã và đang nhận được sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, NNT làm tăng tỉ lệ hấp thu thuốc vào các mô bên trong mắt, tăng thời gian lưu thuốc trước giác mạc, cải thiện SKD và hiệu quả điều trị tại mắt. Các nghiên cứu cũng chỉ ra đây là hệ phân phối thuốc tại mắt tiềm năng cho các DC thuộc nhóm II, III trong bảng phân loại sinh dược học (BCS). Chính vì vậy, nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm là vấn đề cấp thiết, có ý nghĩa khoa học, góp phần phát triển nghiên cứu, bào chế thuốc theo công nghệ nano ở Việt Nam. Mục tiêu của luận án 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1% ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Nâng quy mô bào chế, dự thảo được tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ ổn định cho nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1%. 2 3. Đánh giá được sinh khả dụng của chế phẩm trên thỏ thí nghiệm và bước đầu thiết lập được tương quan in vitro – in vivo của chế phẩm. Những đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên ở Việt Nam, nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac được tiến hành nghiên cứu tương đối đầy đủ: từ lựa chọn công thức bào chế, xây dựng quy trình bào chế, nâng quy mô, dự thảo tiêu chuẩn cơ sở, nghiên cứu độ ổn định, đánh giá SKD in vivo trên súc vật đến thiết lập tương quan in vitro – in vivo. Luận án đã có những đóng góp mới như sau: - Xây dựng công thức và quy trình bào chế cơ bản nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac bằng thiết bị siêu âm, thiết bị siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao, thiết bị phân cắt tốc độ cao. - Xây dựng mô hình đánh giá SKD của chế phẩm nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac trên mắt thỏ. Mô hình này cho thấy, chế phẩm có khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc và làm tăng thấm dược chất qua giác mạc nên cải thiện SKD của chế phẩm hơn so với dạng dung dịch đối chiếu. - Xây dựng mô hình và thiết lập tương quan in vitro – in vivo. Tương quan sau khi thiết lập được ứng dụng trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm và có thể sử dụng để nghiên cứu phát triển sản phẩm, kiểm soát chất lượng sản phẩm. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 149 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục, 58 bảng, 37 hình, 165 tài liệu tham khảo. Bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (32 trang), nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (21 trang), Kết quả nghiên cứu (73 trang), Bàn luận (20 trang), Kết luận, đề xuất (2 trang), Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang). 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. THÔNG TIN VỀ DƢỢC CHẤT ACID DICLOFENAC 1.1.1. Công thức hóa học Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid diclofenac 1.1.2. Đặc tính lý hóa  Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng hoắc gần trắng, hơi hút ẩm, rất ít tan trong nước, độ tan phụ thuộc pH. Tan tốt trong dầu thực vật.  Tính chất hóa học: - Tính acid yếu, pKa = 4,0. 1.1.3. Tác dụng, chỉ định Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid - NSAIDs, có tác dụng ức chế tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo ra tác dụng chống viêm, giảm đau mạnh. Hiện nay trên thị trường mới chỉ có DD thuốc nhỏ mắt chứa NaDC. Chỉ định: DD nhỏ mắt 0,1% NaDC giảm đau các tổn thương biểu mô do chấn thương, phẫu thuật, điều trị viêm sau phẫu thuật, các bệnh viêm mạn tính không lây nhiễm, ngăn ngừa thu hẹp đồng tử trong phẫu thuật đục thủy tinh thể, giảm các triệu chứng do viêm màng kết mạc. 1.2. NANO NHŨ TƢƠNG . 1.2.1. Khái niệm NNT là hệ phân tán siêu vi dị thể, có phân bố KTG nằm trong khoảng từ 20 - 500 nm, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được phân tán vào chất lỏng thứ hai là MTPT (pha ngoại, pha liên tục), được ổn định bằng CDH và CĐDH. 4 1.2.2. Thành phần NNT được hình thành bởi sự hòa trộn của pha dầu, pha nước, CDH, CĐDH và một số thành phần khác. 1.2.3. Kỹ thuật bào chế nano nhũ tƣơng 1.2.3.1. Kỹ thuật phân tán hay nhũ hóa sử dụng năng lượng cao Kỹ thuật này có thể được thực hiện trên các thiết bị như: thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao, thiết bị ĐNH áp suất cao, thiết bị siêu âm. 1.2.3.2. Kỹ thuật tự nhũ hóa hay nhũ hóa sử dụng năng lượng thấp Bao gồm các phương pháp: phương pháp điểm đảo pha, phương pháp nhiệt độ đảo pha, phương pháp tự nhũ hóa 1.2.4. Đặc tính của nano nhũ tƣơng Các đặc tính quan trọng của NNT bao gồm phân bố KTG và chỉ số đa phân tán, đặc tính động học, hiệu điện thế bề mặt (thế zeta), độ nhớt. 1.2.5. Ƣu nhƣợc điểm của nano nhũ tƣơng Ƣu điểm: Tăng độ tan của dược chất, tăng sự ổn định của dược chất, bảo vệ dược chất khỏi sự thủy phân và oxy hóa, tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng, tác dụng tại đích, tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng được trên nhiều đường dùng. Tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng được trên nhiều đường dùng. Nhƣợc điểm: Sử dụng nồng độ cao chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt. Độ ổn định bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH, khó khăn trong quá trình bảo quản. 1.3. NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT 1.3.1. Đặc điểm cấu tạo của mắt liên quan đến hấp thu dƣợc chất. Mắt cấu tạo bởi 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong. Các yếu tố trước giác mạc cộng với thời gian tiếp xúc với màng hấp thu ngắn là lý do chính làm cho lượng thuốc được hấp thu vào các mô bên trong thấp hơn 5% tổng lượng thuốc được đưa vào. 1.3.2. Một số nghiên cứu về nano nhũ tƣơng nhỏ mắt NNT dùng cho nhãn khoa được nghiên cứu với nhiều các hợp chất khác nhau như: dorzolamid, ganciclovir, flurbiprofen axetil, acetazolamid, azithromycin, timolol maleat. Các kết quả nghiên cứu đều chứng minh sự cải thiện SKD của dạng thuốc NNT so với các dạng thuốc thông thường. 5 1.3.3. Đánh giá sinh khả dụng của nano nhũ tƣơng trên mắt 1.3.3.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro - Màng GP: màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có giới hạn KLPT thường 12 - 14 kDa; đôi khi sử dụng màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc thường là 0,2 µm. - Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 hoặc DD nước mắt nhân tạo. Môi trường khuếch tán được điều nhiệt, duy trì ở một khoảng nhiệt độ thích hợp và được khuấy trộn với tốc độ nhất định. - Nhiệt độ: 34 ± 0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) hoặc 37 ± 0,5ºC. - Thiết bị đánh giá GP thuốc: bình Franz, thiết bị thẩm tách micro hoặc thiết bị thử hòa tan khác. 1.3.2.2. Đánh giá sinh khả dụng in vivo Với những thuốc mà đích tác dụng là trong nhãn cầu thì định lượng DC trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là khu vực trung gian vận chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt. Đây cũng là phương pháp được chọn để đánh giá SKD NNT nhỏ mắt diclofenac. 1.3.3.3. Tương quan in vitro – in vivo Mối tương quan in vitro – in vivo là một mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa đặc tính in vitro của một dạng bào chế và đáp ứng in vivo tương ứng. Thông thường, đặc tính in vitro chính là tốc độ và/hoặc mức độ GPDC và đáp ứng in vivo là nồng độ thuốc trong máu hay lượng thuốc được hấp thu. Sau khi tương quan được thiết lập, những thông số thu được từ kết quả nghiên cứu in vitro sẽ dùng để thay thế cho những thông số thu được từ kết quả nghiên cứu in vivo vốn tiêu tốn rất nhiều tiền của, thời gian, nhân lực và làm tăng giá thành sản phẩm của thuốc. Kết quả này cũng là cơ sở xét miễn nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học; cơ sở dùng để đánh giá ứng dụng của các đặc điểm và phương pháp thử hòa tan; cơ sở cho kiểm tra chất lượng sản xuất và lựa chọn công thức thuốc thích hợp. 6 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, tiêu chuẩn nhà sản xuất, tinh khiết phân tích và dùng cho HPLC. 2.1.2. Thiết bị Sử dụng các thiết bị bào chế và đánh giá tin cậy: máy siêu âm cầm tay Labsonic ® M – Sartorius, máy ĐNH phân cắt Unidriver X1000, máy ĐNH dưới áp suất cao EmulsiFlex – C5, hệ thống đánh giá GP thuốc qua màng Hanson Research, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinite, kính hiển vi điện tử truyền qua EMLab – NIHE, máy đo phân bố kích thước tiểu phân và thế zeta Zetasizer Nano ZS90. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xây dựng công thức, quy trình bào chế NNT diclofenac và đánh giá một số đặc tính của chế phẩm. - Nâng quy mô bào chế, và dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của NNT nhỏ mắt diclofenac. - Bước đầu đánh giá SKD của NNT nhỏ mắt diclofenac trên mắt thỏ thí nghiệm. - Thiết lập tương quan in vitro – in vivo và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm NNT nhỏ mắt diclofenac. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp bào chế nano nhũ tƣơng diclofenac Bước 1: Hòa tan hoàn toàn DC vào pha dầu (dung môi pha dầu, CDH thân dầu, CĐDH) ở nhiệt độ 60 – 65oC. Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha nước (dung môi – nước cất pha tiêm, CDH thân nước, CĐDH thân nước, hệ đệm, chất bảo quản) lên 65 – 70oC. Bước 3: Tiến hành nhũ hóa pha dầu vào pha nước bằng thiết bị siêu âm hoặc thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao hoặc thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao. Bước 4: Điều chỉnh pH và thể tích. Bước 5: Lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm để tiệt khuẩn. Bước 6: Đóng lọ thuốc nhỏ mắt đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm. 7 Với những mẫu cần đánh giá độ vô khuẩn thì pha dầu cần được tiệt khuẩn bằng nhiệt khô, pha nước được lọc tiệt khuẩn và quy trình 6 bước được thực hiện trong buồng pha chế vô khuẩn Bioair Topsafe 1.2 2.3.2. Phƣơng pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh DD đối chiếu là dung dịch thuốc nhỏ mắt NaDC được pha theo CT tham khảo trong tài liệu Thực tập bào chế. 2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá một số đặc tính của hệ nano nhũ tƣơng 2.3.3.1. Các đặc tính vật lý của hệ nano nhũ tương a. Phân bố kích thước giọt: Sử dụng máy quang phổ photon ánh sáng Zetasizer Nano ZS90. b. Hình thái giọt nhũ tương: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) EMLab – NIHE. c. Thế zeta: Sử dụng thiết bị đo thế zeta: Zetasizer Nano ZS90. d. Độ nhớt: Sử dụng nhớt kế Brookfield với đầu đo S1, tốc độ quay là 400 vòng/phút, nhiệt độ đo 25 ± 2oC. e. Độ bền của hệ: Trong điều kiện thường và điều kiện khắc nghiệt. 2.3.3.2. pH: Thử theo dược điển Việt Nam IV (phụ lục 6.2). 2.3.3.3. Định lượng dược chất trong nano nhũ tương Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện như sau: Pha tĩnh: Cột InertSustain®C8 (GL Science – Nhật Bản), kích thước 150 mm × 4,6 mm (octyl silica gel; 5 µm).  Dung dịch đệm phosphat pH 2,5: pha dung dịch gồm acid phosphoric 0,01 M và natri dihydrophosphat 0,01 M rồi điều chỉnh pH tới 2,5 bằng hai thành phần này (nếu cần).  Pha động: hỗn hợp methanol và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, rồi siêu âm 15 phút. Tốc độ dòng pha động: 1 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. Detector UV bước sóng: 276 nm.  Tiến hành: Chuẩn bị DD chuẩn (NaDC/methanol, 40g/ml), DD thử (NNT/methanol). Lọc DD chuẩn và thử qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành sắc ký lần lượt với DD chuẩn và DD thử. Tính nồng độ ADC trong một chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của DD chuẩn, DD thử và hàm lượng C14H10Cl2NNaO2 trong NaDC chuẩn. 8 2.3.3.4. Phương pháp xác định tỉ lệ dược chất được nhũ tương hóa Thêm natri clorid đến bão hòa vào 40 ml NNT, rồi tiến hành li tâm với tốc độ 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 40  2oC, trong 30 phút để tách riêng 2 pha dầu và nước. Định lượng dược chất trong pha nước bằng HPLC tương tự mục 2.3.3.3. 2.3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro Sử dụng thiết bị đánh giá sự GP thuốc: bình Franz. Ngăn nhận chứa 7 ml môi trường, ngăn cho là 1 ống trụ tròn, đường kính trong 1 cm, chứa được 1 ml mẫu. Điều kiện thử: Màng GP: màng cellulose acetat 0,2 µm hoặc màng Spectra/Por ® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12 - 14 kD. Diện tích bề mặt màng khuếch tán: 0,785 cm2. Môi trường khuếch tán: DD đệm phosphat pH 7,4 (trong nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo: có thay đổi môi trường, bổ sung CDH, dung môi). Thể tích môi trường khuếch tán: 7 ml. Nhiệt độ môi trường khuếch tán: 34,0 ± 0,5ºC. Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút. Lượng mẫu NNT đem thử: 1 ml. Lấy mẫu: - Lấy mẫu tại thời điểm nhất định, mỗi thời điểm lấy mẫu 1 lần, mỗi lần 1 ml và đồng thời bổ sung 1 ml môi trường khuếch tán mới. - Lượng DC GP tại từng thời điểm được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mẫu lấy xong được tiêm thẳng vào hệ thống sắc ký. 2.3.3.6. Thử vô khuẩn Thử theo dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 13.7, Phương pháp màng lọc). 2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu độ ổn định Việc khảo sát độ ổn định của thuốc được thực hiện dựa theo Hướng dẫn của ASEAN với một số điều chỉnh. Cụ thể như sau: - Đối tượng thử: Mẫu nano nhũ tương diclofenac được đóng trong lọ thuốc nhỏ mắt bằng HDPE đậy kín. Điều kiện bảo quản và chu kỳ lấy mẫu kiểm tra: ngăn mát tủ lạnh (5 ± 3 o C); điều kiện thực trong phòng thí nghiệm (15 – 35oC; 60 - 90%); lão hóa cấp tốc (trong tủ vi khí hậu) (40 ± 2oC; 75 ± 5%). Định kỳ (0, 1, 3, 6) tháng lấy mẫu kiểm tra. Định kỳ khảo sát các chỉ tiêu: tính chất, giới hạn 9 cho phép về thể tích, định tính, định lượng, phần trăm dược chất giải phóng in vitro theo thời gian, kích thước giọt nhũ tương và PdI, thế zeta, độ nhớt, pH, độ vô khuẩn, tỷ lệ dược chất được nhũ tương hoá. 2.3.5. Phƣơng pháp thử kích ứng mắt Thử nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-10: 2002 (E); B.3 “Ocular Irritation test”. 2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu sinh khả dụng 2.3.6.1.Phương pháp định lượng dược chất trong dịch tiền phòng DC có trong dịch tiền phòng của mắt thỏ sau khi nhỏ DD hoặc NNT nhỏ mắt diclofenac được định lượng bằng phương pháp HPLC với detector mảng diod (DAD). 2.3.6.2.Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng Quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo hướng dẫn của FDA về tính chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và khác ngày), độ ổn định của mẫu định lượng. 2.3.6.3.Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học + Quy trình xử lý mẫu và phân tích Do nồng độ acid diclofenac (ADC) trong dịch tiền phòng khá thấp nên phải thêm chuẩn để ADC trong mẫu đạt nồng độ trong khoảng tuyến tính đã khảo sát (500 – 8000 ng/ml). Dịch tiền phòng sau đó được ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút, tách lấy dịch trong rồi định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong các điều kiện sau như mục 2.3.3.3 với thể tích tiêm mẫu: 50 µL. + Quy trình đánh giá sinh khả dụng: Chuẩn bị 6 lô thỏ, mỗi lô gồm 12 con thỏ có trọng lượng từ 2,5 – 3 kg. Lần lượt nhỏ vào mắt trái 0,05 ml NNT, nhỏ vào mắt phải 0,05 ml DD. Ghi lại thời điểm nhỏ thuốc. Lấy mẫu: Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định. Lấy mẫu tại 12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút. Sử dụng kim tiêm đường kính 30 gauge. Thể tích dịch tiền phòng lấy ra là 100 μL. Xử lý mẫu sau đó phân tích bằng phương pháp HPLC. 10 Tính toán và xử lý số liệu: Các thông số dược động học (AUC, AUMC, λz) được tính toán bằng phương pháp không dựa trên mô hình ngăn với sự trợ giúp của phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3. 2.3.7. Phƣơng pháp xây dựng tƣơng quan in vitro – in vivo 2.3.7.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường giải phóng tới sự giải phóng dược chất in vitro Điều kiện: tương tự mục 2.3.3.2 Mẫu thử: 1 ml nano nhũ tương diclofenac 0,093% pha chế ở quy mô 100 ml theo quy trình được lựa chọn. Màng giải phóng: màng Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane. Môi trường khuếch tán: DD đệm phosphat với các pH khác nhau 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 và có thêm CDH Tween 80, ethanol làm tăng độ tan của DC, tăng khả năng giải phóng DC. Lấy mẫu: Lấy mẫu tại thời điểm 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút, 105 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút, lấy mẫu một lần, mỗi lần lấy 1mL rồi bổ sung 1mL môi trường khuếch tán mới. Lượng DC giải phóng từ NNT được xác định bằng phương pháp HPLC. 2.3.7.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng dược chất in vitro Sử dụng phần mềm Phoenix WinNolin 6.3, khớp các số liệu của từng môi trường giải phóng và lựa chọn mô hình phù hợp nhất (Hill, Weibull, Double Weibull, Makoid-Banakar ) trên tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC). Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất. 2.3.7.3. Thiết lập mô hình tương quan phù hợp Sử dụng phần mềm Phoenix IVIVC Toolkit 2.2, mối quan hệ giữa tỷ lệ hấp thu in vivo và tỷ lệ giải phóng in vitro được thiết lập trên các mô hình sau: Mô hình 1 (PT1): Fabs=AbsScale*Fdiss(Tscale*Tvivo) Mô hình 2 (PT2): Fabs=AbsScale*Fdiss(Tscale*Tvivo-Tshift) Mô hình 3 (PT3): Fabs=AbsScale*[Fdiss(Tscale*Tvivo-Tshift)-AbsBase] Trong đó: Fabs: là (tỷ lệ) giải phóng in vivo dạng NNT so lượng giải phóng in vivo tối đa của dạng dung dịch; AbsScale: là tỷ lệ quy đổi hấp thu in vivo với giải phóng in vitro; Fdiss: là tỷ lệ giải phóng in vitro; Tscale: là tỷ lệ quy đổi thời gian hấp thu in vivo với thời gian giải phóng in vitro; Tvivo: thời điểm hấp thu in vivo; Tshift: thời gian tiềm tàng; AbsBase: tỷ lệ hấp thu cơ sở. 11 2.3.8. Phƣơng pháp ghi và xử lý số liệu Sử dụng các phần mềm Microsoft Excel 2013, SPSS, MODDE 8.0, INFORM 3.2, FormRules 2.0 và INForm 3.2, Phoenix WinNonlin 6.3, Phoenix IVIVC Toolkit 2.2. Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất trong mẫu nano nhũ tƣơng và môi trƣờng giải phóng Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu đối với diclofenac. Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac. Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp có độ đúng cao với khả năng thu hồi trung bình 100,68% và độ lệch chuẩn tương đối 1,59% (< 2%). Với điều kiện sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng acid diclofenac có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn tương đối ở 3 nồng độ đều nhỏ hơn 2%. 3.2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế nano nhũ tƣơng Nano nhũ tương được tiến hành bào chế theo quy trình mục 2.3.1 bằng các kỹ thuật bào chế khác nhau: kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao và kỹ thuật phân cắt tốc độ cao. 3.2.1. Bào chế nano nhũ tương bằng phương pháp siêu âm 3.2.1.1. Xác định công thức bào chế cơ bản của nano nhũ tương a. Lựa chọn thành phần: Dược chất, tá dược tạo pha dầu, pha nước, CDH, CĐDH và một số thành phần khác. b. Xác định khoảng tỉ lệ các thành phần: Dược chất ADC (0,093%, dung môi pha dầu (2 – 4%), CDH thân nước (2 – 4%), CDH thân dầu (0,5 – 1%), Chất đồng diện hoạt (0,5 – 1,5%), đệm (0,1 – 0,2 mol/l), pH 6,5 – 7,5, glycerin 5%, nước cất pha tiêm vừa đủ 100%. c. Thiết kế thí nghiệm và kết quả: Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo nguyên tắc hợp tử tại tâm: thu được bảng thiết kế thí nghiệm gồm 23 công thức. 12 3.2.1.2. Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm Qua khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm 15 phút để bào chế nano nhũ tương với quy mô mẻ 100 ml. 3.2.1.3. Xác định quy trình bào chế cơ bản bằng phương pháp siêu âm Với mỗi công thức, 100 ml NNT được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm với các bước 1, 2, 4, 5, 6 theo quy trình mục 2.3.1, trong đó: - Bước 3: Tiến hành ĐNH nhũ tương sử dụng máy siêu âm với tần số 30000 Hz, biên độ 100 µm, siêu âm liên tục trong thời gian 15 phút. 3.2.1.4. Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến đặc tính vật lý và khả năng giải phóng dược chất in vitro của nano nhũ tương Phân tích mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập và các biến phụ thuộc, xử lý số liệu bằng phần mềm FormRules 2.0. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng GPDC của NNT: Lượng Span 80 tăng và lượng Transcutol HP giảm, hỗn hợp Tw 80/Cre EL làm tăng phần trăm giải phóng của dược chất. Các yếu tố ảnh hưởng tới độ bền của NNT: Khi hệ đệm là borat thì NNT ADC ổn định nhất. Khoảng pH càng thấp thì độ bền hệ càng cao, ở pH lớn hơn thì độ bền hệ giảm. Loại dung môi pha dầu là Miglyol, Labrafac hay IPM ít ảnh hưởng tới độ bền của hệ; tuy nhiên với pha dầu là Miglyol cho thấy hệ độ bền hệ cao nhất. Các yếu tố ảnh hưởng tới KTG của NNT: thành phần dầu là IPM ít làm ảnh hưởng tới sự thay đổi KTG, với thành phần dầu là Miglyol và Labrafac đều làm tăng kích thước giọt tuy nhiên lượng dầu thay đổi không ảnh hưởng tới KTG. Tỉ lệ chất diện hoạt thân nước Tw/Cre tăng sẽ làm tăng kích thước giọt. Các yếu tố làm ảnh hưởng tới thế zeta: thành phần đệm borat với lượng đệm nhỏ cũng làm tăng thế zeta của hệ nano nhũ tương và làm tăng sự ổn định của hệ. Lượng Transcutol HP tăng làm tăng nhẹ thế zeta của hệ nhưng không đáng kể. 3.2.1.5. Tối ưu hóa công thức bào chế nano nhũ tương Lựa chọn được 3 công thức tối ưu khi thay đổi thành phần dầu: 13 Bảng 3.22: Thành phần công thức NNT đƣợc lựa chọn Stt DC X1 X2 (%) X3 X4 (%) X5 (%) X6 (%) X7 X8 (mol/l) X9 CT1 ADC Tw/Cr : 1/1 2 Miglyol 2 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5 CT2 ADC Tw/Cr : 1/1 2 IPM 2 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5 CT3 ADC Tw/Cr : 1/1 2 Labrafac PG 2 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5 Tiến hành bào chế 100 ml mẫu NNT theo công thức tối ưu 1, 2, 3 có thành phần như ở bảng 3.22 và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng. Kết quả cho thấy các CTTƯ đều mang đặc tính của chế phẩm NNT. CTTƯ 1 và 2 được tiến hành lựa chọn để tiến hành thử nghiệm tiếp theo với kỹ thuật bào chế siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao. 3.2.2. Bào chế nano nhũ tƣơng bằng kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao 5 CT được lựa chọn để khảo sát cụ thể như sau: CT1, CT 16 và CT 20 (Bảng 3.17), CTTƯ1 và CTTƯ 2 (Bảng 3.22) để tiến hành khảo sát bào chế bằng thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao. Mỗi CT bào chế 100 ml bằng kỹ thuật siêu âm theo mục 3.2.1.3, sau đó tiến hành ĐNH liên tục 50 ml mẫu NNT trong 12 phút ở áp suất 500 bar. Tiến hành đánh giá một số CTCL của NNT bào chế bằng thiết bị siêu âm và siêu âm + ĐNH sau thời gian 12 phút. Kết quả cho thấy quá trình đồng nhất hóa sau siêu âm là không cần thiết. Vì thế quy trình này không được lựa chọn để bào chế NNT cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.3. Bào chế nano nhũ tƣơng bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao 3.2.3.1. Xác định công thức bào chế cơ bản Các thành phần công thức được lựa chọn tương tự như phương pháp siêu âm, tuy nhiên trong quá trình tham khảo tài liệu có điều chỉnh lại tỷ lệ một số thành phần (dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt) thấp hơn so với thành phần công thức bào chế bằng thiết bị siêu âm với mong muốn đạt được chế phẩm nano nhũ tương cho phân bố KTTP đồng nhất, đạt tỷ lệ nhũ hóa cao, nhũ tương ổn định, đạt phần trăm giải phóng dược chất cao và không gây kích ứng mắt. 14 3.2.3.2. Xác định quy trình bào chế cơ bản bằng máy phân cắt tốc độ cao Bước 1, 2, 4, 5, 6: Tương tự phương pháp siêu âm. Bước 3: Tiến hành đồng nhất hóa nhũ tương sử dụng máy phân cắt tốc độ cao với tốc độ phân cắt được khảo sát từ 10000 vòng/phút đến 16000 vòng/phút. Thời gian phân cắt từ 5 - 10 phút. 3.2.3.3. Thiết kế thí nghiệm Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo nguyên tắc hợp tử tại tâm. Thiết kế thí nghiệm được 30 công thức. 3.2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của các thành phần công thức đến một số đặc tính vật lý của nano nhũ tƣơng a. Các đặc tính vật lý của hệ Phân tích mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập và các biến phụ thuộc, xử lý số liệu bằng phần mềm FormRules 2.0. Các yếu tố ảnh hưởng đến KTG của NNT: Tỉ lệ Transcutol HP càng tăng thì KTG tại pic của NNT càng tăng. Tỉ lệ CDH càng tăng thì KTG tại pic càng tăng. Nếu tỉ lệ CDH nằm trong khoảng 1 - 1,5 % thì KTG nhỏ và hầu như không có sự thay đổi. Khi CDH tăng đến 2%, KTG tại pic tăng mạnh. KTG cũng giảm khi thời gian phân cắt tăng. Tốc độ phân cắt tăng từ 10000 đến 13000 vòng/ phút cho thấy làm giảm KTG. Tốc độ phân cắt khoảng 13000 vòng/phút sẽ cho KTG thu được từ các mẫu NNT là nhỏ nhất. Nếu tăng tốc độ phân cắt từ 13000 đến 16000 vòng/phút sẽ làm KTG tăng dần. Các yếu tố ảnh hưởng đến thế điện tích bề mặt của NNT: Tỉ lệ CDH thân nước càng giảm, Transcutol HP càng tăng, tỉ lệ Span 80 càng tăng thì thế zeta càng giảm làm tăng độ ổn định của hệ. Tỉ lệ CDH thân nước có ảnh hưởng lớn nhất, tuy nhiên khi tỉ lệ nằm trong khoảng 1 - 1,5% thì thế zeta ở mức thấp nhất, và không thay đổi nhiều. Kết quả nghiên cứu chỉ ra NNT được bào chế bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao cho thấy các mẫu NNT được bào chế ở quy mô nhỏ dễ bị mắc kẹt lại trong thiết bị do đó cho tỉ lệ nhũ hóa không cao, hệ NNT kém ổn định (thế zeta < 30 mV). Thiết bị có cấu tạo phức tạp khó đảm bảo được tiêu chí vô khuẩn trong bào chế thuốc nhỏ mắt. Vì vậy thiết bị này cũng không được lựa chọn cho quy trình bào chế NNT trong các nghiên cứu tiếp theo. 15 3.3. NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ Kỹ thuật siêu âm là một trong 3 kỹ thuật được sử dụng trong quá trình nhũ hóa bào chế nano nhũ tương diclofenac, đây là kỹ thuật cho thấy nhiều ưu điểm khi sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Do đó kỹ thuật này được lựa chọn trong nghiên cứu nâng quy mô. Mẫu nano nhũ tương bào chế theo thành phần CTTƯ 2 có phân bố KTG dưới 200 nm, GTTĐ của thế zeta < 30 mV, PdI < 0,3 khi được bào chế bằng các kỹ thuật khác nhau, chính vì thế mẫu NNT bào chế theo thành phần CTTƯ 2 được lựa chọn để tiến hành khảo sát thời gian siêu âm phù hợp khi nâng quy mô lên 1000 ml. 3.3.1. Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm khi nâng quy mô Kết quả chỉ ra rằng lựa chọn thời gian siêu âm là 45 phút cho quy trình nâng quy mô bào chế lên 1000 ml là hợp lý và có ý nghĩa thống kê. 3.3.2. Đánh giá tính lặp lại của quy trình khi nâng quy mô bào chế Bào chế mẫu nano nhũ tương theo thành phần CTTƯ 2 với 3 mẻ (mẻ: 001, 002, 003) ở quy mô 1000 ml theo quy trình mục 3.2.1.3 và mục 3.3.1. Tiến hành đánh giá các CTCL theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3. Nhận thấy các chỉ tiêu này đều nằm trong giới hạn cho phép. Kết quả cho thấy không có sự khác nhau về các chỉ tiêu chất lượng giữa 3 mẻ bào chế ở quy mô 1000 ml ở cùng điều kiện nghiên cứu (P > 0,05). 3.4. DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG CỦA NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC Căn cứ vào các nghiên cứu đã trình bày ở mục 3.2, 3.3 và tham khảo “PL 1.14: Thuốc nhỏ mắt” trong DĐVN IV, dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của NNT nhỏ mắt diclofenac được xây dựng như sau: tính chất (NNT màu trắng đục hoặc trong mờ, không mùi); giới hạn cho phép về thể tích (nằm trong giới hạn 100% đến 110% thể tích ghi trên nhãn); định tính (dương tính với diclofenac); định lượng (phải đạt từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn); phần trăm DC GP in vitro theo thời gian qua màng Spectra/Por ® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12- 14 kD. Môi trường đệm phosphat pH 7,4 (1 giờ: < 10%, 2 giờ: 10 – 15%, 3 giờ: 15 – 25%); KTG nhũ tương (phải nhỏ hơn 200 nm); chỉ số đa phân tán (PdI) (phải nhỏ hơn 0,4); thế zeta (phải không dưới 30 mV); độ nhớt (độ 16 nhớt của chế phẩm phải từ 4,0 đến 6,0 cP); pH (6,0 – 8,0); độ vô khuẩn (đạt vô khuẩn); tỉ lệ DC được nhũ tương hoá (không dưới 90%). 3.5. Đánh giá độ ổn định của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt Kết quả đánh giá tuy có thay đổi, nhưng các chỉ tiêu chất lượng vẫn nằm trong giới hạn cho phép trong TCCS sau 6 tháng bảo quản ở cả 3 điều kiện. Tính toán dự đoán thọ bằng phần mềm Minitab 17.2.1, tuổi thọ chế phẩm bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC dài hơn trên 24 tháng. Như vậy, nano nhũ tương nhỏ mắt nên được bảo quản ở 2 – 8oC và hạn dùng thực tế cần được xác định dựa trên số liệu nghiên cứu dài hạn đầy đủ (dự kiến là 24 tháng). 3.6. Khảo sát đặc tính của mẫu nano nhũ tƣơng đƣợc lựa chọn để đánh giá sinh khả dụng Mẫu nano nhũ tương theo CTTƯ 2 (bảng 3.22) được tiến hành bào chế với quy mô 100 ml theo mục 3.2.1.3. Mẫu nano nhũ tương sau bào chế được đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng theo các phương pháp đã nêu mục 2.3.3. Sau đây là một số kết quả thu được: a. Hình thức: NNT có màu trắng đục, đồng nhất, để lâu không bị phân lớp. b. Hình thái hệ Hình 3.31: Ảnh TEM của nano nhũ tƣơng diclofenac Nhận xét: Ảnh TEM của NNT cho thấy: các tiểu phân đều có hình tròn, tách rời nhau, và có lớp CDH và CĐDH (màu nhạt hơn) bao xung quanh các tiểu phân. 17 c. Phân bố kích thước giọt: KTG TB của NNT là 174,4 ± 9,83 nm (n=3) và PdI là 0,226 ± 0,24 (n = 3). d. Thế zeta: Thế zeta TB bằng – 45,3 ± 2,29 mV (n = 3), đảm bảo ổn định, không bị tách lớp trong quá trình bảo quản. e. Độ nhớt: Độ nhớt của thuốc nhỏ mắt liên quan đến khả năng gây kích ứng mắt và thời gian lưu giữ ở mắt. Độ nhớt TB sau 3 lần đo của NNT là 5,08 ± 0,01 cP (n = 3). Độ nhớt tương đối thấp, sẽ làm giảm kích ứng mắt. f. Độ bền: Độ bền của NNT được đánh giá theo mục 2.3.3.1.e. Kết quả cho thấy NNT không tách lớp khi bảo quản ở điều kiện thực trong phòng thí nghiệm. Luộc sôi trong 1 giờ: NNT không bị tách lớp (độ bền: mức 4). g. Định lượng: Định lượng DC có trong mẫu NNT bằng phương pháp HPLC như trình bày ở mục 2.3.2.3, thu được hàm lượng ADC là 100,74 ± 3,35 % (n = 3). Đánh giá GP qua màng trong thời gian giải phóng 1, 2, 3 giờ thu kết quả như sau: Tỉ lệ DC GP (%): 1 giờ (6,59 ± 0,02); 2 giờ (14,58 ± 0,25); 3 giờ (19,24 ± 0,21). Đánh giá phần trăm DC được nhũ tương hóa và tính toán kết quả theo mục 2.3.3.4, thu được: phần trăm nhũ hóa DC: 98,87 ± 0,13% (n = 3) Căn cứ dự thảo chỉ tiêu chất lượng ở mục 3.4, kết luận mẫu nano nhũ tương bào chế theo công thức CTTƯ 2 mang đầy đủ các tiêu chuẩn của một chế phẩm NNT và được lựa chọn để tiếp tục đánh giá thử kích ứng và SKD trên mắt thỏ thí nghiệm. 3.7. Thử kích ứng mắt trên thỏ Kết quả nghiên cứu chỉ ra nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac không có các dấu hiệu gây kích ứng trên mắt thỏ. 3.8. Nghiên cứu sinh khả dụng của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt trên thỏ thí nghiệm 3.8.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng diclofenac trong dịch tiền phòng Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng có tính đặc hiệu đối với acid diclofenac. Trong khoảng nồng độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ diclofenac trong thủy dịch với diện tích pic thu được, giới hạn định lượng dưới là 516,3 ng/ml. Phương pháp định 18 lượng đạt độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày. Diclofenac trong thủy dịch và trong mẫu xử lý đạt độ ổn định trong 24 giờ. 3.8.2. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dƣợc động học 3.8.2.1. Xác định nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng Bố trí 6 lô thỏ thí nghiệm theo quy trình đã mô tả với quy ước là mắt trái nhỏ dạng nano nhũ tương và mắt phải nhỏ dạng dung dịch. Tính toán và xử lý số liệu theo phương pháp đã trình bày thu được kết quả nồng độ dược chất – thời gian của hai dạng bào chế như hình 3.33. Kết quả cho thấy đồ thị nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng biến thiên khá phức tạp và có sự dao động lớn của giá trị nồng độ này giữa các cá thể thỏ. Hình 3.33: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong nồng độ - thời gian (n = 6) 3.8.2.2. Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nano nhũ tương so với dung dịch Kết quả được trình bày ở bảng 3.53 Bảng 3.53. Tỉ lệ giải phóng in vivo của NNT so với dung dịch Thời gian(phút) 10 20 30 40 50 60 75 90 105 120 150 180 ** 0,949 0,949 1,087 1,229 1,230 1,232 1,232 1,232 1,439 1,649 1,649 1,649 **Tỉ lệ giải phóng in vivo của NNT so với dung dịch 19 3.8.2.3. Khảo sát một vài thông số dược động học Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, lựa chọn phương pháp không dựa trên mô hình ngăn để tính toán các thông số λz, Cmax, Tmax, AUC0-180, AUC0-∞, MRT. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.54 Bảng 3.54: Các thông số dƣợc động học tính toán nhờ phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3 Thông số NNT Dung dịch λz (phút -1 ) 0,016 0,014 Cmax (ng/ml) 2191 1546 Tmax (phút) 120 10 AUC0-180 (ng/mlphút) 246220 176440 AUC0-∞ (ng/mlphút) 295216 207575 MRT (phút) 113,81 104,68 Như vậy có thể sơ bộ nhận xét, dạng nano nhũ tương có Cmax và AUC cao hơn, Tmax và MRT dài hơn so với dung dịch nhỏ mắt. 3.9. Xây dựng tƣơng quan in vitro – in vivo trong thiết kế công thức nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac 3.9.1. Đánh giá giải phóng dƣợc chất in vitro Tiến hành thử nghiệm giải phóng, lựa chọn các môi trường giải phóng là các hệ đệm phosphat có pH 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4. Màng giải phóng là màng thẩm tích. Kết quả nhận thấy khi pH của môi trường đệm càng tăng thì phần trăm DC GP tăng theo thời gian bởi lẽ ADC ít tan trong nước, có độ tan thay đổi theo pH. Khi môi trường đệm có tính base hơn làm tăng độ tan của ADC từ đó phần trăm DC GP qua màng thẩm tích tăng và cao hơn ở môi trường đệm có pH cao (môi trường đệm phosphat pH 7,4 sau 3 giờ GP được 32,09% DC) và môi trường đệm phosphat pH 7,4 có chứa Tw 80 và ethanol phần trăm DC GP sau 3 giờ đạt mức cao nhất gần 40% (khi môi trường đệm chứa 30% ethanol và 0,2% Tw 80 thì sau 3 giờ GP được 38,86% DC). 20 3.9.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng Kết quả cho thấy mô hình GP DC trong các môi trường khác nhau tương đối phù hợp với mô hình Double Weibull (với 6 điều kiện thử GP), sau đó là mô hình Hill (với 4 điều kiện thử GP), mô hình Weibull (với 3 điều kiện thử GP) và mô hình Makoid-Banakar (với 2 điều kiện thử GP). 3.9.3. Thiết lập tƣơng quan Mô hình tương quan phù hợp nhất là mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất Môi trường đệm phosphat pH 5,8 tương ứng với mô hình Weibull mô tả tốt nhất sự GP. Mô hình tương quan PT1: (Thời gian: Tvivo = = ) là mô hình tương quan in vitro – in vivo của NNT diclofenac; mô hình này được lựa chọn trong các hướng nghiên cứu tiếp theo của luận án. 3.9.4. Ứng dụng tƣơng quan in vitro – in vivo trong xây dựng chỉ tiêu giải phóng dƣợc chất của nano nhũ tƣơng Kết quả cho thấy khi thay đổi môi trường giải phóng đệm phosphat pH 7,4 bằng môi trường đệm phosphat pH 5,8; kiểm định t-test cho thấy không có sự khác nhau về phần trăm giải phóng dược chất giữa mẫu nano nhũ tương được bào chế ở quy mô 100 ml và các mẻ 001*, 002*, 003* ở quy mô 1000 ml (* với P > 0,05) trong cùng điều kiện. Phân tích phương sai ANOVA cho thấy không có sự khác nhau về phần trăm giải phóng dược chất ở cùng thời điểm nghiên cứu ở 3 mẻ 001*, 002*, 003* với quy mô 1000 ml (* với Pvalue > 0,05). Căn cứ nghiên cứu đã thực hiện tại mục 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm nano nhũ tương được đề xuất. Bảng 3.58. Tiêu chuẩn chất lƣợng của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac STT CTCL Yêu cầu 1 Tính chất Lọ chất dẻo HDPE 10 ml, màu trắng, bên trong có chứa NNT màu trắng đục hoặc trong mờ, không mùi 2 Giới hạn cho phép về thể tích Thể tích nhũ tương nằm trong giới hạn 100% đến 110% thể tích ghi trên nhãn 3 Định tính Dương tính với diclofenac 21 STT CTCL Yêu cầu 4 Định lượng Hàm lượng ADC (C 14 H 11 Cl 2 NO 2) phải đạt từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn 5 Phần trăm DC GP in vitro theo thời gian tại môi trường pH 5,8* 1giờ: < 10% 2 giờ: 10 – 15% 3 giờ: 15 – 25% 6 KTG nhũ tương KTG nhũ tương TB phải nhỏ hơn 200 nm, chỉ số đa phân tán (PdI) phải nhỏ hơn 0,4 7 Thế zeta Giá trị tuyệt đối của thế zeta phải không dưới 30 mV 8 pH 6,0 – 8,0 9 Độ vô khuẩn Đạt vô khuẩn *Màng giải phóng: màng Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12-14 kD. Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. Về acid diclofenac Từ các kết quả nghiên cứu khảo sát ban đầu và tham khảo tài liệu nghiên cứu trước đó, acid diclofenac đã được nhóm nghiên cứu lựa chọn để bào chế NNT nhỏ mắt diclofenac. Đây được coi là nghiên cứu đầu tiên lựa chọn DC là ADC cho chế phẩm thuốc nhỏ mắt. 4.2. Về bào chế nano nhũ tƣơng 4.2.1. Về công thức bào chế Dung môi pha dầu có vai trò rất quan trọng trong hệ do nó ảnh hưởng đến việc hình thành nhũ tương và độ tan của DC. Thành phần dầu IPM khi thay đổi về lượng cũng ít ảnh hưởng tới kích thước giọt tuy nhiên với thành phần dầu Miglyol, Labrafac tăng sẽ làm tăng kích thước giọt. Trong nghiên cứu, lựa chọn ba CDH không ion hóa là: Cre EL (HLB 12 - 14), Tw 80 (HLB 15), Span 80 (HLB 4,3) – là những CDH dung hợp tốt với mắt. Hơn nữa, các chất diện hoạt được lựa chọn cũng cho tổng chỉ số HLB nằm trong khoảng từ 8 – 18 sẽ dễ dàng tạo NNT dầu/ nước. Transcutol HP được lựa chọn là CĐDH, cũng là đồng dung môi (do có khả năng hòa tan nhiều DC, làm tăng độ tan của DC trong pha dầu) và có nhiều ưu điểm: ít kích ứng, đã được sử dụng cho các chế phẩm nhãn khoa, có khả năng cải thiện tính thấm DC qua giác mạc. 22 4.2.2. Về thiết bị bào chế NNT diclofenac được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao, kỹ thuật phân cắt tốc độ cao, kết quả nghiên cứu chỉ ra quy trình bào chế NNT bằng kỹ thuật siêu âm là phù hợp nhất khi sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. 4.3. Về khả năng giải phóng in vitro của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac Lượng dược chất được giải phóng từ NNT nhỏ mắt diclofenac phụ thuộc vào toàn bộ các yếu tố của quy trình bào chế và thành phần công thức. 4.4. Về nghiên cứu độ ổn định Để hoàn thiện quy trình sản xuất nano nhũ tương diclofenac cần có nghiên cứu về độ ổn định trong thời gian dài hơn nhằm đánh giá chính xác độ ổn định và tuổi thọ của chế phẩm. 4.5. Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở Tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm nhũ tương nano nhỏ mắt mới chỉ đề xuất cho các mẻ ở quy mô nhỏ. Do đó kết quả nghiên cứu chỉ mang tính chất tham khảo cho các nghiên cứu ở quy mô lớn hơn. 4.6. Về nghiên cứu tính kích ứng Thử nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-10: 2002 (E); B.3 “ Ocular Irritation test” cho thấy chế phẩm không gây kích ứng mắt. Thực nghiệm theo thử nghiệm này đảm bảo tính đạo đức và không gây đau đớn trên động vật. 4.7. Về đánh giá sinh khả dụng in vivo 4.7.1. Về định lƣợng diclofenac trong dịch tiền phòng Phương pháp định lượng diclofenac bằng HPLC với detector DAD như đã tiến hành ở các nghiên cứu trước đồng thời tăng thể tích tiêm mẫu lên 50 μL và thêm chuẩn vào các mẫu phân tích đã được lựa chọn. Để thực hiện định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng, quy trình thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học theo tiêu chuẩn của FDA về tính đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, độ tuyến tính và giới hạn định lượng. Phương pháp này vẫn có thể cho kết quả đủ tin cậy và chính xác trong phạm vi của mục tiêu nghiên cứu. 23 4.7.2. Về lựa chọn mô hình dƣợc động học và thiết lập tƣơng quan in vitro – in vivo Dữ liệu hòa tan in vitro qua các môi trường GP khác nhau đã được thiết lập tương quan với bốn mô hình GP Mô hình Hill, Mô hình Weibull, Mô hình Double Weibull, Mô hình Makoid – Banakar; chỉ số AIC nhỏ nhất trong các mô hình GP quyết định mô hình nào là phù hợp cho từng môi trường. Kết quả nghiên cứu chỉ ra tương quan in vitro – in vivo của NNT diclofenac dùng cho nhãn khoa rõ ràng nhất ở điều kiện thử GP pH 5,8, thiết bị bình Franz, tốc độ 400 vòng/phút theo mô hình Weibull. Trong giới hạn của luận án, thiết lập tương quan in vitro – in vivo của NNT nhỏ mắt diclofenac chỉ dừng lại ở những bước đầu tiên là lựa chọn được điều kiện thiết lập tương quan và mô hình động học phù hợp. Điều kiện thiết lập tương quan được áp dụng trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm nano nhũ tương diclofenac. Nghiên cứu này chỉ nhằm định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc ứng dụng tương quan IVIVC để lựa chọn công thức bào chế thích hợp hay có thể tiến tới thay thế các nghiên cứu in vivo trong tương lai. KẾT LUẬN 1. Bào chế nano nhũ tƣơng diclofenac ADC lần đầu tiên được sử dụng làm hoạt chất chính trong công thức NNT nhỏ mắt. Lần đầu tiên, NNT diclofenac 0,1% đã được tiến hành bào chế bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao và thiết bị siêu âm, thiết bị siêu âm kết hợp với ĐNH áp suất cao với các quy trình bào chế cơ bản. Chế phẩm hình thành được tiến hành đánh giá khả năng GP DC in vitro, đánh giá ảnh hưởng của các thành phần CT đến một số đặc tính vật lý của NNT, đánh giá ảnh hưởng của các thành phần đến khả năng GP in vitro của NNT nhỏ mắt. Lượng thành phần dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt đều có ảnh hưởng tới khả năng giải phóng in vitro của chế phẩm. Thành phần đệm borat cho điện thế zeta cao, tạo sự ổn định cho hệ. NNT có thành phần dầu IPM cho thấy sự đồng nhất và ổn định khi qua các thiết bị bào chế khác nhau. Quy trình bào chế bằng kỹ thuật siêu âm cho thấy sự phù hợp khi sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Các mẫu NNT được hình thành ổn định đều có KTG nhỏ hơn 300nm, chỉ số đa phân tán PdI ~ 0,3, giá trị tuyệt đối của thế zeta lớn hơn 30 mV và tỉ lệ DC được nhũ hóa luôn lớn hơn 90%. 24 2. Nâng quy mô, dự thảo TCCS, đánh giá độ ổn định Do điều kiện phòng thí nghiệm, nghiên cứu chỉ tiến hành nâng quy mô từ 100 ml lên 1000ml. Thiết kế 3 mẻ với quy mô 1000 ml, đánh giá tính lặp lại của quy trình bào chế. Kết quả cho thấy không có sự sai khác giữa các chỉ tiêu chất lượng giữa các mẻ ở quy mô 1000 ml trong cùng điều kiện nghiên cứu. Căn cứ các kết quả nghiên cứu thu được dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của NNT nhỏ mắt diclofenac đã được đề xuất với 12 tiêu chí (tính chất, giới hạn cho phép về thể tích, định tính, định lượng, phần trăm GP DC, KTG nhũ tương, thế zeta, độ nhớt, pH, độ vô khuẩn, tỉ lệ dược chất nhũ hóa). Nano nhũ tương sau khi tiến hành nghiên cứu độ ổn định sau 6 tháng, với sự trợ giúp của phần mềm Mini Tab, tuổi thọ được dự đoán là 24 tháng. 3. Đánh giá sinh khả dụng, thiết lập tƣơng quan in vitro – in vivo Việc đánh giá SKD của thuốc nghiên cứu trên mắt thỏ đã chứng minh NNT diclofenac có khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc và làm tăng thấm DC qua giác mạc nên cải thiện SKD của chế phẩm hơn so với dạng DD đối chiếu. Các kết quả nghiên cứu về đánh giá SKD của NNT nhỏ mắt diclofenac đã góp phần định hướng cho các nghiên cứu mới trong việc đánh giá SKD của các thuốc có cấu trúc nano. NNT nhỏ mắt diclofenac sau khi được đánh giá SKD in vitro, SKD in vivo đã được thiết lập mô hình tương quan in vitro – in vivo. Kết quả nghiên cứu cho thấy tương quan in vitro – in vivo của NNT dùng cho nhãn khoa rõ ràng nhất ở điều kiện thử giải phóng qua môi trường đệm phosphat pH 5,8, thiết bị bình Franz, tốc độ khuấy 400 vòng/phút theo mô hình Weibull. Đây là môi trường GP thích hợp nhất cho các nghiên cứu tiếp theo của chế phẩm NNT diclofenac để có một mô hình tương quan phù hợp giữa quá trình GP thuốc in vitro và hấp thu thuốc in vivo. Môi trường đệm phosphat (0,01 M) pH 5,8 được tiến hành lựa chọn để làm môi trường giải phóng xây dựng TCCS cho chế phẩm NNT nhỏ mắt diclofenac. ĐỀ XUẤT 1. Hoàn thiện quy trình bào chế nano nhũ tương diclofenac 0,093% trên quy mô lớn hơn. 2. Đánh giá độ ổn định dài hạn để xác định chính xác tuổi thọ của nano nhũ tương diclofenac 0,093%. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 1. Đặng Thị Hiền, Vũ Ngọc Mai, Nguyễn Trần Linh (2012), “Nghiên cứu bào chế và bước đầu đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro của nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac”, Tạp chí Y Dược học Quân sự, tập 37, số 1, tr. 27-32. 2. Đặng Thị Hiền, Nguyễn Hồng Vân, Nguyễn Thị Phượng, Nguyễn Trần Linh (2013), “Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao”, Tạp chí Y Dược học Quân sự, tập 38, số 1, tr. 7-12. 3. Đặng Thị Hiền, An Phương Hà, Quản Duy Quang, Vũ Ngọc Mai, Nguyễn Trần Linh (2015), “Đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt nano nhũ tương diclofenac trên mắt thỏ”, Tạp chí Nghiên cứu dược và Thông tin thuốc, tập 6, số 4, tr. 19-23.