Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng Aspergillus sp. phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

có khả năng sinh trưởng và có hoạt tính đối kháng trên tất cả các nguồn carbon nghiên cứu. Trong đó, chủng này có hoạt tính đối kháng rất mạnh (D-d ≥ 2,5 cm) trên các nguồn carbon là glucose, tinh bột, lactose, rỉ đường và fructose. Chủng này có hoạt tính đối kháng mạnh trên các nguồn carbon là maltose và sucrose. Hoạt tính đối kháng thể hiện yếu nhất khi chủng NS này được nuôi trên MT có nguồn carbon là galactose. Trên 2 nguồn carbon là glucose và tinh bột chủng này cho hoạt tính mạnh nhất (hình 3.11). Tuy nhiên, khi sử dụng tinh bột làm nguồn dinh dưỡng carbon, độ nhớt MT cao, gây khó khăn cho quá trình lọc, tách sinh khối để thu dịch lên men. Do đó, chúng tôi quyết định chọn glucose là nguồn carbon để nuôi cấy chủng Asp. terreus Đ1 cho các thí nghiệm tiếp theo. Glucose Maltose Lactose Fructose Hình 3.11. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 trên MT có nguồn carbon khác nhau 3.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT6, 1% NaCl, nguồn carbon là glucose, thay đổi nguồn nitơ, sau 6 ngày khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 STT Nguồn nitơ Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 1 0,5 g bột đậu tương + 2,5 g cao nấm men 3,54 ± 0,05 2 3 g cao thịt 2,20 ± 0,05 3 3 g cao nấm men 3,00 ± 0,06 4 3 g bột đậu tương 1,70 ± 0,09 5 1,5 g peptone + 1,5 g cao thịt 1,55 ± 0,04 6 3 g NH4Cl 1,64 ± 0,07 7 3 g (NH4)2SO4 1,68 ± 0,03 8 3 g NH4NO3 1,70 ± 0,05 9 2,5 g bột đậu tương + 0,5 g cao nấm men 3,33 ± 0,05 10 3 g NaNO3 1,85 ± 0,00 11 3 g Peptone 2,38 ± 0,07 3.54 2.20 3.00 1.70 1.55 1.64 1.68 1.70 3.33 1.85 2.38 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 0,5g bột đậu tương + 2,5g cao nấm men 3g cao thịt 3g cao nấm men 3g bột đậu tương 1,5g peptone + 1,5 g cao thịt 3g NH4Cl 3g (NH4)2SO4 3g NH4NO3 2,5g bột đậu tương + 0,5 g cao nấm men 3g NaNO3 3g Peptone Ng uồ n ni tơ Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hoạt tính đối kháng chủng Asp. terreus Đ1 Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và biểu đồ 3.3 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng trên tất cả các nguồn nitơ nghiên cứu. Trong đó, chủng này có hoạt tính đối kháng mạnh trên nguồn nitơ là cao nấm men và nguồn nitơ là hỗn hợp gồm cao nấm men và bột đậu tương. Khi MT chỉ có nguồn nitơ là bột đậu tương thì hoạt tính đối kháng của chủng này không mạnh. Khi MT chỉ có nguồn nitơ là cao nấm men, thì chủng này cho hoạt tính đối kháng rất mạnh. Khi MT có cả 2 nguồn nitơ là cao nấm men và bột đậu tương thì chủng này cho hoạt tính đối kháng mạnh hơn cả. Chủng này cho hoạt tính đối kháng mạnh nhất khi trong MT có 0,5 g bột đậu tương và 2,5 g cao nấm men (hình 3.12). Có thể do cao nấm men và bột đậu tương có thành phần dinh dưỡng phong phú. Ngoài protein, cao nấm men và bột đậu tương còn có các acid amin và các vitamin có tác dụng kích thích quá trình tổng hợp CKS của chủng Asp. terreus Đ1. 0,5 g bột đậu tương và 2,5 g cao nấm men 2,5 g bột đậu tương và 0,5 g cao nấm men 3 g NaNO3 3 g NH4Cl Hình 3.12. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 trên MT có nguồn nitơ khác nhau 3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme trong tế bào, do đó ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh trưởng và sinh KS của NS. Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT6, 1% NaCl, nguồn carbon là glucose, nguồn nitơ gồm 0,5 g bột đậu tương và 2,5 g cao nấm men, ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Sau 6 ngày, khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 STT Nhiệt độ (oC) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Sinh khối (g) 1 20 3,24 ± 0,09 1,313 ± 0,013 2 25 3,83 ± 0,17 1,300 ± 0,045 3 30 3,39 ± 0,06 1,607 ± 0,062 4 35 2,64 ± 0,06 1,213 ± 0,065 5 40 1,26 ± 0,06 1,313 ± 0,013 3.24 3.83 3.39 2.64 1.26 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (oC) H oạ t t ín h đố i k há ng D -d (c m ) 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 S in h kh ối (g ) D-d (cm) Sinh khối (g) Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và đồ thị 3.2 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng ở tất cả các điều kiện nhiệt độ nghiên cứu. Trong đó, chủng này cho hoạt tính rất mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 20 - 35oC, mạnh nhất ở nhiệt độ nuôi cấy 25oC (hình 3.13). Nhiệt độ này tương ứng với nhiệt độ trung bình RNM Cần Giờ là 25,8°C. Kết quả này phù hợp với tài liệu của N.S. Egorov (1985), nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh KS của NS là từ 25 - 28oC. Chủng Asp. terreus Đ1 sinh trưởng mạnh trong khoảng nhiệt độ 25 – 35oC, mạnh nhất ở 30oC. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu về NS phân lập từ RNM Cần Giờ, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi RNM Cần Giờ dao động 30 – 35oC [12],[14], [15], [16], [17]. 25oC 35oC Hình 3.13. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi được nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau 3.3.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu pH môi trường có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng, trao đổi chất của VSV. Nồng độ ion H+ hoặc OH- ảnh hưởng trực tiếp lên tế bào hoặc ảnh hưởng gián tiếp do làm thay đổi độ phân li của các chất trong MT. Thay đổi pH còn ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme, đến sản phẩm trung gian, đến sự phân li, sự hòa tan, do đó ảnh hưởng đến sinh tổng hợp KS. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1. Nuôi chủng này trên MT6, 1% NaCl, nguồn carbon là glucose, nguồn nitơ gồm 0,5 g bột đậu tương và 2,5 g cao nấm men, ở 25oC, với pH ban đầu của MT được điều chỉnh trong khoảng từ 4 - 7 bằng NaOH 1N và HCl 1N. Sau 6 ngày, khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH ban đầu trong MT nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 STT pH Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Sinh khối (g) 1 4,0 3,72 ± 0,02 0,953 ± 0,012 2 4,5 4,00 ± 0,04 0,883 ± 0,007 3 5,0 3,78 ± 0,04 0,897 ± 0,015 4 5,5 4,13 ± 0,08 0,900 ± 0,006 5 6,0 4,04 ± 0,03 0,883 ± 0,015 6 6,5 3,68 ± 0,08 0,897 ± 0,003 7 7,0 4,06 ± 0,07 0,897 ± 0,003 pH = 4,5 pH = 5,5 Hình 3.14. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ở các điều kiện pH khác nhau Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng sinh trưởng và có hoạt tính đối kháng rất mạnh ở tất cả các điều kiện pH nghiên cứu, từ pH acid đến pH trung tính. Trong đó, chủng này có hoạt tính đối kháng mạnh nhất ở pH 5,5. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Phan Thanh Phương (2007), các chủng NS tác giả này nghiên cứu đều sinh KS mạnh nhất ở pH 5 – 6. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của các tác giả Masahira Nakagawa, Arika Hirota và Heiichi Sakai (1982) trên chủng Asp. terreus phân lập từ mẫu đất lấy từ trại chăn nuôi của Trường Đại học Osaka. Các tác giả này lên men chủng Asp. terreus để thu CKS cũng nuôi trên MT có pH 5,5. 3.3.7. Động học quá trình lên men Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT6, 1% NaCl, nguồn carbon là glucose, nguồn nitơ 0,5 g bột đậu tương + 2,5 g cao nấm men, ở 25oC, pH môi trường 5,5. Sau mỗi 12 giờ khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, đo pH và cân sinh khối khô, kết quả được trình bày trong bảng 3.9. Bảng 3.9. Động học quá trình lên men của chủng Asp. terreus Đ1 STT Thời gian (giờ) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) pH Sinh khối (g) 1 24 0,47 ± 0,04 5,40 ± 0,00 0,089 ± 0,001 2 36 1,72 ± 0,03 4,22 ± 0,01 0,260 ± 0,001 3 48 1,88 ± 0,02 3,84 ± 0,00 0,271 ± 0,002 4 60 1,85 ± 0,15 4,91 ± 0,00 0,440 ± 0,001 5 72 2,32 ± 0,06 4,66 ± 0,01 0,491 ± 0,001 6 84 2,22 ± 0,00 4,89 ± 0,00 0,570 ± 0,006 7 96 3,17 ± 0,04 5,93 ± 0,00 0,480 ± 0,009 8 108 4,37 ± 0,03 5,28 ± 0,00 0,460 ± 0,012 9 120 3,47 ± 0,02 5,97 ± 0,00 0,513 ± 0,009 10 132 3,50 ± 0,09 6,03 ± 0,01 0,516 ± 0,012 11 144 3,52 ± 0,09 6,00 ± 0,00 0,413 ± 0,009 12 156 3,47 ± 0,04 6,05 ± 0,00 0,403 ± 0,003 13 168 3,72 ± 0,03 6,48 ± 0,00 0,423 ± 0,009 14 180 2,87 ± 0,04 6,33 ± 0,00 0,407 ± 0,003 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h đố i k há ng D- d (c m ) 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 S in h kh ối (g ) D-d (cm) Sinh khối (g) Đồ thị 3.3. Động học quá trình lên men của chủng Asp. terreus Đ1 Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và đồ thị 3.3 cho thấy, sinh khối của chủng Asp. terreus Đ1 tăng dần từ 24 giờ đến khoảng 84 giờ, sau đó đạt trạng thái ổn định đến khoảng 132 giờ và giảm nhẹ. pH môi trường giảm trong thời gian đầu, từ pH ban đầu của MT là 5,5 giảm đến 3,84 sau 48 giờ nuôi cấy. Điều này có thể giải thích là do trong thời gian này chủng Asp. terreus Đ1 sinh trưởng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trung gian là acid hữu cơ tiết vào MT làm pH môi trường giảm. Sau 48 giờ, pH môi trường tăng dần. Hoạt tính đối kháng của chủng NS nghiên cứu tăng dần sau 24 giờ, đạt mức rất mạnh sau 96 giờ nuôi cấy và đạt cực đại ở 108 giờ (hình 3.15), sau đó giảm nhẹ và giữ trạng thái ổn định cho đến 168 giờ. Sau 168 giờ nuôi cấy, hoạt tính đối kháng giảm mạnh. Như vậy, CKS được tạo ra từ pha log trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, trong pha log NS chủ yếu sinh trưởng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất bậc I, nên nó thể hiện hoạt tính đối kháng yếu. Khi bước vào pha cân bằng (sau 84 giờ nuôi cấy), hoạt tính đối kháng tăng lên nhanh chóng. CKS được tạo ra nhiều nhất trong pha cân bằng của quá trình sinh trưởng của NS. Điều này có thể giải thích là do CKS là sản phẩm trao đổi chất bậc II (sản phẩm trao đổi chất thứ cấp), nên nó không được tổng hợp đồng thời với quá trình sinh trưởng. Sản phẩm trao đổi chất bậc II được tổng hợp sau quá trình sinh trưởng. Hoạt tính đối kháng của chủng NS nghiên cứu, duy trì khá ổn định và rất mạnh trong khoảng thời gian khá dài, từ 96 giờ đến 168 giờ, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận CKS một cách linh động về thời gian. Khi sinh khối của NS giảm, thì hoạt tính đối kháng của nó cũng giảm. Có thể, trong giai đoạn này, chất dinh dưỡng trong MT nuôi cấy bắt đầu cạn kiệt, các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra nhiều, không còn nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp CKS. Và cũng có thể, trong giai đoạn này trong MT nuôi cấy xuất hiện các chất làm phân hủy một phần CKS. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007), các chủng NS tác giả này nghiên cứu cho hoạt tính KS mạnh nhất dao động trong khoảng từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 6. Khi chủng Asp. terreus Đ1 cho hoạt tính đối kháng mạnh nhất, đường kính vòng vô khuẩn D-d = 4,37 cm. So sánh với nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) về NS phân lập từ RNM Cần Giờ sinh KS (D-d dao động từ 2,60 - 3,20 cm), đường kính vòng vô khuẩn của chủng Asp. terreus Đ1 lớn hơn nhiều. Có thể tạm kết luận hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 mạnh hơn so với các chủng NS do Phan Thanh Phương (2007) nghiên cứu. Theo kết quả của bảng 3.1 và bảng 3.9, chúng ta thấy sau khi tìm các điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp CKS, hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 tăng lên nhiều (D-d = 4,37 cm) so với hoạt tính đối kháng của chủng này lúc khảo sát sơ bộ bằng phương pháp khối thạch (D-d = 2,74 cm). 48 giờ 108 giờ Hình 3.15. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ở thời gian nuôi cấy khác nhau 3.4. Khảo sát enzyme ngoại bào Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus, chúng tôi nhận thấy chủng NS có hoạt tính đối kháng rất mạnh. Để làm cơ sở cho việc hướng tới ứng dụng, chúng tôi khảo sát thêm khả năng sinh enzyme chitinase và protease của chủng NS này. Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng Asp. terreus Đ1 STT Enzyme Đường kính vòng phân giải, D-d (cm) 1 Chitinase 2,00 ± 0,10 2 Protease 2,01 ± 0,03 Chitinase Protease Hình 3.16. Hoạt tính enzyme của chủng Asp. terreus Đ1 Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng sinh 2 loại enzyme khảo sát là chitinase và protease ở mức khá mạnh. Enzyme chitinase có chức năng phân giải chitin. Chitin có mặt trong thành tế bào nấm, vỏ giáp xác và côn trùng. Enzyme protease phân giải protease. Protein có mặt trong màng tế bào và chiếm đến khoảng 50% khối lượng khô của tế bào. Do đó, hoạt tính enzyme chitinase và protease khá mạnh của chủng Asp. terreus Đ1 sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng đối kháng với các VSV gây bệnh của chủng này. 3.5. Khảo sát khả năng kháng khuẩn Từ những kết quả trên cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 không những có hoạt tính đối kháng rất mạnh, mà còn sinh enzyme khá mạnh. Những đặc điểm này thể hiện tiềm năng ứng dụng của chủng Asp. terreus Đ1. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 với một số VK và nấm men gây bệnh cho người, cho cây trồng, trong đó có cả VK kháng thuốc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11. Bảng 3.11. Khả năng đối kháng với một số VK của chủng Asp. terreus Đ1 STT Vi khuẩn Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 1 Staphylococcus aureus 3,28 ± 0,03 2 Streptococcus pyogenes 3,72 ± 0,02 3 Pseudomonas aeruginosa 0,00 ± 0,00 4 S. aureus kháng methicillin 3,48 ± 0,10 5 E. coli kháng ampicillin 1,47 ± 0,07 6 Ralstonia solanacearum 0,00 ± 0,00 Kết quả cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng đối kháng rất mạnh với S. aureus, Str. pyogenes, S. aureus kháng methicillin (MRSA); có khả năng kháng E. coli kháng ampicillin ở mức yếu; không kháng P. aeruginosa, R. solanacearum và nấm men C. albicans. Nhìn chung CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng kháng mạnh VKG(+), kháng yếu hoặc không kháng VKG(-), không kháng nấm men. Trong đó, CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng kháng rất mạnh MRSA (hình 3.17), gây bệnh nhiễm trùng thường gặp và khó chữa. Hình 3.17. Khả năng đối kháng với S. aureus của chủng Asp. terreus Đ1 Hình 3.18. Khả năng đối kháng với MRSA của chủng Asp. terreus Đ1 3.6. Khảo sát khả năng kháng nấm Bên cạnh việc khảo sát khả năng đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm của chủng này với một số nấm gây bệnh cây trồng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cây trồng của chủng Asp. terreus Đ1 STT Nấm kiểm định Khả năng đối kháng 1 Phytophthora palmivora + 2 Colletotrichum sp. - 3 Fusarium oxysporum - 4 Rhizoctonia solani - 5 Candida albicans - Ghi chú: + có khả năng đối kháng, - không có khả năng đối kháng. Hình 3.19. Khả năng đối kháng với P. palmivora của chủng Asp. terreus Đ1 Hình 3.20. Khả năng đối kháng với Colletotrichum sp. của chủng Asp. terreus Đ1 Kết quả được trình bày trong bảng 3.12 cho thấy CKS của Asp. terreus Đ1 có khả năng kháng nấm P. palmivora, nhưng không có khả năng kháng các nấm gây bệnh còn lại: Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Candida albicans. Nấm Phytophthora là loại nấm rất nguy hiểm, gây bệnh cho nhiều loại cây trồng như tiêu, cà phê, táo, chôm chôm, cà chua, khoai tây, thuốc lá, rau, đậu, bông vải Các loài nấm thuộc chi này gây bệnh khó chữa, làm thiệt hại nghiêm trọng năng suất cây trồng. P. palmivora ký sinh gây hại trên nhiều loại hoa màu, cây ăn quả, Trên cây sầu riêng, loại nấm này có thể tấn công ở tất cả các bộ phận từ rễ, thân, lá, hoa và trái. Dịch bệnh có thể gặp từ vườn ươm đến cây đang thu hoạch. Loài nấm này có thể gây bệnh thối rễ, chảy nhựa thân, thối trái. Chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng đối kháng với P. palmivora cho thấy nó có tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát bệnh do nấm này gây ra. Kết luận: chủng Asp. terreus có khả năng đối kháng mạnh với các VKG(+), trong đó có cả VKG(+) kháng thuốc; không có khả năng đối kháng với các VKG(-), nấm men; có khả năng đối kháng với P. palmivora; không có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng khác. ĐC TN ĐC TN 3.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ bền CKS của chủng Asp. terreus Đ1 Từ những khảo sát trên cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh, có nhiều tiềm năng ứng dụng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc tính lí hóa của CKS từ chủng NS này để làm cơ sở cho việc ứng dụng và tách chiết CKS. 3.7.1. Độ bền nhiệt Độ bền nhiệt là một tính chất quan trọng của CKS, CKS bền nhiệt sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các thao tác trong quá trình tách chiết có sử dụng nhiệt, giúp quá trình tách chiết dễ dàng hơn, ít hoặc không làm mất hoạt tính của CKS. Chúng tôi xử lí dịch lên men ở các điều kiện nhiệt độ 40 – 100oC, trong khoảng thời gian từ 10 – 60 phút. Sau đó, kiểm tra hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13. Bảng 3.13. Độ bền nhiệt của CKS chủng Asp. terreus Đ1 Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 30 40 60 80 100 Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 10 4,22 ± 0,03 4,27 ± 0,02 4,18 ± 0,08 4,18 ± 0,04 4,18 ± 0,02 20 4,23 ± 0,02 4,17 ± 0,11 4,20 ± 0,00 4,17 ± 0,03 40 4,15 ± 0,00 4,23 ± 0,07 4,15 ± 0,05 4,12 ± 0,02 60 4,15 ± 0,03 4,12 ± 0,07 4,07 ± 0,02 3,83 ± 0,07 Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 cho thấy dịch lên men từ chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh ở tất cả các nhiệt độ và thời gian xử lí. Khi xử lí ở 100oC trong 40 phút, hoạt tính đối kháng của chủng này vẫn không giảm so với ở nhiệt độ phòng. Đến 100oC trong 60 phút hoạt tính đối kháng của chủng này giảm nhẹ, nhưng vẫn ở mức rất mạnh. Không xử lí nhiệt 40oC trong 10 phút 100oC trong 40 phút 100oC trong 60 phút Hình 3.21. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi xử lí ở các nhiệt độ khác nhau 3.7.2. Độ bền pH Điều chỉnh pH dịch lên men từ chủng Asp. terreus Đ1 về các giá trị pH từ 4,0 – 7,5 trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đó, điều chỉnh pH về 7, và thử hoạt tính đối kháng bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14. Bảng 3.14. Độ bền pH của CKS chủng Asp. terreus Đ1 STT pH Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 1 4,0 4,03 ± 0,07 2 4,5 4,02 ± 0,07 3 5,0 4,02 ± 0,03 4 5,5 4,12 ± 0,06 5 6,0 4,10 ± 0,05 6 6,5 4,15 ± 0,03 7 7,0 4,10 ± 0,05 8 7,5 4,10 ± 0,03 9 Đối chứng 4,22 ± 0,03 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 pH H o ạt tí n h đ ố i k h án g D -d (c m ) Đồ thị 3.4. Độ bền pH của CKS của chủng Asp. terreus Đ1 Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 và đồ thị 3.4 cho thấy dịch lên men từ chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh ở tất cả các điều kiện pH khảo sát từ 4 - 7,5. CKS của chủng này hoạt động mạnh trong một giới hạn pH rộng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết cũng như ứng dụng. Trong quá trình tách chiết có thể sử dụng một số hóa chất có thể làm thay đổi pH, CKS hoạt động mạnh ở giới hạn pH rộng giúp chúng ta khi tách chiết có thể sử dụng hóa chất hỗ trợ mà không sợ mất hoạt tính. Đặc biệt, trong ứng dụng CKS chúng ta không thể kiểm soát được pH, khi đó đặc điểm hoạt động trong một giới hạn pH rộng là một đặc điểm đáng quý. pH = 4 pH = 7,5 pH = 5,5 Không xử lí pH Hình 3.22. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi xử lí ở các điều kiện pH khác nhau 3.7.3. Độ bền thời gian Chúng tôi tiến hành khảo sát độ bền thời gian của CKS trong dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 bằng cách bảo quản dịch lên men ở điều kiện nhiệt độ 4oC, sau các khoảng thời gian 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, khảo sát lại hoạt tính đối kháng với B. subtilis, kết quả được trình bày trong bảng 3.15. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 STT Thời gian (tuần) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 1 0 3,03 ± 0,02 2 1 3,07 ± 0,04 3 2 3,10 ± 0,03 4 3 2,90 ± 0,00 5 4 3,12 ± 0,04 6 5 3,13 ± 0,03 7 16 2,98 ± 0,04 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Thời gian (tuần) H o ạt tí n h đ ố i k h án g , D -d (c m ) Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 Độ bền thời gian của CKS là một thuộc tính quan trọng của CKS, thể hiện tiềm năng ứng dụng của nó. Bởi vì từ khi lên men, thu dịch lên men và tách chiết CKS sẽ mất nhiều thời gian. Kết quả trong bảng 3.15 và đồ thị 3.5 cho thấy hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 duy trì ổn định theo thời gian khi được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4oC. Sau thời gian bảo quản 16 tuần, hoạt tính đối kháng vẫn duy trì ở mức rất mạnh và tương đương với lúc ban đầu. Đây là một đặc điểm có giá trị trong việc hướng tới ứng dụng CKS từ chủng này. Ban đầu Sau 16 tuần Hình 3.23. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau 3.8. Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 làm giảm sinh khối nấm P. palmivora Chúng tôi tiến hành tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 để làm giảm sinh khối P. palmivora. Nuôi P. palmivora trên MT12 có bổ sung dịch lên men của chủng Asp. terreus ở các nồng độ từ 0 – 20%. Sau các khoảng thời gian 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, kiểm tra sinh trưởng của P. palmivora bằng cách cân sinh khối khô. Kết quả được trình bày trong bảng 3.16. Bảng 3.16. Khả năng làm giảm sinh khối P. palmivora của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 Nồng độ (%) Thời gian (ngày) 0 1 10 20 Sinh khối (g) 2 0,226 ± 0,035 0,216 ± 0,020 0,190 ± 0,003 0,166 ± 0,003 3 0,291 ± 0,022 0,239 ± 0,040 0,221 ± 0,048 0,167 ± 0,004 4 0,372 ± 0,031 0,325 ± 0,025 0,111 ± 0,003 0,076 ± 0,033 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 2 3 4 Thời gian (ngày) S in h k h ố i ( g ) 0% 1% 10% 20% Đồ thị 3.6. Sự thay đổi sinh khối nấm P. palmivora theo thời gian Kết quả trong bảng 3.16 và đồ thị 3.6 cho thấy trong MT không có dịch lên men (đối chứng) chủng Asp. terreus, P. palmivora tăng sinh khối trong khoảng thời gian khảo sát từ 2 ngày đến 4 ngày. Trong MT có 1% dịch lên men, P. palmivora cũng tăng sinh khối, nhưng so với đối chứng, sinh khối của P. palmivora tăng ít hơn, giảm 12,63% sau 4 ngày. Trong MT có 10% dịch lên men, P. palmivora tăng sinh khối rất ít trong khoảng từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 3 (từ 0,190 g ở ngày thứ 2 tăng lên 0,221g ở ngày thứ 3). Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 4, sinh khối P. palmivora giảm mạnh, chỉ còn 0,111 g, giảm 41,58% so với ngày thứ 2 cùng điều kiện thí nghiệm, và giảm 70,16% so với sinh khối nấm P. palmivora ở ngày thứ 4 trong điều kiện đối chứng. Trong MT có 20% dịch lên men, P. palmivora gần như không tăng sinh khối trong khoảng từ ngày 2 đến ngày 3. Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 4, sinh khối P. palmivora giảm mạnh từ 0,167 g xuống còn 0,076 g, giảm 54,50%. So sánh với sinh khối nấm P. palmivora nuôi ở điều kiện đối chứng (0,372 g), sinh khối nấm P. palmivora nuôi ở MT có 20% dịch lên men sau 4 ngày giảm 79,57%. 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0 1 10 20 Nồng độ (%) S in h k h ố i ( g ) ngày 2 ngày 3 ngày 4 Đồ thị 3.7. Sự thay đổi sinh khối nấm P. palmivora theo nồng độ dịch lên men Đồ thị 3.7 cho chúng ta thấy rõ sinh khối P. palmivora giảm khi chúng ta tăng dần nồng độ dịch lên men trong MT nuôi cấy. Ở ngày thứ 4, trong MT chứa 10%-20%, sinh khối P. palmivora giảm rõ rệt. Điều này thể hiện khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 trong việc điều trị các bệnh trên cây trồng do P. palmivora gây ra. Hình 3.24. Khả năng ức chế sinh khối P. palmivora của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 sau 2 ngày nuôi cấy Đối chứng 10% 3.9. Xác định dung môi để thu CKS thô từ chủng Asp. terreus Đ1 Để tìm ra dung môi thích hợp cho việc tách chiết CKS từ dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1, chúng tôi tiến hành lắc dịch lên men của chủng này bằng các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexan, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, với tỉ lệ 1 thể tích dịch lên men : 4 thể tích dung môi. Dùng bình lóng, tách riêng dung môi và dịch lên men sau khi lắc, kiểm tra hoạt tính đối kháng bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.17. Bảng 3.17. Hoạt tính CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 khi thu nhận bằng các dung môi khác nhau Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Đối chứng Dịch lên men trước khi lắc với các dung môi 3,5 ± 0,00 Dịch lên men sau khi lắc với các dung môi 0,00 ± 0,00 Thí nghiệm n-hexan 3,43 ± 0,03 Diethyl ether 2,67 ± 0,12 Chloroform 2,23 ± 0,15 Ethyl acetate 1,27 ± 0,09 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 Hexan Diethyl ether Chloroform Ethyl acetate Dung môi H o ạt tí n h đ ố i k h án g D -d (c m ) Biểu đồ 3.4. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 khi thu nhận bằng các dung môi khác nhau Kết quả được trình bày trong bảng 3.17 và biểu đồ 3.4 cho thấy, trong tất cả các dung môi từ n-hexan đến ethyl acetate sau khi lắc với dịch lên men đều thể hiện hoạt tính đối kháng. Điều này chứng tỏ CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng hòa tan trong tất cả các dung môi khảo sát. Trong đó, khi thu nhận CKS thô bằng dung môi n-hexan chúng tôi thu được CKS thô có hoạt tính mạnh nhất. Do đó, chúng tôi chọn n-hexan là dung môi thu CKS thô để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, khi chúng ta thu bằng n-hexan thì trong dịch lên men vẫn còn nhiều CKS (hòa tan trong các dung môi có độ phân cực cao hơn), đến ethyl acetate thì dịch lên men sau khi lắc với ethyl acetate không còn hoạt tính đối kháng, chứng tỏ CKS đã hòa tan hết trong dung môi. Như vậy, chúng tôi chọn lắc dịch lên men với n-hexan, sau đó lắc với ethyl acetate, và khảo sát tiếp CKS thô thu từ 2 dung môi này. n-hexan Diethyl ether Chloroform Ethyl acetate Hình 3.25. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu bằng các dung môi khác nhau Hình 3.26. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus trước Hình 3.27. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 khi lắc với các dung môi sau khi lắc với các dung môi Chúng tôi tiến hành khảo sát lại việc thu CKS thô từ dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 với 2 dung môi là n-hexan và ethyl acetate, bỏ qua 2 dung môi là diethyl ether và chloroform. Chỉ lắc dịch lên men với n-hexan (tỉ lệ 1 thể tích dịch lên men : 4 thể tích dung môi), rồi sau đó dùng bình lóng để tách riêng dung môi và dịch lên men. Lấy dịch lên men đã lắc với n-hexan tiếp tục lắc với ethyl acetate, dùng bình lóng tách riêng dung môi và dịch lên men. Tiến hành khảo sát hoạt tính của dịch lên men trước khi lắc với dung môi, sau khi lắc với dung môi, CKS thô trong n-hexan và trong ethyl acetate. Kết quả được trình bày trong bảng 3.18. Bảng 3.18. Hoạt tính CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 khi thu nhận n-hexan và ethyl acetate Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Đối chứng Dịch lên men trước khi lắc với các dung môi 3,00 ± 0,06 Dịch lên men sau khi lắc với các dung môi 0,20 ± 0,00 Thí nghiệm n-hexan 3,03 ± 0,09 Ethyl acetate 2,98 ± 0,02 Từ kết quả trong 2 bảng 3.17 và 3.18, chúng tôi quyết định khảo sát 2 phân đoạn CKS thô thu bằng n-hexan và ethyl acetate. Hình 3.28. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu bằng n-hexan Hình 3.29. Hoạt tính đối kháng của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu bằng ethyl acetate Hình 3.30. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus trước khi lắc với các dung môi Hình 3.31. Hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 sau khi lắc với n-hexan và ethyl acetate 3.10. So sánh CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 với các CKS khác Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính đối kháng của một số đĩa giấy KS chuẩn (do công ty NK-Biotek cung cấp) với B. subtilis. Bên cạnh đó, thử hoạt tính đối kháng của một khối lượng tương đương CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 thu trong phân đoạn n – hexan bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.19. Bảng 3.19. So sánh hoạt tính của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 với một số CKS khác CKS Hàm lượng (µg) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 thu từ n-hexan 2 2,30 ± 0,10 10 2,93 ± 0,07 15 3,10 ± 0,10 30 3,32 ± 0,02 Clindamycin 2 2,00 ± 0,03 Ampicillin 10 3,83 ± 0,06 Streptomycin 10 1,63 ± 0,07 Erythromycin 15 2,35 ± 0,05 Tetracyclin 30 3,50 ± 0,06 Neomycin 30 0,77 ± 0,02 Kanamycin 30 1,95 ± 0,00 Các CKS chúng tôi sử dụng để so sánh đều là các CKS có hoạt tính kháng lại VKG(+) hoặc kháng cả VKG(+) và VKG(-). Trong đó, CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 trong phân đoạn n-hexan có hoạt tính mạnh hơn nhiều so với một số CKS như clindamycin, streptomycin, neomycin, kanamycin; có hoạt tính yếu hơn so với ampicillin, tetracyclin. Tuy nhiên, theo kết quả được trình bày trong bảng 3.11, dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 có thể kháng được MRSA và E. coli kháng ampicillin (các VK kháng KS nhóm β-lactam). Chứng tỏ CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có ưu điểm hơn ampicillin ở chỗ không bị phân hủy bởi enzyme lactamase. Hình 3.32. Hoạt tính đối kháng của 30 µg CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 Hình 3.33. Hoạt tính đối kháng của 2 µg CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 Hình 3.34. Hoạt tính đối kháng của 10 µg CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 Hình 3.35. Hoạt tính đối kháng của 10 µg ampicillin Hình 3.36. Hoạt tính đối kháng của 15 µg erythromycin Hình 3.37. Hoạt tính đối kháng của 2 µg clindamycin 3.11. Xác định MIC của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 Sau khi khảo sát khả năng ức chế B. subtilis của CKS thô thu từ dung môi n-hexan, chúng tôi thu được kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của nó trên B. subtilis là 25 µg/ml. Masahira Nakagawa, Arika Hirota và Heiichi Sakai (1982) nghiên cứu trên CKS của chủng Asp. terreus có MIC trên B. subtilis là 50 µg/ml. Nếu so sánh thì CKS của chủng Asp. terreus có MIC thấp hơn rất nhiều. 3.12. Tinh sạch CKS 3.12.1. Sắc ký bản mỏng Chúng tôi tiến hành triển khai sắc ký CKS thu từ n-hexan (cao n-hexan) và CKS thu từ ethyl acetate (cao ethyl acetate) trên silica gel 60 F254 trong các hệ dung môi khác nhau, nhằm tìm ra hệ dung môi thích hợp để tiến hành sắc ký cột, tinh chế CKS. Bảng 3.20. Rf của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 khi triển khai sắc ký trong các hệ dung môi khác nhau STT Hệ dung môi Rf Cao hexan Cao ethyl acetate 1 n-hexan 0 0 2 Benzen 0,01 0,04 3 Diethyl ether 0,08 0,11 4 Chloroform 0,06 0,14 5 Ethyl acetate 0,55;0,75 0,39 6 Acetone 0,68 0,71 7 Chloroform:methanol=100:1 0,21 0,21 8 Chloroform:methanol=20:1 0,51;0,66 0,32 9 Chloroform:methanol=10:1 0,54 0,46 Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), dung môi được sử dụng để bắt đầu giải li sắc ký cột là hệ dung môi có thể đẩy chất cần quan tâm lên Rf từ 0,20 đến 0,30. Do đó, đối với cao n-hexan chúng tôi chọn hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1 để bắt đầu quá trình giải li trong sắc ký cột. Tương tự, chúng tôi cũng chọn hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1 để bắt đầu quá trình giải li trong sắc ký cột cao ethyl acetate. Hình 3.38. Hiện hình sinh học bản mỏng sắc ký trên hệ 100 chloroform: 1 methanol (cao n-hexan) Hình 3.39. Hiện hình bằng H2SO4 bản mỏng sắc ký trên hệ 100 chloroform: 1 methanol (cao ethyl acetate) 3.12.2. Sắc ký cột 3.12.2.1. Sắc ký cột cao hexan Chúng tôi triển khai sắc ký cột với 265mg cao thu bằng hexan trong hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1, sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi theo các tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3, Hứng mỗi lọ thủy tinh 20 ml. Theo dõi sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform:methanol tỉ lệ 10: 1. Các lọ thủy tinh có bản mỏng sắc ký tương đương nhau chúng tôi sẽ gom chung lại thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.21. Bảng 3.21. Sắc ký cột cao n-hexan STT Phân đoạn Đặc điểm theo dõi bằng sắc ký bản mỏng Hoạt tính kháng khuẩn Ghi chú 1 H1 Nhiều vết - Không khảo sát 2 H2 Một vết + Khảo sát 3 H3 Nhiều vết - Không khảo sát Chúng tôi thu được phân đoạn H2 13,8 mg có hoạt tính kháng khuẩn, chứng tỏ trong phân đoạn này có chứa CKS. Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn này, chúng tôi sắc ký bản mỏng trong 3 hệ dung môi khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.22. Bảng 3.22. Sắc ký bản mỏng để kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn H2 STT Hệ dung môi Tỉ lệ Số vết Rf 1 Chloroform:methanol 10:1 1 0,50 2 Butanol:acid acetic: nước cất 5:1:2 1 0,87 3 Ethyl acetate 100% 1 0,41 4 Acetonitril 100% 3 0,44; 0,73;0,86 Khi kiểm tra trên hệ dung môi là 100% acetonitril, phân đoạn H2 thu được tách ra thành 3 vết, chứng tỏ CKS thu được trong phân đoạn H2 chưa tinh khiết, cần tinh chế thêm. Nhưng do khối lượng của phân đoạn H2 quá ít, chỉ có 13,80 mg nên chúng tôi không thể tiếp tục tinh chế. Hình 3.40. Hiện hình sinh học bản mỏng sắc ký phân đoạn H2 trong 100% acetonitril 3.12.2.2. Sắc ký cột cao ethyl acetate Chúng tôi triển khai sắc ký cột với 2854,20 mg cao thu bằng ethyl acetate trong hệ dung môi 100 chloroform: 1 methanol. Sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi theo các tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3, Hứng mỗi lọ thủy tinh 20 ml. Theo dõi sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform: acetonitril tỉ lệ 10: 1. Các lọ thủy tinh có bản mỏng sắc ký tương đương nhau chúng tôi sẽ gom chung lại thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.23. Bảng 3.23. Sắc ký cột cao ethyl acetate STT Phân đoạn Đặc điểm theo dõi bằng sắc ký bản mỏng Hoạt tính kháng khuẩn Ghi chú 1 E1 Có nhiều vết, có vết dơ - Không khảo sát 2 E2 Một vết + Không khảo sát 3 E3 Nhiều vết, có vết dơ - Không khảo sát 4 E4 Nhiều vết + Không khảo sát 5 E5 3 vết + Khảo sát 6 E6 Nhiều vết + Không khảo sát 7 E7 Nhiều vết - Không khảo sát 8 E8 Nhiều vết + Không khảo sát 9 E9 Nhiều vết - Không khảo sát 10 E10 Nhiều vết + Không khảo sát 11 E11 Nhiều vết - Không khảo sát Qua quá trình sắc ký cột cao ethyl acetate, chúng tôi thu được nhiều phân đoạn có hoạt tính đối kháng với B. subtilis, trong đó phân đoạn E5 khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform: methanol có 3 vết, ít vết nhất so với các phân đoạn khác, nên chúng tôi chọn phân đoạn E5 để tiếp tục khảo sát. Hình 3.41. Bản mỏng theo dõi sắc ký cột cao ethyl acetate Chúng tôi tiếp tục sử dụng sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 trên các hệ dung môi khác nhau, để tìm ra hệ dung môi thích hợp có thể tách rõ ràng các chất trong phân đoạn E5. Bảng 3.24. Sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 STT Hệ dung môi Tỉ lệ Số lần nhúng bản Rf chất mục tiêu Ghi chú 1 Benzen:acid acetic: methanol 10:1:1 1 0,36 Các chất không tách nhau 2 Chloroform: acid acetic 100:1 2 0,41 Các chất tách ra không rõ ràng 3 Chloroform: acid acetic 100:3 2 0,45 Các chất tách ra không rõ ràng 4 Chloroform:acid acetic 100:3 3 0,59 Các chất tách nhau ra; chất mục tiêu tách xa các chất khác, vết tròn, màu đồng nhất 5 Chloroform: acid acetic 100:4 3 0,68 Các chất tách ra không rõ ràng 6 Chloroform: acid acetic 100:5 1 0,46 Các chất tách ra không rõ ràng 7 Chloroform: acid acetic 100:5 3 0,75 Các chất tách ra không rõ ràng 8 Chloroform: acid acetic 100:6 1 0,54 Các chất tách ra không rõ ràng 9 Chloroform: acid acetic 100:10 1 0,82 Các chất tách ra không rõ ràng 10 Chloroform: acetonitril 20:1 3 0,74 Các chất tách ra không rõ ràng 11 Chloroform: acetonitril 100:6 3 0,62 Các chất tách ra không rõ ràng 12 Chloroform: acetonitril 9:1 3 0,65 Các chất tách ra không rõ ràng 13 Chloroform: acetonitril 4:1 3 0,88 Các chất không tách nhau ra 14 Chloroform: methanol: acetonittril 20:0,5:0,5 2 0,55 Các chất tách ra không rõ ràng 15 Chloroform: methanol: acetonittril 10:0,5:0,5 2 0,76 Các chất tách ra không rõ ràng 16 Chloroform:methanol: acetonittril 10:1:0,5 1 0,56 Các chất tách ra không rõ ràng 17 Chloroform:pyridine 100:1 2 0,4 Các chất tách ra không rõ ràng 18 Chloroform:acid acetic: methanol 10:1:0,5 1 0,94 Các chất không tách ra Trong hệ dung môi chloroform acid acetic tỉ lệ 100: 3, các chất trong phân đoạn V tách nhau rõ rệt, chất mục tiêu (màu xanh xám), thể hiện vết tròn, màu sắc đồng nhất (hình 3.42). Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi này để chạy sắc ký bản mỏng chế hóa. Hình 3.42. Hiện hình hóa học bản mỏng sắc ký phân đoạn E5 trong hệ dung môi 100 chloroform: 3 acid acetic Khi tiến hành triển khai sắc ký bản mỏng chế hóa phân đoạn E5, chúng tôi nhận thấy các vạch tách rõ nhau ra hình (3.43.). Nhưng khi hiện hình bằng H2SO4 đậm đặc, chúng tôi nhận thấy trong chất mục tiêu màu xanh xám còn xuất hiện vết màu cam. Điều này chứng tỏ, trong vạch chứa chất mục tiêu còn có chứa chất khác. Do hạn chế về thời gian và kinh phí, chúng tôi tạm dừng việc tinh chế CKS lại. Hình 3.43. Hiện UV bản mỏng chế hóa phân đoạn E5 Như vậy, chúng tôi tiến hành tinh chế CKS theo các bước sau, và thu được 2 phân đoạn H2 và E5 có chứa CKS. Hình 3.44. Qui trình tinh chế CKS Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT glucose 30g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2mg, ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất 1 lít; pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 giờ. Lọc, tách sinh khối Dịch lên men Lắc với n-hexan, tách dung môi n-hexan có CKS Dịch lên men sau khi lắc với n-hexan Cô chân không ở 35oC Cao n-hexan Sắc ký cột, trong hệ 100 chloroform: 1 methanol Lắc với ethyl acetate, tách dung môi Ethyl acetate có CKS Dịch lên men sau khi lắc với ethyl acetate Cô chân không ở 35oC H1 Cao ethyl acetate Sắc ký cột, trong hệ 100 chloroform: 1methanol H2 H3 E1-E4 E5 E6-E11 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Từ 58 chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ trong bộ sưu tập giống của PTN Sinh hóa – Vi sinh Trường ĐH Sư Phạm TP. HCM, đã tuyển chọn được chủng Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh với B. subtilis (D-d=2,74 cm) và đối kháng yếu với E. coli (D-d=1,10 cm). - Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài chủng Đ1, kết luận chủng này thuộc loài Aspergillus terreus. - Đã khảo sát và tìm ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Asp. terreus Đ1 sinh kháng sinh mạnh nhất như sau: glucose 30 g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2 mg, ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất 1 lít; pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 giờ. - Đã khảo sát phổ tác động của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1: kháng rất mạnh các VKG(+) như Staphylococcus aureus, S. aureus kháng methicillin, Streptococcus pyogenes; kháng yếu hoặc không kháng các VKG(-) và nấm men; không kháng các loài nấm Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani nhưng có khả năng kháng mạnh Phytophthora palmivora. - Đã xác định một số đặc điểm của CKS trong dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1: bền nhiệt (đến 100oC trong 40 phút hoạt tính vẫn không thay đổi), bền pH (thể hiện hoạt tính rất mạnh trong khoảng pH 4 - 7,5), bền thời gian (khi bảo quản ở 4oC, sau 16 tuần hoạt tính vẫn không thay đổi). - Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 trong việc làm giảm sinh khối P. palmivora: cho thấy MT có 10% dịch lên men làm giảm 70,16% sinh khối P. palmivora, MT có 20% làm giảm 79,57% sinh khối P. palmivora sau 4 ngày nuôi cấy. - Bước đầu khảo sát để tách chiết CKS, thu được kết quả như sau: + Dung môi thích hợp để thu CKS là n-hexan và ethyl acetate. + CKS thô thu từ n-hexan có MIC là 25 µg/ml. CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu từ dung môi n-hexan có hoạt tính đối kháng với B. subtilis mạnh hơn streptomycin, neomycin, kanamycin, erythromycin, clindamycin; yếu hơn ampicillin, tetracyclin. + Đã bước đầu tiến hành tinh chế CKS bằng cách sắc ký cột silica gel, thu được 2 phân đoạn H2 và E5 có hoạt tính đối kháng. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục tinh sạch và xác định bản chất của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 để làm cơ sở cho việc ứng dụng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. HCM, tr.62-63. 2. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.96-108. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, tr.90-108. 4. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học Vi sinh vật tập 1, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, tr.124-130. 5. Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thủy (2007), “Khảo sát đặc điểm một số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, 12 (46), tr.138-150. 6. Bùi Xuân Đồng (2004), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.154-160. 7. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.3-31. 8. Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr.3-30. 9. Nguyễn Thị Lan Hương (2009), Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ - TP. HCM, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.40-64. 10. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2009), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr.221-269. 11. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học – tập 2 Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.34. 12. Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr. 22-32. 13. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.151-252. 14. Phạm Thị Thanh Thúy (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.67-77. 15. Trần Thị Nhã Uyên (2010), Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.56-76. 16. Võ Thị Bích Vân (2010), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.47-63. 17. Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. HCM, tr.70-75. Tiếng Anh 18. A. A. Brakhage, T. Scheper (2004), Molecular Biotechnology of Fungal β-Lactam Antibiotics and Related Peptide Synthetases - Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Volume 88, Springer Berlin Heidelberg New York, pp.47-49. 19. Benjaphorn Prapagdee, Chutima Kuekulvong, Skorn Mongkolsuk (2008), “Antifungal Potential of Extracellular Metabolites Produced by Streptomyces hygroscopicus against Phytopathogenic Fungi”, International Journal of Biological Sciences, 4, pp.330-337. 20. Carsten Christophersen, Oscar Crescente, Jens C. Frisvad, Lone Gram, Joan Nielsen, Per Halfdan Nielsen, Lisa Rahbæk (1999), “Antibacterial activity of marine- derived fungi”, Mycopathologia, 143(3), pp.135-138. 21. E. B. Gareth Jones (2011), “Fifty years of marine mycology”, Fungal Diversity, 50, pp.73-112. 22. Emanuel Goldman, Lorrence H. Green (2008), Practical handbook of microbiology, CRC Press, pp.131-143. 23. Guangshun Wang (2010), Antimicrobial Peptides discovery Design and Novel Therapeutic Strategies, CAB International, pp.9-10. 24. I. Edward Alcamo (1991), Fundamentals of Microbiology, The Benjamin/ Cummings, pp.470-485. 25. Iqbal Ahmad, Farah Ahmad, John Pichtel (2011), Microbes and Microbial Technology - Agricultural and Environmental Applications, Springer, pp.447-453. 26. J. Heritage, E. G. V. Evans, R. A. Killington (2003), Microbiology in action, Cambridge University Press, pp.249-260. 27. J. Webster, R. W. S. Weber (2007), Introduction to fungi, Cambridge University Press, pp.293-304. 28. K. Sambamurthy, Ashutosh Kar (2010), Pharmaceutical biotechnology, New Age International Publishers, p.173. 29. Kevin D. Hyde, E. B. Gareth Jones, Eduardo Leanä O, Stephen B. Pointing, Asha D. Poonyth, Lilian L. P. Vrijmoed (1998), “Role of fungi in marine ecosystems”, Biodiversity and Conservation, 7, pp.1147-1161. 30. Kim Lewis, Abigail A. Salyers, Harry W. Taber, Richard G. War (2002), Bacterial Resistance to Antimicrobials, Marcel Dekker Inc, pp.331. 31. Kongkiat Trisuwan, Vatcharin Rukachaisirikul, Yaowapa Sukpondma, Sita Preedanon, Souwalak Phongpaichit, Nattawut Rungjindamai, Jariya Sakayaroj (2008), “Epoxydons and a Pyrone from the Marine-Derived Fungus Nigrospora sp. PSU- F”, Journal of Natural products, 71(8), pp.1323-1326. 32. Kyoko Adachi, Kaneo Kanoh, Puntip Wisespongp, Miyuki Nishijima, Yoshikazu Shizuri (2005), “Clonostachysins A and B, New Anti-dinoflagellate Cyclic Peptides from a Marine-derived Fungus”, The Journal of Antibiotics, 58, pp.145- 150. 33. Marie B. Coyle et al. (2005), Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing, American Society for Microbiology, pp.3-14. 34. Masahira Nakagawa, Arika Hirota, Heiichi Sakai (1982), “Terrecyclic acid A, A new antibiotic from Aspergillus terreus”, The Journal of Antibiotics, 35(7), pp.778- 782. 35. Micheal J. Carlite, Sarah C. Watkingson, Graham W. Gooday (2001), The fungi, Academic Press, pp.145-515. 36. N. S. Egorov (1985), Antibiotics - A scientific approach, MIR, pp.76-340. 37. P. C. Trivedi (2009), Microbes applications and effects, Aavishkar Publishers Distributors, pp.65-77. 38. Petur W. Dalsgaard, Thomas O. Larsen, Carsten Christophersen (2005), “Bioactive Cyclic Peptides from the Psychrotolerant Fungus Penicillium algidum”, The Journal of Antibiotics, 58(2), pp.141-144. 39. Quek Rop Fun (2007), A Study on Higher Marine Fungal Interaction, A Thesis Submitted For the Degree of Master of Science, National University of Singapore, pp.4-18. 40. R. Gayatri Nambiar, K. Raveendran (2009), “Manglicolous Marine Fungi of Kerala (South India)”, Botany Research International, 2(3), pp.206-210. 41. R. J. Howard, N.A.R. Gow (2007), Biology of the Fungal Cell, 2nd Edition, Springer- Verlag Berlin Heidelberg, pp.219-230. 42. Robert A. Samson, Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad (2004), Intruduction to food and airborne fungi, Centraalbureau voor Schimmelculture_Utrecht, pp.52-76. 43. S. Arunmozhi Balajee (2009), “Aspergillus terreus complex”, Medical Mycology, 47, pp.42-46. 44. Shu-Wei Yang, Tze-Ming Chan, Joseph Terracciano, David Loebenberg, Mahesh Patel, Min Chu (2005), “Structure Elucidation of Sch 725674 from Aspergillus sp.”, The Journal of Antibiotics, 58(8), pp.535-538. 45. Simone Rochfort, Joanne Ford, Simon Ovenden, Soo San Wan, Samantha George, Howard Wildman, R. Murray Tait, Barbara Meurer-Grimes, Susan Cox, Jonathan Coates, David Rhodes (2005), “A Novel Aspochalasin with HIV-1 Integrase Inhibitory Activity from Aspergillus flavipes”, The Journal of Antibiotics, 58(4), pp.279-283. 46. Soo-Jin Choo, Hae-Ryong Park, In-Ja Ryoo, Jong-Pyung Kim, Bong-Sik Yun, Chang- Jin Kim, Kazuo Shin-ya, Ick-Dong Yoo (2005), “Deoxyverrucosidin, a Novel GRP78/BiP Down-regulator, Produced by Penicillium sp.”, The Journal of Antibiotics, 58(3), pp.210-213. 47. Stuart Hogg (2005), Essential Microbiology, John Wiley & Sons Ltd, pp.59-63, 197- 209, 353-364. 48. Takashi Fukuda, Hiroshi Tomoda, Satoshi Ōmura (2005), “Citridones, New Potentiators of Antifungal Miconazole Activity Produced by Penicillium sp. FKI-1938”, The Journal of Antibiotics, 58(5), pp.315-321. 49. Timothy G. Schimmel, Allen D. Coffman, Sarah J. Parsons (1998), “Effect of Butyrolactone I on the Producing Fungus, Aspergillus terreus”, Applied And Environmental Microbiology 64(10), pp.3707-3712. 50. V. Venkateswara Sarma, K. D. Hyde, B. P. R. Vittal (2001), “Frequency of occurrence of mangrove fungi from the east coast of India”, Hydrobiologia, 455, pp.41-53. 51. W. Scott Champney (2008), New antibiotic targets, Humana Press, pp.11-12. 52. Weizhong Liu, Qianqun Gu, Weiming Zhu, Chengbin Cui, Guotao Fan (2005), “Dihydrotrichodimerol and Tetrahydrotrichodimerol, Two New Bisorbicillinoids, from a Marine-derived Penicillium terrestre”, The Journal of Antibiotics, 58(10), pp.621-624. Địa chỉ website 53. khang-sinh-do-MIC.vhtm 54. 55. 56. 57. gif 58. 59. 60. _nuc.gif 61. 62. 63. &lang=vi 64. PHỤ LỤC