Luận văn Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (musa x paradisiaca l.) trên thực nghiệm (chuyên ngành: Hóa sinh dược)

tformin liều 240 mg/kg 58,09±3,32 54,61±0,53 Lô 4 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 250 mg/kg 25,13±6,32 18,75±2,13 Lô 5 (Thử, n =10 Uống cắn toàn phần liều 500 mg/kg 35,25±7,99 29,19±12,96 Lô 6 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 1000 mg/kg 56,61±4,08 53,55±1,78 Lô 7 (Thử, n =10) Uống cắn toàn phần liều 2000 mg/kg 58,04±7,04 54,6±7,08 Nhận xét: Với các mức liều thử nghiệm khác nhau, mức hạ glucose máu của lô 6 uống cắn toàn phần liều 1000 mg/kg, % hạ glucose máu so với ngày 1 và lô chứng bệnh ổn định và tương đương với % hạ glucose máu của lô chứng dương và lô uống cắn toàn phần 2000 mg/kg. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo sử dụng liều 1000 mg/ kg thể trọng chuột nhắt trắng và chuột cống là 500 mg/kg theo quy đổi từ liều chuột nhắt sang liều chuột cống PHỤ LỤC IV SỰ TÍCH TỤ MÔ MỠ TRONG Ổ BỤNG CHUỘT ĐTĐ TYP 2 Chuột ĐTĐ typ 2 được gây bằng cách cho chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo kết hợp tiêm STZ liều thấp. Sau 15 ngày cho chuột uống cắn toàn phần liều 500 mg/kg. Kết quả sự tích tụ mô mỡ trong ổ bụng của các lô chuột thí nghiệm được thể hiện trong hình 4.1 Hình 4.1. Sự tích tụ mô mỡ trong ổ bụng của chuột đái tháo đường typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử (1: Chứng sinh lý; 2: Chứng bệnh; 3: Chứng dương; 4: Thử) Tiến hành cân trọng lượng chuột, sau đó tách các mô mỡ trong ổ bụng (mỡ bám trên các tạng trong ổ bụng) và cân tiếp. Tính tỷ lệ mô mỡ trên trọng lượng cơ thể, kết quả được thể hiện trong bảng 4.2. 1 4 2 3 Bảng 4.2. % khối lượng mô mỡ trong ổ bụng/trọng lượng cơ thể của 4 lô chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm Lô Mẫu thử Khối lượng mỡ bụng/ trọng lượng cơ thể (%) Lô 1 (Chứng sinh lý, n = 8 DM pha hỗn dịch thử 0,4±0,5** Lô 2 (Chứng bệnh, n = 8) DM pha hỗn dịch thử 1,6±0,7 Lô 3 (Chứng dương, n =8) Metformin (120 mg/kg) 0,8±0,3* Lô 4 (Thử, n =8) Hỗn dịch cắn toàn phần(500 mg/kg) 0,9±0,2* * : p < 0,01 và ** : p < 0,001 so với lô chứng bệnh Nhận xét: Sau 2 tháng ăn chế độ giàu lipid, tỷ lệ khối lượng mỡ bụng/trọng lượng cơ thể của chuột cống tăng 400 % so với lô chuột bình thường (p <0,001). Ở động vật ĐTĐ typ 2 bị béo phì khi sử dụng metformin và cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, tỷ lệ này giảm còn 50,0 và 56,25 % so với lô chứng bệnh (p < 0,01). PHỤ LỤC V QUY TRÌNH CHI TIẾT XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5.1. CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH 5.1.1. Định tính flavonoid Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy cho tới cắn khô. Hòa tan cắn vào 5ml cồn 90%, lọc, chia dịch vào 3 ống nghiệm: - Phản ứng Cyanidin: Thêm một ít bột Mg kim loại, thêm tiếp vài giọt HCl đặc, đun cách thủy. Thấy dịch chiết không chuyển sang màu đỏ. - Phản ứng với FeCl3 5%: Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Thấy dịch chiết chuyển sang màu xanh đen. - Tác dụng với kiềm: Thêm vài giọt NaOH 10%. Màu vàng của dung dịch đậm lên. Kết luận: Trong dịch ép không có flavonoid. 5.1.2. Định tính alcaloid Lấy 10 ml dịch ép cho vào bình lắng gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết tới pH = 10 bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết bằng chloroform (10ml x 3 lần). Gộp chung và rửa lớp dung môi hữu cơ với 10ml nước cất. Lắc lớp chloroform với dung dịch HCl 5% (2ml x 3 lần). Chia dung dịch làm 3 ống nghiệm nhỏ: - Ống nghiệm 1: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa bông trắng. - Ống nghiệm 2: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện tủa màu cam. - Ống nghiệm 3: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa đỏ nâu. Kết luận: Trong dịch ép không có alcaloid. 5.1.3. Định tính saponin Lấy khoảng 5 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy cho tới cắn khô. Hòa cắn với 5ml cồn 25%, lọc vào ống nghiệm, pha loãng với 5ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc 15 giây. Thấy cột bọt không bền. Kết luận: Trong dịch ép không có saponin 5.1.4. Định tính glycosid tim Lấy khoảng 20 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy cho tới cắn khô. Hòa tan cắn vào 5ml cồn 900, lọc, chia dịch vào 3 ống nghiệm, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn để tiến hành các phản ứng sau: - Phản ứng Liebermann- Burchard: Hòa tan cắn trong ống nghiệm thứ nhất bằng 0,5ml anhydric acetic. Đặt ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ 0,5ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp. Quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ. - Phản ứng Legal:Cắn trong ống nghiệm thứ 2 đem hòa tan bằng 0,5ml EtOH 90%. Thêm 5 giọt nitroprussiat 1% và 5 giọt NaOH 10%. Không thấy xuất hiện màu hồng trong ống nghiệm. - Phản ứng Baljet:Cắn trong ống nghiệm thứ 3 được hòa tan bằng 0,5ml EtOH 90%, thêm thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). Không thấy xuất hiện màu vàng cam. Kết luận:Trong dịch ép không có glycosid tim. 5.1.5. Định tính coumarin Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu vào chén sứ. Đun cách thủy cho tới cắn khô. Hòa tan cắn vào 5ml cồn 90%, lọc. Dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau: - Phản ứng mở đóng vòng lacton:Cho dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. + Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH + Ống 2: để nguyên. Đun cả 2 ống trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy: + Ống 1 có tủa vẩn đục. + Ống 2 vẫn trong. Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát: + Ống 1 vẫn có tủa vẩn đục + Ống 2 vẫn trong. - Phản ứng Diazo: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử diazo, không thấy xuất hiện tủa đỏ gạch. Kết luận: Trong dịch ép không có coumarin. 5.1.6. Định tính tanin - Ống 1: Lấy khoảng 1ml dịch ép cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%. Quan sát thấy xuất hiện màu xanh đen. - Ống 2: Lấy khoảng 1ml dịch ép cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch chì acetat 10%. Quan sát thấy xuất hiện tủa trắng. - Ống 3: Lấy khoảng 1ml dịch ép cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 5 giọt dung dịch gelatin 2%. thấy xuất hiện tủa trắng mờ. Kết luận: Trong dịch ép có tannin và hợp chất polyphenol. 5.1.7. Định tính anthranoid Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu. Thêm 1ml dung dịch H2SO4 20%, đun sôi trên bếp cách thủy 10 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc, cho vào bình lắng gạn 50ml. Thêm 5 ml ether ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether ethylic. Cho 1 ml dịch chiết ether ethylic vào ống nghiệm sạch thêm 10 ml NaOH 10%. Không thấy xuất hiện màu hồng. Kết luận: Trong dịch ép không có anthranoid. 5.1.8. Định tính sterol Lấy khoảng 10 ml dịch ép thân cây chuối tiêu. Thêm 1ml dung dịch H2SO4 20%, đun sôi trên bếp cách thủy 10 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc, cho vào bình lắng gạn 50 ml. Thêm 5ml ether ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether ethylic cho vào chén sứ. Bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn bằng 0,5 ml anhydric acetic rồi thêm vào 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm khô. Đặt ống nghiệm nghiêng 45° rồi thêm từ từ 0,5 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tròn tím đỏ. Kết luận: Trong dịch ép có sterol. 5.1.9. Định tính đường khử Cho 1 ml dịch ép vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy trong 5 phút. Quan sát thấy trong ống xuất hiện tủa đỏ gạch. Kết luận: Trong dịch ép có đường khử. 5.1.10. Định tính acid hữu cơ Cho 2 ml dịch ép vào ống nghiệm và cho thêm một ít tinh thể Na2CO3, thấy bọt khí nổi lên Kết luận: Trong dịch ép có acid hữu cơ. 5.1.11. Định tính acid amin Cho 2 ml dịch ép vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy trong 10 phút. Không thấy xuất hiện màu xanh tím. Kết luận: Trong dịch ép không có acid amin. 5.1.12. Định tính polysaccharid - Ống 1: 4ml dịch ép và 5 giọt thuốc thử Lugol - Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol Hiện tượng: ống 1 không có màu đỏ đậm hơn ống 2 Kết luận: Trong dịch ép không có polysaccharid. 5.1.13. Định tính chất béo Nhỏ vài giọt dịch ép thân cây chuối tiêu lên giấy lọc, hơ khô, không có vết mờ trên giấy Kết luận: Trong dịch ép không có chất béo 5.1.14. Định tính Caroten Cho vào ống nghiệm 4ml dịch ép, cô tới cắn, nhỏ vài giọt acid H2SO4, không thấy xuất hiện màu xanh ve. Kết luận: Trong dịch ép không có caroten 5.2. PHÂN LẬP HỢP CHẤT 5.2.1. Phân lập hợp chất trong phân đoạn ethylacetat 5.2.1.1. Phân tách các hợp chất - Lấy 3,5 g cắn phân đoạn ethyl acetat (E) hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó tẩm với silicagel pha thường. Khối silicagel ẩm này được cất quay thu hồi dung môi tới thể chất tơi mịn. - Chuẩn bị cột: Cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên. Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn lên giá. Cho silicagel pha thuận lên cột. Gõ nhẹ vào thành cột cho tới khi không còn bọt khí, mặt thóang chất hấp phụ phẳng và không tụt thêm nữa. Ổn định cột trong vòng 6 giờ. Sau đó đưa lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều. - Cột sắc ký được khai triển bằng hệ dung môi n-hexan dichlomethan với gradient tăng dần từ 0-100%. Sau đó tiếp tục khai triển bằng hệ dung môi dichlomethan-aceton với gradient tăng dần từ 0-100% thu được 12 phân đoạn ký hiệu từ FE1 đến FE12. Quá trình phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat của dịch ép thân cây chuối tiêu được thể hiện tóm tắt ở hình 5.1 Hình 5.1. Sơ đồ phân lập phân đoạn Ethyl acetat Ghi chú: A (aceton); D (dichlomethan); H (n-hexan); M (methanol); E (ethyl acetat) FFE6. 2 60mg FFE6. 1 100mg Sephadex D/M (2/8) Silicagel H/E (0-20%) FE6.2.2 50mg FFE6 B 30mg Silica gel H/D (0-50%) FFE1. B 30mg FFE1. 2 20mg FFE1. 3 400mg FFE1 C 10mg Silicagel H/D (0-30%) Sephadex D/M (2/8) FFE12.1 150mg FFE12 A 15mg FE10.1 50mg FFE10 A 28mg Sephadex D/M (2/8) Silicagel H/D và D/A (0-100%) Cắn Ethyl acetat 3,5g FE1 0,7g FFE 20,2 g FFE 30,1 g FFE4 0,09g FFE 50,5 g FFE 6 0,2g FFE 70,3 g FFE 80,4 g FFE 90,3 g FFE 100,1 g FFE1 1 0,1g FFE 120,2 g - Các phân đoạn này được tiếp tục tinh chế qua các cột silicagel pha thường và sephadex LH-20. + Phân đoạn FE1 (0,7 g) được phân lập bằng sắc ký cột silicagel pha thường, khai triển bằng hệ dung môi n-hexan-dichlomethan với gradient tăng dần từ 0-50% thu được 3 phân đoạn: FE1.B (30 mg), FE1.2 (20 mg) và FE1.3 (400 mg). + Phân đoạn FE1.2 được tinh chế qua cột silicagel, khai triển với hệ dung môi n-hexan- dichlomethan với gradient tăng dần từ 0-30% thu được hợp chất FE1C (10 mg) là chất dầu màu trắng. + Phân đoạn FE6 (0,2 g) được tiến hành phân lập tiếp bằng sắc ký cột sephadex LH20, khai triển với hệ dung môi dichlomethan-methanol (2:8) thu được 2 phân đoạn FE6.1 (100 mg) và FE6.2 (60 mg). Phân đoạn FE6.1 được tinh chế qua cột silicagel hệ dung môi n-hexan- ethyl acetat với gradient tăng dần từ 0-20% thu được hợp chất FE6B (30 mg) là chất rắn màu trắng. + Phân đoạn FE10 (0,1 g) tinh chế qua cột sephadex LH20 khai triển với hệ dung môi dichlomethan-methanol (2:8) thu được hợp chất FE10A (28 mg) là chất rắn màu trắng. + Phân đoạn FE12 cũng được tinh chế qua cột sephadex LH20 khai triển với hệ dung môi dichlomethan-methanol (2:8) thu được hợp chất FE12A (15mg) là chất rắn màu trắng. 5.2.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được - Kiểm tra chất FE1C Bằng sắc kí lớp mỏng, kiểm tra chất FE1Cvới 2 hệ dung môi khác nhau là hệ I: n-hexan-ethyl acetat (95:5) và hệ II: n-hexan-dichlomethan (8:2). Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất FE1C được thể hiện trong hình 5.2 Hình 5.2. Sắc ký lớp mỏng của hợp chất FE1C trong các hệ dung môi khác nhau Nhận xét: Kết quả cho thấy, với hai hệ dung môi khác nhau, chất FE1C không quan sát được ở ánh sáng thường, cũng như UV254, chỉ cho 1 vết trên sắc kí đồ sau khi đã hiện màu bằng thuốc thử cerium-molybdat. Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất FE1C là tinh khiết. - Kiểm tra chất FE6B Bằng sắc kí lớp mỏng, kiểm tra chất FE6B với 3 hệ dung môi khác nhau: Hệ I: n-hexan- aceton (95:5), hệ II: n-hexan-ethyl acetat (8:2) và hệ III n-Hexan- CH2Cl2(2:8). Kết quả được thể hiện trong hình 5.3. n-Hexan:Aceton (95:5) n-Hexan:EtOAc (8:2) n-Hexan: CH2Cl2(2:8) Hình 5.3. Sắc ký lớp mỏng của hợp chất FE6B trong các hệ dung môi khác nhau n-Hexan:EtOAc (95:5) n-Hexan:CH2Cl2 (8:2) Nhận xét: Kết quả cho thấy với 3 hệ dung môi khai triển khác nhau, chất FE6Bkhông quan sát được ở ánh sáng thường cũng như UV254, chỉ cho 1 vết trên sắc kí đồ sau khi đã hiện màu bằng thuốc thử cerium-molybdat. Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất FE6B là tinh khiết. -Kiểm tra chất FE10A Bằng sắc kí lớp mỏng, kiểm tra chất FE10A với 3 hệ dung môi khác nhau: Hệ I: Dichlomethan- methanol (9: 1) và hệ II: Dichlomethan- ethyl acetat (1:1) và hệ III CH2Cl2: Aceton (8:2). Kết quả được thể hiện trong hình 5.4 CH2Cl2:MeOH (9:1) CH2Cl2: EtOAc (1:1) CH2Cl2:Aceton (8:2) Hình 5.4. Sắc ký lớp mỏng của hợp chất FE10A trong các hệ dung môi khác nhau Nhận xét: Kết quả cho thấy với 3 hệ dung môi khai triển khác nhau, chất FE10A không quan sát được ở ánh sáng thường, hiện màu nâu ở UV254, chỉ cho 1 vết trên sắc kí đồ sau khi đã hiện màu bằng thuốc thử cerium-molybdat. Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất FE10A là tinh khiết. - Kiểm tra chất FE12A Bằng sắc kí lớp mỏng, kiểm tra chất FE12A với 2 hệ dung môi khác nhau:hệ I: Dichlomethan-methanol (9:1) và hệ II: Dichlomethan-aceton (8:2). Kết quả được thể hiện trong hình 5.5. CH2Cl2:MeOH (9:1) CH2Cl2:Aceton (6:4) Hình 5.5. Sắc ký lớp mỏng của hợp chất FE12A trong các hệ dung môi khác nhau Nhận xét: Kết quả cho thấy với 2 hệ dung môi khai triển khác nhau, chất FE12A không quan sát được ở ánh sáng thường, cũng như UV254, chỉ cho 1 vết trên sắc kí đồ sau khi đã hiện màu bằng thuốc thử cerium-molybdat. Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất FE12A là tinh khiết. 5.2.1.3. Nhận dạng hợp chất được phân lập - Nhận dạng hợp chất FE1C Hợp chất thu được dưới dạng chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy (mp) = 84 - 86°C. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), δ (ppm): 4,72(1H, br), 4,66 (1H, br), 2,39-2,43 (2H, m), 2,20-2,25 (2H, m), 2,03-2,13 (2H, m), 1,85-1,94 (3H, m), 1,55-1,72 (7H, m), 1,09-1,46 (10H, m),1,04(3H, d, J= 7,0 Hz), 1,02(3H, d, J=7,0 Hz), 1,00(3H, s), 0,98(3H, d, J= 6,5 Hz), 0,91(3H, s), 0,90(3H, d, J= 7,0 Hz), 0,62(1H, d, J=3.5 Hz),0,39(1H, d, J=3,5 Hz) . Phổ13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ(ppm):213,3; 156,8; 105,9; 52,2; 50,0; 48,8; 47,0; 46,0; 45,4; 40,9; 36,1; 35,4; 35,0; 33,8; 32,8; 32,8; 31,3; 29,3; 28,1; 27,2; 26,9; 25,9; 25,2; 24,9; 22,0; 21,8; 19,1; 18,3; 17,9; 10,7. Phổ 1H- NMR xuất hiện tín hiệu của hợp chất triterpen khung cycloartan với 6 nhóm methyl ở các vị trí δH1,04; 1,02; 1,00; 0,99; 0,91 và 0,91 ppm, 1 nối đôi CH2= C với hai tín hiệu ở vị trí 4,72(1H, br) và 4,66 (1H, br) và 2 proton ở trường cao tại 0,62(1H, d, J=3,5 Hz); 0,39(1H, d, J=3,5 Hz) gợi ý sự xuất hiện của vòng cyclopropan trong phân tử. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện của 30 tín hiệu (có 6 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 7 nhóm CH và 5 carbon bậc 4) trong đó tín hiệu của nhóm keton ở vị trí δC 213,3 ppm, tín hiệu của nhóm CH2=C ở vị trí δC156,8 và 105,6 ppm và tín hiệu của 6 nhóm methyl ở vị trí δC 22,0; 21,8; 19,1; 18,3; 17,9 và 10,7 ppm. Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M + H] là 425.1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FE1Clà 424, tương ứng với công thức phân tử là C30H48O. - Nhận dạng hợp chất FE6B Hợp chất FE6B thu được dưới dạng chất màu trắng, nhiệt độ nóng chảy (mp) = 53-55°C. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3+ CD3OD), δ (ppm):2,35 (2H, t, J = 7,5Hz), 1,63 (2H, quin, J = 7,5 Hz), 1,40-1,20 (20H), 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz). Phổ13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ(ppm):180,4; 34,1; 31,9; 29,7; 29,6; 29,6; 29,6; 29,4; 29,3; 29,2; 29,0; 24,6, 22,7;14,1Phổ 1H-NMR cho thấy sự xuất hiện của các proton ở vùng trường cao 2,35 (2H, t, J = 7,5Hz), 1,63 (2H, quin, J = 7,5 Hz ), 1,40-1,20 ppm (22H) và tín hiệu nhóm methyl ở vị trí 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz ) gợi ý sự xuất hiện của mạch C bão hòa, mạch thẳng. Trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT thấy xuất hiện tín hiệu của 1 carbon nhóm COOH ở vị trí 180,4 ppm, 1 tín hiệu của nhóm methyl ở vị trí 14,1 ppm, còn lại là các tín hiệu của nhóm methylene trong mạch thẳng từ 22,1 đến 34,7 ppm. Như vậy qua dữ liệu phổ gợi ý cho việc xác định đây là phổ của acid béo mạch no với 14carbon.Phổ ESI-MS có pic ion giả phân tử là m/z [M + H] là 229,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FE6B là 228, tương ứng với công thức phân tử C14H28O2 - Nhận dạng hợp chất FE10A Hợp chất thu được dưới dạng bột trắng. Nhiệt độ nóng chảy 210-212oC. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3+ CD3OD), δ (ppm):7,41 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, J =1,5 Hz), 6,76 (1H, d, J= 8,5 Hz). Phổ13C-NMR (125 MHz,CDCl3+ CD3OD), δ(ppm):169,4; 149,6; 144,0; 123,2; 121,6; 116,4; 114,5. Trên phổ NMR thấy xuất hiện 3 proton ở trường thấp, của vòng thơm hệ ABX với hai cặp khá trùng nhau ở vị trí 7.41 với hằng số tương tác J = 8,5 Hz và J = 1,5 Hz, xuất hiện 1 cặp khác ở vị trí 6,76 ppm với với hằng số tương tác J = 8,5 Hz. Phổ 13C-NMR thấy xuất hiện 6 pic của vòng phenyl và một pic của nhóm carboxylic acid. Từ dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR cho phép ta xác định đây là dẫn chất benzoic acid có 2 nhóm thế ở vị trí 3,4. Phổ ESI-MS có pic ion giả phân tử là m/z [M -H]+ là 153,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FE10A là 154, tương ứng với công thức phân tử C7H6O4 - Nhận dạng hợp chất FE12A Hợp chất FB12A thu được dưới dạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy (mp) = 275-277°C. Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 5,34 (1H, br), 4,80 (3H, br, OH), 4,42 (1H, br, OH), 4,21 (1H, d,J = 8 Hz), 3,63 (1H, d,J = 12 Hz), 3,44 (1H, m), 3,40 (1H, m, overlapped), 3,12 (1H, d,J = 8.5 Hz), 3,01-3,08 (2H, m), 2,89 (1H, t, J = 8 Hz), 2,36 (1H, dd,J = 10 Hz), 2,12 (1H, m), 1,89-1,96 (2H, m), 1,75-1,85 (3H, m), 0,90-1,64 (20H, m),0,95 (3H, s), 0,91(3H, d, J = 6,5Hz), 0,82 (3H, t, J = 7,0 Hz), 0,81 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz),0,64 (3H, s). Phổ13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6), δ (ppm):140,6; 121,1; 100,8; 76,9; 76,7; 76,7; 73,4; 70,1; 61,1; 56,1; 55,4; 49,6; 45,1; 41,8; 39,2; 38,3; 36,8; 36,2; 35,4; 33,3; 31,4; 31,3; 29,2; 28,7; 27,7; 25,4; 23,8; 22,6; 20,5; 19,6; 19,0; 18,9; 18,6; 11,7; 11,6. Trên phổ 1H-NMR của FB12A xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho hợp chất sterol glycoside, trong đó phần hợp chất sterol có tín hiệu proton ở vị trí 5,34 (1H, br), ứng với một nối đôi, có một nhóm hydroxyl với tín hiệu CH-OH ở vị trí δ 3,44 (1H, m) và 6 nhóm methyl tại δH0,95 (3H, s),0,91 (3H, d, J = 6,5Hz), 0,82 (3H, t, J = 7,0 Hz), 0,81 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,79 (3H, d, J = 7,0 Hz),0,64 (3H, s). Phần đường có tín hiệu anomeric proton ở vị trí δH 4,21 (1H, d,J = 8 Hz), các tín hiệu OH ở δH 4,80 (3H, br, OH), 4,42 (1H, br, OH), các tín hiệu nhóm CH2OH và CHOH xuất hiện ở vị trí δH3,63 (1H, d,J = 12 Hz), 3,40 (1H, m, overlapped), 3,12 (1H, d,J = 8.5 Hz), 3,01-3,08 (2H, m), 2,89 (1H, t, J = 8 Hz). Ngoài ra là các tín hiệu khác của vòng sterol. Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy FB12Acó 35 carbon (6 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 14 nhóm CH và 3 carbon bậc 4), trong đó tín hiệu của nối đôi xuất hiện ở vị trí δC140,6 và 121,1 ppm. Tín hiệu anomeric carbon xuất hiện ở δC100,8 ppm. Các tín hiệu của phần đường, và nhóm CH2OH, CHOH ở các vị trí δC 76,7; 76,7; 73,4; 70,1; 61,1 ppm. Tín hiệu 6 nhóm methyl xuất hiện ở δC19,6; 19,0; 18,9; 18,6; 11,7 và 11,6 ppm. Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M + H]+ là 577,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FB12A là 576, tương ứng với công thức phân tử là C35H60O6. 5.2.2. Phân lập hợp chất trong phân đoạn n-butanol 5.2.2.1. Phân tách các hợp chất Cắn phân đoạn n-butanol tổng (4,5g), được cho lên cột sephadex LH-20, khai triển với dung môi MeOH 100% thu được 4 phân đoạn: FB1 (1,5g), FB2 (2,3g), FB3 (0,5g), FB4 (0,2g) hình 5.6 Chạy cột silicagel DM Aceton/MeOH (100% Acton - > 9/1) Chạy cột sephadex Dung môi MeOH 100% Chạy cột silicagel, Dung môi nHx/CH2Cl2 (100% nHx ->1/1) Rửa MeOH FB2.1 (130mg) FB2B (5mg) Không có UV dạng dầu màu vàng FB2 (2,3g) FB3 (0,5g) Chất rắn FB2A (15mg) FB3 (130mg) Chất rắn vô định hình màu trắng, tan trong nước, không có UV, không hiện thuốc thử (có thể là muối amonium) FB2C(90mg) Hỗn hợp đường FB4 (0,2g) Chạy cột silicagel Dung môi aceton/MeOH (100% Acton ->9/1) FB2.1.2 (100mg) FB2.2 1,4g FB2. 30,5g Cắn butanol Khoảng 4,5g FB1 (1,5 g) Chất keo màu nâu Hình 5.6. Sơ đồ phân lập cắn phân đoạn n-butanol Các phân đoạn này được tinh chế tiếp để thu được chất sạch - Trong phân đoạn FB1 chủ yếu là chất keo màu nâu, triển khai trên sắc ký lớp mỏng các vệt không tách nhau trong các hệ dung môi nên không tinh chế tiếp. - Phân đoạn FB2 được tinh chế qua cột silicagel với hệ dung môi aceton/MeOH với gradient (0-10%) thu được 4 phân đoạn nhỏ FB2.1 (130mg) và FB2.2 (1,4g), FB2.3 (0,5g) và 1 chất sạch FB2A (15mg). Phân đoạn FB2.1 tiếp tục được tinh chế qua cột silicagel n-Hexan/CH2Cl2 gradient (0-50%) thu được chất sạch FB2B (5mg) là chất dầu màu vàng. Công thức của FB2B - Phân đoạn FB2.3 tinh chế qua cột silicagel với hệ dung môi Aceton/MeOH với gradient (0-10%) thu được hợp chất FB2C (90 mg) là chất keo màu trắng. Phân đoạn FB22 chủ yếu là FB2C và được xác định là hỗn hợp của đường. - Phân đoạn FB3 có nhiều chất rắn không tan trong MeOH, dùng dung môi MeOH rửa thu được hợp chất sạch FB3 (130 mg) là chất rắn vô định hình màu trắng, tan trong nước, không có UV, không hiện thuốc thử được dự đoán là muối vô cơ của ammoni. 5.2.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được - Kiểm tra sự tinh khiết của hợp chất FB2A Bằng sắc kí lớp mỏng, kiểm tra hợp chất FB2Avới 3 hệ dung môi khác nhau là hệ I: n-hexan- ethylacetat (8 : 2), hệ II: n-hexan-Aceton (8 : 2) và hệ III: n-hexan-Diclomethan (3:7). Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất FB2A được thể hiện trong hình 5.7 n-hexan-ethylacetate (8:2) n-hexan-Aceton (8:2) n-hexan-Diclomethan (3:7) Hình 5.7. Sắc ký lớp mỏng của hợp chất FB2A trong các hệ dung môi khác nhau Nhận xét: Kết quả cho thấy, với hệ dung môi I, II, III chất FE1C không quan sát được ở ánh sáng thường, cũng như UV254, chỉ cho 1 vết trên sắc kí đồ sau khi đã hiện màu bằng thuốc thử cerium-molybdat. Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất FB2A là tinh khiết. - Kiểm tra chất FB2B Bằng sắc kí lớp mỏng, kiểm tra chất FB2B với 3 hệ dung môi khác nhau: Hệ I: n-hexan-ethylacetate (9:1); hệ II: n-hexan-aceton (9:1) và hệ III n-hexan- diclomethan (4:6). Kết quả được thể hiện trong hình 5.8 n-hexan-ethyl acetate (9:1) n-hexan-Aceton (9:1) n-hexan-Diclomethan (4:6) Hình 5.8. Sắc ký lớp mỏng của hợp chất FB2B trong các hệ dung môi khác nhau Nhận xét: Kết quả cho thấy với 3 hệ dung môi khai triển khác nhau, chất FB2B không quan sát được ở ánh sáng thường cũng như UV254, chỉ cho 1 vết trên sắc kí đồ sau khi đã hiện màu bằng thuốc thử cerium-molybdate. Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất FB2B là tinh khiết. 2.2.3. Nhận dạng các hợp chất phân lập được - Nhận dạng hợp chất FB2A Hợp chất FB2A thu được dưới dạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy (mp) = 136-137°C. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,34 (1H, br d, J = 4,5 Hz), 3,52 (1H, m), 2,20-2,31 (2H, m), 1,95-2,02 (2H, m), 1,83-1,86 (3H, m), 1,47- 1,70 (9H, m), 1,20-1,38 (6H, m), 0,90-1,20 (8H, m), 1.01 (3H, s), 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz), 0, 84 (3H, t, J = 7,5Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,80 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,68 (3H, s). Phổ13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ(ppm):140,7; 121,7; 71,8; 56,7; 56,0; 50,1; 45,8; 42,3; 42,3; 39,8; 37,2; 36,5; 36,1; 33,9; 31,9; 31,9; 31,6; 29,1; 28,2; 26,1; 24,3; 23,1; 21,1; 19,8; 19,4; 19,0; 18,7; 11,9; 11,8. Trên phổ 1H-NMR của MP-2 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho hợp chất sterol có một nối đôi với tín hiệu proton ở vị trí δH5,34 (br d, J = 5 Hz), có một nhóm hydroxyl với tín hiệu CH-OH ở vị trí δH 3,52 (1H, m) và 6 nhóm methyl trong đó có 2 singlet tại δH 0,68 (3H, s) và 1,01 (3H, s), 3 tín hiệu cặp tại δ 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J= 7,3 Hz), 0,80 (3H, d, J= 6,8 Hz), và một tín hiệu bậc 3 tại δ 0,84 (3H, t, J= 7,5 Hz). Ngoài ra là các tín hiệu khác của vòng sterol. Phổ 13C-NMR và DEPT cho FB2A có 29 carbon, trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 9 nhóm CH và 3 carbon bậc 4. Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M+H]+ là 415,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FB2A là 414, tương ứng với công thức phân tử là C29H50O - Xác định cấu trúc hợp chất FB2B - Hợp chất FB2B thu được dưới dạng chất dầu màu vàng Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm):3,98 (4H, dd, J= 3,5 Hz; 6,0 Hz), 2,33 (4H, td, J= 7,0 Hz, J= 1,0 Hz), 1,66 (4H, td, J= 7,0 Hz, J= 1,0 Hz), 1,56 (4H, m), 1,24-1,36 (12H, m),0,88 (t, 6H), 0,87 (t, 6H). Phổ13C-NMR (125 MHz CDCl3), δ (ppm): 173,5; 66,8; 38,7; 34,0; 30,4; 28,9; 24,5; 23,8; 23,8; 22,9; 14,0; 10,9. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR của FB2B cho thấy đây là một ester mạch hydrocacbon no với tín hiệu của nhóm ethyl -CH2O ở vị trí 3,98 là 1 cặp với hằng số J = 3,5 Hz và 6,0 Hz gợi ý cho việc liên kết với nhóm CH mạch nhánh. Ngoài ra còn xuất hiện các tín hiệu của hydro khác ở các vị trí 2,33, 1,66, 1,56, 1,34, 1,29 ppm và hai nhóm methyl ở vị trí 0,88 ppm, 0,87 ppm dưới dạng bậc 3 . Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất FB2B xuất hiện tín hiệu của 11 carbon (2 nhóm CH3, 7 nhóm CH2, 1 nhóm CH, 1 cacbon bậc 4), trong đó có carbon bậc 4 của nhóm carbonyl ester ở vị trí 173,5, nhóm CH2O xuất hiện ở vị trí 66,8, ngoài ra có 2 nhóm CH3 ở 14,0 và 10,9 ppm, và 1 nhóm CH ở vị trí 38,7 ppm. Phổ khối lượng (ESI-MS) có pic ion giả phân tử là m/z [M + H] là 371,1 cho biết khối lượng phân tử của hợp chất FB2B là 370, tương ứng với công thức phân tử là C22H42O4. 5.3. PHỔ CỦA HỢP CHẤT 5.3.1. Hợp chất FE1C 5.3.2. Hợp chất FE6B 5.3.3. Hợp chất FE10A 5.3.4. Hợp chất FE12A 5.3.5. Hợp chất FB2A 5.3.6. Hợp chất FB2B PHỤ LỤC VI ĐỘC TÍNH CỦA CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI 6.1. ĐỘC TÍNH CẤP 6.1.1. Chuẩn bị mẫu thử Mẫu thử được pha với nước cất thành dung dịch với các nồng độ thích hợp để cho động vật thí nghiệm uống theo các mức được thiết kế, sau đây gọi là chế phẩm thử cắn chuối tiêu . 6.1.2. Phương tiện nghiên cứu 6.1.2.1. Động vật nghiên cứu - Chuột nhắt trắng trưởng thành, giống cái, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. - Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệmBộ môn Dược lực, Trường ĐH Dược Hà Nội ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do. 6.1.2.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu - Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius). - Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống mẫu thử. 6.1.3. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thử độc tính cấp theo hướng dẫn của Bộ Y tế kết hợp với hướng dẫn của OECD. Thiết kế thí nghiệm - Chuột nhắt trắng được nhịn ăn 3 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. - Cách dùng: đưa mẫu thử theo đường uống. Lấy thể tích mẫu thử theo dự kiến đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù. - Thể tích mẫu thử dùng theo đường uống: 0,2mL/10 g chuột/lần. - Số lần cho động vật uống: 2 lần trong vòng 24 giờ, mỗi lần cách nhau ít nhất 2 giờ. - Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại. - Sau khi thăm dò trên một số chuột hạn chế (thử nghiệm thăm dò), động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 động vật (thử nghiệm chính thức). Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức. Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật. - Theo dõi động vật trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau lần uống chế phẩm thử cuối cùng). Theo dõi, đánh giá - Theo dõi động vật trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, ghi chép lại các thông số sau: + Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu... + Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống. + Số động vật chết:xác định tỷ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính toán LD50. + Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng. Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân. - Tiếp tục theo dõi động vật trong cho đến 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử. 6.1.4. Kết quả nghiên cứu Thử nghiệm thăm dò - Sử dụng 10 chuột nhắt trắng, giống cái, chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 2 động vật và cho uống chế phẩm thử cắn chuối tiêu với liều tăng dần, theo dõi liên tục 4 giờ và tiếp tục quan sát cho đến 14 ngày. - Kết quả: sau 4 giờ, cả 10 chuột đều không có biểu hiện bất thường; sau 72 giờ cả 10 chuột đều còn sống và không xuất hiện chuột chết trong vòng 14 ngày sau khi uống thuốc. - Kết thúc thử nghiệm thăm dò đã xác định được liều 20g (tính theo khối lượng cao)/kg chuột, tương đương0,4 ml/10 g chuột là mức liều cao nhất có thể cho uống được vẫn không gây chết chuột nhắt trắng thí nghiệm. Thử nghiệm chính thức Dựa trên kết quả của thử nghiệm thăm dò, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 20 chuột nhắt trắng, giống cái, chia thành 2 nhóm thử theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử được dùng mẫu thử ở các mức liều và số lần đưa mẫu thử như bảng 6.1. Bảng 6.1. Bố trí thí nghiệm cho thử độc tính cấp của mẫu thử Cắn chuối tiêu Nhóm chuột Liều dùng (g/kg) Thể tích dùng (mL mẫu thử/10g) Số lần cho uống Số chuột thí nghiệm Mức liều 1 10 0,2 mL mẫu thử 1 10 Mức liều 2 20 0,2 mL mẫu thử 2 10 - Kết quả + Sau khi uống thuốc 4 giờ: tất cả các chuột đều không có biểu hiện bất thường: ăn uống, vận động bình thường, phản xạ tốt với các kích thích, không khó thở, lông mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khô, nước tiểu bình thường, không bị tiêu chảy. + Trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, không xuất hiện chuột chết và 100% số chuột thử nghiệm đều còn sống sau 14 ngày thử nghiệm. + Vì không có chuột chết ở các lô thử nghiệm nên chưa xác định LD50 của cắn chuối tiêu . 6.1.5. Kết luận Mẫu thử cắn chuối tiêu khi dùng theo đường uống trên chuột nhắt trắng với liều 20 g/kg, là liều cao nhất có thể cho chuột uống được, không thấy thể hiện độc tính cấp trên chuột nhắt trắng. Liều thử độc tính cấp này của chế phẩm cắn chuối tiêu gấp khoảng 20 lần liều thể hiện tác dụng dược lý. 6.2. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN 6.2.1. Chuẩn bị mẫu thử - Mẫu thử được pha bằng nước cất thành dung dịch với các nồng độ thích hợp để cho động vật thí nghiệm uống theo các mức liều được thiết kế, sau đây gọi là chế phẩmcắn chuối tiêu. - Các mức liều thử: thử độc tính ở hai mức liều bao gồm liều tương đương liều có tác dụng dược lý và liều gấp 3 lần liều có tác dụng dược lý. Các mức liều thử đối với chế phẩm cắn chuối tiêucụ thể như sau: + Liều có tác dụng dược lý:liều 1.000 mg/kg có tác dụng hạ đường huyết trên thực nghiệm. + Liều tương đương liều có tác dụng dược lý : 1.000 mg/kg. + Liều gấp 3 lần liều có tác dụng dược lý:3.000 mg/kg. - Cách dùng:mẫu thử được dùng theo đường uống, bằng kim đầu tù với thể tích 0,1mL/10 g chuột nhắt trắng. Động vật được cho uống thuốc một lần hàng ngày. 6.1.2. Phương tiện nghiên cứu 6.1.2.1. Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắngtrưởng thành, khỏe mạnh, cả hai giống, cân nặng từ 20- 22g, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do.Động vật khác giống được chăm nuôi riêng. 6.1.2.2. Thiết bị , dụng cụ và hóa chất nghiên cứu - Máy sinh hóa TC 3300 plus (Teco Diagnostics). - Máy phân tích huyết học tự động dành cho động vật thí nghiệm Autohematology analyser URIT-3000 VET Plus. - Máy ly tâm HERMLE Z300. - Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU). - Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius). - Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và xét nghiệm: micropipet tự động, dụng cụ thủy tinh, bơm và kim tiêm các cỡ, mao quản, ống nghiệm các loại, dụng cụ cho động vật uống mẫu thử. - Bộ hóa chất phân tích huyết học (URIT). - Bộ hóa chất xét nghiệm các thông số sinh hóa máu: AST, ALT, cholesterol toàn phần, glucose, protein toàn phần, creatinin (Teco Diagnostics). 6.2.3. Phương pháp nghiên cứu Thử nghiệm độc tính bán trường diễn với liều nhắc lại 28 ngày trên chuột nhắt trắng cả hai giống đực và cái theo hướng dẫn thử độc tính liều lặp lại 28 ngày qua đường uống trên động vật gặm nhấm của OECD TG-407 [1], [2]. 6.2.3.1. Thiết kế thí nghiệm Chuột nhắt trắng mỗi giống (đực hoặc cái) được chia ngẫu nhiên thành 3 lô: + Lô chứng: uống nước với thể tích 0,1 ml/10g chuột. + Lô thử 1: uống chế phẩm cắn chuối tiêu với liều1000 mg/kg (thể tích uống 0,1mL/10g chuột). + Lô thử 2:uống chế phẩm cắn chuối tiêu với liều3000 mg/kg (thể tích uống 0,1mL/10g chuột). Động vật thí nghiệm được cho uống chế phẩm thử hoặc nước hàng ngày vào 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày. Nếu cần, sau đó cho động vật ngừng uống thuốc, nuôi thêm 2 tuần để theo dõi sự hồi phục của các cơ quan, chức phận sau thời gian ngừng dùng thuốc. Trong suốt quá trình thử nghiệm, theo dõi tình trạng chung của động vật, hàng tuần cân để theo dõi khối lượng cơ thể đồng thời điều chỉnh lượng thuốc uống. Tại thời điểm kết thúc (sau 28 ngày uống thuốc) và thời gian nuôi hồi phục (nếu cần), lấy máu từ xoang tĩnh mạch của từng động vật cho vào hai loại ống nghiệm riêng: ống có chứa chất chống đông để làm các xét nghiệm huyết học và ống không chứa chất chống đông, ly tâm lấy huyết thanh để làm các xét nghiệm hóa sinh. Mổ toàn bộ động vật để quan sát đại thể các cơ quan, lấy ngẫu nhiên 3 động vật trong mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận. Qui trình xác định độc tính bán trường diễn được mô tả ở hình 6.2. Hình 6.2. Qui trình xác định độc tính bán trường diễn 28 ngày 6.2.3.2. Thông số đánh giá - Tình trạng toàn thân: hàng ngày theo dõi các biểu hiện của của động vật thực nghiệm (tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch mũi, miệng, hô hấp, phân, nước tiểu), hoạt động tự nhiên, tư thế, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống. Hàng tuần cân động vật thực nghiệm để theo dõi sự thay đổi khối lượng cơ thể đồng thời điều chỉnh lượng thuốc uống. - Các thông số huyết học: số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu. - Các thông số hóa sinh: hoạt độ transaminase huyết thanh (AST, ALT), glucose, cholesterol toàn phần, protein toàn phần và creatinin huyết thanh. - Đại thể cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, lách. Cân ngay khối lượng các cơ quan và tính tỷ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể. - Mô bệnh học: sau khi giết động vật thực nghiệm, các mẫu gan và thận được cố định bằng dung dịch Carnoy, vùi trong parafin, cắt các lát mỏng 5 – 7 µm, nhuộm hematoxylin – eosin và quan sát dưới kính hiển vi quang học để đánh giá cấu trúc hình thái vi thể gan, thận. Tiêu bản được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả được đánh giá bởi PGS. TS. Lê Trung Thọ, Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội. uống nước/chế phẩm thử hàng ngày Thích nghi ngừng uống thuốc 0 Theo dõi hàng ngày cân hàng tuần 28 Cân, lấy máu xét nghiệm, tim, gan, thận, lách 42 Ngày -5 Cân, lấy máu xét nghiệm, tim, gan, thận, lách 6.2.4. Kết quả nghiên cứu 6.2.4.1. Ảnh hưởng của chế phẩm cắn chuối tiêu đến tình trạng toàn thân của chuột nhắt trắng - Ảnh hưởng của chế phẩm cắn chuối tiêu đến tình trạng toàn thân của chuột nhắt trắng Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống, hoạt động bình thường, phản xạ nhanh, mắt sáng, không tiết chất nhày mũi, miệng, lông mượt, phân khô, nước tiểu không có biểu hiện bất thường. - Ảnh hưởng của chế phẩm cắn chuối tiêu đến tăng trưởng khối lượng cơ thể của chuột nhắt trắng Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống, hoạt độngbình thường, phản xạ nhanh, mắt sáng, không tiết chất nhày mũi, miệng, lông mượt, phân khô, nước tiểu không có biểu hiện bất thường. Chuột nhắt trắng được theo dõi cân nặng hàng tuần trong suốt quá trình thực nghiệm.Kết quả được thể hiện ở hình 6.3 và 6.4. Hình 6.3. Khối lượng cơ thể chuột nhắt đực dùng chế phẩm cắn chuối tiêu trong quá trình nghiên cứu Hình 6.4. Khối lượng cơ thể chuột nhắt cái dùng chế phẩm cắn chuối tiêu trong quá trình nghiên cứu Nhận xét: Trong suốt 28 ngày nghiên cứu, cân nặng chuột nhắt ở cả 2 giống đều tăng lên ở cả lô chứng và lô thử. Không có sự khác biệt về sự tăng trưởng khối lượng cơ thể giữa các lô chứng với các lô thử tại tất cả các thời điểm nghiên cứu. 6.2.4.2. Ảnh hưởng của chế phẩm Cắn chuối tiêu đến các thông số huyết học của chuột nhắt trắng Ảnh hưởng của chế phẩm cắn chuối tiêutrên chức năng tạo máu của chuột nhắt trắng được thể hiện qua các thông số: số lượng bạch cầu (WBC), số lượng hồng cầu (RBC), nồng độ hemoglobin (HGB), tỷ lệ hematocrit (HCT), thể tích trung bình hồng cầu (MCV) và số lượng tiểu cầu (PLT). Kết quả được trình bày ở bảng 6.2. Bảng 6.2. Các thông số huyết học của chuột nhắt trắng dùng cắn chuối tiêu liều lặp lại 28 ngày Giống Liều dùng (mg/kg) n WBC (109/L) RBC (1012/L) HGB (g/dL) HCT (%) MCV (fL) PLT (109/L) Đực Chứng 8 9,2±0,4 6,8±0,2 12,7±0,4 27,7±1,0 40,8±0,6 401,4±63,2 1000 8 11,3±0,8 6,9±0,2 11,7±0,4 28,9±1,0 41,9±0,4 505,0±27,5 3000 8 8,6±1,1 6,4±0,5 11,8±0,6 26,2±2,8 40,4±1,8 444,1±53,8 Cái Chứng 8 7,1±0,5 6,9±0,2 12,7±0,3 26,7±0,9 39,8±0,2 476,9±57,4 1000 8 8,9±0,9 6,7±0,2 12,7±0,3 26,7±1,3 39,7±1,0 556,9±94,5 3000 8 8,0±0,8 6,9±0,3 11,8±0,6 28,4±1,9 41,3±0,8 433,6±79,1 (Số liệu biểu diễn dưới dạng M±SD) Nhận xét: Tại thời điểm sau uống thuốc 28 ngày, không có sự khác biệt về thông số huyết học giữa các lô dùng chế phẩm thử cắn chuối tiêu so với lô chứng (p >0,05). 6.2.4.3. Ảnh hưởng của chế phẩm Cắn chuối tiêu đến các thông số sinh hóa của chuột nhắt trắng Ảnh hưởng của chế phẩm cắn chuối tiêu lên các thông số sinh hóa của chuột được thể hiện qua các thông số AST, ALT, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin, glucose và albumin huyết thanh. Kết quả được trình bày ở bảng 6.3. Bảng 6.3. Các thông số hóa sinh của chuột nhắt trắng dùng Cắn chuối tiêu liều lặp lại 28 ngày Giống Liều dùng (mg/kg) n AST (U/L) ALT (U/L) Creatinin (µmol/L) Protein (g/L) Cholesterol (mmol/L) Glucose (mmol/L) Đực Chứng 8 145,27±10,37 55,21±3,26 57,78±3,60 93,75±2,41 2,64 ±0,09 6,94±0,29 1000 8 152,25±17,46 55,50±5,37 55,84±4,42 88,95±2,97 2,55±0,12 6,28±0,28 3000 8 105,25±17,08 55,98±6,86 55,85±7,58 85,95±2,76 2,29±0,18 5,93±0,28* Cái Chứng 8 104,59±10,89 45,33± 4,35 67,26±5,12 98,78±1,75 2,11±0,08 6,56±0,36 1000 8 110,68±8,78 57,19±4,88 56,43±8,27 96,10±2,12 2,40±0,14 6,83±0,76 3000 8 126,63±12,67 47,19±3,36 67,44±5,14 90,99±3,39 2,04±0,25 6,18±0,35 (Số liệu biểu diễn dưới dạng M±SD, *, p <0,05 khi so với lô chứng cùng giống) Nhận xét: Nhìn chung, tại thời điểm sau uống thuốc 28 ngày, các thông số AST, ALT, creatinin, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, glucose, huyết thanh không có sự khác biệt giữa các lô uống chế phẩm cắn chuối tiêu so với lô chứng (p>0,05). Riêng lô đực uống cắn chuối tiêu liều cao 3000 mg/kg liên tục 28 ngày, nồng độ glucose giảm so với lô chứng (p>0,05). 6.2.4.4. Thay đổi về mô bệnh học trên chuột nhắt trắng Để đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm thử đến các cơ quan tại thời điểm sau khi uống thuốc 28 ngày, toàn bộ động vật thực nghiệm được mổ để quan sát đại thể các cơ quan. Lấy ngẫu nhiên 3 chuột ở từng lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận. Về đại thể Ảnh hưởng của chế phẩm Cắn chuối tiêu lên sự thay đổi tỷ lệ khối lượng các cơ quan so với khối lượng cơ thể được trình bày ở bảng 6.4. Bảng 6.4. Tỷ lệ khối lượng các cơ quan so với khối lượng cơ thể của chuột nhắt trắng dùng cắn chuối tiêu liều lặp lại 28 ngày Giống Liều dùng (mg/kg) n Tỷ lệ khối lượng cơ quan so với khối lượng cơ thể (%) Tim Gan Lách Phổi Thận Đực Chứng 8 0,62±0,05 5,85±0,20 0,57±0,04 0,58±0,05 1,24±0,03 1000 8 0,61±0,04 5,68±0,24 0,65±0,03 0,65± 0,02 1,19±0,05 3000 8 0,55±0,04 5,15±0,28 0,54±0,03 0,58±0,06 1,14±0,08 Cái Chứng 8 0,54 ±0,03 5,11±0,11 0,58±0,04 0,71±0,04 1,05±0,05 1000 8 0,60±0,04 5,02±0,26 0,52±0,04 0,75±0,05 1,11±0,05 3000 8 0,58±0,03 5,32±0,32 0,62±0,07 0,73±0,06 1,06±0,06 (Số liệu biểu diễn dưới dạng M±SD) Nhận xét: Tại thời điểm sau khi dùng liều lặp lại 28 ngày, tỷ lệ khối lượng các cơ quan tim, gan, thận, phổi, lách, thượng thận/khối lượng cơ thể của các động vật ở các lô dùng chế phẩm thử và lô chứng nhìn chung không có sự khác biệt Về vi thể Tiêu bản vi thể gan, thận được thực hiện và đánh giá tại Bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường ĐH Y Hà Nội. Kết quả cho thấy, sau 28 ngày dùng thuốc liên tục, cấu trúc vi thể gan và thận chuột ở các lô dùng chế phẩm thử nhìn chung đều không khác biệt nhiều so với lô chứng tương ứng. Hình ảnh cấu trúc vi thể gan và thận của đại diện các lô được thể hiện trong các hình 6.5; 6.6; 6.7 và 6.8. Lô chứng (Đực) Cấu trúc gan không bị xóa, nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa, các bè gan xắp xếp hướng xuyên tâm. Các tế bào gan có hình thái trong giới hạn bình thường, không có nhân lớn bất thường, không hoại tử. Một số ít (khoảng 1-2%) tế bào gan thoái hóa nhẹ (thoái hóa nước, thoái hóa hạt). Trong mô gan không thấy xâm nhập tế bào viêm. Khoảng cửa không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Kết luận: Mô gan không thấy tổn thương Lô thử (Đực) 1.000 mg/kg Cấu trúc gan không bị xóa, nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa, các bè gan xắp xếp hướng xuyên tâm. Các tế bào gan có hình thái trong giới hạn bình thường, không có nhân lớn bất thường, không hoại tử. Một số ít (khoảng 1-2%) tế bào gan thoái hóa nhẹ (thoái hóa nước, thoái hóa hạt). Trong mô gan không thấy xâm nhập tế bào viêm. Khoảng cửa không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Kết luận: Mô gan không thấy tổn thương Lô thử (Đực) 3.000 mg/kg Cấu trúc gan không bị xóa, nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa, các bè gan xắp xếp hướng xuyên tâm. Các tế bào gan có hình thái trong giới hạn bình thường, không có nhân lớn bất thường, không hoại tử. Một số ít (khoảng 1-2%) tế bào gan thoái hóa nhẹ (thoái hóa nước, thoái hóa hạt). Trong mô gan không thấy xâm nhập tế bào viêm. Khoảng cửa không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Kết luận: Mô gan không thấy tổn thương. Hình 6.5. Hình ảnh và mô tả trên các mảnh cắt từ mô gan chuột nhắt đực Lô chứng (Cái) Gan: Cấu trúc gan không bị xóa, nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa, các bè gan xắp xếp hướng xuyên tâm. Các tế bào gan có hình thái trong giới hạn bình thường, không có nhân lớn bất thường, không hoại tử. Một số ít (khoảng 1-2%) tế bào gan thoái hóa nhẹ (thoái hóa nước, thoái hóa hạt). Trong mô gan không thấy xâm nhập tế bào viêm. Khoảng cửa không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Kết luận: Mô gan không thấy tổn thương. Lô thử (cái) 1.000 mg/kg Cấu trúc gan không bị xóa, nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa, các bè gan xắp xếp hướng xuyên tâm. Các tế bào gan có hình thái trong giới hạn bình thường, không có nhân lớn bất thường, không hoại tử. Một số ít (khoảng 1-2%) tế bào gan thoái hóa nhẹ (thoái hóa nước, thoái hóa hạt). Trong mô gan không thấy xâm nhập tế bào viêm. Khoảng cửa không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Kết luận: Mô gan không thấy tổn thương. Lô thử (cái) 3.000 mg/kg Cấu trúc gan không bị xóa, nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa, các bè gan xắp xếp hướng xuyên tâm. Các tế bào gan có hình thái trong giới hạn bình thường, không có nhân lớn bất thường, không hoại tử. Một số ít (khoảng 1-2%) tế bào gan thoái hóa nhẹ (thoái hóa nước, thoái hóa hạt). Trong mô gan không thấy xâm nhập tế bào viêm. Khoảng cửa không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Kết luận: Mô gan không thấy tổn thương. Hình 6.6. Hình ảnh và mô tả trên các mảnh cắt từ mô gan chuột nhắt cái Lô chứng (đực) Cấu trúc thận nhận rõ các đơn vị thận. Các cầu thận có hình thái trong giới hạn bình thường, không thấy tăng sinh cuộn mao mạch cầu thận, màng đáy không dầy, khoang Bowman rõ, không bị hẹp. Các ống thận có hình thái bình thường. Tế bào ống thận không hoại tử. Mô kẽ không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Các tế bào ống thận không lắng đọng glycogen, màng đáy ống thận không dầy. Kết luận: Mô thận không thấy tổn thương. Lô thử (đực) 1.000 mg/kg Cấu trúc thận nhận rõ các đơn vị thận. Các cầu thận có hình thái trong giới hạn bình thường, không thấy tăng sinh cuộn mao mạch cầu thận, màng đáy không dầy, khoang Bowman rõ, không bị hẹp. Các ống thận có hình thái bình thường. Tế bào ống thận không hoại tử. Mô kẽ không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Các tế bào ống thận không lắng đọng glycogen, màng đáy ống thận không dầy. Kết luận: Mô thận không thấy tổn thương. Lô thử (đực) 3.000 mg/kg Cấu trúc thận nhận rõ các đơn vị thận. Các cầu thận có hình thái trong giới hạn bình thường, không thấy tăng sinh cuộn mao mạch cầu thận, màng đáy không dầy, khoang Bowman rõ, không bị hẹp. Các ống thận có hình thái bình thường. Tế bào ống thận không hoại tử. Mô kẽ không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Các tế bào ống thận không lắng đọng glycogen, màng đáy ống thận không dầy. Kết luận: Mô thận không thấy tổn thương. Hình 6.7. Hình ảnh và mô tả trên các mảnh cắt từ mô thận chuột nhắt đực Lô chứng (cái) Cấu trúc thận nhận rõ các đơn vị thận. Các cầu thận có hình thái trong giới hạn bình thường, không thấy tăng sinh cuộn mao mạch cầu thận, màng đáy không dầy, khoang Bowman rõ, không bị hẹp. Các ống thận có hình thái bình thường. Tế bào ống thận không hoại tử. Mô kẽ không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Các tế bào ống thận không lắng đọng glycogen, màng đáy ống thận không dầy. Kết luận: Mô thận không thấy tổn thương. Lô thử cái (1.000 mg/kg) Cấu trúc thận nhận rõ các đơn vị thận. Các cầu thận có hình thái trong giới hạn bình thường, không thấy tăng sinh cuộn mao mạch cầu thận, màng đáy không dầy, khoang Bowman rõ, không bị hẹp. Các ống thận có hình thái bình thường. Tế bào ống thận không hoại tử. Mô kẽ không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Các tế bào ống thận không lắng đọng glycogen, màng đáy ống thận không dầy. Kết luận: Mô thận không thấy tổn thương. Lô thử cái (3.000 mg/kg) Cấu trúc thận nhận rõ các đơn vị thận. Các cầu thận có hình thái trong giới hạn bình thường, không thấy tăng sinh cuộn mao mạch cầu thận, màng đáy không dầy, khoang Bowman rõ, không bị hẹp. Các ống thận có hình thái bình thường. Tế bào ống thận không hoại tử. Mô kẽ không tăng sinh xơ, không xâm nhập viêm. Các tế bào ống thận không lắng đọng glycogen, màng đáy ống thận không dầy. Kết luận: Mô thận không thấy tổn thương. Hình 6.8. Hình ảnh và mô tả trên các mảnh cắt từ mô thận chuột nhắt đực Sau 28 ngày uống chế phẩm cắn chuối tiêuvới liều lên đến3000 mg/kg/ngày, các thông số cân nặng, huyết học, hóa sinh, đại thể cơ quan và mô bệnh học gan, thận của chuột nhắt trắng không có sự khác biệt so với lô chứng tương ứng. Theo qui định, nghiên cứu không cần thực hiện tiếp giai đoạn theo dõi sau 14 ngày dừng chế phẩm thử. 6.2.5. Kết luận Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chế phẩm cắn chuối tiêu không thể hiện các dấu hiệu của độc tính khi dùng liều lặp lại 28 ngày trên chuột nhắt trắng với các mức liều thử 1.000 mg/kg/ngày(liều tương đương liều thể hiện tác dụng dược lý) và 3.000 mg/kg/ngày (liều gấp 3 lần liều thể hiện tác dụng dược lý).Do không quan sát thấy các tác dụng không muong muốn trong suốt quá trình thử nghiệm, vì vậy mức liều 3.000 mg/kgđược coi là mức liều không quan sát thấy các tác dụng không mong muốn liên quan đến việc dùng chế phẩm cắn chuối tiêu. Nhìn chung, khi dùng với liều lặp lại 28 ngày, cắn chuối tiêu không thể hiện độc tính trên chuột nhắt trắng. THAM KHẢO ĐỘC TÍNH Tiếng Việt 1. Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm (2005), Dự thảo hướng dẫn thử độc tính của thuốc, Viện Kiểm nghiệm. 2. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. Tiếng Anh 3. OECD (2002), Test No. 420: Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris.DOI: 4. OECD (2002), Test No. 423: Acute Oral toxicity - Acute Toxic Class Method, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris.DOI: 5. OECD (2008), Test No. 425: Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procdure, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris.DOI: 6. Shayne C. G. (2002), Drug safetey evaluation, John Wiley & Sons, New York.