Luận văn Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

mạch, được sản xuất nhờ quá trình lên men chìm chủng Bacillus amyloliquefaciens [17]. Neutrase thuộc loại metallo proteinase xúc tác thuỷ phân các liên kết peptit ở bên trong phân tử protein, polypeptit,… Neutrase là một protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại khác đều chứa cả phần proteinase kiềm tính. Dải pH hoạt động 5,5 – 7,5; dải nhiệt độ hoạt động 45 - 550C. Chế phẩm này không chứa amylase, chứa một lượng β-glucanase không xác định. Cần ion kẽm cho hoạt động của nó, ion Ca2+ có tác dụng làm bền enzym, enzym bị ức chế bởi EDTA. Neutrase bị vô hoạt ở 850C trong 2 phút. Sự ổn định của neutrase ở nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất. Neutrase 0.8L có màu nâu sáng, trạng thái lỏng. Nhiệt độ bảo quản 0–100C, bảo quản trong bao bì khô, kín, tránh ánh sáng mặt trời, vi sinh vật tổng số ≤ 50000 TB/g, coliform ≤30 TB/g. Neutrase 0.8L có hoạt độ là 0.8AU/g (Anson Units per gram). Các thành phần của enzym neutrase dễ dàng hoà tan trong nước. Vị trí hoạt động của neutrase khi tham gia xúc tác thuỷ phân cơ chất có chứa nhóm hydroxyl Serine195, imidazol của histidin57, và nhóm cacboxyl của Aspartic102. Hình 1.6. Vị trí xúc tác của neutrase Cơ chế xúc tác của enzym neutrase Trung tâm hoạt động của enzym gồm 3 gốc Asp102, His57, Ser195. Khi cho enzym và cơ chất tiếp xúc với nhau thì tâm ái nhân của enzym sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷ phân. Cụ thể là dưới sự giúp đỡ của gốc Asp102, His57 sẽ cho ra một proton, nguyên tử oxy của nhóm – OH của gốc Ser 195 của enzym nhận thêm một electron. Gốc này sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử C của nhóm CO của liên kết peptit cần phân cắt và tạo phức chất trung gian giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym. Tiếp đến, phức chất này sẽ bị phá huỷ do sự sắp xếp lại các liên kết, khi này một phần của cơ chất được tách ra ngoài, 1 phần còn lại của cơ chất vẫn liên kết với gốc Ser của trung tâm hoạt động của enzym và tạo ra chất mới Acyl-enzym, chất này được hình thành giữa nhóm CO với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốc Ser 195 của enzym. Dưới sự trợ giúp của Asp102, His57 sẽ cho phân tử nước 1 proton, nguyên tử oxy của nước sẽ tấn công vào Acyl-enzym, để hình thành một phức chất trung gian mới. Phức chất này giải phóng sản phẩm thứ 2, lúc này liên kết giữa C của CO của phần còn lại của cơ chất với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốc Ser195 bị phá vỡ. Enzym giải phóng ra và bắt đầu hành trình mới. 1.2.3.2. Chế phẩm enzym Flavourzyme Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan mạch được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae [17]. Flavourzyme là một hỗn hợp peptidase, vừa có hoạt tính endoprotease, vừa có hoạt tính exoprotease. Có thể thuỷ phân trên 70 % mối liên kết peptit, sản phẩm thuỷ phân của flavourzyme thơm ngon, không có vị đắng khi thuỷ phân ở mức độ vừa phải. Sản phẩm không có các chất độc hại, hàm lượng muối thấp. Nhiệt độ tối ưu cho hỗn hợp enzym cũng như cho exopeptidase là 500C. Thuỷ phân trong điều kiện axit nhẹ hoặc trong điều kiện trung tính, dải pH hoạt động 5.0 – 7.0; pH tối ưu cho exopeptidase 7.0. Flavourzyme bị vô hoạt ở nhiệt độ 850C trong 5 phút hoặc ở 1200C trong 5 giây. Flavourzyme 500 MG có màu nâu, có 2 loại: Loại A: Tạo thành hạt trong NaCl Loại B: Tạo thành hạt trong yến mạch Các thành phần của Flavourzyme 500MG dễ dàng hoà tan trong nước. Flavourzyme 500 MG có hoạt độ 500 LAPU/g. 1 LAPU (đơn vị Leucine Aminopeptidase) là lượng enzym thuỷ phân được 1μmol L-leucine-p-nitroanilide trong 1 phút theo phương pháp phân tích của Novo Nordisk AF 298/1 [17]. Chế phẩm dạng bột, màu nâu. Sản phẩm được bảo quản trong điều kiện khô, lạnh, bảo quản ở 50C sản phẩm có thể duy trì được hoạt độ trong ít nhất 3 tháng. 1.3. Các phương pháp thủy phân nấm men Bản chất của quá trình thuỷ phân protein là sự thuỷ phân liên kết peptit. Do liên kết peptit là liên kết mạnh, thuỷ phân xảy ra trong điều kiện có xúc tác. Tác nhân xúc tác có thể là tác nhân hoá học hoặc tác nhân sinh học. Các sản phẩm thuỷ phân chưa hoàn toàn thường hay bị đắng. Sản phẩm bị đắng khi mức độ thuỷ phân đạt từ 4 – 40%. Vị đắng liên quan tới các peptit chứa các axit amin kỵ nước. Vị đắng chỉ ảnh hưởng đến tính chất cảm quan, không ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng. 1.3.1. Phương pháp hoá học 1.3.1.1. Thuỷ phân bằng axit Nguyên tắc: Dùng HCl nồng độ 6 – 10 N, nhiệt độ 100 – 1800C, thời gian thuỷ phân 24 – 72 giờ. Nếu gia tăng áp suất sẽ giảm được thời gian. Sau thuỷ phân, axit trong dịch thuỷ phân được trung hoà bằng NaOH hoặc Na2CO3 [15]. Ưu điểm: Rẻ tiền, nhanh và hiệu suất thuỷ phân cao từ 85 – 90 %, sản phẩm giàu axit amin và dễ bảo quản. Nhược điểm: Do nhiệt độ cao và nồng độ axit đặc, một số axit amin bị phá huỷ trong quá trình thuỷ phân. Tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, các axit amin chứa lưu huỳnh bị mất 10 – 30 %. Các axit amin chứa nhóm – OH bị phân huỷ một phần như Thr, Ser, Met, Cys. Chí phí năng lượng và thiết bị cao do phải chịu nhiệt và chống axit ăn mòn, việc sử dụng HCl đặc độc hại và ô nhiễm môi trường. Khi nồng độ HCl cao và nhiệt độ cao thường xảy ra phản ứng giữa Cl2 hoặc HCl có trong chất béo tế bào nấm men sinh độc tố monochloropropanol và dichloropropanol là tác nhân gây ung thư. Hàm lượng muối cao do quá trình trung hoà bằng NaOH. Người ta cũng có thể thuỷ phân nấm men bằng axit H2SO4, thuỷ phân bằng axit này thì dịch sau thuỷ phân được trung hoà bằng vôi, kết tủa CaSO4 tạo thành được lọc ra. Dịch lọc sẽ có hàm lượng muối thấp hơn so với thuỷ phân bằng HCl. Tuy nhiên vị của dịch thuỷ phân bằng H2SO4 thường kém hơn dịch thuỷ phân bằng HCl. 1.3.1.2. Thuỷ phân bằng kiềm Nguyên tắc: Dùng kiềm 4–8 N, nhiệt độ 100 – 1100C, thời gian 24 – 36 giờ [15]. Ưu điểm: Thuỷ phân bằng phương pháp này bảo toàn được tryptophan. Nhược điểm: Xảy ra hiện tượng racemic hoá nên sản phẩm thuỷ phân là hỗn hợp racemic D, L – amino axit, làm giảm giá trị dinh dưỡng. Ngoài ra, còn xảy ra quá trình oxy hoá một số axit amin khác. Kiềm xúc tác cho phản ứng tạo lysinoalanine làm giảm lysine trong dịch thuỷ phân. Vì vậy, trong sản xuất thực phẩm ít khi dùng phương pháp thuỷ phân bằng kiềm [15]. 1.3.2. Phương pháp enzym 1.3.2.1. Phương pháp tự phân nấm men Nguyên tắc là nấm men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, giữ ở nhiệt độ thích hợp cho hệ enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men hoạt động phân huỷ các thành phần của tế bào. Dịch thuỷ phân rất giàu axit amin, peptid, vitamin nhóm B và các hydratcacbon. 1.3.2.2. Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease Nguyên tắc là sử dụng chế phẩm enzym protease thuỷ phân protein của nấm men trong điều kiện thích hợp cho enzym hoạt động để tạo thành các dạng đạm khác nhau. Phương pháp này về bản chất giống phương pháp tự phân, chỉ khác là phương pháp tự phân sử dụng enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men, còn phương pháp bổ sung thêm enzym protease thì protein nấm men được kết hợp thuỷ phân từ protease có sẵn trong tế bào nấm men và chế phẩm enzym bổ sung vào với mục đích tăng hiệu suất thuỷ phân. Phương pháp enzym có ưu điểm là điều kiện thuỷ phân ôn hoà, hoàn toàn không sử dụng hoá chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu nên an toàn cho người sử dụng và giữ được giá trị dinh dưỡng. Hiệu suất thuỷ phân tối đa của phương pháp chỉ đạt 70 %. Sự thuỷ phân hạn chế do tác dụng của enzym nhất là các endoprotease từ vi khuẩn làm giải phóng ra các peptit kị nước có đính các gốc leucin và phenylalanin nên sản phẩm thuỷ phân từ protease thường có vị đắng. Tuy nhiên việc loại bỏ vị đắng hoàn toàn có thể giải quyết được khi sử dụng phản ứng plastin [30] hoặc serine proteinase của Bacillus subtilis vì protease này đặc hiệu ở vị trí axit amin thơm hoặc axit amin kỵ nước. Vì vậy chúng có khả năng làm giảm vị đắng của dịch thuỷ phân. Trong thời điểm hiện nay khi mà báo chí trong và ngoài nước đề cập rất nhiều đến một số chất độc trong thực phẩm trong đó có monochloropropanol và dichloropropanol, monochloropropanediol,… là những chất gây ung thư, rất độc hại cho con người hình thành từ quá trình thuỷ phân protein bằng phương pháp axit đặc thì việc sản xuất ra sản phẩm thuỷ phân protein an toàn và giàu giá trị dinh dưỡng bằng phương pháp enzym, và dễ tiêu hoá không chứa D-aminoacid như thuỷ phân protein bằng kiềm là rất cần thiết. 1.3.3. Phương pháp thuỷ phân enzym kết hợp với axit: Có thể thực hiện thuỷ phân bằng axit trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng enzym hoặc thuỷ phân trước bằng enzym rồi mới thuỷ phân bằng axit. Việc kết hợp sử dụng enzym protease và axit xúc tác quá trình thuỷ phân có ưu điểm là giảm thiểu hoá chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sảnxuất, nhưng vẫn có khả năng sinh ra độc tố.  CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nấm men Nấm men bia sử dụng thuộc chủng men nổi Saccharomyces cerevisiae, là thứ phẩm của nhà máy bia henninger, có màu trắng sữa, mịn, được bảo quản ở 40C dùng dần. 2.1.2. Các chế phẩm enzym Chế phẩm enzym netrase 0.8L Neutrase 0.8L là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ chủng Bacillus amyloliquefaciens, có dạng lỏng, màu nâu. Dải nhiệt độ hoạt động 45-550C, dải pH hoạt động 5,5-7,5. Chế phẩm được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Chế phẩm enzym flavourzyme 500MG Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae. Flavourzyme vừa có hoạt tính endoprotease, vừa có hoạt tính exoprotease. Nhiệt độ tối ưu 50 – 550C, dải pH hoạt động 5,0 – 7,0. Chế phẩm dạng bột, màu nâu, được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. Chế phẩm cereflo 1500L Cereflo là chế phẩm endo-Glucanase thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ Bacillus amyloliquefaciens bằng lên men chìm, enzym này phân giải β-glucan (các cầu nối 1,3(4) β-glucozit) của thành tế bào nấm men. Cereflo có dạng lỏng, màu nâu, tỷ trọng 1.25g/ml, hoạt độ 1500 BGU/g. Ngoài hoạt tính β-glucanase, cereflo còn có hoạt tính α-amylase. Các thành phần enzym hoạt tính của cereflo đều dễ dàng hoà tan trong nước. Ổn định trong NaCl, sacarose/glucose. Lượng vi sinh vật tổng số trong chế phẩm <50000 TB/g, coliform < 30 TB/g. Chế phẩm được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. 2.1.3. Các loại hoá chất sử dụng trong đề tài - Dung dịch ninhydrin 2% - Rượu n-butilic - Dung dịch pyridine 20% - Axit axetic - TCA 1.5M - Axeton - Cazein - Bản mỏng silicagen - Đệm phot phat pH = 7 - Nước cất - Một số axit amin chuẩn (leucin, lysin, axit glutamic, methionin) 2.1.4. Thiết bị sử dụng - Bình ổn nhiệt - Lò vi sóng - Cân phân tích - Nồi thanh trùng - Tủ sấy - Micropipet - Máy đo OD - Tủ ấm - Máy khuấy từ - Máy đo pH - Máy ly tâm lạnh - Buồng sắc ký - Máy ly tâm thường tốc độ 6000 vòng/phút 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym protease Cơ sở của phương pháp: Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân cazein bằng enzym nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng TCA. Định lượng sản phẩm tạo thành bằng cách đo độ hấp thụ của axit amin có trong dung dịch thuỷ phân tại bước sóng 275 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzym xúc tác tạo ra. Một đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym làm giải phóng ra 1mg tyrozin trong thời gian 5 phút ở 500C. Tiến hành - Chuẩn bị dung dịch cazein 2%, pH = 7: Cân chính xác 1g cazein cho vào cốc thuỷ tinh sạch. Thêm 40 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, rồi để cốc trong tủ lạnh 40C ngâm qua đêm để cazein trương nở. Đậy kín bằng giấy bạc để tránh nhiễm khuẩn. Lấy cốc ra, bổ sung vào đó 5 ml dung dịch NaOH 0.1N rồi bổ sung thêm dung dịch đệm để đạt pH = 7. Cốc phải được đặt trên máy khuấy từ để cazein được hoà tan hoàn toàn. Định mức đến 50 ml bằng dung dịch đệm. Như vậy ta sẽ thu được dung dịch cazein 2% pH = 7. - Chuẩn bị dung dịch enzym: + Đối với chế phẩm enzym flavourzyme 500MG: Cân 0.1g enzym, cho vào cốc thuỷ tinh sạch rồi bổ sung 49.9 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, cho lên máy khuấy từ khuấy đều. Được dung dịch enzym flavourzyme 0.2% (w/v). + Đối với chế phẩm enzym neutrase 0.8L: Tiến hành pha loãng 500 lần bằng dung dịch đệm photphat pH = 7. - Thực hiện phản ứng enzym: Lấy vào ống falcon 50 ml những thành phần sau: 3.5 ml dung dịch đệm photphat (pH = 7) + 0.5 ml dung dịch cazein 2% (pH = 7) + 0.5 ml dung dịch enzym vừa chuẩn bị ở trên. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút, sau đó bổ sung 0.5 ml TCA 1.5 M. Giữ trong 30 phút ở 40C để đình chỉ hoạt động của enzym. Sau đó mang đi ly tâm lạnh ở 40C trong 15 phút với vận tốc 10000 vòng phút. Ta sẽ thu được dịch trong đem so màu ở bước sóng bằng 275 nm sử dụng cuvet thạch anh. Với mẫu kiểm chứng ta cũng làm tương tự như trên nhưng không để phản ứng 5 phút trong bình ổn nhiệt mà bổ sung TCA vào ngay. Từ giá trị OD thu được ta tiến hành tính hoạt độ enzym. - Thiết lập công thức tính hoạt độ protease: Dựa vào phương trình đường chuẩn tyrozin y = 0.1242x – 0.0001 R2 = 0.9 x là giá trị OD đo được tại bước sóng λ = 275 nm y là nồng độ tyrozin tính theo mg/ml + Đối với chế phẩm enzym Flavourzyme: Hoạt độ Flavourzyme HdPF = = 5000×y (U/g) 5: Số ml dịch phản ứng trong ống nghiệm (3.5 ml dung dịch đệm + 0.5 ml dung dịch cazein 2% + 0.5 ml dung dịch enzym + 0.5 ml dung dịch TCA). 50: Số ml dịch enzym sau khi pha loãng 0.5: Số ml dịch enzym tham gia phản ứng 0.1: Số g enzym đem đi pha + Đối với chế phẩm enzym neutrase Hoạt độ enzym neutrase HdPN = = 5000×y (U/ml) 5: Số ml dịch phản ứng trong ống nghiệm (3.5 ml dung dịch đệm + 0.5 ml dung dịch cazein 2% + 0.5 ml dung dịch enzym + 0.5 ml dung dịch TCA). 500: Số lần pha loãng của dung dịch enzym 0.5: Số ml dịch enzym tham gia phản ứng 2.2.2. Phương pháp rửa nấm men - Tiến hành: Để chuẩn bị nấm men cho các thí nghiệm, đã tiến hành rửa bằng nước cất ở 40C 3 - 4 lần, ly tâm 6000 vòng/phút. Sau đó đem lọc bằng hệ thống lọc hút chân không. Men thu được sẽ dùng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.3. Phương pháp xác định độ ẩm - Nguyên tắc: Để xác định độ ẩm nấm men lọc chân không ta tiến hành theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [7]. - Tiến hành: Cân m0 g nấm men lọc chân không, sấy ở 1050C tới khi khối lượng men không đổi ta được m1 g. - Độ ẩm của nấm men lọc chân không được tính như sau: W = % 2.2.4. Nghiên cứu thuỷ phân nấm men 2.2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym protease Đối với chế phẩm enzym flavourzyme 500MG Chuẩn bị 6 bình tam giác sạch khô. Cho vào mỗi bình 10 g nấm men + 20 ml nước cất có nhiệt độ 550C. Sau đó bổ sung enzym, bình 1 là bình tự phân (không bổ sung enzym), bình 2 bố sung 0.1 % enzym (0.01 g enzym), bình 3 bổ sung 0.4 % enzym (0.04 g enzym), bình 4 bổ sung 0.7 % enzym (0.07 g enzym), bình 5 bổ sung 1 % enzym (0.1g enzym), bình 6 bổ sung 2 % enzym (0.2 g enzym). Các bình được ủ ở 550C trong bình ổn nhiệt. Cứ 8 giờ lại lẫy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin. Đối với chế phẩm enzym neutrase 0.8L Chuẩn bị 4 bình tam giác sạch khô. Cho vào mỗi bình 10 g nấm men + 20 ml nước cất có nhiệt độ 500C. Sau đó bổ sung enzym, bình 1 là bình tự phân (không bổ sung enzym), bình 2 bố sung 0.1 % enzym (0.01 ml enzym), bình 3 bổ sung 0.2% enzym (0.02 ml enzym), bình 4 bổ sung 0.3 % enzym (0.03 ml enzym). Các bình được ủ ở 500C trong bình ổn nhiệt. Cứ 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin. 2.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân Đối với chế phẩm enzym Flavourzyme 500MG Chuẩn bị 4 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất + 0.1 g enzym. Bình 1 ủ ở 450C, bình 2 ủ ở 500C, bình 3 ủ ở 550C, bình 4 ủ ở 600C. Cứ 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100 g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin. Đối với chế phẩm enzym neutrase 0.8L Chuẩn bị 3 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất + 0.03 ml enzym. Bình 1 ủ ở 450C, bình 2 ủ ở 500C, bình 3 ủ ở 550C. Cứ 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin. 2.2.4.3. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo Chuẩn bị 5 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất. Đánh số thứ tự các bình theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5. Các bình 3, bình 4, bình 5 được chỉnh về pH 7.5, sau đó bổ sung enzym: - Bình 3: Bổ sung 0.1 % chế phẩm cereflo (bổ sung 0.01 ml chế phẩm cereflo) - Bình 4: Bổ sung 0.2 % chế phẩm cereflo (bổ sung 0.02 ml chế phẩm cereflo) - Bình 5: Bổ sung 0.4 % chế phẩm cereflo (bổ sung 0.04 ml chế phẩm cereflo) 3 bình (bình 3, bình 4, bình 5) được ủ trong bình ổn nhiệt ở 300C trong 30 phút [2]. Sau đó chỉnh về pH ban đầu (lúc chưa điều chỉnh pH). Tiếp theo, tiến hành bổ sung chế phẩm enzym neutrase 0.8L vào các bình như sau: - Bình 1: không bổ sung neutrase. - Bình 2, bình 3, bình 4, bình 5 bổ sung 0.1 % neutrase 0.8L (bổ sung 0.01 ml chế phẩm neutrase 0.8L). Các bình được ủ ở nhiệt độ 500C. Cứ 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin. 2.2.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym Chuẩn bị 3 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất. - Bình 1: Ủ trong bình ổn nhiệt ở 800C trong 15 phút. Sau đó, lấy ra làm nguội đến 500C. Bổ sung 0.1 % chế phẩm neutrase 0.8L (bổ sung 0.01 ml chế phẩm). - Bình 2: Không bổ sung enzym - Bình 3: Bổ sung 0.1 % chế phẩm neutrase 0.8L (bổ sung 0.01 ml chế phẩm) Các bình được ủ ở 500C trong bình ổn nhiệt. Cứ 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100 g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin. 2.2.5. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng axit amin - Nguyên tắc: Khi đun nóng ở nhiệt độ cao, axit amin phản ứng với thuốc thử ninhydrin tạo thành 1 phức có màu tím xanh. Dựa vào cường độ màu của phức này khi đo OD ở bước sóng 570nm có thể định lượng được axit amin thông qua xây dựng 1 đường chuẩn [7]. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch trong: Dung dịch cần lấy mẫu trước khi lấy mẫu phải lắc đều, sau đó lấy ra 2 g, thêm vào 20 ml nước cất. Đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch trong để lấy mẫu phản ứng. + Thực hiện phản ứng ninhydrin: Lấy 1 ml dịch trong thu được ở trên + 1 ml dung dịch ninhydrin 2 % + 1 ml dung dịch pyridine 20 %, lắc đều. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 750C trong 10 phút. Sau đó, lấy ra làm lạnh trong 20 phút để ổn định màu và dừng phản ứng. Pyridine có vai trò là chất ổn định màu. Song song với mẫu thí nghiệm ta cũng làm 1 mẫu kiểm chứng tương tự như trên, chỉ khác là thay 1 ml dung dịch cần phân tích bằng 1 ml nước cất. + Tiến hành pha loãng: Các mẫu phản ứng sau khi làm lạnh đem đổ vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch, lắc đều. + Tiến hành đo quang: Đo quang ở bước sóng 570 nm. Từ giá trị OD thu được ta tính lượng axit amin tạo ra từ 100 g men KTĐ. + Thiết lập công thức tính hàm lượng axit amin: Hình 2.1. Đường chuẩn glutamic Dựa vào phương trình đường chuẩn glutamic: y = 5.97x + 0.3178 R2 = 0.9959 y là giá trị OD đo được tại bước sóng λ = 570 nm. x là nồng độ axit glutamic tính theo g/100ml → Hàm lượng axit amin (tính theo axit glutamic) quy ra g/100g men KTĐ là: C == (g/100g men KTĐ) 22: Thể tích dịch thuỷ phân lấy ra đã pha loãng (2 g dịch thuỷ phân + 20 ml nước cất) 2: Số g dịch thuỷ phân lấy mẫu 100: Số ml dịch trong chứa x g axit amin 30: Khối lượng dịch thuỷ phân chuẩn bị lúc đầu (10 g men lọc chân không + 20 g nước cất bổ sung) 10: Số g men lọc chân không đem đi phản ứng thuỷ phân w: Độ ẩm của men lọc chân không 2.2.6. Phương pháp sắc ký bản mỏng Nguyên tắc: Khi dung môi pha động di chuyển qua pha tĩnh (bản mỏng) có chấm 1 giọt dung dịch chứa hỗn hợp các chất cần phần tích. Do tác dụng của lực mao quản, dung môi thấm theo lớp mỏng, các cấu tử trong hỗn hợp dịch chuyển trên bản mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau, do có hệ số phân bố khác nhau. Kết quả ta thu được sắc ký đồ trên lớp mỏng với mỗi cấu tử trong hỗn hợp được phân chia thành 1 vùng riêng. So sánh với chất chuẩn ta định tính được các cấu tử trong hỗn hợp. Tiến hành: Hệ dung môi sử dụng là rượu n-butilic:axit axetic:nước theo tỉ lệ 3:1:1. Dung dịch axit amin (mẫu phân tích và axit amin chuẩn) được pha loãng sao cho trong 5µl dung dịch chứa 50µg axit amin. Thời gian chạy sắc ký 3 giờ. Sử dụng thuốc hiện màu ninhydrin 0.1% pha trong cồn 990. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không Để xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không, ta tiến hành theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [7]. Khối lượng nấm men lọc chân không đem đi sấy là m0 (g). Lượng nấm men này được sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi là m1(g). Bảng 3.1. Kết quả đo độ ẩm m0 (g) m1 (g) W (%) 19.13 3.988 79.15 19.5 3.958 79.70 20.0 4.130 79.35 Độ ẩm của nấm men lọc chân không là W = = 79.4% Vậy độ ẩm của nấm men lọc chân không là 79.4% 3.2. Xác định hoạt độ enzym protease 3.2.1. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG Để xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG, ta tiến hành pha dung dịch enzym Flavourzyme 0.2% (w/v). Thực hiện phản ứng enzym và đo quang ở bước sóng 275nm (xem mục 2.2.1). Giá trị OD đo được là 0.267 A. Hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG là 165.31U/g (công thức tính mục 2.2.1). 3.2.2. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L Để xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L, tiến hành pha loãng chế phẩm enzym 500 lần. Sau đó, thực hiện phản ứng enzym và đo quang ở bước sóng 275nm (xem mục 2.2.1). Giá trị OD đo được là 0.744 A. Hoạt độ protease trong chế phẩm enzym neutrase 0.8L là 461.52 U/ml (công thức tính mục 2.2.1). 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm flavourzyme 500MG 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme Tỉ lệ chế phẩm enzym bổ sung vào có ảnh hưởng lớn đến khả năng thuỷ phân protein nấm men. Để xác định tỉ lệ enzym cơ chất thích hợp, ta tiến hành làm 6 mẫu thí nghiệm với tỉ lệ enzym bổ sung khác nhau: Mẫu 1: Không bổ sung enzym Mẫu 2: Bổ sung 0.1% enzym (0.01g enzym/10 g nấm men) Mẫu 3: Bổ sung 0.4% enzym (0.04 g enzym/10 g nấm men) Mẫu 4: Bổ sung 0.7% enzym (0.07g enzym/10 g nấm men) Mẫu 5: Bổ sung 1% enzym (0.1 g enzym/10 g nấm men) Mẫu 6: Bổ sung 2% enzym (0.2 g enzym/10 g nấm men) Sản phẩm cuối cùng thu được trong phản ứng thuỷ phân protein là các axit amin. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu, khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym được xác định qua lượng axit amin tạo thành. Quá trình thuỷ phân xảy ra trong điều kiện nhiệt độ 550C. Sau 8 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần. Hàm lượng axit amin được xác định theo phương pháp ninhydrin (xem mục 2.2.5) và được chuyển ra g/100g men KTĐ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 (xem phụ lục) và trên hình 3.1. Kết quả thu được cho thấy: Khả năng thuỷ phân protein nấm men tăng lên khi tăng nồng độ enzym bổ sung. Axit amin thu được nhiều nhất ở mẫu bổ sung 2% chế phẩm enzym. Sau 16 giờ thuỷ phân, lượng axit amin thu được ở mẫu không bổ sung enzym là 33.4g, mẫu bổ sung 0.1% enzym là 38.25g, mẫu bổ sung 0.4% enzym là 47.43g, mẫu bổ sung 0.7% enzym là 49.05g, mẫu bổ sung 1% enzym là 59.47g, mẫu bổ sung 2% enzym là 62g. Điều này cũng đúng với quy luật ảnh hưởng của các yếu tố đến vận tốc enzym. Khi vận tốc phản ứng lớn hơn nhiều lần so với vận tốc enzym thì tốc độ của phản ứng thuỷ phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym. Có nghĩa là nồng độ enzym càng tăng thì hiệu suất thuỷ phân càng cao. Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Nồng độ enzym 0.1% cho lượng axit amin tạo thành thấp nhất, tức hiệu suất thuỷ phân bé nhất (38.25g) nhưng vẫn tăng 14.5% so với mẫu đối chứng không bổ sung enzym (33.4 g) sau 16 giờ thuỷ phân. Nồng độ enzym cao nhất 2% cho lượng axit amin nhiều nhất (62 g) sau 16 giờ thuỷ phân. Nhưng mức tăng là không đáng kể so với mẫu bổ sung 1% enzym (59.47g), tức chỉ tăng 4.25% (so với mẫu bổ sung 1% enzym), trong khi lượng enzym phải dùng cao hơn gấp đôi. Sử dụng enzym ở nồng độ này là không có lợi về mặt kinh tế. vì vậy, ta chọn tỉ lệ chế phẩm flavourzyme bổ sung là 1% cho các thí nghiệm tiếp theo. Ở mẫu bổ sung 1% enzym hiệu suất thuỷ phân tăng 78% so với mẫu không bổ sung enzym sau 16 giờ thuỷ phân. 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thuỷ phân Trong quá trình thuỷ phân nhiệt độ đóng vai trò rất quan trọng đối với hoạt động của enzym. Mỗi enzym có nguồn gốc khác nhau thường hoạt động mạnh nhất ở 1 khoảng nhiệt độ nhất định. Khi tạo môi trường phản ứng có nhiệt độ tối ưu cho enzym thuỷ phân sẽ thu được hàm lượng axit amin tối đa và rút ngắn được thời gian thuỷ phân cần thiết để đạt được hàm lượng axit amin này. Để theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm flavourzyme, em tiến hành thuỷ phân 4 mẫu với cùng tỉ lệ enzym là 1% (0.1g enzym/10g nấm men) ở các mức nhiệt độ 450C, 500C, 550C, 600C. Sau 4 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100 men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (xem mục 2.2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 (xem phụ lục) và trên hình 3.2 Hình 3.2. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme Kết quả thu được cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến vận tốc, thời gian thuỷ phân. Hiệu suất thuỷ phân cao nhất ở 550C sau 16 giờ thuỷ phân (đạt 59.47g), lượng axit amin thu được tăng 89 % so với mẫu thuỷ phân ở 450C (đạt 31.46g), tăng 34 % so với mẫu thuỷ phân ở 500C (đạt 44.22g), tăng 151 % so với mẫu thuỷ phân ở 600C (đạt 23.69 g). Nhiệt độ thuỷ phân tốt nhất là 550C, giảm lần lượt theo thứ tự 500C, 450C, 600C. Điều này có thể giải thích như sau: Nhiệt độ cao hơn 550C (600C), hiệu suất thuỷ phân giảm do enzim mất hoạt tính vì bị biến tính. Nhiệt độ cao làm duỗi chuỗi protein enzim, cấu trúc bậc 2, bậc 3 của enzim bị phá vỡ, không còn cấu trúc không gian cần thiết cho enzym hoạt động bình thường. Ở nhiệt độ thấp hơn 550C (450C, 500C), enzim không được cung cấp đủ năng lượng hoạt hoá cần thiết nên hoạt động kém hiệu quả. Do vậy, nhiệt độ thích hợp cho enzym flavourzyme hoạt động là 550C. Vì ở 600C enzim bắt đầu bị biến tính nên trong sản xuất cần phải điều chỉnh nhiệt độ thuỷ phân trong khoảng 500C – 550C. Tốc độ thuỷ phân diễn ra nhanh nhất trong 16 giờ đầu tiên. Sau đó, axit amin vẫn tiếp tục tăng ở các mẫu thuỷ phân tại nhiệt độ 450C, 500C, 600C. Riêng mẫu đặt ở 550C axit amin hầu như không tăng nữa. Như vậy, ở nhiệt độ thuỷ phân thích hợp 550C thời gian thuỷ phân được rút ngắn. Với nhiệt độ được chọn 550C, sau 16 giờ thuỷ phân axit amin đạt được là 59.47 g, trong khi axit amin chỉ đạt 63.88 g sau 32 giờ thuỷ phân (tăng 7.4% so với thời gian thuỷ phân 16 giờ). Nếu tiếp tục tăng thêm thời gian thuỷ phân thì sản phẩm thuỷ phân rất dễ bị nhiễm và không đạt hiệu quả kinh tế. Vì vậy, ta chọn nhiệt độ thuỷ phân 550C, thời gian thuỷ phân thích hợp là 16 giờ. 3.4. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo Glucan là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị phá vỡ hoàn toàn. Thành tế bào bị phá vỡ sẽ giải phóng protein bên trong tế bào, tạo điều kiện cho enzym protease bên ngoài tiếp xúc và phân cắt protein nấm men, góp phần làm tăng hiệu suất thuỷ phân protein. Với mục đích đó, ở thí nghiệm này em tiến hành bổ sung chế phẩm cereflo 1500L (xem 2.1.2). Để theo dõi ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men, em tiến hành phản ứng thuỷ phân 5 mẫu (Các bước tiến hành xem mục 2.2.4.3). - Mẫu 1: Không bổ sung enzym - Mẫu 2: Bổ sung 0.1% neutrase 0.8L - Mẫu 3: Bổ sung 0.1% cereflo và 0.1% neutrase 0.8L - Mẫu 4: Bổ sung 0.2% cereflo và 0.1% neutrase 0.8L - Mẫu 5: Bổ sung 0.4% cereflo và 0.1% neutrase 0.8L Các mẫu được ủ trong cùng điều kiện nhiệt độ 500C. Sau 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (tính theo g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (xem 2.2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 (xem phụ lục) và hình 3.3. Hình 3.3. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Kết quả thu được cho thấy, hàm lượng axit amin tạo thành ở các mẫu có bổ sung enzym cereflo gần như nhau và nhiều hơn không đáng kể so với mẫu đối chứng chỉ bổ sung 0.1% enzym neutrase. Cụ thể là, ở mẫu có bổ sung enzym cereflo với liều lượng cao nhất là 0.4% thì lượng axit amin tạo thành (đạt 48.22 g) cũng chỉ tăng 5.7% so với mẫu đối chứng bổ sung 0.1% neutrase (đạt 45.6 g) sau 16 giờ thuỷ phân. Vì vậy, sử dụng enzym cereflo trong trường hợp này không đem lại hiệu quả. Điều này có thể giải thích rằng ta chưa tạo được điều kiện thích hợp cho β- glucanase hoạt động thuỷ phân thành tế bào nấm men. Trong tương lai cần nghiên cứu điều kiện tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian,…) cho enzym β-glucanase (cereflo) công phá thành tế bào nấm men. 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Để theo dõi ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men, em tiến hành thuỷ phân 3 mẫu: - Mẫu 1: Ủ trong bình ổn nhiệt ở 800C trong 15 phút. Sau đó làm nguội đến 500C, bổ sung 0.1% chế phẩm enzym neutrase 0.8L (0.01ml enzym/10g nấm men). - Mẫu 2: Tự phân (không bổ sung enzym) - Mẫu 3: Bổ sung 0.1% chế phẩm enzym neutrase 0.8L (0.01ml enzym/10g nấm men). Các bình được ủ ở nhiệt độ 500C. Cứ 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (tính theo g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (xem 2.2.5). Kết quả phân tích được trình bày trên hình 3.4 và bảng 3.5 (xem phụ lục). Hình 3.4. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Kết quả thu được cho thấy: Mẫu 3 cho hiệu quả thuỷ phân cao nhất. Cụ thể là, sau 16 giờ thuỷ phân lượng axit amin thu được ở mẫu 3 (đạt 45.6 g) gấp 1.29 lần mẫu 2 (đạt 35.37 g), gấp 15.3 lần mẫu 1 (đạt 2.98 g). Điều này có thể giải thích như sau: Xử lý nhiệt tế bào mẫu 1 ở 800C trong 15 phút làm vô hoạt hoàn toàn hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men, trong đó có enzym protease. Axit amin tạo thành ở mẫu 1 chỉ do hoạt động thuỷ phân của enzym trong chế phẩm neutrase bổ sung vào. Ở mẫu 2, axit amin thu được là kết quả của quá trình tự phân huỷ tế bào nhờ hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men. Trong khi đó, axit amin tạo thành ở mẫu 3 nhiều hơn cả là do hoạt động thuỷ phân của hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men có sự hỗ trợ của enzym neutrase bổ sung vào. Axit amin tạo thành ở mẫu 1 thấp hơn hẳn mẫu 2 chứng tỏ hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men có vai trò rất lớn trong việc phá vỡ tế bào tạo sản phẩm thuỷ phân protein nấm men. Hay nói cách khác, khả năng công phá thành tế bào nấm men và tạo sản phẩm thuỷ phân của riêng enzym neutrase yếu hơn nhiều so với hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men. Lượng axit amin tạo thành ở mẫu 3 cao hơn hẳn tổng lượng axit amin tạo thành ở mẫu 1 và mẫu 2. Điều này có thể giải thích rằng các enzym không hoạt động độc lập mà có sự phối hợp hoạt động giữa enzym có sẵn trong tế bào nấm men và enzym bổ sung vào. Chọn phương pháp bổ sung thêm enzym protease để tăng hiệu quả thuỷ phân protein nấm men là rất cần thiết. 3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân Cũng như đối với tất cả các enzym khác, nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất mạnh đến độ hoạt động của enzym. Mỗi loại enzym có một vùng nhiệt độ hoạt động riêng. Để theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L, em tiến hành thuỷ phân 3 mẫu với cùng tỉ lệ enzym là 0.3% (nấm men (g)/nước cất (ml)/enzym (ml) = 10/20/0.03), nhưng nhiệt độ thuỷ phân khác nhau: Mẫu 1 ủ ở 450C Mẫu 2 ủ ở 500C Mẫu 3 ủ ở 550C Sau 4 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (mục 2.2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 (xem phụ lục) và trên hình 3.5 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L So sánh 3 mức nhiệt độ thuỷ phân 450C, 500C, 550C ta thấy hàm lượng axit amin tạo thành nhiều nhất nhiệt độ 500C. Sau 16 giờ thuỷ phân, lượng axit amin tạo thành là 48.69 g ở 450C; 51.44 g ở 500C; 45.51 g ở 550C. Ta chọn nhiệt độ thuỷ phân là 500C cho các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu quả thuỷ phân ở nhiệt độ 550C bắt đầu giảm so với mẫu thuỷ phân ở nhiệt độ 500C. Chứng tỏ ở 550C enzym bắt đầu bị biến tính. Vì vậy, trong sản xuất công nghiệp cần phải điều chỉnh nhiệt độ thuỷ phân từ 45-500C. 3.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzym neutrase và thời gian thuỷ phân Để xác định tỉ lệ chế phẩm enzym neutrase 0.8L thích hợp cần bổ sung. Ta tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với cùng nhiệt độ thuỷ phân 500C nhưng tỉ lệ enzym bổ sung khác nhau: Mẫu 1: Không bổ sung enzym Mẫu 2: Bổ sung 0.1% enzym (0.01ml enzym/10g nấm men) Mẫu 3: Bổ sung 0.2% enzym (0.02ml enzym/10g nấm men) Mẫu 4: Bổ sung 0.3% enzym (0.03ml enzym/10g nấm men) Sau 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (mục 2.2.5). Kết quả được trình bày trên hình 3.6 và bảng 3.7 (xem phụ lục). Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Kết quả thu được cho thấy: Việc bổ sung chế phẩm enzym neutrase 0.8L vào làm hiệu quả thuỷ phân tăng hơn hẳn so với mẫu không bổ sung enzym. Cụ thể là, sau 16 giờ thuỷ phân hàm lượng axit amin tạo thành ở các mẫu được so sánh với mẫu đối chứng không bổ sung enzym như sau: Tăng 29 % (đạt 45.6g) ở mẫu bổ sung 0.1% enzym, tăng 45.5% (đạt 51.44 g) ở mẫu bổ sung 0.2% enzym, tăng 45.5 % (đạt 51.44 g) ở mẫu bổ sung 0.3% enzym. Nồng độ enzym 0.3% cho lượng axit amin tạo thành cao hơn nồng độ enzym 0.2% một chút trong 12 giờ đầu tiên. Nhưng sau 12 giờ thuỷ phân, 2 đường biểu diễn nhập làm một, tức hiệu quả thuỷ phân của chúng bằng nhau. Lượng axit amin tạo thành ở tất cả các mẫu tăng mạnh trong thời gian thuỷ phân từ 0-16 giờ, sau 16 giờ thuỷ phân lượng axit amin tạo thành tăng chậm hơn rất nhiều (axit amin tạo thành ở mẫu bổ sung 0.2 % enzym tăng 32 % khi tăng thời gian thuỷ phân từ 8 giờ lên 12 giờ, tăng 16.8 % khi tăng thời gian thuỷ phân thuỷ phân từ 12 giờ lên 16 giờ, tăng 3.65 % khi tăng thời gian thuỷ phân từ 16 giờ lên 20 giờ). Vì vậy, ta chọn thời gian thuỷ phân là 16 giờ là thơi gian thích hợp để tiến hành phản ứng thuỷ phân. 3.7. So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân Các enzym protease có nguồn gốc khác nhau thì khả năng phân cắt của chúng lên mạch protein khác nhau. Kết quả là hàm lượng axit amin tạo thành trong dịch thuỷ phân và cơ cấu tỉ lệ giữa các thành phân của sản phẩm cũng khác nhau. Để so sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân, ta chọn điều kiện thuỷ phân cho mỗi mẫu là điều kiện thích hợp nhất cho hoạt động của nó, tức là: Đối với chế phẩm enzym flavourzyme: Thuỷ phân trong điều kiện tối ưu là nồng độ enzym 1%, nhiệt độ thuỷ phân 550C. Đối với chế phẩm enzym neutrase: Thuỷ phân trong điều kiện tối ưu là nồng độ enzym 0.2%, nhiệt độ thuỷ phân 500C. Đối với mẫu tự phân: Chọn nhiệt độ tự phân là 500C (cho hàm lượng axit amin tạo thành cao hơn ở 550C). Kết quả được trình bày trên hình 3.7 Hình 3.7. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân Từ đồ thị cho thấy: Hàm lượng axit amin tạo thành ở mẫu thuỷ phân bằng flavourzyme luôn cao hơn mẫu thuỷ phân bằng neutrase và mẫu tự phân. Hiệu suất thuỷ phân đạt cao nhất ở các mẫu sau 16 giờ thuỷ phân ở cả mẫu thủy phân bằng flavourzyme và mẫu thuỷ phân bằng neutrase. Sau 16 giờ thuỷ phân, hàm lượng axit amin tạo thành ở mẫu thuỷ phân bằng enzym flavourzyme và neutrase cao hơn mẫu tự phân tương ứng là 78% và 45.5%. Vậy thủy phân bằng flavourzyme (1% enzym, 550C) cho hiệu quả thuỷ phân cao hơn sử dụng enzym neutrase và phương pháp tự phân. 3.8. Định tính thành phần axit amin trong dịch thuỷ phân nấm men Để khảo sát thành phần axit amin trong dịch thuỷ phân nấm men, em tiến hành theo phương pháp sắc ký bản mỏng trên hệ dung môi n-butanol - axit axetic - nước (3:1:1) (xem mục 2.2.6). Bao gồm 6 mẫu phân tích. Trong đó có 4 mẫu là axit amin chuẩn. Mẫu 1: Dịch axit amin là sản phẩm thuỷ phân 16 giờ sử dụng 0.2% chế phẩm neutrase 0.8L (kí hiệu N) Mẫu 2: Dịch axit amin là sản phẩm thuỷ phân 16 giờ sử dụng 1% chế phẩm flavourzyme 500MG (kí hiệu F) Mẫu 3: Dung dịch axit glutamic chuẩn ( kí hiệu Glu) Mẫu 4: Dung dịch Leucin chuẩn (kí hiệu Leu) Mẫu 5: Dung dịch Lysin chuẩn (kí hiệu Lys) Mẫu 6: Dung dịch Methionin chuẩn (kí hiệu Met). Thời gian chạy sắc ký 3 giờ. Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.8 N F Glu Leu Lys Met 4 3 2 1 Hình 3.8. Sắc ký đồ Kết quả thu được trên sắc ký đồ cho thấy: Thành phần axit amin trong dịch thuỷ phân sử dụng chế phẩm neutrase và dịch thuỷ phân sử dụng chế phẩm flavourzyme không khác nhau nhiều. Hai dung dịch này đều tạo ra 4 vệt tương ứng với quãng đường chạy, kích thước, độ rõ của các vệt tương tự như nhau trên sắc ký đồ. Dung dịch thuỷ phân thu được khi sử dụng flavourzyme và neutrase có 4 axit amin chiếm thành phần nhiều nhất. So với các vệt axit amin chuẩn, thấy rằng dung dịch mẫu N và F đều chứa Lysin. Theo tài liệu tham khảo, lysin thành phần axit amin chiếm tương đối nhiều trong dịch thuỷ phân nấm men (3.2% theo [27]). Trên sắc ký đồ cũng cho thấy sự có mặt của Leucin trong dịch thủy phân mẫu N và F. Leucin là thành phần axit amin có trong sản phẩm thuỷ phân nấm men , chiếm 2.9% [27]. Giá trị R của các axit amin chuẩn trên sắc ký đồ như sau: Axit glutamic RGlu = 0.3, Leucin RLeu = 0.68, Lysin RLys = 0.14, methionin RMet = 0.61. Độ lớn của các giá trị này không đúng với [37], nhưng thứ tự về độ lớn thì đúng với [37]. tức là theo [37] thì RLys < RGlu < RMet < RLeu .Vì vậy, ta có thể dựa vào giá trị R thu được của các giếng trên sắc ký đồ của dung dịch thuỷ phân để dự đoán thành phần xuất hiện trên sắc ký đồ. Vệt số 2 và số 3 có quãng đường chạy không trùng với axit amin chuẩn nào. Các axit amin ở các vị trí này có giá trị R nằm trong khoảng R của lysin và leucin. Vệt 2 có quãng đường chạy xa hơn axit glutamic nên ta có thể dự đoán rằng vệt 2 rất có thể là valin (2.3% dịch thuỷ phân [27]), alanin (chiếm 3.4% dịch thuỷ phân [27]). Vệt số 3 có quãng đường chạy ngắn hơn methionin nên ta có thể dự đoán rằng vệt số 3 rất có thể là valin (chiếm 2.3% dịch thuỷ phân [27]). Tóm lại đã khảo sát sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng để khẳng định trong sản phẩm thủy phân nấm men có chứa các axit amin không thay thế quan trọng đối với người và động vật, đặc biệt là Lysin, Leucin. KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu, em đã rút ra được kết luận như sau: Đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym, nhiệt độ và thời gian đến khả năng thuỷ phân nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme 500MG Nồng độ enzym thích hợp 1% Nhiệt độ thuỷ phân tối ưu 550C Thời gian thuỷ phân thích hợp 16 giờ Hiệu quả thuỷ phân tăng 78% so với quá trình tự phân (3.3.1) Đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym, nhiệt độ và thời gian đến khả năng thuỷ phân nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L Nồng độ enzym thích hợp 0.2% Nhiệt độ thuỷ phân tối ưu 500C Thời gian thuỷ phân thích hợp 16 giờ Hiệu suất thuỷ phân tăng 45.5% so với quá trình tự phân (3.6.2) Quá trình xử lý nhiệt tế bào đem lại hiệu quả thuỷ phân thấp hơn nhiều so với quá trình tự phân. Sự kết hợp sử dụng enzym β-glucanase (cereflo) và enzym protease (neutrase) cho hiệu quả thuỷ phân không cao. Đã định tính thành phần dịch thuỷ phân nấm men Thành phần dịch thuỷ phân bằng 2 chế phẩm flavourzyme và neutrase có chứa các axit amin tương tự như nhau. Thành phần dịch thuỷ phân bằng 2 chế phẩm flavourzyme và neutrase đều có chứa lysin và leucin. KIẾN NGHỊ Qua quá trình nghiên cứu, em xin đề xuất 1 số ý kiến như sau: Tiến hành thử nghiệm sản xuất sản phẩm thuỷ phân nấm men bia với quy mô rộng bằng chế phẩm flavourzyme. Khai thác thêm về ảnh hưởng của các yếu tố khác (pH, chất kìm hãm, chất hoạt hoá,…) đến quá trình thuỷ phân nấm men bia bằng enzym protease. Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân nấm men bia bằng các enzym khác nhau. Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tối ưu để công phá thành tế bào nấm men bằng các phương pháp khác nhau. Nghiên cứu các phương pháp là giảm hàm lượng acid nucleic trong dịch phân . Tiếp tục nghiên cứu thành phần dịch thuỷ phân nấm men. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2000. Sử dụng chế phẩm sinh học trong chăn nuôi. Hà Nội. 2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998. Công nghệ enzym. NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. 3. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 1998. Hoá sinh học. NXB Giáo dục. 4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, 1997. Thực hành hoá sinh học. NXB Giáo dục. 5. Densikow, M.T., 1963. Tận dụng phế liệu của công nghệ thực phẩm (Nguyễn Văn Đạt – Bùi Huy Thanh dịch). NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 6. Tống Thị Anh Đào, Lê Văn Nhương, Nguyễn Đức Lượng, 1999. Thu nhận enzym superoxit dismutaza theo công nghệ nghiền tế bào Saccharomyces cerevisiae. Tạp chí Khoa học Công nghệ, 37(5): tr 20 -25. 7. Nguyễn Văn Đạt, Ngô Văn Tàm, 1974. Phân tích lương thực thực phẩm. Bộ Lương thực – Thực phẩm. 8. Quản Lê Hà, 1999. Nghiên cứu 1 số đặc tính và ứng dụng hệ enzym thuỷ phân tinh bột và protein trong sản xuất các đồ uống. Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sản phẩm lên men và nước uống không có rượu. Trường ĐHBK Hà Nội. 9. Nguyễn Ngọc Hải, 1994. Nấm men và công nghệ sinh học. Viện Di truyền Nông Nghiệp. 10. Vương Thị Việt Hoa, Nguyễn Hải Sự, Đặng Ngọc Thuỳ Dương, 2005. Tận dụng men dư thừa từ nhà máy bia để sản xuất yeasts extract bột dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh. Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, TP Hồ Chí Minh, (2). 11. Hoàng Đình Hòa, 2002. Công nghệ sản xuất malt và bia. NXB Khoa Học và Kĩ Thuật. 12. Trương Thị Hoà, 1994. Nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất bia. 13. Nguyễn Văn Hồng, 2004. Báo cáo tuyển tập hội nghị khoa học. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym protease dùng để thay thế một số chất xúc tác hoá học trong công nghiệp. TP Hồ Chí Minh. 14.http:// www.forum.hanoifishing.com/showthread.php?t=2424 15.16. http:// www.nanogenpharma.com 17. http:// www.novozymes.com 18. Khoa học - Công nghệ - Môi trường Tuyên Quang. Chế biến thức ăn gia súc gia cầm. Nhà xuất bản văn hoá dân tộc, tr 18-20. 19. Ngô Tuấn Kỳ, 1988. Enzym và đời sống. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 20. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, 2005. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 19. 21. Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự, Thái Thị Hảo, Trần Việt Lan, 1998. Ứng dụng enzym protease để rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm. Viện Công nghiệp Thực phẩm. 22. Lê Văn Việt Mẫn, Phạm Quốc Chương, 2007. Nghiên cứu cải thiện quá trình lên men nồng độ cao trong sản xuất bia. Đại học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh, 10 (6): tr 66-70. 23. Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thâm Minh Hoàng, Nguyễn Ngọc Tuyết Sương, 2006. Nghiên cứu quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 9 (12). 24. Lê Văn Việt Mẫn, Phạm Quốc Chương, 2007. Nghiên cứu cải thiện quá trình lên men nồng độ cao trong sản xuất bia. Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 25. Lao Thị Nga, 1987. Kỹ thuật sản xuất nấm men bánh mì và một số loài nấm ăn. NXB TP Hồ Chí Minh. 26. Lương Đức Phẩm, 2005. Nấm men công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 27. Lê Xuân Phương, 2001. Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây dựng, Hà Nội. 28. Nguyễn Phương, 2007. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để thiết kế chế tạo thiết bị sản xuất bột đậu nành uống liền và bột nấm men giàu protein và khoáng chất. Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Hà Nội. 29. Lường Văn Sơn, Trinh Xuân Bài, Hà Thị Hạnh, Lê Đức Lễ, 1999. Nghiên cứu sử dụng sinh khối nấm men bia của nhà máy bia Thanh Hoá sản xuất thuốc ống uống Biofil ở quy mô công nghiệp. Công ty cổ phần Dược - Vật tư Y tế Thanh Hoá. 30. Lâm Xuân Thanh. Nghiên cứu các phương pháp biến hình protein đậu tương và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Luận văn phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, ĐHBK Hà Nội. 31. Quản Văn Thịnh, 1978. Sinh tổng hợp enzym protease từ chủng nấm mốc Asp. Oryzae VN1 và ứng dụng trong sản xuất nước chấm. Luận án phó tiến sĩ Khoa học kỹ thuật, Trường ĐHBK Hà Nội. 32. Nguyễn Bích Thuỷ, năm. Nghiên cứu sử dụng một số enzym thuỷ phân trong sản xuất bia. Luận văn thạc sĩ ngành công nghệ thực phẩm, ĐHBK Hà Nội. 33. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thanh Trà, Lương Đức Phẩm, năm. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm proteaza từ Aspergillus oryzae TP-98 bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Tạp chí Khoa học Công nghệ. 34. Đặng Trung Trụ. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lên men đến sự thoái hoá của nấm men trong sản xuất bia. Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm, ĐHBK Hà Nội. 35. Trường đại học Y Hà Nội, 2001. hoá sinh. NXB Y học. 36. Hoàng Vân, 2004. Một số nét về enzym sử dụng trong các chất tẩy rửa. Tạp chí Công nghệ Hoá Chất, 3. 37. Đào Hữu Vinh. Nguyễn Xuân Dũng. Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Việt Hùng, 1985. Các phương pháp sắc ký. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 38. Anna Halász, Radomir Lásztity, 1991. Use of yeast biomass in food production. CRC press, Boca Raton Ann Arbor Boston. 39. Behalova B. and Berank, 1986. Autolysis of disintegrated cells of the yeasts Saccharomycess cerevisiae. Acta biotechnology Vol 6; pp 147 – 152. 40. Carl C.Lindegren, 1949. The yeast cell. Educat.publ. 41. Champagne C.P., Gaudreau H., Conway J., 2003. Effect of the production or use of mixtures of bakers’ or brewers’ yeast extract on their ability to promote growth of lactobacilli and pediococci. Electronic journal of biotechnology, vol 6. 42. Conway J, Gaudreau.H, Champagne C.P., 2001. The effect of the addition of proteases and glucanases during yeast autolysis on the production and properties of yeast extraxt. Canadian J. of Microbiology. Vol.47, Number 1, pp 18-24. 43. F.G. Walter, 1953. The manufacture of compressed yeast. Chapman and Hall. 44. Hanlon GW, Hodges NA, Russel AD, 1982. The influence of glucose, ammonium and magnesium by A.oryzae- J.Gen microbial 128, pp 845-851. 45. H.d.A.H. Cook, 1958. The chemistry and biology of yeasts. Acad. 46. Henry J. Peppler, 1973. Yeast technology. Avi Publ. Co., 47. J. Ladder, Rij N.j. W. Kreger – Van, 1967. The yeast. North – Holland 48. K. Arima, H.d. w. Roman, 1957. Yeasts . W.Junk Publ. 49. Owen P. Ward, 1983. Properties of microbial protease – Microbial enzymes and biotechnology, pp 263-281. 50. Schanus, Edward G, Mcpherson, Marinelle, 1994. Yeast extract from Candida utilis, production and use as emulsifier of same. 51. Tatjana Vukasinovic Milic, Marica Rakin and Slavica Siler-Marinkovic, 2006. Utilization of baker’s yeast (Saccharomyces cerevisiae) for the production of yeast extract: effect of different enzymatic treatments on solid, protein and carbohydrate recovery. J. Serb. Soc. 72(5). PHỤ LỤC Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzym 0.1% enzym 0.4% enzym 0.7% enzym 1% enzym 2% enzym 8 27.86 31.75 35.58 37.04 39.61 42.36 16 33.40 38.25 47.43 49.05 59.47 62.0 24 33.83 38.83 48.74 54.34 63.20 64.66 32 39.08 50.73 52.18 56.28 63.88 64.66 40 42.31 54.60 54.60 59.06 64.60 66.0 Bảng 3.3. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) 450C 500C 550C 600C 4 2.67 12.26 22.34 3.25 8 11.18 31.36 39.61 10.39 12 16.17 43.40 51.21 14.71 16 31.46 44.22 59.47 23.69 20 43.69 48.54 62.96 28.98 24 46.84 52.52 63.20 38.30 28 49.63 55.58 63.88 39.06 32 52.54 57.62 63.88 42.07 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzym 0.1% neutrase 0.1% cereflo 0.1% neutrase 0.2% cereflo 0.1% neutrase 0.4% cereflo 0.1% neutrase 8 28.40 32.08 33.32 35.66 35.77 16 35.37 45.60 46.28 48.98 48.22 24 40.26 49.35 50.26 52.38 52.11 32 42.38 53.08 53.22 54.29 54.32 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Xử lý 800C (15 phút), 0.1% enzym neutrase Tự phân 0.1% neutrase 8 1.45 28.40 32.08 16 2.98 35.37 45.60 24 3.06 40.26 49.35 32 3.84 42.38 53.08 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) 450C 500C 550C 4 13.27 23.88 16.52 8 29.46 36.09 21.71 12 39.03 46.14 35.94 16 48.69 51.44 41.51 20 51.44 53.52 42.79 24 52.66 55.29 43.28 28 52.89 55.29 44.79 32 55.06 55.48 45.81 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzym 0.1% neutrase 0.2% neutrase 0.3% neutrase 4 12.35 16.58 19.64 23.88 8 28.40 32.08 33.38 36.09 12 33.08 38.53 44.03 46.14 16 35.37 45.60 51.44 51.44 20 38.83 46.97 53.32 53.52 24 40.26 49.35 54.48 55.29 28 41.25 51.04 54.72 55.29 32 42.38 53.08 54.72 55.48 8 1