Luận văn nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích phát hiện thuốc giả bằng phổ raman (chuyên ngành: kiểm nghiệm thuốc và độc chất)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Đặng Thị Ngọc Lan NGHIÊN CỨU XÂY DƯṆG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2017 Công trình được hoàn thành tại : Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Người hướng dẫn khoa học GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu PGS.TS. Đoàn Cao Sơn Phản biện 1 : ......... Phản biện 2 : ......... Phản biện 3 : ......... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường tổ chức tại Trường Đại học Dược Hà Nội. Vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia VN Thư viện trường ĐH Dược HN 1 A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết của luận án Thuốc giả làm thất baị quá trình điều trị, gây biến chứng và có thể tử vong. Thuốc giả đa dạng về chủng loại, nguồn gốc xuất xứ và ngày càng được sản xuất tinh vi. Nhiều trường hợp, thuốc giả đã đến tay bệnh nhân hoặc thậm chí được bán hết mới có quyết định thu hồi, đình chỉ. Tình hình thuốc giả ngày càng diễn biến phức tạp, số lượng thuốc trên thị trường ngày càng lớn, các phương pháp phân tích thường quy cho kết quả chính xác nhưng tốn nhiều thời gian. Vì vậy việc ngăn ngừa và bài trừ thuốc giả, thuốc kém chất lượng đang là thách thức lớn đối với cơ quan chức năng. Trước thực trạng ấy, việc tìm tòi, khai thác các phương pháp mới giúp phân tích nhanh, phân tích được số lượng thuốc lớn để ứng dụng vào quản lý chất lượng thuốc tại Việt Nam là vô cùng cần thiết. Luâṭ Dươc̣ 2016 đã nêu ra 4 trường hơp̣ thuốc giả, tuy nhiên để phát hiêṇ đươc̣ thuốc giả ở cả 4 trường hơp̣ của Luâṭ Dươc̣ 2016 cần phải kết hơp̣ rất nhiều phương pháp phân tích khác nhau. Vi ̀vâỵ nôị dung của đề tài này chỉ tâp̣ trung phát hiêṇ thuốc giả thuôc̣ hai trường hơp̣ sau: (1) Không có dược chất, (2) Có dược chất không đúng với dược chất ghi trên nhãn hoặc theo tiêu chuẩn đã đăng ký lưu hành hoặc ghi trong giấy phép nhập khẩu. Qua quá trình tìm hiểu, nhận thấy phổ tán xa ̣Raman (goị tắt là phổ Raman) có nhiều tiềm năng để giải quyết yêu cầu khó khăn trên. Do vậy, luận án “Nghiên cứu xây dưṇg phương pháp phân tích phát hiện thuốc giả bằng phổ Raman” đã được thực hiện. 2. Mục tiêu của luận án 1) Triển khai xây dựng bộ phổ Raman chuẩn cho 10 dược chất và xác định các tiêu chí định tính cơ bản. 2) Thử nghiêṃ phương pháp trên để kiểm tra nhằm phát hiện thuốc giả dạng không có dược chất hoặc sử duṇg sai dươc̣ chất so với công thức trên thị trường Việt Nam. 2 3. Những đóng góp mới của luận án  Ứng dụng quang phổ Raman trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm  Đề tài là nghiên cứu đầu tiên đưa quang phổ Raman vào ứng dụng trong kiểm tra chất lượng thuốc trên thị trường Việt Nam và xây dựng được quy trình phân tích trên thiết bị đo quang phổ Raman để bàn và cầm tay.  Đã xây dựng được quy trình định tính cho các dược chất trên các nền tá dược cơ bản, sử dụng hệ số HQI để đánh giá kết quả theo như hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị. Quy trình này đã được ứng dụng để kiểm tra các thuốc dạng viên nang cứng, viên nén có chứa 10 dược chất nghiên cứu trên thị trường.  Xác định bộ dịch chuyển Raman cơ bản cho các dược chất  Lần đầu tiên bộ dịch chuyển Raman cơ bản (BDCRCB) được xác định nhằm tăng khả năng nhận diện của dược chất trong các nền mẫu. Bộ dịch chuyển này gồm vị trí và tỷ lệ cường độ của một số đỉnh có cường độ lớn đặc trưng cho dược chất nghiên cứu  Đã triển khai xác định BDCRCB cho 5 dược chất là isoniazid, ethambutol HCl, sildenafil citrat, ibuprofen, lamivudin.  Ứng dụng công nghệ thông tin để xác định bộ dịch chuyển Raman cơ bản của các dược chất  Đã ứng duṇg công nghê ̣thông tin để xây dựng chương trình phần mềm xác định BDCRCB tăng tính khách quan và giảm thời gian xử lý dữ liêụ phổ thu đươc̣. Phần mềm gọn, dễ dàng cài đặt trong máy tính xách tay, kết hợp với dữ liệu phổ thu được bằng thiết bị cầm tay để có thể xử lý cho ra kết quả ngay sau khi đo phổ tại hiện trường.  Quy trình phân tích định tính để phát hiện thuốc giả  Đã xây dựng được quy trình sử dụng quang phổ Raman để kiểm tra phát hiện thuốc giả (dạng không có dược chất hay sử duṇg sai dươc̣ 3 chất so với công thức đa ̃đăng ký) trên thị trường bằng phối hợp sử dụng hệ số HQI và BDCRCB. 4. Ý nghĩa của luận án Đề tài đã xây dựng được quy trình để kiểm tra thuốc giả trên thị trường qua các bước sau: 1. Xây dựng bộ phổ chuẩn Raman cho các dược chất cần phân tích. 2. Xác định BDCRCB cho các dược chất đã xây dựng bộ phổ Raman chuẩn. Có 2 cách xác định BDCRCB: xử lý dữ liệu phổ trực tiếp và xử lý qua phần mềm. Cách xử lý dữ liệu qua phần mềm sẽ cho BDCRCB đầy đủ được xếp theo thứ tự đặc trưng ưu tiên giảm dần từ trên xuống. Cách xử lý dữ liệu trực tiếp sẽ cho BDCRCB ngắn hơn với những đỉnh được ưu tiên cao trong danh sách. 3. Sử dụng thiết bị Raman cầm tay để sàng lọc nhanh tất cả các mẫu thuốc cần phân tích. Đánh giá kết quả theo hệ số HQI được cài đặt trong máy. 4. Xác định hệ số HQI theo phần mềm đã được cài đặt trong thiết bị và dữ liệu bộ phổ Raman chuẩn đã xác định được. 5. Xử lý kết quả tùy theo hệ số HQI xác định được như sau:  HQI ≥ 90%: mẫu thử dương tính với dược chất và đạt yêu cầu.  HQI < 80%: mẫu thử âm tính với dược chất nên tiếp tục làm thêm các biện pháp khẳng định trước khi kết luận và xử lý hành chính.  80%  HQI < 90%: mẫu thuốc thuộc trường hợp nghi ngờ và sẽ tiếp tục được kiểm tra thêm bằng BDCRCB trước khi kết luận. Cách xử lý cụ thể như sau: - Nếu tất cả các đỉnh trong BDCRCB của mẫu phân tích có vị trí và tỷ lệ cường độ nằm trong khoảng xác định thì có thể kết luận là mẫu dương tính với dược chất. - Nếu có ít nhất từ 2 đỉnh hoăc̣ tỷ lê ̣nằm ngoài BDCRCB thì lấy mẫu và phân tích thêm bằng các phương pháp khác để kết luận 5. Bố cục của luận án 4 Luận án gồm 4 chương, 61 bảng, 78 hình, 122 tài liệu tham khảo với 10 tài liệu tiếng Việt và 112 tài liệu tiếng Anh, 6 phụ lục. Luận án có 142 trang gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1. Tổng quan (40 trang); Chương 2. Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (10 trang); Chương 3. Kết quả nghiên cứu (72 trang); Chương 4. Bàn luận (16 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang). B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Đã tập hợp và trình bày có hệ thống 4 nội dung chính liên quan đến luận án bao gồm: - Tình hình thuốc giả trên thế giới và ở Việt Nam: tỷ lệ thuốc giả nói chung trên toàn thế giới vào khoảng 10% trên tổng số thuốc lưu hành. Tỷ lệ thuốc giả của Việt Nam là xấp xỉ 0,1% trên tổng số lượng mẫu được lấy kiểm tra. - Các phương pháp phát hiện thuốc giả: đã nêu được nguyên tắc và ứng dụng chính của quang phổ cận hồng ngoại và nhiễu xạ tia X trong phát hiêṇ thuốc giả. - Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman: Phổ Raman đã được phát hiện cách đây rất lâu nhưng khoa học công nghệ chưa phát triển nên còn khó khăn về thiết bị và ứng dụng. Nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ mà quang phổ Raman gần đây đang được tái triển khai để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, trong đó có ngành Dược. Phổ Raman đăc̣ biêṭ có ưu thế trong viêc̣ phát hiêṇ thuốc giả maọ danh các nhà sản xuất. - Một số nhóm thuốc hay bị làm giả: giới thiệu các tính chất và tình hình phát hiêṇ thuốc giả trên thế giới của 10 dược chất nghiên cứu (thuộc 6 nhóm tác dụng). Thuốc giả đang là vấn đề không chỉ gây khó khăn cho các cơ quan chức năng mà còn là mối hiểm họa với nhiều người bệnh. Theo WHO và FDA, thuốc giả, thuốc bất hơp̣ pháp chiếm khoảng 10% thị 5 trường dược phẩm thế giới. Đối với các nước công nghiệp phát triển với hệ thống quản lý hiệu quả (ví dụ như Mỹ, EU, Australia, Canada, Nhật Bản, New Zealand) có tỷ lệ thuốc giả, thuốc kém chất lượng thấp chỉ khoảng 1%. Trong khi đó, con số này là 30% ở các nước Mỹ La- tinh, châu Á, châu Phi Châu Á đang được xem là khu vực bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi nạn thuốc giả, đặc biệt vùng Đông Nam Á. Các loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng phần nhiều là thuốc tân dược như: thuốc điều trị sốt rét, thuốc chống lao, thuốc tránh thai hỗn hợp, thuốc chống cúm H5N1, thuốc kháng virus viêm gan và thuốc AIDS, một số thuốc thông thường tiêu thụ nhiều (như hạ nhiệt giảm đau, kháng sinh). Ở Việt Nam, trong những năm đầu thâp̣ kỷ 90 của thế kỷ trước, tỷ lê ̣thuốc giả trên thi ̣ trường theo báo cáo của WHO là khoảng 7%. Đến năm 1995, tỷ lê ̣này giảm xuống 6%, trong đó tỷ lê ̣thuốc giả không có dươc̣ chất hoăc̣ sai dươc̣ chất là khoảng 0,6%. Hiêṇ nay, với hê ̣ thống quản lý chăṭ che,̃ tỷ lê ̣ thuốc giả ở Viêṭ Nam đã giảm đáng kể, dao động ở mức 0,1%. Tuy tỷ lê ̣thuốc giả giảm đi rõ rêṭ do công tác quản lý dươc̣ phẩm đươc̣ tăng cường nhưng không vì thế mà viêc̣ phát hiêṇ và ngăn chăṇ thuốc giả không còn ý nghiã. Vì vẫn có môṭ tỷ lê ̣thuốc giả trong vô vàn thuốc đảm bảo chất lươṇg lưu hành trên thi ̣ trường. Do vâỵ, viêc̣ kiểm tra phát hiêṇ thuốc giả càng phải đơn giản, goṇ nhe,̣ ít ảnh hưởng đến viêc̣ kinh doanh và lưu thông dươc̣ phẩm trên thi ̣ trường. Để phân tích phát hiện được thuốc giả, người ta thường sử dụng các cách sau: - Phân tích tại phòng thí nghiệm: lấy mẫu mang về phòng thí nghiệm, phân tích bằng các phương pháp hóa học (làm các phản ứng trong ống nghiệm) hay phương pháp hóa lý (sắc ký, phổ) - Phân tích ngay tại hiện trường: trước đây thường sử dụng các bộ kít hoặc mini-lab đã trang bị sẵn một số ống nghiệm, thuốc thử hoặc sắc 6 ký lớp mỏng có thể thực hiện được phân tích mẫu tại hiện trường. Với sự phát triển và tiến bộ vượt bậc trong công nghệ, một số thiết bị phân tích phổ (Raman, NIR, nhiễu xạ tia X) đã được thiết kế và chế tạo dưới dạng thiết bị cầm tay. Đây được coi là bộ công cụ mạnh trong phát hiện nhanh thuốc giả tại hiện trường Quang phổ Raman được phát hiện lần đầu tiên năm 1928 bởi nhà khoa học Chandrasekhra Venkata Raman. Theo thời gian, đã có những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc tán xạ Raman. Nhờ sự phát triển một loạt các bộ phận của thiết bị như nguồn laser, detector, các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn. Ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích. Quang phổ Raman là hiện tượng tán xạ, xảy ra do va chạm không đàn hồi và có trao đổi năng lượng giữa các photon ánh sáng kích thích với phân tử. Khi chiếu bức xạ điện từ vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ. Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử. Phương pháp phân tích quang phổ Raman đã và đang giữ một vai trò to lớn trong công tác kiểm soát, phân tích và phát hiện thuốc giả. Cụ thể như sau: - Phương pháp phân tích cho kết quả nhanh, không cần chuẩn bị mẫu. - Phổ Raman có thể được đo trực tiếp thông qua màng vỉ, màng gelatin, qua chai lọ thủy tinh trong suốt - Việc đo phổ Raman là khá dễ dàng nên có thể trang bị máy cho nhiều cơ quan quản lý cấp cơ sở, không cần phải cán bộ có trình độ cao để sử dụng. 7 - Sự ra đời của máy quang phổ Raman cầm tay có ý nghĩa cực kỳ quan trọng, cho phép phân tích mẫu ngay tại hiện trường, đưa ra kết quả nhanh chóng để có biện pháp cảnh báo, tạm ngưng hoặc thu hồi ngay các thuốc có nguy cơ làm giả, ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. - Các đầu dò quang học có thể đo được phổ Raman ở nhiều vị trí khác nhau trong bao bì đựng lớn giúp cho kiểm soát được sự đồng đều của nguyên liệu, của thuốc bột, dung dịch thuốc, nhũ tương, hỗn dịch - Khi đo phổ Raman của thành phẩm thuốc, người ta thường so sánh phổ Raman của thuốc đó với thuốc đối chiếu do nhà sản xuất cung cấp. Vì khi đo thành phẩm thì ngoài tín hiệu Raman của dược chất ra, chúng ta còn thu được tín hiệu nền của hệ tá dược, do đó sẽ khẳng định được thuốc đó có đúng là thuốc do chính nhà sản xuất đã đăng ký hay không. Đánh giá mức độ nguy hiểm và tần suất xuất hiện của các thuốc giả, thuốc kém chất lượng trên thị trường dược phẩm Việt Nam, 6 nhóm thuốc với các dược chất đại diện đã lựa chọn để nghiên cứu. Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU - Chất chuẩn: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương - Các nguyên liệu có nguồn gốc Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam - Các loại tá dược có nguồn gốc Việt Nam hoặc Trung Quốc - Đối tượng nghiên cứu: 10 dươc̣ chất (cefixim, cefpodoxim proxetil, cefuroxim axetil, ethambutol HCl, ibuprofen, isoniazid, lamivudin, lumefantrin, sildenafil citrat và zidovudin). Đối tươṇg phân tích: các chế phẩm (viên nang cứng, viên nén) có chứa 10 dươc̣ chất trên. 2.2. TRANG THIẾT BỊ - Máy quang phổ Raman để bàn của hãng Renishaw - Máy quang phổ Raman cầm tay của hãng BW-TEX 8 Cả hai loaị thiết bi ̣ đều đươc̣ hiêụ chuẩn điṇh kỳ theo đúng hướng dâñ của nhà sản xuất. Mỗi loaị thiết bi ̣ có quy trình hiêụ chuẩn cu ̣thể tùy thuôc̣ vào đăc̣ tính của thiết bi ̣. Tuy nhiên, về cơ bản thiết bi ̣ se ̃đươc̣ hiêụ chuẩn về các chỉ tiêu: nguồn laser và đô ̣đúng thang đo. - Các trang thiết bị, dụng cụ khác của phòng thí nghiệm tại trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương . 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Bào chế viên mô hình - Xây dựng công thức viên nén, viên nang dựa trên hàm lượng thực tế trên thị trường và các nền tá dược cơ bản. Mỗi loại viên được bào chế trên một số nền tá dược khác nhau và các nền viên placebo tương ứng (không chứa dược chất). - Các viên bào chế xong được kiểm tra chất lượng bằng các phương pháp phân tích thông thường. Yêu cầu: trừ các viên placebo, các viên phải dương tính với dược chất và hàm lượng của dược chất khi định lượng phải đạt từ 90,0% đến 110,0% so với hàm lượng mong muốn bào chế được.. 2.3.2. Nghiên cứu thiết lập bộ phổ chuẩn 2.3.2.1. Chuẩn bị chất chuẩn Lựa chọn chất chuẩn đang được sử dụng phổ biến trên thị trường Việt Nam. Tiến hành thực nghiệm và sau đó so sánh phổ chuẩn vừa thiết lập được với phổ của một số chuẩn khác để đánh giá sự tương đương. 2.3.2.2. Lựa chọn điều kiện đo: Các thông số cụ thể cần khảo sát + Công suất nguồn laser; + Độ phân giải; + Dải đo; + Thời gian thu phổ. 2.3.2.3. Thiết lập thư viện phổ chuẩn Cài đặt các thông số đã xác định được cho thiết bị đo. Tiến hành đo phổ và lưu thư viện phổ chuẩn trên thiết bị phân tích. 9 Thẩm định thư viện phổ chuẩn thông qua so sánh phổ chuẩn của từng chất với phổ của một số chất chuẩn khác cùng loại và đánh giá đô ̣dao động về vị trí và cường độ của các đỉnh đặc trưng sau nhiều lần đo khác nhau thông qua hê ̣số HQI. 2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính các dược chất bằng phương pháp quang phổ Raman 2.3.3.1. Nguyên tắc chung Mẫu phân tích được xem là dương tính với dược chất theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bi ̣ HQI giữa phổ dược chất và phổ mẫu phân tích đạt từ 90% trở lên. Khi hệ số tương đồng phổ thu được dưới 90% cần xem xét sự xuất hiện của các đỉnh đặc trưng của dược chất trước khi kết luận. 2.3.3.2. Xây dựng quy trình phân tích  Xác định điều kiện đo: Khảo sát để lựa chọn điều kiện đo (công suất đo, thời gian ghi phổ, số lần quét, độ phân giải, khoảng phổ.) trên các chất chuẩn.  Đo phổ của chất chuẩn theo các điều kiện đã thiết lập.  Lưu thư viện phổ chuẩn.  Đo phổ Raman của các viên mô hình và các viên placebo.  So sánh phổ của dược chất và tá dược để xác định các đỉnh đặc trưng của chất chuẩn cũng như sự ảnh hưởng của nền tá dược lên phổ dược chất trong thành phẩm.  Thiết lập các đỉnh nhận dạng và vùng nhận dạng đặc trưng của dược chất trong nền mẫu thành phẩm để phân tích trực tiếp.  So sánh phổ mẫu thử trong cùng điều kiện đo tương ứng với phổ chất chuẩn. 2.3.3.3. Thẩm định quy trình phân tích  Thẩm định độ đặc hiệu - Phải xác định được các đỉnh đặc trưng của dược chất. 10 - Hệ số tương đồng phổ giữa phổ chất chuẩn và phổ viên đạt từ 90% trở lên (HQI ≥ 90%), không có sự tương đồng phổ giữa phổ của viên placebo và phổ của viên chứa dược chất.  Thẩm định độ lặp lại Đánh giá độ lặp lại của phương pháp thông qua sự lặp lại về hệ số chồng phổ giữa các lần đo khác nhau. Yêu cầu RSD của hệ số chồng phổ không quá 10%.  Giới hạn phát hiện Phải phát hiện được dược chất trong viên khi hàm lượng dược chất trong viên dưới 50% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Tại giới hạn phát hiện, hệ số tương đồng phổ (HQI) xấp xỉ 90%. 2.3.3.4. Ứng dụng phân tích thuốc trên thị trường Sử dụng thiết bị đo phổ Raman cầm tay để phân tích các thuốc có chứa các dược chất nghiên cứu trên thị trường. So sánh phổ của mẫu thử với phổ chuẩn, yêu cầu HQI phải đạt từ 90% trở lên. Lấy một số mẫu thuốc mang về phòng thí nghiệm, đo phổ Raman bằng thiết bị để bàn, đánh giá sự tương đồng phổ bằng hệ số HQI. 2.3.4. Xây dựng phương pháp xác định BDCRCB HQI là kết quả của việc so sánh toàn phổ nên ngoài việc so sánh những đỉnh chính của dược chất cần nghiên cứu, nó bao gồm cả việc so sánh những đỉnh khác của tá dược – những thông số làm nhiễu đối với việc nhận biết dược chất trong viên, làm cho hệ số HQI bị giảm đi. Vì vậy, để hạn chế việc ảnh hưởng của nền mẫu, cần chọn ra một số đỉnh của dược chất ít chịu ảnh hưởng của tá dược và tính tỷ lệ cường độ tương đối để xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản cho các dược chất nghiên cứu. Các bước tiến hành như sau: - Đo phổ Raman của các chất chuẩn và các viên mô hình - Xác định một số dịch chuyển Raman có cường độ lớn của từng dược chất nghiên cứu trên phổ Raman của chất chuẩn. 11 - Xác định sự ảnh hưởng của các tá dược bằng so phổ của chất chuẩn với phổ của các mẫu viên placebo - Xác định khoảng dao động về vị trí và cường độ của các giá trị dịch chuyển Raman chính bằng so phổ của chất chuẩn với phổ của các viên nghiên cứu. - Ảnh hưởng của hàm lượng dược chất trong viên được xác định bằng so sánh phổ của viên có hàm lượng 50% với phổ của viên có đủ hàm lượng tương ứng. 2.3.5. Xây dựng chương triǹh phần mềm xác định BDCRCB của các dược chất Số lượng file dữ liệu phổ rất lớn nên xử lý trực tiếp gặp nhiều khó khăn về thời gian và tính khách quan. Do vậy cần ứng dụng công nghệ thông tin để giải quyết khó khăn trên. Dữ liệu phổ Raman của chất chuẩn và từng loại viên đo trên các máy quang phổ Raman được lưu lại dưới dạng các file text (có định dạng *.txt) hoặc file của Microsoft Excel (*.xls). Chuyển file dữ liệu đo được (dạng *.txt hay *.xls) thành file dạng database (*.dbf) của Microsoft Visual FoxPro. Xây dựng chương trình xác định BDCRCB dựa trên các dữ liệu phổ của các dược chất nghiên cứu trên bằng phần mềm Microsoft Visual FoxPro theo các nguyên tắc xác định BDCRCB đã thực hiện trực tiếp. 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIÊỤ - Các kết quả phân tích phổ (đo phổ, HQI) được xử lý theo phần mềm của thiết bị phân tích: WIRE 2.0 với máy để bàn và Nano Ram OS với máy cầm tay. - Trình bày và vẽ phổ bằng phần mềm Origin 8.0. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Microsoft Visual FoxPro. 12 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. THIẾT LẬP THƯ VIỆN PHỔ RAMAN CHUẨN CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT 3.1.1. Kết quả bào chế viên mô hình Công thức của viên mô hình sử dụng trong nghiên cứu được xây dựng tại Khoa Nghiên cứu & Phát triển (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương). Công thức viên được xây dựng dựa trên các nền tá dược cơ bản của viên nén và viên nang (tá dược độn, tá dược rã, tá dược dính, tá dược trơn) và dựa trên lượng dược chất trong mỗi loại viên hay được sử dụng trên thị trường. Đối với mỗi công thức, số lượng viên mô hình được chế tạo khoảng 200 viên chứa dược chất và 200 viên placebo. Các viên mô hình bào chế xong được mang đi kiểm tra chất lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quả kiểm tra chất lượng gồm:  Định tính: tất cả các viên mô hình chứa dược chất đều cho kết quả dương tính với dược chất tương ứng của nó.  Định lượng: Các viên mô hình chứa dược chất đều đạt yêu cầu về định lượng (97,2% – 100,7%). 3.1.2. Lựa chọn điều kiện đo phổ - Chất chuẩn: sử dụng chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. - Điều kiện đo (máy để bàn/cầm tay): nguồn laser (633 nm/785 nm), độ phân giải (4 cm-1/9 cm-1), dải đo (120 - 1800 cm-1/176 – 2000 cm-1), công suất nguồn và thời gian thu phổ: tùy từng dược chất. - Chuẩn bị mẫu đo: phổ được thu trực tiếp trên bột mẫu (máy để bàn), hoặc thu qua màng PE mỏng, trong suốt (máy cầm tay). 3.1.3. Kết quả phổ Raman thiết lập được Việc biểu diễn phổ Raman được tiến hành như sau: - Lựa chọn một số đỉnh có cường độ lớn trên phổ đồ làm các đỉnh đặc trưng để nhận dạng các chất. 13 - Quy cường độ phổ về tỉ lệ thang đo theo một trong các đỉnh có cường độ lớn nhất (đỉnh tham chiếu). Chọn đỉnh tham chiếu và coi tỷ lệ cường độ là 100%. Các đỉnh đặc trưng phải được biểu diễn kèm thông số là cường độ tương đối của chúng so với đỉnh tham chiếu này. - Phổ đồ ngoài thông số dải phổ được thể hiện trên thang đo ra, phải đưa thêm thông số về độ phân giải phổ. 3.1.4. Thẩm định bộ phổ Raman chuẩn 3.1.4.1. Thẩm định độ lặp lại Đo lặp lại 6 lần taị các vi ̣ tri ́ khác nhau trên cùng môṭ chất chuẩn của mỗi dược chất, giá trị HQI giữa các lần đo chuẩn so với phổ chuẩn đã thiết lập đều đạt từ 99,0% trở lên, (RSD < 0,5%). 3.1.4.2. So sánh với một số chuẩn cùng loại So sánh phổ chuẩn vừa thiết lập với phổ của một số chất chuẩn khác nhằm đánh giá được giá trị sử dụng của bộ phổ vừa thiết lập. Tất cả các giá trị HQI đều trên 99,0%. Như vậy không có sự khác nhau về phổ Raman giữa các chất chuẩn đã thiết lập. 3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC CHẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ RAMAN 3.2.1. Quy trình phân tích định tính bằng quang phổ Raman  Bước 1: Bật máy, chờ ổn định khoảng 1 giờ trước khi tiến hành phân tích;  Bước 2: Kiểm tra độ đúng thang đo bằng vật liệu chuẩn (thường là phim polystyren);  Bước 3: Gọi phương pháp phân tích tương ứng với dược chất đang phân tích hoặc cài đặt các thông số kỹ thuật đã xác định cho từng mẫu phân tích;  Bước 4: Chuẩn bị mẫu phân tích: - Đối với các thuốc không bao, các thuốc không bao đựng trong vỉ trong suốt: không cần chuẩn bị mẫu. 14 - Đối với các thuốc viên nén bao hoặc bọc trong vỉ không trong suốt: loại bỏ vỉ và lớp bao, bộc lộ phần lõi thuốc bên trong. - Đối với các thuốc viên nang cứng: loại bỏ vỏ nang, nghiền đều bột thuốc nếu cần.  Bước 5: Đo trực tiếp phổ của mẫu phân tích vừa chuẩn bị. So sánh phổ thử và phổ chuẩn để xác định chỉ số HQI.  Bước 6: Đánh giá kết quả phân tích dựa trên chỉ số HQI vừa thu được. Nếu mẫu phân tích cho HQI ≥ 90% thì kết quả được xem là dương tính. Nếu HQI dưới 90%, mẫu bị coi là nghi ngờ và phải được kiểm tra bằng các phương pháp tiếp theo. 3.2.2. Kết quả thẩm định quy trình định tính bằng quang phổ Raman 3.2.2.1. Độ đặc hiệu và độ lặp lại - Độ đặc hiệu: Hệ số tương đồng phổ (HQI) của phổ chuẩn và phổ viên đều đạt từ 91,0% trở lên; phổ placebo: âm tính với dược chất. - Độ lặp lại: RSD của hệ số tương đồng phổ giữa các lần đo lặp lại không quá 3%. 3.2.2.2. Giới hạn phát hiện Tất cả các quy trình đều phát hiện được dược chất trong viên khi hàm lượng dược chất trong viên không quá 30% so với hàm lượng dư ̣kiến. Tại giới hạn phát hiện, hệ số tương đồng phổ (HQI) xấp xỉ 90%. 3.2.3. Kết quả phân tích thuốc trên thị trường Trong quá trình thực hiện đề tài, khoảng 500 mẫu ở một số địa phương (Hà Nội, TP. Hồ Chí Minh, Lào Cai và Đà Nẵng) đã được phân tích sàng loc̣ bằng thiết bi ̣ đo phổ Raman cầm tay. Sau đó 40 mẫu đã đươc̣ lấy về phòng thí nghiêṃ để phân tích bằng cả thiết bị để bàn và cầm tay. Tất cả các mẫu đều cho kết quả dương tính với dược chất khảo sát (HQI > 90%). 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH BỘ DỊCH CHUYỂN RAMAN CƠ BẢN CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT 15 Để việc tìm ra BDCRCB được chính xác nhất, thiết bị quang phổ Raman để bàn là thiết bị có độ phân giải cao hơn được sử dụng để tiến hành nghiên cứu. Các dược chất nghiên cứu được chọn để xác định BDCRCB là: isoniazid, ethambutol HCl, sildenafil citrat, ibuprofen và lamivudin Kết quả BDCRCB của isoniazid với khoảng Raman shift (cm-1) (tỷ lệ) như sau: 664 ± 2 (0,25-0,45), 1002 ±1 (0,95-1,10), 1186 ±1 (0,50- 0,65), 1332 ±1 (1,00), 1602 ±1 (0,85-1,20) Các bộ dịch chuyển này cũng đã được kiểm tra với các chế phẩm trên thị trường. Kết quả cho thấy các mẫu kiểm tra đều có các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman nằm trong giới hạn cho phép. 3.4. XÂY DỰNG CHƯƠNG TRÌNH PHẦN MỀM XÁC ĐỊNH BDCRCB CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT 3.4.1. Xây dưṇg chương triǹh phần mềm cho thiết bi ̣ để bàn 3.4.1.1. Chuyển đổi dữ liệu đo thành các database Các dữ liệu phổ Raman đo từ các mẫu trên máy để bàn được xuất ra các file dạng text, se ̃ được chuyển thành các file database (DBF) để có thể xử lý tiếp bằng chương trình được xây dựng với Microsoft Visual FoxPro. Việc chuyển đổi được thực hiện bằng chức năng Import của menu File. File DBF đệm được copy sang file DBF chính thức với 2 trường A và B bằng lệnh COPY TO. 3.4.1.2. Hoàn thiện dữ liệu trong các database Chaỵ chương trình Hoanthien (bao gồm khoảng 70 câu lêṇh), khai báo tên file DBF, các dữ liệu phổ Raman trong các file se ̃tư ̣đôṇg đươc̣ hoàn thiện bằng việc chuyển đổi sang các trường tương ứng. 3.4.1.3. Sơ bộ chọn các Raman shift cơ bản Sau khi dữ liệu trong tất cả các file dạng DBF đã được hoàn thiện, các bộ dịch chuyển cơ bản sẽ được sơ bộ chọn ra tùy theo mức độ làm tròn khác nhau về các giá trị Raman shift. Chaỵ chương triǹh BOCB (bao gồm khoảng 240 câu lêṇh) sẽ tạo ra các bộ dịch chuyển. 16 3.4.1.4. Hoàn tất việc chọn các Raman shift cơ bản Ảnh hưởng của nền tá dươc̣ se ̃ đươc̣ loaị bỏ sau khi chaỵ chương trình Nentaduoc (bao gồm khoảng 500 câu lêṇh). Các đỉnh có cường độ Raman vượt quá 30% so với dược chất sẽ bị loại bỏ. Các đỉnh còn lại được sử dụng để xác định khoảng dao động về đỉnh và tỷ lệ trong quá trình hoàn thiện BDCRCB. 3.4.1.5. Hoàn thiện Bộ dịch chuyển Raman cơ bản Việc hoàn thiện BDCRCB được tiến hành qua 2 bước chính như sau:  Xác định khoảng dao động về vị trí và tỷ lệ cường độ (so với đỉnh tham chiếu đã chọn) của các nhóm chất chuẩn (R), các mẫu có hàm lượng dược chất 100% dạng viên nang (C) và viên nén (T), các mẫu có hàm lượng dược chất 50% dạng viên nang (BC) và viên nén (BT), các mẫu placebo (PC và PT).  Từ 4 nhóm kết quả so sánh và đưa ra BDCRCB của dược chất nghiên cứu. Người phân tích có thể thực hiện toàn bộ công việc hoàn thiện này bằng thực hiện chương trình Ramancb. 3.4.1.6. So sánh kết quả thực hiện bằng chương trình với xử lý trực tiếp So sánh các kết quả thu được bằng 2 phương pháp cho thấy kết quả xử lý bằng phần mềm cho kết quả khách quan, bao trùm toàn bộ các đỉnh và khoảng tỷ lệ có trong Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của các dược chất tương ứng đã được xác định trước đây. 3.4.1.7. So sánh dữ liệu phổ của các mẫu thử với bộ dịch chuyển Raman cơ bản bằng phần mềm Chaỵ chương trình Mauthu (gồm 200 câu lêṇh) để so sánh dữ liệu phổ Raman của mẫu phân tích. Chương trình se ̃tư ̣đôṇg thưc̣ hiêṇ các bước sau: - So sánh giá trị của từng đỉnh và tỷ lệ cường độ so với đỉnh tham chiếu của mẫu thử với Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của dược chất. 17 Nếu thỏa mãn trường INDINH hoăc̣ INTL sẽ nhận giá trị “OK” nếu không sẽ nhận giá trị “Fail”. - Cuối cùng kết quả kiểm tra được kết xuất ra màn hình. Việc kiểm tra cho một file rất nhanh chóng chỉ hết khoảng chục giây. 3.4.2. Xây dưṇg chương triǹh phần mềm cho thiết bi ̣ cầm tay Chương trình phần mềm để xác điṇh BDCRCB cho thiết bi ̣ cầm tay cũng đươc̣ xây dưṇg theo nguyên tắc giống như cho thiết bi ̣ để bàn. Tuy nhiên, do điều kiêṇ đo của 2 thiết bi ̣ khác nhau nên quy trình xây dưṇg có môṭ số điểm khác như sau: - Dữ liêụ đo phổ trên thiết bi ̣ cầm tay đươc̣ lưu dưới daṇg file excel nên các file này có thể để riêng re ̃hoăc̣ gôp̣ vào thành từng sheet trong 1 file excel chung. - Đô ̣phân giải của thiết bi ̣ để bàn là 9 cm-1 nên mức dao đôṇg đươc̣ đăṭ là 9. Quy trình xác điṇh BDCRCB bằng thiết bi ̣ để bàn đươc̣ thưc̣ hiêṇ qua các bước: - Chuyển dữ liêụ đo sang file database - Hoàn thiêṇ dữ liêụ, choṇ bô ̣cơ bản, xác điṇh ảnh hưởng của tá dươc̣ và hoàn thiêṇ dữ liêụ để thu đươc̣ BDCRCB. Viêc̣ so sánh mẫu thử đo trên thiết bi ̣ cầm tay với BDCRCB xác điṇh đươc̣ cũng đươc̣ thưc̣ hiêṇ bằng viêc̣ chaỵ chương trình Mauthu. 3.4.3. Sử duṇg phần mềm và thiết bi ̣ cầm tay để kiểm tra các mẫu thưc̣ tế trên thi ̣ trường Sử duṇg BDCRCB isoniazid để kiểm tra 40 chế phẩm trên thi ̣ trường (đã đươc̣ làm mù mẫu và mã hóa). Kết quả có 5 mẫu đaṭ (đều chứa isoniazid), 35 mẫu không đaṭ (không có isoniazid). Như vâỵ chương trình phần mềm này là khả thi và có đô ̣tin câỵ. Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THƯ VIỆN PHỔ RAMAN THIẾT LẬP ĐƯỢC 18 4.1.1. Về công thức bào chế viên nén, viên nang cứng cho các dược chất Thuốc trên thị trường rất đa dạng, tùy vào loại dược chất và mục đích sử dụng, hàm lượng dược chất trong viên sẽ khác nhau. Tuy nhiên, trong cùng một dạng bào chế, chúng chỉ được hình thành bởi dược chất và một số loại tá dược cơ bản. Chẳng hạn với viên nén thường bao gồm hai phần: phần vỏ và phần lõi. Phần vỏ gồm các tá dược bao và tá dược màu, phần lõi gồm dược chất và các tá dược độn, rã, dính, trơn. Do việc nghiên cứu chế tạo viên mô hình và việc nghiên cứu phổ là độc lập, nên kết quả phân tích là khách quan. 4.1.2. Về cách chuẩn bị mẫu đo Dưạ trên những ưu điểm của phương pháp quang phổ Raman nên đề tài đã có bước cải tiến là đo mẫu qua bao bì PE mỏng, trong suốt. Bước cải tiến này tuy nhỏ nhưng cũng giúp tăng tuổi thọ của các đầu đo, tránh bị lẫn các mẫu đo với nhau và giảm thời gian phân tích do sau mỗi lần đo mẫu cần vệ sinh đầu đo. 4.1.3. Về cách biểu diễn phổ Raman Các phổ đồ của các dươc̣ chất đo đươc̣ đã thể hiêṇ đươc̣ bản chất của phổ Raman, mỗi đỉnh phổ đều thể hiêṇ dao đôṇg của liên kết trong phân tử. Tuy nhiên cách dùng các đỉnh đặc trưng theo các nhóm chức không được chọn để biểu diễn quang phổ Raman trong nghiên cứu này, do nội dung của luận án không phải đi theo hướng nghiên cứu cấu trúc mà chỉ tập trung nhận dạng các chất bằng so phổ mẫu thử với phổ chuẩn. Muc̣ đích cuối cùng của luâṇ án là xây dưṇg phương pháp để góp thêm môṭ công cu ̣ cho các cơ quan quản lý trong viêc̣ kiểm soát chất lươṇg dươc̣ phẩm trên thi ̣ trường. 4.1.4. Khả năng ứng dụng trong phát hiện thuốc giả Phương pháp phổ Raman giúp phân tích nhanh, sàng lọc và đánh giá sơ bộ số lượng lớn chất lượng của các thuốc đang lưu hành trên thị 19 trường, giúp giảm gánh nặng cho đội ngũ cán bộ quản lý chất lượng dược phẩm. Với các chế phẩm có hàm lươṇg dươc̣ chất (khối lươṇg/khối lươṇg) trong viên lớn nên phổ Raman thường có nhiều đin̉h và các đỉnh có cường đô ̣lớn, có thể sử duṇg các thiết bi ̣ cầm tay để phân tích ngay taị hiêṇ trường, cho kết quả nhanh chóng. Điều này làm cho phổ Raman có thêm ưu thế trong phát hiêṇ thuốc giả có thành phần không đúng như công thức đã đăng ký. Ngươc̣ laị, tá dược thường có đáp ứng nhỏ, phổ của dược chất có cường độ lớn, lại nhiều đỉnh, phổ của tá dược bị lẫn vào phổ dược chất là khó tránh khỏi, nhất là trong các trường hợp tỉ lệ tá dược bị làm giả thấp thì cực kỳ khó phát hiện. Khi phân tích thuốc giả về tá dược, cần sử dụng các thiết bị Raman có độ phân giải cao, các máy để bàn sẽ giải quyết vấn đề này tốt hơn máy cầm tay. 4.2. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC DƯỢC CHẤT BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ RAMAN Hệ số HQI được tự động tính toán dựa trên sự so sánh toàn phổ giữa mẫu thử và mẫu chuẩn trong vùng dải đo được lựa chọn. Vì thế nó bị ảnh hưởng bởi nhiễu nền và tá dược mà người làm phân tích không can thiệp được. Nhưng bên cạnh đó, việc tính toán theo hệ số HQI có ưu điểm là cho kết quả nhanh, thuận tiện vì phần mềm tính toán được tích hợp cùng thiết bị đo. Do đó, các thiết bị cầm tay với cách tính kết quả bằng HQI sẽ thích hợp cho nghiên cứu sàng lọc số lượng mẫu lớn trên thị trường. Trong quá trình thực hiện đề tài, quy trình phân tích xây dựng đã được áp dụng với một số lượng lớn mẫu thuốc trên thị trường. Tuy chưa phát hiện được mẫu thuốc giả nào (dạng không có dược chất hoặc thiếu thành phần), nhưng phương pháp này đã giảm gánh nặng cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc tại thực địa của các cơ quan chức năng: không phải mang hóa chất thuốc thử đi theo như các 20 phương pháp khác (mini-lab, sắc ký lớp mỏng), thời gian phân tích một mẫu rất nhanh (15-20 giây/mẫu) giúp sàng lọc được số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn, tiết kiệm thời gian, nhân lực và chi phí. 4.3. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH BỘ DỊCH CHUYỂN RAMAN CƠ BẢN CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT Quy trình này được xây dựng để định tính các chất thông qua bản chất phổ, tức là dựa vào vị trí và cường độ của các giá trị dịch chuyển Raman. Đối với các thuốc thường nền mẫu phức tạp vì có nhiều tá dược nên cần làm giảm sự ảnh hưởng nền mẫu tới phép đo. Nếu chất phân tích có cường độ tán xạ Raman mạnh và nền mẫu có cường độ Raman yếu thì kết quả phép đo sẽ chính xác hơn. Ngoài các đỉnh của các liên kết đặc trưng, khi có bức xạ kích thích chiếu vào, phân tử còn tán xạ ra các bức xạ là tương tác giữa các gốc, các liên kết trong phân tử với nhau tạo nên các đỉnh đặc trưng riêng cho mỗi phân tử. Các đỉnh đặc trưng này có thể được sử dụng như “dấu vân tay” để so sánh và xác định xem các tín hiệu đó có phải là của chất khảo sát hay không. BDCRCB chính là tập hợp các “dấu vân tay” để tăng khả năng xác định dược chất trong viên. Các BDCRCB của một số dược chất vừa xác định được đã được ứng dụng kiểm tra cho một số thuốc trên thị trường và cho kết quả khả quan. Bô ̣dic̣h chuyển này có thể áp duṇg cho nhiều loaị chế phẩm có hàm lươṇg dươc̣ chất (khối lươṇg/khối lươṇg) khác nhau trên thi ̣ trường vì về bản chất bô ̣dic̣h chuyển lưạ choṇ những đỉnh đăc̣ trưng dưạ trên chuẩn dươc̣ chất ít bi ̣ ảnh hưởng của các tá dươc̣ thường dùng. Vi ̀thế với các viên có khối lươṇg lớn, tỷ lê ̣tá dươc̣ lớn thì các đỉnh có cường đô ̣lớn của tá dươc̣ đều đã bi ̣ loaị bỏ khỏi BDCRCB nên viêc̣ so đỉnh ít bi ̣ ảnh hưởng. Do đó, nếu viên thưc̣ tế có hàm lượng không đúng như viên mô hình nhưng vẫn thể hiện đủ các đỉnh với vi ̣ trí và tỷ lê ̣cường đô ̣như bô ̣dic̣h chuyển thì vẫn kết luận đươc̣ là có dược chất. 21 4.4. VỀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ THÔNG TIN ĐỂ XÁC ĐỊNH BỘ DỊCH CHUYỂN RAMAN CƠ BẢN CỦA MỘT SỐ DƯỢC CHẤT Phương pháp định tính theo HQI cũng có một số nhược điểm như đã nêu ở trên (bị ảnh hưởng bởi nền mẫu). Do đó, cần phải tìm ra bộ dữ liệu Raman đặc trưng để tăng khả năng phát hiện của các dược chất trong viên, cũng như các chương trình xử lý số liệu để mở rộng khả năng áp dụng của bộ dữ liệu này. Để nhận diện dược chất có trong các mẫu thử vẫn có thể dùng HQI để sàng lọc ban đầu. Những trường hợp cho HQI đủ lớn có thể khẳng định ngay sự có mặt của dược chất trong mẫu. Những trường hợp có HQI quá bé có thể kết luận được sự không có mặt của dược chất trong mẫu. Những trường hợp còn chưa kết luận được cần sử dụng thêm các biện pháp khác để có kết luận phù hợp. Chương trình xử lý số liệu bằng Microsoft Visual FoxPro được xây dựng dựa trên nguyên tắc xác định BDCRCB theo cách trực tiếp nhằm tăng tính khách quan và cho kết quả chính xác hơn. Phần mềm cũng đã được thiết kế để xác định được BDCRCB cho các viên mô hình với các hàm lươṇg khác nhau. Do đó, phạm vi áp dụng của phần mềm này là rất rộng, khi gặp nhiều đối tượng phân tích khác nhau (các thuốc có hàm lượng thay đổi khác nhau trên thị trường), phần mềm này vẫn xử lý được với số lươṇg viên mô hình tùy choṇ. Với phần mềm xác điṇh BDCRCB cho thiết bi ̣ cầm tay se ̃là môṭ công cu ̣hữu ích giúp cơ quan quản lý có thể kiểm tra chất lươṇg thuốc ngay taị hiêṇ trường. Với mỗi dươc̣ chất có thể quét phổ của tất cả các chế phẩm có số đăng ký ở Cuc̣ Quản lý Dươc̣ làm nguồn dữ liêụ đầu vào, sử duṇg BDCRCB xác điṇh đươc̣ có thể kiểm tra đươc̣ tất cả các mẫu trên thi ̣ trường. Microsoft Visual FoxPro là môṭ phần mềm khá phổ biến, dê ̃ sử duṇg và hoàn toàn có thể chuyển đổi dữ liêụ phổ thu đươc̣ từ cả 22 máy Raman để bàn và cầm tay. Với các chương triǹh đã đươc̣ xây dưṇg để xử lý kết quả phổ đo đươc̣ se ̃là môṭ công cu ̣maṇh giúp phân tích đươc̣ số lươṇg lớn thuốc và cho kết quả ngay taị hiêṇ trường. 4.5. VỀ THỬ NGHIÊṂ PHƯƠNG PHÁP TRONG KIỂM TRA PHÁT HIÊṆ THUỐC GIẢ TRÊN THI ̣ TRƯỜNG Trong thời gian thưc̣ hiêṇ đề tài, không có mẫu thuốc giả nào (daṇg không có dươc̣ chất hoăc̣ sử duṇg sai dươc̣ chất) đươc̣ phát hiêṇ (mẫu dương tính) nên tiến hành làm mẫu giả tư ̣ taọ như sau: 40 chế phẩm trên thi ̣ trường đươc̣ lấy về đã đươc̣ làm mù mẫu, mã hóa và kiểm tra bằng phần mềm xây dưṇg cho thiết bi ̣ cầm tay. Kết quả cho thấy 5 mẫu dương tính đều chứa đúng dươc̣ chất đươc̣ kiểm tra, 35 mẫu còn laị đều âm tińh với dươc̣ chất đươc̣ kiểm tra. Do vâỵ, quy trình đã xây dưṇg là khả thi và có thể phát hiêṇ đươc̣ thuốc giả daṇg không có dươc̣ chất hoăc̣ sử duṇg sai dươc̣ chất so với công thức đa ̃ đăng ký. Các nghiên cứu phát hiêṇ thuốc giả trên thế giới chủ yếu tâp̣ trung theo hướng phát hiêṇ thuốc sản xuất maọ danh các nhà sản xuất. Những nghiên cứu này đều đã tâṇ duṇg đươc̣ những ưu thế nổi bâṭ của phổ Raman trong phát hiêṇ thuốc giả. Tuy nhiên, se ̃cần phải có công thức chuẩn và nguyên liêụ chuẩn cho từng chế phẩm của mỗi nhà sản xuất. Do vâỵ, hướng nghiên cứu này se ̃phù hơp̣ cho các nhà sản xuất hơn là cho các cơ quan quản lý với muc̣ tiêu kiểm tra chất lươṇg thuốc trên thi ̣ trường. Đề tài không đi sâu vào nghiên cứu thuốc giả maọ danh, thuốc nhái các nhà sản xuất vì muc̣ tiêu chińh là xây dưṇg phương pháp để góp thêm môṭ công cu ̣ hữu hiêụ giúp các cơ quan quản lý kiểm tra nhanh đươc̣ số lươṇg lớn thuốc ngay taị thưc̣ điạ. Đối với thuốc giả daṇg không đủ hàm lươṇg như đã đăng ký cần có những nghiên cứu tiếp theo sâu hơn để phát hiêṇ. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 23 Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đã đề ra và thu được các kết quả như sau: 1. Đã triển khai xây dựng được bộ phổ Raman chuẩn cho 10 dược chất và xác định được các tiêu chí định tính cơ bản. - Xây dựng thư viện phổ chuẩn: Thư viện phổ chuẩn bước đầu đã được xây dựng cho 10 dược chất. Các bộ phổ chuẩn thiết lập được cũng đã được thẩm định cho kết quả độ lặp lại của HQI cao (RSD < 0,5%). So sánh phổ chuẩn đã thiết lập với phổ của một số chất chuẩn khác (USP, Asean, Châu Âu) trong cùng điều kiện không có sự khác nhau giữa các phổ thu được. - Xác định được tiêu chí định tính cơ bản cho các dược chất là BDCRCB gồm vị trí và tỉ lệ cường độ Raman của một số đỉnh có cường độ lớn, có tính đến ảnh hưởng của các tá dược thường dùng trong bào chế các loại viên. - Đã xác định được BDCRCB cho 5 dược chất là ethambutol HCl, ibuprofen, isoniazid, sildenafil citrat, lamivudin. - Đã ứng dụng công nghệ thông tin để xử lý dữ liệu phổ Raman bằng xây dựng phần mềm với Microsoft Visual FoxPro cho cả thiết bi ̣ để bàn và cầm tay để tăng tính khách quan và độ chính xác trong xác định các BDCRCB. - Đã đề xuất được quy trình phân tích định tính sử dụng quang phổ Raman để kiểm tra phát hiện thuốc giả (dạng không có dược chất hoăc̣ sử duṇg sai dươc̣ chất so với công thức đăng ký) trên thị trường bằng phối hợp sử dụng hệ số HQI và BDCRCB gồm 5 bước. 2. Đã thử nghiêṃ phương pháp trên để kiểm tra nhằm phát hiện thuốc giả dạng không có dược chất hoặc sử duṇg sai dươc̣ chất so với công thức trên thị trường Việt Nam. - Quy trình phân tích định tính bằng quang phổ Raman đã được áp dụng để sàng loc̣ cho khoảng 500 mẫu ở một số địa phương (Hà Nội, 24 TP. Hồ Chí Minh, Lào Cai và Đà Nẵng) bằng thiết bi ̣ cầm tay. Kết quả các mẫu đều dương tińh với dươc̣ chất ghi trên nhãn. - 40 chế phẩm đươc̣ lấy mẫu về phòng thí nghiêṃ đã đươc̣ kiểm tra bằng quy trình điṇh tính xây dưṇg trên cả thiết bi ̣ để bàn và cầm tay. Kết quả, các chế phẩm này đều dương tính với dươc̣ chất ghi trên nhãn với hê ̣số HQI đều lớn hơn 95%. - Đã áp dụng BDCRCB xây dựng được cho 25 chế phẩm thuốc trên thị trường (gồm 5 dược chất nghiên cứu) cho kết quả khả quan. - Đã đánh giá được ưu nhược điểm của từng loại thiết bị (để bàn và cầm tay) cũng như khả năng ứng dụng thực tiễn của hai thiết bị này. - 40 chế phẩm trên cũng đã đươc̣ làm mù mẫu và kiểm tra bằng phần mềm xây dưṇg với môṭ dươc̣ chất (isoniazid) đươc̣ lưạ choṇ để so sánh. Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dưṇg là khả thi và có đô ̣ tin câỵ. KIẾN NGHỊ - Với ưu điểm phân tích nhanh, lượng mẫu phân tích ít, rất đặc hiệu cho các dược chất hữu cơ, phương pháp quang phổ Raman hứa hẹn sẽ rất có tiềm năng trong phân tích tìm các dược chất trộn trái phép trong thuốc đông dược. Cần tiếp tục triển khai ứng dụng quang phổ Raman để phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong đông dược, dược liệu. - Tiếp tục sử dụng các quy trình phân tích đã xây dựng để sàng lọc, phân tích thuốc tại hiện trường. Cần tiếp tục nghiên cứu trên các dược chất khác và những dạng bào chế khác để tiếp tục khai thác ưu điểm của phương pháp quang phổ Raman. - Tiếp tuc̣ nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ troṇg viên, mâṭ đô ̣dươc̣ chất trong viên, đô ̣cứng khi dâp̣ viên và kết hợp với các thuật toán để mở rộng khả năng ứng dụng của phương pháp quang phổ Raman nhằm ứng dụng cho việc phát hiện các thuốc giả dạng không đủ hàm lượng trên thị trường. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Đặng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thùy Linh, Thái Nguyễn Hùng Thu (2016), "Bước đầu nghiên cứu ứng dụng phổ Raman trong việc phát hiện nhanh thuốc chống lao giả", Tạp chí Dược học, 01/2016 (477), 6-11. 2. Đặng Thị Ngọc Lan, Đoàn Cao Sơn, Thái Nguyễn Hùng Thu (2016), “Nghiên cứu xác định bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Sildenafil, Ibuprofen và Lamivudin để sàng lọc nhanh thuốc giả", Tạp chí Dược học, 7/2016 (483), 16-20. 3. Đặng Thị Ngọc Lan, Thái Nguyễn Hùng Thu, Đoàn Cao Sơn (2016), “So sánh khả năng ứng dụng của quang phổ Raman để bàn và cầm tay trong phân tích thuốc", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, Số 3, 2016, 14 (53), 22-25. 4. Đặng Thị Ngọc Lan, Đoàn Cao Sơn, Thái Nguyễn Hùng Thu (2016), “Ứng dụng công nghệ thông tin để xác định bộ dịch chuyển Raman cơ bản của một số dược chất", Tạp chí Dược học, 12/2016 (488), 52-55, 70.