Luận văn Tốt nghiệp, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường đến sự sinh trưởng và phát tricuaruar nấm men Sacharomyces cerevisiae

rµng, tÕ bµo nÊm men Sacharomyces cerevisiae ®­îc bao bëi líp thµnh tÕ bµo. CÊu t¹o chñ yÕu cña thµnh tÕ bµo lµ Hªmixenlul« chiÕm 70% träng l­îng kh« (trong ®ã 31% manan, 29% glucan ). Ngoµi ra cßn chøa 1%- 3% kitin, 6% - 10% pr«tªin, 8% - 8,5% lipit, 7% chÊt kho¸ng. Thµnh tÕ bµo cã cÊu t¹o nhiÒu líp lµ c¬ quan b¶o vÖ vµ duy tr× h×nh d¹ng tÕ bµo. Thµnh tÕ bµo nÊm men cã kh¶ n¨ng kÕt dÝnh, cã ý nghÜa lín trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt r­îu vang vµ bia. Bªn ngoµi chÊt nguyªn sinh lµ mµng sinh chÊt (mµng chÊt nguyªn sinh ) cã chøc n¨ng quan träng lµ hÊp phô c¸c chÊt dinh d­ìng vµ th¶i c¸c c¸c s¶n phÈm trao ®æi chÊt. Mµng chÊt nguyªn sinh lµ lipoprotªin chøa nhiÒu hîp chÊt canxi. Mµng chÊt nguyªn sinh ¨n s©u vµo trong t¹o thµnh m¹ng l­íi néi chÊt gåm 2 líp vµ dµy kho¶ng 30- 40A0 vµ cã ty thÓ. Ty thÓ cña nÊm men cã d¹ng h×nh h¹t vµ cã thÓ thay ®æi tuú thuéc ®iÒu kiÖn cña m«i tr­êng còng nh­ tr¹ng th¸i sinh lý cña tÕ bµo, kÝch th­íc kho¶ng 0,2 – 0,6 cm, ty thÓ cã mµng trong suèt, máng (60 – 80 A0 ), cã tÝnh thÊm cao, mµng ty thÓ cã cÊu t¹o 2 líp, líp trong h×nh thµnh nÕp gÊp hoÆc èng nhá h×nh r¨ng l­îc. Líp ngoµi ®­îc cÊu t¹o b»ng nhiÒu ®¬n vÞ h×nh th¸i. Ty thÓ ®­îc cÊu t¹o chñ yÕu b»ng hîp chÊt pr«tªin, lipit trong ®ã chiÕm mét l­îng lín nuclªopr«tªin, photpholipit. Sè l­îng ty thÓ trong tÕ bµo nÊm men tõ 10 ®Õn 20. Chóng tham gia vµo qu¸ tr×nh sinh tr­ëng cña tÕ bµo, sù h×nh thµnh vµ n¶y mÇm cña bµo tö. [1, 3, 9 ]. Trong tÕ bµo nÊm men cã chøa mét hoÆc mét hÖ thèng kh«ng bµo ®­îc h×nh thµnh tõ thÓ glogi hay m¹ng l­íi néi chÊt, kh«ng bµo cã tÝnh chÊt thÈm thÊu cao vµ lµ n¬i tÝch luü c¸c s¶n phÈm cña trao ®æi chÊt. Kh«ng bµo chøa mét hÖ thèng keo, trong ®ã gåm c¸c ®iÖn tö, enzim, protit, hi®rat cacbon, c¸c muèi canxi, photpho, kali, axit nuclªic. H×nh d¹ng cña kh«ng bµo th­êng thay ®æi do sù co rót cña chÊt nguyªn sinh. Trong kh«ng bµo th­êng x¶y ra c¸c ph¶n øng oxi ho¸ - khö nhê vµo hÖ thèng enzim xitocromoxidaza trong kh«ng bµo. Mét d¹ng dù tr÷ cña tÕ bµo lµ glucogen trong m«i tr­êng giµu hi®rat cacbon, glicogen cña tÕ bµo nÊm men ®­îc tÝch luü kh¸ nhiÒu. Kh¸c víi tÕ bµo vi khuÈn, tÕ bµo nÊm men cã nh©n thËt, nh©n cã h×nh trßn, h×nh «van n»m gÇn kh«ng bµo trung t©m cã kÝch th­íc 1- 2,4 µm. Nh©n tÕ bµo ®­îc bao bäc bëi 2 líp mµng tÕ bµo, mçi mµng cã cÊu tróc nh­ mµng c¬ së, gåm 3 líp ph©n tö, nh÷ng líp nµy ®­îc liªn hÖ víi nhau ë gÇn lç mµng nh©n. Lç mµng nh©n tham gia viÖc kiÓm tra qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt tÕ bµo. [6, 9]. 2.2.3. Sinh s¶n cña tÕ bµo nÊm men NÊm men cã nhiÒu h×nh thøc sinh s¶n (sinh s¶n v« tÝnh, sinh s¶n h÷u tÝnh,). B×nh th­êng tÕ bµo nÊm men sinh s¶n n¶y chåi khi gÆp ®iÒu kiÖn kh«ng thuËn lîi mét sè cã thÓ sinh s¶n theo c¸ch t¹o bµo tö. [1, 12 ]. Sinh s¶n v« tÝnh: Sinh s¶n n¶y chåi lµ h×nh thøc sinh s¶n phæ biÕn nhÊt. Khi tÕ bµo ph¸t triÓn ®Õn møc ®é nhÊt ®Þnh th× c¬ thÓ cña nã ®©m ra mét chåi nhá gäi lµ mÇm (hay chåi ). MÇm sinh ra ë vÞ trÝ lÖch t©m trªn ®Çu cña tÕ bµo mÑ. Cïng mét lóc tÕ bµo mÑ cã thÓ ®©m ra nhiÒu nh÷ng chåi ë nhiÒu phÝa kh¸c nhau. ë mçi chåi sÏ nhËn ®­îc mét phÇn chÊt nh©n vµ chÊt nguyªn sinh ë tÕ bµo mÑ. Sau khi n¶y mÇm tÕ bµo con cã thÓ t¸ch khái tÕ bµo mÑ sèng ®éc lËp, còng cã thÓ kh«ng t¸ch khái tÕ bµo mÑ mµ tiÕp tôc n¶y mÇm t¹o ra mét líp tÕ bµo nÊm men gièng h×nh cµnh c©y. Trong ®iÒu kiÖn thuËn lîi mét tÕ bµo ®­îc h×nh thµnh ®iÒu chØnh vµ t¸ch khái tÕ bµo mÑ víi thêi gian 20- 30 phót. NÊm men cßn cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh bµo tö. Bµo tö tói ®­îc sinh ra trong nh÷ng tói nhá gäi lµ tói nang. Mçi tói nang chøa tõ 1 – 8 bµo tö. (Th­êng tõ 4 bµo tö ). NÊm men ®­îc t¹o thµnh tõ 1 tÕ bµo riªng rÏ kh«ng qua tiÕp hîp. Bµo tö tói gÆp ®iÒu kiÖn thuËn lîi sÏ ph¸t triÓn thµnh tÕ bµo nÊm men. TÕ bµo nµy sinh s¶n theo lèi n¶y chåi (Lodder.J.1971 ). Sinh s¶n h÷u tÝnh lµ h×nh thøc hîp nhÊt 2 tÕ bµo nÊm men thµnh hîp tö. TÕ bµo nµy ph¸t triÓn thµnh tói trong ®ã cã gi¶m nhiÔm ®Ó h×nh thµnh c¸c bµo tö. Nhê kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö khoa häc ®· thÊy ®­îc sù kh¸c nhau vÒ thêi gian h×nh thµnh thoi v« s¾c trong sinh s¶n v« tÝnh ë nÊm men ph©n ®«i vµ nÊm men n¶y chåi. NÊm men sinh s¶n v« tÝnh b»ng n¶y chåi hoÆc ph©n ®«i. Gi÷a qu¸ tr×nh nµy cã thÓ sinh s¶n h÷u tÝnh. 2.2.4. NÊm men thuÇn chñng Trong thiªn nhiªn tån t¹i mét sè l­îng lín c¸c chñng nÊm men kh¸c nhau, chóng cã nh÷ng ®Æc tÝnh ®Æc biÖt vµ ®­îc sö dông trong s¶n xuÊt. TÕ bµo nÊm men cã thÓ t×m thÊy ë kh¾p mäi n¬i ®Æc biÖt trªn bÒ mÆt tr¸i c©y. Tuy nhiªn trªn bÒ mÆt tr¸i c©y tån t¹i c¶ nh÷ng nÊm men d¹i, vi khuÈn, nÊm mèc. §Ó tr¸nh ¶nh h­ëng cu¶ nÊm d¹i, vi khuÈn, nÊm mèc,.. mµ ngµy nay xu thÕ lªn men víi chñng thuÇn khiÕt ®ang ®­îc phæ biÕn réng r·i. NÊm men thuÇn chñng lµ nÊm men ®­îc ph¸t triÓn tõ cïng mét tÕ bµo ®· ®­îc ph©n lËp vµ tuyÓn chän trªn m«i tr­êng Hansen. NÊm men ®­îc phæ biÕn vµ sö dông nhiÒu trong s¶n xuÊt lµ loµi Sacharomyces cerevisiae – loµi nµy ®«i khi ®­îc gäi lµ Sacharomyces ellÝpsoideus hoÆc Sacharomyces vini nh­ng nh÷ng tªn nµy ®­îc coi lµ lçi thêi, nã ®­îc ®Æt tªn bëi Hoyer (1837 ), ®­îc m« t¶ tõ ®Çu bëi Schwann trong cïng mét n¨m. * Mét sè chñng hay dïng trong s¶n xuÊt r­îu vang: Sacharomyces vini tr­íc ®©y gäi lµ Sacharomyces cerevisiae vaxini nÊm men nµy chiÕm tíi 80% Saccharomyces. Trong khi lªn men lo¹i nµy cã kh¶ n¨ng lªn men glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin. Saccharomyces oriformis ®­îc t¸ch tõ n­íc nho lªn men tù nhiªn, ®Æc biÖt lo¹i nµy chÞu ®­îc ®­êng cao, t¹o ®é r­îu cao (10% V) trong qóa tr×nh lªn men. Trong qu¸ tr×nh lªn men gièng nhau t¹o thµnh mµng trªn bÒ mÆt dÞch qu¶, cã kh¶ n¨ng lªn men glucoza, fructoza, mantoza. Saccharomyces cerevisiae dïng s¶n xuÊt b¸nh mú, bia r­îu vang, tr­íc ®©y gäi lµ Saccharomyces ellipsoides khi lªn men ®¹t 10 – 20% V cån. * Kh¶ n¨ng lªn men ®­êng cña Saccharomyces Sù lªn men r­îu x¶y ra qua mét sè giai ®o¹n trong thêi kú ®Çu khi m«i tr­êng cßn chøa nhiÒu hµm l­îng oxy ®· hoµ tan, nÊm men chñ yÕu oxy ho¸ ®­êng ®Õn CO2 vµ H2O, vµ sinh s«i n¶y në mét c¸ch m¹nh mÏ. N¨ng l­îng cña sù lªn men kh«ng ®¶m b¶o cho møc ®é ph¸t triÓn cao cña tÕ bµo thêi kú nµy. Trong giai ®o¹n cuèi cïng cña sù lªn men, v× ®­êng cßn l¹i Ýt trong m«i tr­êng nÊm men sÏ sö dông c¸c glicogen ®· ®­îc tÝch luü trong ®ã, do ®ã hµm l­îng glicogen trong tÕ bµo gi¶m dÇn. Tèc ®é lªn men cña c¸c chñng Saccharomyces lªn men r­îu bia lµ kh¸c nhau ®èi víi mçi lo¹i ®­êng. Tèc ®é lªn men ®­êng glucoza vµ fructoza nhanh h¬n xaccaroza. Tèc ®é lªn men ®­îc x¸c ®Þnh l­îng CO2 bay ra tõ mét thÓ tÝch m«i tr­êng nhÊt ®Þnh trong mét ®¬n vÞ thêi gian (Nelte vµ céng sù, 1976 ). * Cã nhiÒu ý kiÕn kh¸c nhau vÒ viÖc sö dông chñng nÊm men thuÇn chñng cho s¶n xuÊt r­îu vang [7]. Nh­ng chØ tõ khi cã nh÷ng h·ng r­îu s¶n xuÊt ®­îc vang ngon tõ gièng thuÇn chñng th× vÊn ®Ò nµy míi ®­îc quan t©m, ph¸t triÓn. NÊm men sö dông réng r·i trong s¶n xuÊt lµ gièng Saccharomyces cerevisiae. Chóng cã sù lu©n phiªn thÕ hÖ n vµ 2n. Thµnh phÇn ho¸ häc cña nÊm men dao ®éng m¹nh phô thuéc vµo d¹ng cña chóng vµ m«i tr­êng nu«i cÊy. Trung b×nh nÊm men chøa 75% n­íc, 25% chÊt kh«. Theo quan ®iÓm kinh tÕ, ng­êi ta chia nÊm men ra thµnh c¸c chñng nh­ sau: + Chñng lªn men víi hiÖu suÊt cån cao, ë thêi gian tèi ­u s¶n xuÊt th× ®¹t 20,5% V cån. + Chñng lªn men trong thêi gian ng¾n, s¶n sinh 8 – 12% V cån, thËm chÝ ë nhiÖt ®é thÊp 4 – 100 c kh«ng bÞ k×m h·m. + Chñng chÞu ®­îc n«ng ®é ®­êng cao, lªn men ®­îc r­îu vang gÇn 30% ®­êng víi hµm l­îng cån 10 -13% V. 2.3. C¸c biÕn ®éng sinh lý, sinh ho¸ vi sinh khi lªn men r­îu vang, kh¶ n¨ng lªn men ®­êng cña Saccharomyces cerevisiae Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt r­îu vang b¾t ®Çu b»ng c«ng ®o¹n: ®Çu tiªn nÊm men sinh s¶n trong m«i tr­êng dÞch qu¶. Lóc ®Çu cÇn nhiÒu oxy kÝch thÝch sinh tr­ëng cña nÊm men. Sau ®ã t¹o ®iÒu kiÖn lªn men r­îu etylic yÕm khÝ nhanh chãng, chiÕm toµn bé kho¶ng kh«ng cho qu¸ tr×nh lªn men t¹o thµnh CO2 vµ r­îu etylic x¶y ra m¹nh mÏ, sù lªn men r­îu etylic ®­îc biÓu diÔn theo ph­¬ng tr×nh sau: [1, 12]. C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q N¨ng l­îng sinh ra phôc vô cho ho¹t ®éng sèng cña tÕ bµo nÊm men vµ tÝch luü trong s¶n phÈm r­îu. Qu¸ tr×nh lªn men r­îu x¶y ra qua 5 giai ®o¹n: Giai ®o¹n 1: Giai ®o¹n ho¹t ho¸ ph©n tö glucoza gåm 3 ph¶n øng. Ph©n tö glucoza nhë enzim: hexotrinaza chuyÓn mét gèc photphat tõ ATP sang t¹o ra glucoza 6 - è lµ d¹ng ho¹t ®éng. Glucoza 6 -è bÞ t¸c dông cña enzim iromeza chuyÓn thµnh fructoza 6 - è cã cÊu t¹o kÐm bÒn v÷ng h¬n. Fructoza 6 – è bÞ photphoril ho¸ 2 lÇn nhê enzim photphorictokinaza víi sù tham gia cña ph©n tö ATP lÇn 2 t¹o ra fructoza 1,6 ®i photphoglyxeric * Giai ®o¹n 2: Giai ®o¹n c¾t m¹ch. Fructo 1,6 ®i è dÔ dµng biÕn ®æi thµnh 3 – Photphoglyxeral®ehyt vµ ®ioxyhi®rooxy axeton photphat nhê xóc t¸c cña enzim aldolaza. ë giai ®o¹n nµy d­íi t¸c dông cña trioza – photphatizomericeza cã thÓ chuyÓn ho¸ lÉn nhau. §ioxyaxeton photphat al®ehyt – 3 – photphoglyxeric. * Giai ®o¹n 3: Oxy ho¸ D­íi t¸c dông cña enzim al®ehyt photphoglyxeri®ehy®rogenaz mµ al®ehyt – 3 – photphoglyxeric bÞ oxy ho¸ thµnh axit 1,3 ®i phophoglixeric. Axit nµy chuyÓn gèc photphat cao n¨ng cho ADP thµnh ATP. Ph¶n øng nµy cã ý nghÜa h¬n v× n¨ng l­îng gi¶i phãng cho qu¸ tr×nh oxy ho¸ ®­îc tÝch luü trong c¸c ph©n tö ATP, ®¶m b¶o cung cÊp n¨ng l­îng cho qu¸ tr×nh ho¹t ®éng cña tÕ bµo trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã oxy. Ph¶n øng do enzim photpho – glyxeratkitonaza xóc t¸c t¹o axit 3 – photphoglyxeric. * Giai ®o¹n 4: Sù t¹o thµnh axit piruvic D­íi sù t¸c dông cña enzim photphat glyxeranmutaza mµ axit 3 – photphoglyxeric bÞ chuyÓn thµnh axit 2 – photphoglyxeric. Do t¸c dông cña enzim enolaza mµ axit 2 – photphoglyxeric chuyÓn thµnh axit enol piruvic D­íc sù t¸c dông cña enzim piruvat kinaza mµ axit 2 photpho enol piruvic chuyÓn thµnh axit piruvic. * Giai ®o¹n 5: Sù chuyÓn axit piruvic thµnh r­îu. §Çu tiªn axit piruvic bÞ khö nhãm cacboxyl thµnh CO2 vµ axetal®ehyt nhê enzim xóc t¸c lµ pyruvat ®ecacbonxylaza. Sau ®ã axetal®ehyt bÞ khö thµnh etanol nhê enzim alco®ehi®rogenaz. Ph­¬ng tr×nh tæng qu¸t qu¸ tr×nh lªn men: C6H12O6 + 2ADP+ 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 6H2O Nh­ vËy sù lªn men chuyÓn ®­êng thµnh r­îu lµ mét d·y c¸c qu¸ tr×nh oxy ho¸ khö cã enzim trong tÕ bµo nÊm men tham gia. 2.4. HÖ vi sinh vËt tham gia vµo qu¸ tr×nh lªn men r­îu vang, bÖnh vang 2.4.1. NÊm men 2.4.2. NÊm mèc NÊm mèc ph¸t triÓn ë qu¶, chÊt b· cña s¶n xuÊt r­îu vang, thïng chøa thiÕt bÞ hoÆc do bôi, kh«ng khÝ ®­a ®Õn nh­ nÊm mèc thuéc chi Rhizopus, Aspergillus. 2.4.3. Vi khuÈn Trong n­íc hoa qu¶ vµ n­íc r­îu vang cã thÓ ph¸t triÓn nh÷ng d¹ng vi khuÈn cã tÝnh æn ®Þnh lín víi r­îu vµ axit h÷u c¬. Chóng cã thÓ g©y ra nh÷ng biÕn ®æi s©u s¾c trong r­îu vang vÒ vÞ chua, mïi vµ cã loµi cßn g©y bÖnh lµm ®ôc cho vang, ®ã th­êng lµ c¸c vi khuÈn Acetorbacter xylium, Acetorbacter aceti. Pasteur ®· kh¸m ph¸ c¬ chÕ lµm ho¸ láng vang cña c¸c vi sinh vËt khi r­îu vang tiÕp xóc víi kh«ng khÝ nhiÔm vi khuÈn Bacillus. Do vËy, ®Ó b¶o qu¶n r­îu vang ng­êi ta cã thÓ thanh trïng pasteur nh­ng nã lµm gi¶m chÊt l­îng r­îu vang, ph­¬ng ph¸p vi läc hoÆc dïng mét sè chÊt b¶o qu¶n phæ biÕn nh­ SO2 ( 75 – 120 mg/l ). 2.4.4. BÖnh vang BÖnh vang ®· ®­îc Pasteur nghiªn cøu vµ kh¸m ph¸. BÖnh vang lµ hiÖn t­îng r­îu bÞ chua ®i vµ phÈm chÊt gi¶m rÊt nhanh. [1,18]. Nguyªn nh©n: Do r­îu vang tiÕp xóc víi kh«ng khÝ vµ do ®ã d­íi t¸c dông cña vi khuÈn axit axetic ph¸t triÓn ®· biÕn cån thµnh axit. Ngoµi ra bÖnh vang cßn cã thÓ do vi sinh vËt lªn men kþ khÝ. 2.5. C¸c yÕu tè ¶nh h­ëng tíi qu¸ tr×nh sinh tr­ëng cña nÊm men 2.5.1. Nguån cacbon Cacbon cã trong tÕ bµo chÊt thµnh tÕ bµo, trong tÊt c¶ c¸c ph¶n øng enzim axit nucleic vµ s¶n phÈm trao ®æi chÊt. V× vËy c¸c hîp chÊt cacbon cã vÞ trÝ quan träng hµng ®Çu cho sù sinh tr­ëng nÊm men. Nguån thøc ¨n chñ yÕu cña nÊm men lµ hy®rat cacbon, nã ®¸p øng 3 nhu cÇu cña nÊm men lµ: - S¶n sinh n¨ng l­îng - T¹o thµnh nh÷ng tiÒn chÊt - Thùc hiÖn qu¸ tr×nh oxy ho¸ khö ®Ó biÕn nh÷ng tiÒn chÊt nµy thµnh s¶n phÈm trung gian, ®Ó x©y dùng tÕ bµo hoÆc tÝch tô trong m«i tr­êng. 2.5.2. Nguån nit¬ vµ muèi kho¸ng - Nguån nit¬: Trong qu¸ tr×nh sèng cña nÊm men còng nh­ tÊt c¶ nh÷ng c¬ thÓ sèng kh¸c ®Òu cÇn nit¬ ®Ó x©y dùng tÕ bµo. Do ®ã m«i tr­êng nu«i cÊy cÇn cung cÊp ®Çy ®ñ c¸c hîp chÊt nit¬ mµ nÊm men cã thÓ ®ång ho¸. - C¸c nguyªn tè cña photpho, l­u huúnh ®ãng vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña tÕ bµo nÊm men, tham gia chñ yÕu vµo thµnh phÇn cña nh©n, h¹t nhiÔm s¾c thÓ, enzim. C¸c ion: Ca2+, Mg2+ ®iÒu chØnh sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo nÊm men. C¸c ion: Fe3+, Mg2+ n»m trong thµnh phÇn cña enzim ho¹t ®éng sinh häc còng ¶nh h­ëng tíi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña nÊm men [16]. 2.5.3. Nguån Oxi §èi víi nÊm men dïng ®Ó lªn men, oxi cÇn trong giai ®o¹n ®Çu gióp nÊm men sinh tr­ëng, t¨ng sinh khèi. Qu¸ tr×nh lªn men r­îu diÔn ra ë ®iÒu kiÖn yÕm khÝ ®Ó t¨ng hiÖu qu¶ t¹o cån. Sù khuÊy ®¶o lµm t¨ng tèc ®é lªn men, rót ng¾n thêi gian lªn men cã lîi vÒ mÆt kinh tÕ nh­ng kh«ng cã lîi vÒ c«ng nghÖ do t¹o s¶n phÈm bËc hai qu¸ lín. 2.6. C¸c yÕu tè ¶nh h­ëng tíi qu¸ tr×nh lªn men 2.6.1. pH m«i tr­êng Trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy, pH m«i tr­êng bÞ biÕn ®æi khiÕn cho sù sinh s¶n cña nÊm men còng bÞ biÕn ®æi, ë giai ®o¹n cuèi pH t¨ng lªn mét Ýt do m«i tr­êng lóc nµy b¾t ®Çu khan hiÕm chÊt dinh d­ìng vµ ho¹t lùc enzim trong tÕ bµo lín. V× vËy nÊm men tù ph©n huû vµ gi¶i phãng NH3. Khi pH d­íi 2 – 3 th× qu¸ tr×nh lªn men bÞ yÕu ®i. NÕu pH trªn 6,5 – 7,5 kh¶ n¨ng lªn men vang ph¸t triÓn tèt: 4,0 – 5,0. 2.6.2. ¶nh h­ëng cña nhiÖt ®é Qu¸ tr×nh lªn men th­êng sinh ra nhiÖt vµ l­îng nhiÖt nµy cã ¶nh h­ëng lín ®Õn chÊt l­îng r­îu. NhiÖt ®é ¶nh h­ëng lín ®Õn qu¸ tr×nh ph¸t triÓn cña nÊm men do c¸c ph¶n øng sinh ho¸ diÔn ra trong tÕ bµo ®Òu chÞu sù chi phèi cña nhiÖt ®é. NhiÖt ®é giíi h¹n cña men r­îu vang lµ kh«ng qu¸ 300 c. ë 35 0c ®­îc coi lµ nhiÖt ®é nguy hiÓm, tuy nhiªn ®©y kh«ng ®­îc coi lµ quy luËt chung tuyÖt ®èi vÒ nhiÖt ®é. NhiÖt ®é 35 0c nÊm men mÊt t¸c dông , qu¸ tr×nh lªn men bÞ dõng l¹i nh­ng kh«ng bÞ chÕt nÊm men. Trong qu¸ tr×nh lªn men r­îu vang, viÖc khèng chÕ nhiÖt ®é d­íi 30 0c lµ ®iÒu rÊt quan träng. NÕu v­ît qu¸ ®Õn nhiÖt ®é tíi h¹n (350 c ), qu¸ tr×nh lªn men r­îu bÞ ngõng l¹i ¶nh h­ëng ®Õn viÖc chuyÓn ho¸ ®­êng thµnh cån vµ CO2. §ång thêi l­îng ®­êng sãt l¹i ch­a ®­îc lªn men lµ m«i tr­êng cho c¸c vi khuÈn sinh khÝ ho¹t ®éng, ®Æc biÖt vi khuÈn chuyÓn ho¸ ®­êng thµnh axit l¾c tÝc hoÆc axit axetic, ®ã lµ hiÖn t­îng ho¸ chua axit, lµm gi¶m chÊt l­îng r­îu vang. Ng­îc l¹i ë nhiÖt ®é thÊp (<20 0c), qu¸ tr×nh lªn men x¶y ra chËm ch¹p, c¸c cÊu tö cã lîi cho r­îu vang ®­îc h×nh thµnh qu¸ Ýt. Qu¸ tr×nh lªn men b¾t ®Çu tèt ë nhiÖt ®é 200 c, ë 25 0c qu¸ tr×nh lªn men x¶y ra râ rÖt sau 12 h, cßn 17 - 18 0c x¶y ra sau 24 h. Qu¸ tr×nh lªn men kh«ng diÔn ra ë nhiÖt ®é thÊp 100c. Nh­ vËy nhiÖt ®é thÝch hîp cho nÊm men ph¸t triÓn lµ 20 - 28 0c. 2.6.3. ¶nh h­ëng cña nång ®é cån Nghiªn cøu cho biÕt nång ®é cån thÝch hîp cho r­îu vang ph¸t triÓn tèt: 9 – 140. Hµm l­îng cån cao g©y khã kh¨n cho qu¸ tr×nh lªn men, lµm chËm, thËm chÝ lµm dõng l¹i qu¸ tr×nh lªn men. ¶nh h­ëng cña cïng mét hµm l­îng cån ë 300 c vµ 200c lµ hoµn toµn kh¸c nhau. ë 300 c cån g©y ¶nh h­ëng xÊu h¬n ë 20 0c. §iÒu nµy cã ý nghÜa quan träng trong viÖc c¶i t¹o chÊt l­îng r­îu vang. NhiÒu thÝ nghiÖm chØ ra r»ng, chÝnh hµm l­îng cån cao (nång ®é cån 14% ) ®· c¶n trë sù lªn men chø kh«ng ph¶i sù thiÕu v¾ng c¸c chÊt sinh tr­ëng hoÆc sù t¹o thµnh c¸c chÊt kh¸ng khuÈn. §Ó phôc vô cho c«ng nghiÖp s¶n xuÊt r­îu vang, c¶i thiÖn chÊt l­îng vang, nhiÒu nhµ nghiªn cøu ®· t¹o ra nh÷ng nßi nÊm men thÝch øng víi nång ®é cao. ViÖc sö dông c¸c nßi nÊm men nµy lµ bæ Ých song c¸c nßi nµy rÊt nh¹y c¶m víi nhiÖt ®é cao. 2.6.4. ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng vµ ¸p suÊt thÈm thÊu Ngoµi yÕu tè pH, nhiÖt ®é, ®é cån th× nång ®é ®­êng còng lµ mét yÕu tè quan träng, ¶nh h­ëng ®Õn qu¸ tr×nh lªn men. Nång ®é ®­êng cao, øc chÕ qu¸ tr×nh lªn men. Nång ®é ®­êng thÝch hîp kho¶ng 200 – 280 g/l. NÕu cao h¬n n÷a tèc ®é lªn men gi¶m ®i. §­êng vµ c¸c chÊt hoµ tan kh¸c trong m«i tr­êng t¹o ¸p suÊt, ¸p suÊt thÈm thÊu chªnh lÖch gi÷a tÕ bµo nÊm men vµ m«i tr­êng nu«i cÊy. Sù chªnh lÖch nµy lµm cho c¸c chÊt dinh d­ìng dÔ hßa tan vµ thÊm vµo m«i tr­êng tÕ bµo qua mµng vµ s¶n phÈm cña tÕ bµo hoµ tan vµo m«i tr­êng. ¸p suÊt thÈm thÊu qu¸ cao g©y hiÖn t­îng kh« sinh lý teo chÊt nguyªn sinh. Nång ®é qu¸ cao tÕ bµo nÊm men kh«ng sinh tr­ëng ®­îc. Nång ®é ®­êng qu¸ thÊp tÕ bµo sÏ ngõng ph¸t triÓn. PhÇn 3 §èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 3.1. §èi t­îng nghiªn cøu Qu¶ v¶i thiÒu (Litchi chinensis sonn ) ®­îc thu nhËn tõ hai trung t©m trång vµ thu ho¹ch nhiÒu nhÊt ë ViÖt Nam lµ huyÖn Lôc Ng¹n (B¾c Giang ) vµ Thanh Hµ (H­ng Yªn ). C¸c chñng nÊm men nghiªn cøu ®­îc ph©n lËp tõ dÞch cïi qu¶ v¶i thiÒu cã vÞ trÝ ph©n lo¹i theo Yelinov N.(1996 ) sau ®©y: Líp : Ascomycetes Bé : Saccharomyateae Hä phô : Saccharomyateaetdieae Gièng : Saccharomyces Loµi : Cervisiae 3.2. Ho¸ chÊt - §­êng: glucoza, sacaorza. - Mét sè chÊt v« c¬: KH2SO4 ( Kalihi®rophotphat ). MgSO4. 7H2O ( Magie sun phat ). - Mét sè chÊt h÷u c¬: Th¹ch agar, pept«n, phenolphtalein. - N­íc cÊt, n­íc m¸y. - Cån. 3.3. Dông cô thiÕt bÞ - Nåi hÊp ¸p lùc. - Cån kÕ. - KÝnh hiÓn vi quang häc. - Buång ®Õm Goriaev. - C©n kü thuËt vµ c©n ph©n tÝch. - Tñ sÊy. - Buång v« trïng. - èng nghiÖm. - M¸y ®o pH vµ giÊy ®o pH. - Hép pªtri. - B×nh cÇu, b×nh tam gi¸c. - Bµn trong thuû tinh, phÔu thuû tinh, c«c thuû tinh. - Que cÊy, ®Ìn cån. 3.4. M«i tr­êng Dùa vµo tÝnh chÊt cña nÊm men Saccharomyces cerevisiae chóng t«i chän m«i tr­êng v« c¬ theo tû lÖ sau: 3.4.1. M«i tr­êng Hansen (MT1 ) g/l: M«i tr­êng ph©n lËp vµ s¬ tuyÓn chñng nÊm men - §­êng glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Th¹ch agar : 20 g. - N­íc cÊt : 1000 ml. 3.4.2. M«i tr­êng nh©n gièng (MT2 ): g/l. - §­êng glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - N­íc cÊt : 1000 ml. 3.4.3. M«i tr­êng lªn men (MT3 ) : g/l. - DÞch siro hoa qu¶ :200 - MgSO4. 7 H2O : 1,0 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - N­íc cÊt : 1000 ml. 3.5. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu: Trong ®Ò tµi nµy t«i sö dông ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu sau: TuyÓn chän khuÈn l¹c nÊm men. X¸c ®Þnh ho¹t lùc lªn men b»ng: + C©n b×nh träng l­îng. +X¸c ®Þnh sè l­îng tÕ bµo trªn buång ®Õm Goriaev vµ ho¹t ho¸ gièng. X¸c ®Þnh hµm l­îng ®­êng b»ng khóc x¹ kÕ. X¸c ®Þnh ®é pH b»ng giÊy ®o pH vµ m¸y ®o pH. Quan s¸t tÕ bµo nÊm men trªn kÝnh hiÓn vi quang häc cã ®é phãng ®¹i 1000 lÇn. C¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch: + X¸c ®Þnh hµm l­îng axit trong dÞch lªn men b»ng chuÈn ®é NaOH 0,1 N. + X¸c ®Þnh ®é cån b»ng ancol kÕ råi quy vÒ ®é cån chuÈn 150c, b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc. Xö lý sè liÖu b»ng thèng kª to¸n häc. 3.5.1. Ph©n lËp vµ tuyÓn chän khuÈn l¹c nÊm men trªn m«i tr­êng th¹ch ®Üa: §Ó tuyÓn chän mét tËp hîp tÕ bµo nÊm men cña cïng mét nßi cã kÝch th­íc h×nh th¸i vµ kh¶ n¨ng lªn men nh­ nhau, chóng t«i chän ph­¬ng ph¸p ph©n lËp trªn hép pªtri. M«i tr­êng ®Ó tuyÓn chän khuÈn l¹c nÊm men lµ Hansen. C¸c tiÕn hµnh: M«i tr­êng ph©n lËp ®­îc khö trïng vµ ph©n vµo c¸c hép pªtri v« trïng ®Ó nguéi theo ph­¬ng ph¸p Pasteur. DÞch hoa qu¶ ®· ®­îc pha lo·ng 10-1- 10-10 b»ng n­íc cÊt. Nhê mét hai giät huyÒn phï víi ®é pha lo·ng 10-9 lªn bÒ mÆt th¹ch dµn ®Òu b»ng bµn trang. Gãi kÝn vµ nu«i trong tñ Èm ë ®iÒu kiÖn 24 – 280c trong 4 ngµy trªn bÒ mÆt xuÊt hiÖn c¸c khuÈn l¹c, víi c¸c ®Æc ®iÓm tr¾ng, bãng ®Æc tr­ng cho nÊm men (mÐp r¨ng c­a vµ nh½n bãng ). 3.5.2. Ph­¬ng ph¸p ho¹t ho¸ gièng Tr­íc khi cÊy nÊm men vµo dÞch lªn men ®Ó cã nh÷ng tÕ bµo to khoÎ th× t«i tiÕn hµnh ho¹t ho¸ gièng b»ng c¸ch nu«i trªn m«i tr­êng th¹ch nghiªng 24 – 280c trong vßng 24 h trªn m¸y l¾c. Sau ®ã ®em cÊy vµo dÞch nh©n gièng ®­îc pha ë nång ®é ®­êng 10% trong vßng 24 h ®­îc gièng cÊp hai. 3.5.3. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t lùc lªn men cña nÊm men §Ó biÕt ®­îc ho¹t lùc lªn men so s¸nh gi÷a c¸c chñng, chóng t«i ®· tiÕn hµnh dïng c¸c ph­¬ng ph¸p sau: * Ph­¬ng ph¸p c©n b×nh träng l­îng: DÞch lªn men trong c¸c b×nh cã cïng thÓ tÝch 250 ml m«i tr­êng, cã cïng mét l­îng tÕ bµo nÊm men cña c¸c gièng kh¸c nhau. Sau 24 h lªn men ®em c©n träng l­îng chªnh lÖch gi÷a 2 lÇn c©n lµ 0,1 th× dõng l¹i. * Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tÕ bµo b»ng buång ®Õm Goriaev: CÊy gièng vµo m«i tr­êng nh©n gièng ë 280c, l¾c ®Òu canh tr­êng dïng pipet chia ®é pha lo·ng canh tr­êng. Tuú theo møc ®é giai ®o¹n ph¸t triÓn mµ ®é pha lo·ng theo tû lÖ kh¸c nhau. Dïng pipet lÊy dÞch pha lo·ng nhá vµo mét khe hë gi÷a hai tÊm kÝnh, chó ý tr¸nh t¹o bät khÝ sau ®ã ®Æt l¸ kÝnh lªn trªn ®Ó yªn 3 – 5 phót råi tiÕn hµnh soi trªn kÝnh hiÓn vi ë vËt kÝnh 10 vµ 40 ®Õm sè tÕ bµo trong 5 « lín chÐo nhau. C¸ch tÝnh sè tÕ bµo trong 1 ml : M = A. 50. B. Trong ®ã: M: Sè tÕ bµo trong 1 ml dÞch huyÒn phï. A: Sè l­îng tÕ bµo trung b×nh trong 1 « vu«ng. B : HÖ sè pha lo·ng. 3.5.4. Ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch + X¸c ®Þnh hµm l­îng ®­êng b»ng khóc x¹ kÕ. + X¸c ®Þnh ®é pH b»ng giÊy ®o pH vµ m¸y ®o pH. + X¸c ®Þnh hµm l­îng axit trong dÞch lªn men b»ng c¸ch: Dùa vµo nguyªn t¾c trung hoµ axit b»ng dung dÞch NaOH 0,1 N tõ sè ml NaOH 0,1 N dïng ®Ó chuÈn ta suy ra hµm l­îng axit trong dÞch lªn men. Ph¶n øng trung hoµ: OH- + H+ H2O 3.5.5. Quan s¸t h×nh d¹ng tÕ bµo trªn kÝnh hiÓn vi Quan s¸t h×nh th¸i tÕ bµo nÊm men trªn kÝnh hiÓn vi quang häc cã ®é phãng ®¹i 1000 lÇn. 3.5.6. Ph­¬ng ph¸p xö lý c¸c kÕt qu¶ b»ng thèng kª to¸n häc Xö lý c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ theo ph­¬ng ph¸p thèng kª to¸n häc th«ng qua c¸c th«ng sè sau: - Gi¸ trÞ trung b×nh sè häc: = - §é lÖch chuÈn: = nÕu n < 30 = nÕu n 30 - Sai sè trung b×nh sè häc: m = - HÖ sè biÕn ®éng: Cv % = . 100 (%). n : Sè lÇn lÆp l¹i. Xi : Gi¸ trÞ ®o lÇn thø i. PhÇn 4 KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn 4.1. Ph©n lËp, tuyÓn chän vµ ®Þnh lo¹i chñng nÊm men 4.1.1. Tiªu chuÈn chän chñng Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt etanol phô thuéc vµo chñng dïng trong lªn men. NÊm men sö dông ®Ó lªn men r­îu vang tõ dÞch v¶i thiÒu ph¶i ®¹t c¸c yªu cÇu sau: [10, 12]. - Lªn men tèt trong m«i tr­êng cã hµm l­îng ®­êng cao. - ChÞu ®é cån vµ ®é axit cao. - Tèc ®é ph¸t triÓn nhanh, chu kú lªn men ng¾n. - H­¬ng th¬m cã t¹o c¸c este ®Æc biÖt. - DÔ l¾ng trong. - æn ®Þnh l©u dµi trong s¶n xuÊt. 4.1.2. Ph©n lËp vµ tuyÓn chän M«i tr­êng ph©n lËp lµ m«i tr­êng Hansen ®­îc thanh trïng theo ph­¬ng ph¸p Pasteur sau ®ã ®­îc ph©n vµo c¸c ®Üa petri ®· v« trïng. DÞch v¶i ®­îc pha lo·ng tõ 10-1 – 10-10, dïng pipet lÊy 1 ml dÞch huyÒn phï 10-9 më hÐ ®Üa petri nhá vµo ®ã tõ 1 – 2 giät, dïng bµn trang v« trïng nhÑ nhµng dµn ®Òu thÓ tÝch ®ã kh¾p bÒ mÆt m«i tr­êng. Nu«i trong tñ Êm 280 c trong thêi gian 48 giê. Sau 12 lÇn ph©n lËp chóng t«i ®· chän ®­îc 35 mÉu nÊm men. Khi cã mÉu tiÕn hµnh lùa chän 2 mÉu cã ®­êng kÝnh khuÈn l¹c lín nhÊt vµ kh¶ n¨ng lªn men cao nhÊt ®­a sang nghiªn cøu tiÕp. Hai mÉu nÊm men nµy t¹m thêi ®­îc gäi lµ H7 vµ C13. 4.1.3. X¸c ®Þnh tªn khoa häc cña hai mÉu nÊm men H7 vµ C13 Dùa vµo kho¸ ph©n lo¹i cña Loder n¨m 1971 (Kho¸ ph©n lo¹i míi ®­îc nhiÒu ng­êi sö dông ), theo khãa ph©n lo¹i nµy c¶ hai mÉu nÊm men nghiªn cøu ®Òu cã ®Æc tÝnh [10]: - Sinh s¶n b»ng n¶y chåi nhiÒu phÝa. - Kh«ng ®ång ho¸ nitrat. - TÕ bµo h×nh trøng, ovan, h×nh cÇu. - Lªn men Gluc«za m¹nh. - Lªn men ®­îc saccaroza, galactoza, mantoza. - §iÒu kiÖn kh«ng thuËn lîi h×nh thµnh 1 4 bµo tö. - Mçi nang chøa 2 4 bµo tö. Tõ ®ã t¹m thêi ®Æt tªn cho 2 mÉu nÊm men lµ Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13. 4.2. X¸c ®Þnh ho¹t lùc lªn men Trong qu¸ tr×nh lªn men th× ho¹t lùc lªn men ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng hµm l­îng CO2 sinh ra. L­îng CO2 sinh ra cµng nhiÒu, tho¸t ra ngoµi m«i tr­êng th× träng l­îng b×nh lªn men cµng gi¶m. §iÒu ®ã chøng tá ho¹t lùc lªn men cµng m¹nh. Chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm trªn hai chñng H7 vµ C13 víi sè lÇn nh¾c l¹i lµ 8 lÇn, thu ®­îc kÕt qu¶ l­îng CO2 tho¸t ra trong 72 h tõ khi lªn men ë b¶ng sè 2. B¶ng 2.Hµm l­îng khÝ CO2 gi¶i phãng sau 72 h lªn men cña hai chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13. Tªn chñng Hµm l­îng CO2 (g/100 ml ) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 H7 2,32 2,36 2,30 2,58 2,60 2,35 2,47 2,40 C13 2,60 2,48 2,45 2,32 2,30 2,58 2,28 2,35 Qua kÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy hai chñng H7vµ C13 ®Òu lªn men m¹ch, l­îng CO2 tho¸t ra nhiÒu, phñ kÝn bÒ mÆt lªn men lµm m«i tr­êng lªn men Ýt bÞ « nhiÔm. Sù ph¸t triÓn nhanh cña tÕ bµo nÊm men lµm cho vi khuÈn, nÊm men d¹i khã x©m nhËp, víi l­îng CO2 tho¸t ra ®¹t trªn 4g/100 ml lµ ®¹t yªu cÇu dïng cho lªn men r­îu vang c¸c lo¹i hoa qu¶. V× vËy, hai chñng nµy ®­îc nghiªn cøu tiÕp ®éng th¸i ph¸t triÓn [10]. 4.2.2. §éng th¸i ph¸t triÓn cña hai chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 Trong qóa tr×nh s¶n xuÊt r­îu vang giai ®o¹n nh©n gièng chiÕm mét thêi gian ng¾n kho¶ng 24 – 28 h, nh­ng nã l¹i ®ãng vai trß hÕt søc quan träng trong qu¸ tr×nh t¨ng nhanh sè l­îng cña tÕ bµo nÊm men. ViÖc nghiªn cøu c¸c nh©n tè ¶nh h­ëng tíi sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn 2 chñng H7 vµ C13 lµ mét phÇn trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt r­îu. Chóng t«i tiÕn hµnh nu«i cÊy trªn m«i tr­êng sè 2 (m«i tr­êng nh©n gièng ) ë ®iÒu kiÖn m«i tr­êng 280c, sè tÕ bµo ban ®Çu 3,5 . 106 tÕ bµo, cø sau 12 h kiÓm tra 1 lÇn. Môc ®Ých lµ x¸c ®Þnh ®éng th¸i ph¸t triÓn cña 2 chñng nÊm men H7 vµ C13. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®­îc diÔn ra ë b¶ng 3 vµ ®å thÞ 2. B¶ng 3. §éng th¸i ph¸t triÓn cña 2 chñng nÊm men S . cerevisiae H7 vµ C13 Thêi gian(h) H7 C13 M.106±m d (%) Cv (%) M.106±m d (%) Cv (%) 0 3,5 ± 0,2 0,00 0,00 3,5 ± 0,2 0,00 0,00 4 6,2 ± 2 0,14 0,24 8,0 ± 3 0,15 0,24 8 11,8 ± 2,5 0,12 0,20 12,6 ± 34 0,14 0,22 12 14 ± 2 0,12 0,20 16± 0,41 0,13 0,20 16 28,2 ± 0,36 0,08 0,14 28 ± 0,26 0,10 0,16 20 37 ± 0,23 0,06 0,10 39 ± 0,25 0,07 0,11 24 46 ± 0,25 0,03 0,05 48 ± 0,28 0,02 0,03 28 52 ± 0,36 0,02 0,03 56 ± 0,32 0,02 0,03 32 68 ± 0,42 0,03 0,05 78 ± 0,38 0,04 0,06 36 82 ± 0,38 0,07 0,12 90 ± 0,42 0,07 0,11 40 108 ± 0,46 0,14 0,24 112 ± 0,48 0,14 0,22 44 116 ± 0,42 0,16 0,25 126 ± 0,38 0,17 0,27 48 124 ± 0,49 0,18 0,31 138 ± 0,51 0,21 0,33 52 120 ± 0,43 0,15 0,22 134 ± 0,37 0,17 0,27 Sè l­îng tÕ bµo ( M.106) Thêi gian(h) §å thÞ 2. §éng th¸i ph¸t triÓn cña 2 chñng H7 vµ C13. Nh­ vËy c¶ 2 chñng H7 vµ C13 ®Òu cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn tèt vµ theo ®óng ®éng th¸i ph¸t triÓn . Tõ kÕt qu¶ trªn ta x¸c ®Þnh ®­îc ®éng th¸i ph¸t triÓn cña 2 chñng nh­ sau: - Pha tiÒn ph¸t: tõ 0h – 12h, v× giai ®o¹n nµy tÕ bµo míi thÝch nghi víi m«i tr­êng, kÝch th­íc tÕ bµo t¨ng dÇn lªn. - Pha logarit (pha cÊp sè mò ): tõ 12h – 48h, tÕ bµo nÊm men ph¸t triÓn nhanh do l­îng vËt chÊt tÝch luü ë pha tiÒn ph¸t. - Pha c©n b»ng: tõ 48h – 60h, sè l­îng tÕ bµo kh«ng t¨ng. - Pha suy vong: Tèc ®é sinh tr­ëng cña nÊm men gi¶m nhanh do vËy nÊm men chÕt nhiÒu. Mét sè nghiªn cøu tr­íc ®©y cho thÊy kÕt qu¶ lµ pha logarit tõ 12h – 96h. Tuy nhiªn pha logarit cña 2 chñng H7 vµ C13 mµ chóng ta ®· nghiªn cøu chØ tån t¹i tõ 12h – 48h. Nguyªn nh©n do m«i tr­êng cã ®é cån cao, ®é pH thÊp mµ c¸c tÕ bµo nÊm men sinh ra ®· lªn men, lµm øc chÕ sù sinh tr­ëng cña nÊm men. 4.3. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña m«i tr­êng dinh d­ìng ®Õn sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña 2 chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 trong m«i tr­êng lªn men Nh­ chóng ta ®· biÕt hµm l­îng r­îu etylic t¹o thµnh, l­îng axit h÷u c¬ sinh ra sÏ quyÕt ®Þnh ®Õn chÊt l­îng r­îu vang. Do ®ã viÖc nghiªn cøu yÕu tè cña m«i tr­êng ®Õn qu¸ tr×nh lªn men r­îu vang lµ vÊn ®Ò cÇn thiÕt. Sù biÕn ®æi c¸c yÕu tè m«i tr­êng trong mét ph¹m vi nhÊt ®Þnh sÏ ¶nh h­ëng tíi sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña tÕ bµo nÊm men. M«i tr­êng chóng t«i dïng ®Ó lªn men lµ m«i tr­êng sè 3 (MT3 ) m«i tr­êng ®­îc bæ sung ®­êng cho ®ñ 210 g/l, hµm l­îng men sãt, hµm l­îng r­îu t¹o thµnh, l­îng CO2 gi¶i phãng, c¸c chØ tiªu ®­îc x¸c ®Þnh sau 15 ngµy. KÕt qu¶ ®­îc dÉn ra ë b¶ng 4 vµ ®å thÞ sè 2, 3. B¶ng 4. Nång ®é cån, hµm l­îng ®­êng sãt,hµm l­îng CO2, ®é pH trong dÞch lªn men sau 15 ngµy cña 2 chñng H7 vµ C13 Thêi gian (ngµy) §­êng (g/l) CO2 (g/l) R­îu (% V) pH H7 C13 H7 C13 H7 C13 H7 C13 1 210 210 0 0 0 0 4,5 4,5 2 180,6 1 182 1 17,8 0,5 18 0,5 1,8 0,05 2,0 0,05 4,39 4,40 3 160,5 1 162,3 1 19,2 0,5 19,3 0,5 2,1 0,05 2,2 0,05 4,32 4,38 4 143,1 1 140,4 1 20,5 0,5 21,4 0,5 2,8 0,05 3,1 0,05 4,28 4,27 5 110,4 1 108,5 1 25,3 0,5 26,1 0,5 3,5 0,05 3,7 0,05 4,15 4,13 6 87,9 0,8 86,3 0,8 28,9 0,5 29,4 0,5 4,1 0,05 4,2 0,05 4,11 4,09 7 63,5 0,6 60,2 0,6 32,4 0,5 35,2 0,5 4,9 0,05 4,8 0,05 4,07 4,05 8 58,6 0,6 59,3 0,6 40,1 0,5 40,4 0,5 5,5 0,05 5,6 0,05 4,0 4,0 9 46,2 0,4 45,7 0,4 46,2 0,5 48,6 0,5 6,3 0,05 6,5 0,05 3,92 3,93 10 37,1 0,4 39,2 0,4 53,5 0,5 59,2 0,5 7,7 0,05 7,4 0,05 3,86 3,82 11 31,2 0,3 30,7 0,3 60,2 0,5 63,8 0,5 8,4 0,05 8,6 0,05 3,73 3,76 12 22,8 0,3 23 0,3 78,1 0,5 80,2 0,5 9,3 0,05 9,4 0,05 3,62 3,64 13 15,3 0,2 15,9 0,2 83,6 0,5 87,9 0,5 10,4 0,05 10,6 0,05 3,51 3,56 14 10,2 0,2 11,4 0,2 91,3 0,5 93,8 0,5 11,5 0,05 11,5 0,05 3,33 3,29 15 5,3 0,2 5,2 0,2 103,8 0,5 100,4 0,5 12,8 0,05 12,9 0,05 3,20 3,21 §å thÞ 2. Nång ®é cån, hµm l­îng ®­êng sãt,hµm l­îng CO2, ®é pH trong dÞch lªn men sau 15 ngµy cña Sacharomyces cerevisiae H7 §å thÞ 3. BiÓu diÔn Nång ®é cån, hµm l­îng ®­êng sãt,hµm l­îng CO2, ®é pH trong dÞch lªn men sau 15 ngµy cña Sacharomyces cerevisiae C13 Qua b¶ng 4 vµ ®å thÞ 2, 3 cho thÊy chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 ph¸t triÓn m¹nh b¾t ®Çu tõ ngµy thø 2 trë ®i v× nã ®­îc ®¸nh dÊu b»ng sù gi¶m ®i hµm l­îng ®­êng trong dung dÞch lªn men. Sù gi¶m hµm l­îng ®­êng t¨ng m¹nh ë c¸c ngµy tiÕp theo. §ång thêi víi sù gi¶m hµm l­îng ®­êng lµ sù t¨ng lªn cña khÝ CO2 tho¸t ra. §é r­îu còng t¨ng vµ ®¹t cùc ®¹i vµo ngµy 15 lµ 12,8% V (H7 ) vµ 12,9% V (C13 ). Qóa tr×nh lªn men hµm l­îng axit t¨ng lªn lµm pH cña m«i tr­êng gi¶m m¹nh tõ 4,5 xuèng 3,20 (H7 ), 3,21 (C13 ) t¹o nªn vÞ chua cña r­îu vang. 4.3.1. ¶nh h­ëng cña hµm l­îng ®­êng tíi qu¸ tr×nh lªn men Qu¸ tr×nh lªn men quyÕt ®Þnh chÊt l­îng r­îu vang. M«i tr­êng lªn men cã nhiÒu ®Æc ®iÓm kh¸c so víi m«i tr­êng nh©n gièng: hµm l­îng ®­êng trong m«i tr­êng lªn men cao h¬n, thêi gian kÕt thóc qóa tr×nh lªn men dµi h¬n. Qu¸ tr×nh lªn men kþ khÝ hoµn toµn cßn qu¸ tr×nh nh©n gièng th«ng khÝ. NÕu nh­ tèc ®é sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña tÕ bµo nÊm men lµ nh©n tè chÝnh cña qu¸ tr×nh nh©n gièng th× trong qóa tr×nh lªn men l¹i dùa vµo c¸c tiªu chuÈn kh¶ n¨ng sinh r­îu, t¹o h­¬ng, kh¶ n¨ng chuyÓn ho¸ ®­êng, mµu s¾c s¶n phÈm. Trng qóa tr×nh lªn men, hµm l­îng r­îu sinh ra chñ yÕu tõ qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ ®­êng cña nÊm men. Do ®ã, yÕu tè m«i tr­êng ph¶i nghiªn cøu ®Çu tiªn lµ ¶nh h­ëng cña hµm l­îng ®­êng tíi qu¸ tr×nh lªn men. Theo tÝnh to¸n, hµm l­îng ®­êng thÝch hîp cho nÊm men lµ 200 – 240 g/l. V× vËy, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm víi c¸c hµm l­îng 200, 210,220, 230, 240 g/l víi hai chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13. C¸c chØ tiªu kh¸c vÉn gi÷ nguyªn pH = 4,5, gièng 12%. Theo dâi qu¸ tr×nh lªn men vµ ph©n tÝch chñ tiªu ®¸nh gi¸: hµm l­îng CO2 tho¸t ra (g/1000 ml ), sè l­îng tÕ bµo sau 72h, ph©n tÝch nång ®é cån vµ hµm l­îng ®­êng sãt trong dÞch lªn men sau 360h kÕt qu¶ ®­îc dÉn ra ë b¶ng 5.1,5.2,6 vµ biÓu ®å 1,2. B¶ng 5.1. KÕt qña vÒ ¶nh h­ëng cña hµm l­îng ®­êng ®Õn qu¸ tr×nh lªn men cña chñng nÊm men H7 ChØ tiªu §¬n vÞ Hµm l­îng ®­êng trong dÞch lªn men chñng H7 200 210 220 230 240 CO2 g/l 2,75 2,88 2,72 2,55 2,13 §­êng sãt g/l 5,80,2 5,30,2 6,0±0,2 6,1±0,2 6,50,2 `Cån %V 10,10,2 12,80,2 11,0±0,2 11,5±0,2 12,40,2 B¶ng 5.2. KÕt qña vÒ ¶nh h­ëng cña hµm l­îng ®­êng ®Õn qu¸ tr×nh lªn men cña chñng nÊm men C13 ChØ tiªu §¬n vÞ Hµm l­îng ®­êng trong dÞch lªn men chñng C13 200 210 220 230 240 CO2 g/l 3,16 3,32 3,0 2,9 2,45 §­êng sãt g/l 6,10,2 5,20,2 5,7±0,2 6,40,2 7,00,2 Cån %V 12,20,2 12,90,2 11,2±0,2 11,60,2 12,40,2 BiÓu ®å 1. BiÓu diÔn hµm l­îng ®­êng sãt trong dung dÞch lªn men ë c¸c hµm l­îng ®­êng kh¸c nhau cña chñng nÊm men H7 vµ C13 BiÓu ®å 2. . BiÓu diÔn hµm l­îng cån sinh ra trong dung dÞch lªn men ë c¸c hµm l­îng ®­êng kh¸c nhau cña chñng nÊm men H7 vµ C13 B¶ng 6. ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng tíi sù sinh s¶n vµ ph¸t triÓn cña chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 ( x 106 tÕ bµo/ml ) Hµm l­îng ®­êng Tªn chñng Thêi gian(h) 12 24 36 48 60 72 84 200 H7 13±1 26±1 53±2 78±3 120±4 128±5 123±5 C13 12±1 23±1 55±2 74±3 115±4 125±5 120±4 210 H7 14±1 32±1 62±2 90±3 130±5 135±5 129±5 C13 14±1 30±1 57±2 85±3 127±5 135±5 128±5 220 H7 12±1 25±1 46±2 73±3 110±4 125±5 120±4 C13 14±1 22±1 48±2 70±3 148±4 120±4 115±4 230 H7 12±1 21±1 41±2 65±3 96±4 110±4 120±4 C13 11±1 23±1 42±2 64±3 95±4 107±4 118±4 Sè l­îng tÕ bµo H7 (x106TB/ml) 240 H7 10±1 18±1 37±2 60±2 72±3 85±3 110±4 C13 8±0,8 20±1 38±2 59±2 75±3 88±3 107±4 Thêi gian 12 24 36 48 60 72 84 §å thÞ 4 . BiÓu diÔn ¶nh h­ëng cña hµm l­îng ®­êng tíi sù sinh s¶n vµ ph¸t triÓn cña chñng saccharomyces cerevisiae H7(106TB/ml) Số lượng tế bào chủng H7 (x106 TB/ml) §å thÞ 5 . BiÓu diÔn ¶nh h­ëng cña hµm l­îng ®­êng tíi sù sinh s¶n vµ ph¸t triÓn cña chñng Saccharomyces cerevisiae C13(106TB/ml) Thêi gian 12 24 36 48 60 72 84  Qua b¶ng 5.1,5.2,6 vµ ®å thÞ 4,5, biÓu ®å 1,2 ta thÊy khi hµm l­îng ®­êng trong dÞch men cao th× hµm l­îng ®­êng sãt còng t¨ng, ®Æc biÖt ë hµm l­îng 240 (g/l) th× hµm l­îng ®­êng sãt cao nhÊt lµ 6,5 (g/l ) vµ 7,0 (g/l ) ®ång thêi lµm l­îng cån còng lµ cao nhÊt 6,5 (g/l ) vµ 7,0 (g/l ). Hµm l­îng ®­êng trong dÞch lªn men cµng cao th× hµm l­îng ®­êng sãt, axit sinh ra còng t¨ng nh­ng hiÖu suÊt lªn men r­îu vang bÞ gi¶m. §iÒu nµy lµ hoµn toµn phï hîp v× hµm l­îng ®­êng trong dÞch lªn men cµng cao th× ¸p suÊt thÈm thÊu cµng lín sÏ øc chÕ sù ph¸t triÓn cña nÊm men vµ h¹n chÕ qu¸ tr×nh t¹o cån. MÉu r­îu vang lªn men tõ dÞch cã hµm l­îng ®­êng 210 g/l, hµm l­îng cån sinh ra cao nhÊt 12,4 % V (H7), 12,6% V (C13) vµ hµm l­îng ®­êng sãt thÊp nhÊt 5,3 g/l (H7 ) vµ 5,2 g/l (C13). [6,10, 14]. T­¬ng ®­¬ng víi vang b÷a ¨n. ChÝnh v× vËy, chóng t«i chän hµm l­îng ®­êng thÝch hîp trong dung dÞch lªn men lµ 210 g/l cho 2 chñng nÊm men nµy. Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña t¸c gi¶ §inh Thi Kim Nhung, §oµn V¨n T©n hµm l­îng ®­êng thÝch hîp lµ 240 (g/l), 200 ( g/l) hµm l­îng ®­êng mµ chóng t«i nghiªn cøu lµ kh¸c bëi v×: Do ®Æc tÝnh sinh lý di truyÒn cña hai chñng: Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13. Theo b¶ng 1 thµnh phÇn ho¸ häc qu¶ v¶i kh¸c nhiÒu so víi thµnh phÇn ho¸ häc c¸c lo¹i qu¶, ®Æc biÖt hµm l­îng ®­êng tæng sè kh¸ cao: V¶i Lôc Ng¹n 152g/l, v¶i Thanh Hµ 185g/l [12]. Trong m«i tr­êng nh©n gièng vµ m«i tr­êng lªn men nguån c¬ chÊt ®ãng vai trß rÊt quan träng. NÕu cung cÊp ®Çy ®ñ nguån dinh d­ìng th× ë giai ®o¹n ®Çu tÕ bµo nÊm men ph¸t triÓn m¹nh sau ®ã khi c¹n kiÖt nguån dinh d­ìng chóng ph¸t triÓn kÐm. §Ó tr¸nh ¶nh h­ëng cña m«i tr­êng giµu dinh d­ìng chóng t«i gi¶m bít thµnh phÇn pepton cßn kho¶ng gÇn 3/4 hoÆc 1/2 tæng sè. Tuy nhiªn kÕt qu¶ nµy ®Òu n»m trong kho¶ng thÝch hîp cho sù ph¸t triÓn cña nÊm men. Do ®ã chóng t«i chän hµm l­îng thÝch hîp lµ 210g/l. 4.3.2. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é NaCl §Ó x¸c ®Þnh nång ®é NaCl cho 2 chñng H7 vµ C13 chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm lªn men ë hµm l­îng ®­êng 21%, KH2PO41 ‰ vµ NaCl ë c¸c nång ®é 1 ‰, 2 ‰, 3 ‰ nh»m x¸c ®Þnh nång ®é muèi ¨n phï hîp cho chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn. Theo dâi c¸c chØ tiªu nghiªn cøu hµm l­îng ®­êng sãt, nång ®é cån, sè l­îng tÕ bµo sau 120h trong dÞch lªn men. KÕt qu¶ thu ®­îc dÉn ra ë b¶ng 7,8 vµ ®å thÞ 6,7, biÓu ®å 3, 4. B¶ng 7. ¶nh h­ëng cña nång ®é NaCl tíi qóa tr×nh lªn men chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 ChØ tiªu nghiªn cøu §¬n vÞ Nång ®é NaCl trong dÞch lªn men H7 C13 1 ‰ 2 ‰ 3 ‰ 1 ‰ 2 ‰ 3 ‰ ®­êng sãt (g/l ) 6,40,3 5,30,2 7,40,4 6,80,3 5,20,2 7,30,4 Cån (% V) 11,00,2 12,50,2 10,70,2 10,80,2 12,80,2 11,30,2 §å thÞ 3: ¶nh h­ëng cña nång ®é NaCl tíi qóa tr×nh lªn men chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 §å th× 4: ¶nh h­ëng cña nång ®é NaCl tíi qóa tr×nh lªn men chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 B¶ng 8. ¶nh h­ëng cña nång ®é NaCl tíi sù sinh s¶n vµ ph¸t triÓn cña chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 ( X 106 tÕ bµo/ml ) N. ®é NaCl Tªn chñng Thêi gian (h ) 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 1 H7 11,01 65,03 87,04 52,02 502 452 452 402 382 322 C13 12,01 70,03 90,04 78,04 512 482 462 432 372 342 2 H7 16,01 80,03 1205 1005 954 884 814 733 583 372 C13 17,01 86,03 1245 96,04 944 854 783 663 523 362 3 H7 12,01 70,03 1065 87,04 753 623 553 482 412 332 C13 13,01 76,03 1015 84,04 703 643 533 452 372 302 Đồ thị 6. Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự sinh sản và phát triển của chủng saccharomyces cerevisiae H7 (x106TB/ml) Đồ thị 7. Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự sinh sản và phát triển của chủng saccharomyces cerevisiae C13 (x106TB/ml) Qua b¶ng 7, 8 vµ ®å thÞ 6, 7, biÓu ®å 3, 4 ta thÊy viÖc bæ sung hµm l­îng muèi NaCl trong m«i tr­êng lªn men cã ý nghÜa rÊt lín bëi nã cung cÊp thªm nguån kho¸ng Na+ cho tÕ bµo nÊm men ph¸t triÓn. ë ®©y nång ®é NaCl 2 ‰ th× sè l­îng tÕ bµo nÊm men Sacharomyces cerevisiae ph¸t triÓn m¹nh nhÊt, nã ®­îc ®¸nh dÊu b»ng hµm l­îng ®­êng sãt thÊp nhÊt 5,3 g/l (H7 ) vµ 5,2 g/l (C13 ). Hµm l­îng r­îu sinh ra cao nhÊt 12,8% V (H7 ) vµ 12,9% V (C13 ) ®ång thêi gi¸ trÞ c¶m quan s¶n phÈm lµ tèt nhÊt. Do ®ã, chóng t«i quyÕt ®Þnh chän nång ®é NaCl bæ sung vµo m«i tr­êng lªn men thÝch hîp lµ 2 ‰. Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu tr­íc cña T.S §inh ThÞ Kim Nhung, §oµn V¨n T©n,TrÇn V¨n TuyÓn, NguyÔn ThÞ Tè Nga th× nång ®é NaCl ®Òu ë møc thÝch hîp nhÊt ®Þnh 2 ‰ cho qu¸ tr×nh lªn men vang v¶i thiÒu. 4.3.3 Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é KH2PO4 §Ó x¸c ®Þnh nång ®é KH2PO4 thÝch hîp cho 2 chñng S . cerevisiae H7 vµ C13, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm lªn men ë hµm l­îng ®­êng 21%, NaCl 2%0 vµ KH2PO4 ë c¸c nång ®é 0,6%0; 0,8%0; 1%0; 1,2%0. ChØ tiªu ®¸nh gi¸ : hµm l­îng ®­êng sãt l¹i vµ nång ®é cån trong dung dÞch lªn men. Chóng t«i thÊy r»ng khi bæ sung vµo m«i tr­êng lªn men mét l­îng nhá KH2PO4 (1%0) th× tèc ®é lªn men ®¹t lín nhÊt. BiÓu hiÖn ë nång ®é cån trong dÞch lªn men sau 360h ®¹t gi¸ trÞ lín nhÊt lµ 11,4 ®èi víi chñng H7 vµ 11,7 ®èi víi chñng C13. Hµm l­îng ®­êng sãt trong dÞch lªn men sau 360h ®¹t gi¸ trÞ nhá nhÊt lµ 5,6 % ®èi víi chñng H7 vµ 5,4 % ®èi víi chñng C13. Nguyªn nh©n lµ khi bæ sung vµo m«i tr­êng mét l­îng nhá KH2PO4 cã nghÜa lµ ta ®· cung cÊp nguyªn liÖu cho qu¸ tr×nh tæng hîp c¸c hîp phÇn cña tÕ bµo cã chøa photpho, tÕ bµo chÊt vµ chÊt nh©n, ®ång thêi ®iÒu ch×nh ho¹t tÝnh hÖ enzim ®ång hãa c¸c lo¹i thøc ¨n cacbon, thóc ®Èy qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña tÕ bµo nÊm men. Tuy nhiªn, nÕu bæ sung qu¸ nhiÒu sÏ lµm rèi lo¹n qu¸ tr×nh sinh tæng hîp c¸c chÊt cña tÕ bµo, nÕu qu¸ Ýt lµm qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt diÔn ra chËm ch¹p, tèc ®é lªn men yÕu. Mét sè nghiªn cøu cña t¶c gi¶ ®i tr­íc còng thu ®­îc kÕt qu¶ nh­ trªn. V× vËy t«i kh¼ng ®Þnh l­îng KH2PO4 thÝch hîp lµ 1%0. KÕt luËn: M«i tr­êng dinh d­ìng phï hîp víi chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13lµ: Hµm l­îng ®­êng Saccharoza: 210g/l Nång ®é NaCl :2 0/00 Nång ®é KH2PO4 :1 0/00. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña ®iÒu kiÖn lªn men víi chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13. Sù sinh tr­ëng, ph¸t triÓn cña tÕ bµo nÊm men kh«ng chØ phô thuéc vµo c¸c yÕu tè cña m«i tr­êng dinh d­ìng, mµ cßn phô thuéc vµo hµm l­îng men gièng,®é pH ban ®Çu, nhiÖt ®é. V× vËy chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu x¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn thuËn lîi nhÊt vÒ hµm l­îng men gièng, pH ban ®Çu, nhiÖt ®é cho qu¸ tr×nh lªn men víi chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13. ¶nh h­ëng cña hµm l­îng men gièng Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt r­îu vang phô thuoch rÊt nhiÒu vµo hµm l­îng men gi«ng ®­a vµo, v× nã lµ t¸c nh©n chÝnh cña qu¸ tr×nh lªn men. Hµm l­îng men gièng nhiÒu qu¸ tr×nh lªn men ®­îc thóc ®Èy nh­ng nÕu nhiÒu qu¸ sÏ x¶y ra c¹nh tranh nguån dinh d­ìng ®Õn lªn men. §Ó x¸c ®Þnh ®­îc hµm l­îng men gièng thÝch hîp, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm víi 2 chñng S. cerevisiae H7 vµ C13 trªn m«i tr­êng lªn men cã hµm l­îng ®­êng 210g/l, NaCl 2%0, KH2PO41%0, víi hµm l­îng men gièng: 8%, 10%, 12%,14%. Theo dâi sù sinh tr­ëng , ph¸t triÓn cña 2 chñng S .cerevisiae H7 vµ C13 b»ng c¸ch ®Õm sè l­îng tÕ bµo sau 72h. ph©n tÝch nång ®é cån vµ hµm l­îng ®­êng sãt trong dung dÞch lªn men sau 360h . Ta thÊy khi hµm l­îng men gièng t¨ng tõ 8 – 12% th× hiÖu suÊt lªn men t¨ng dÇn vµ ®¹t cao nhÊt ë hµm l­îng men gièng lµ 12% cô thÓ: ®èi víi chñng H7 sè l­îng tÕ bµo lín nhÊt lµ 128 . 106 tÕ bµo ë 48 – 60h, hµm l­îng ®­êng sãt lµ 5,3 g/l, ®é cån lµ 12,8%V. §èi chñng C13: sè l­îng tÕ bµo lín nhÊt lµ 132.106 tÕ bµo ë 48 – 60h, hµm l­îng ®­êng sãt lµ 5,2 g/l, ®é cån lµ 12,9%V. Trong khi ë hµm l­îng gièng 14% tÕ bµo nÊm men ph¸t triÓn vµ ®¹t gi¸ trÞ tèi ®a sím (nhanh ®¹t ®Õn logarit) nh­ng l¹i gi¶m rÊt nhanh ë pha suy vong do m«i tr­êng c¹n kiÖt chÊt dinh d­ìng. Kh¶ n¨ng chuyÓn ho¸ ®­êng diÔn ra trong thêi gian ng¾n do ®ã ®é ®­êng sãt cao, ®é r­îu thÊp. ë hµm l­îng gièng 12%, tÕ bµo nÊm men ph¸t triÓn tõ tõ, ®¹t pha logarit chËm h¬n nh­ng l¹i gi¶m dÇn dÇn ë pha suy vong, v× vËy thêi gian chuyÓn ho¸ ®­êng dµi h¬n. ë hµm l­îng gièng 8 – 10 %, sè l­îng tÕ bµo Ýt do ®ã ®¹t gi¸ trÞ lín nhÊt ë pha logarit thÊp, vi khuÈn l©y nhiÔm x©m nhËp, cã xuÊt hiÖn mµng vi khuÈn sau thêi gian lªn men chÝnh. XÐt vÒ mÆt kinh tÕ nÕu hµm l­îng men gièng qu¸ lín th× hiÖu qu¶ kinh tÕ thÊp. §èi chiÕu víi kÕt qu¶ cña mét sè t¸c gi¶ ®i tr­íc cña T.S §inh ThÞ Kim Nhung, NguyÔn Ngäc Linh t«i thÊy ë hµm l­îng men gièng 12% lµ thÝch hîp cho qu¸ tr×nh lªn men. ¶nh h­ëng cña pH ban ®Çu pH cña m«i tr­êng lªn men còng lµ mét yÕu tè lµm ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng sinh s¶n vµ ph¸t triÓn cña nÊm men. §Ó nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña qu¸ tr×nh lªn men chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm trªn m«i tr­êng lªn men. Riªng ®é pH ban ®Çu ®­îc gi÷ l¹i ë møc pH =3,5; 4,5; 5,5; 6. Chóng t«i thÊy r»ng pH ban ®Çu tõ 3,5®5 th× c¶ 2 chñng ®Òu cã xu thÕ chung hµm l­îng r­îu sinh ra t¨ng vµ cao nhÊt ë pH=4,5 nh­ H7lµ 12,6% cßn C13 lµ 12,7%. §ång thêi hµm l­îng ®­êng sãt thÊp. Khi ®é pH t¨ng 5®6 th× hµm l­îng r­îu sinh ra gi¶m.. VÝ dô pH=6 H7 lµ 10,2% vµ C13 lµ 10,5%. Nh­ vËy pH ban ®Çu cao th× kh«ng thuËn lîi cho qu¸ tr×nh lªn men cã thÓ kh«ng t¹o m«i tr­êng axit thÝch hîp cho nÊm lªn men. Tõ kÕt qu¶ vµ nhËn xÐt trªn t«i quyÕt ®Þnh lÊy pH=4,5 lµ pH thÝch hîp cho qu¸ tr×nh lªn men. ¶nh h­ëng cña nhiÖt ®é lªn men tíi qu¸ tr×nh lªn men YÕu tè nhiÖt ®é ¶nh h­ëng ®Õn c¶ qu¸ tr×nh lªn men song mçi chñng nÊm men ®Òu cã giíi h¹n nhiÖt ®é nhÊt ®Þnh . H¬n n÷a n­íc ta lµ n­íc cã khÝ hËu nhiÖt ®íi nãng Èm giã mïa. Do ®ã theo t«i viÖc nghiªn cøu t×m ra kho¶ng nhiÖt tèi ­u cho qu¸ tr×nh lªn men lµ cÇn thiÕt ®Ó n©ng cao chÊt l­îng cña r­îu vang. TiÕn hµnh sö dông 2 chñng H7 vµ C13 vµo c¸c lÇn lªn men víi c¸c nhiÖt ®é kh¸c nhau 200c,250c,300c,350c. NhiÖt ®é trong kho¶ng 25-300C rÊt thuËn lîi cho viÖc lªn men. KÕt luËn: Hµm l­îng men gièng, pH ban ®Çu, nhiÖt ®é tèi ­u nhÊt cho qu¸ tr×nh lªn men chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 lÇn l­ît lµ 12%, 4,5 vµ 25- 300C. 4.5. øng dông c¸c chñng H7 vµ C13 lªn men ë quy m« phßng thÝ nghiÖm Qua kÕt qu¶ nghiªn cøu chóng t«i tiÕn hµnh lªn men H7 vµ C13 víi m«i tr­êng lªn men nh­ng thùc hiÖn qu¸ tr×nh lªn men ë nhiÖt ®é 300C vµ pH=4,5 víi quy m« phßng thÝ nghiÖm ( cã b×nh lªn men 5 lit) Sau 15 ngµy kÕt thóc giai ®o¹n lªn men chÝnh ®¸nh gi¸ r­îu thµnh phÈm b»ng c¶m quan vµ bæ sung 2-3% cån thùc phÈm vµ chuyÓn tiÕp lªn men phô. KÕt qu¶ ph©n tÝch b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc ®­îc dÉn ra ë b¶ng 19 vµ biÓu ®å 4. B¶ng 9. KÕt qu¶ ph©n tÝch r­îu thµnh phÈm Vang Tiªu chÝ Vang(H7) Vang(C13) §é r­îu %v 12,9 13,2 §­êng sãt(%) 4,3 3,6 pH 4,2 3,9 Axit(%) 0,45 0,5 §é trong, h­¬ng vÞ Trong, th¬m Trong, th¬m BiÓu ®å 4 . BiÓu diÔn kÕt qu¶ ph©n tÝch r­îu thµnh phÇn Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch thµnh phÇn ho¸ häc cña r­îu thµnh phÈm t«i thÊy r»ng 2 chñng S.HC7 vµ S.HC13 cã kh¶ n¨ng øng dông trong thùc tÕ s¶n xuÊt vµ víi ®iÒu kiÖn tèi ­u cña pH=4,5 vµ nhiÖt ®é t0=25®300C th× qu¸ tr×nh lªn men rÊt thuËn lîi. Qua nghiªn cøu s¬ bé nµy cóng t«i hy väng ®ãng gãp phÇn n©ng cao chÊt l­îng r­îu vang ®¸p øng ®­îc thÞ hiÕu ng­êi tiªu dïng. 4.6. Quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt r­îu vang Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu thùc nghiÖm trªn quy m« phßng thÝ nghiÖm, chóng t«i ®· x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt vang v¶i thiÒu nh­ sau: X©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt r­îu vang v¶i thiÒu Quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt ThuyÕt minh c«ng nghÖ *) Qu¶ : NÕu lµ v¶i t­¬i chän v¶i chÝn mäng kh«ng dËp n¸t. NÕu lµ v¶i kh« chän lo¹i sÊy vá n©u t­¬i cã cïi mµu c¸nh gi¸n. §èi víi v¶i t­¬i khi ng©m lÊy dÞch kh«ng cÇn thªm n­íc. §èi víi v¶i kh« cÇn bæ sung n­íc s«i ®Ó nguéi. *) Men gièng ®­îc sö dông trùc tiÕp tõ èng gièng th¹ch nghiªng. *) M«i tr­êng nh©n gièng: khö trïng Pasteur tr­íc khi cÊy. Nh©n gièng ë nhiÖt ®é 27- 280C, pH=4,5. Sau 24h cã thÓ nh©n tiÕp hoÆc sö dông ngay. Th­êng xuyªn kiÓm tra sè l­îng tÕ bµo, nÕu sè l­îng tÕ bµo nhá h¬n 108 (TB/ml) th× thay èng gièng kh¸c. Bæ sung (NH4)2SO4 3-4g/l vµ pepton(3g/l).Bæ sung vitaminB1 vµ vitamin H. L¾c trong 24h. *) M«i tr­êng lªn men: bæ sung gièng 12% ( 2.108 tb/ml) cho lªn men ë pH=4,5. NhiÖt ®é æn ®Þnh trong kho¶ng 25- 300C .Giai ®o¹n lªn men chÝnh th­êng lµ 15-17 ngµy (quan s¸t b»ng m¾t th­êng) thÊy Ýt hoÆc kh«ng thÊy bät khÝ tho¸t ra vµ dung dÞch kh«ng bÞ ®¶o trén do ho¹t ®éng cña nÊm men. DÞch lªn men b¾t ®Çu l¾ng trong. *) T¸ch cÆn b»ng c¸ch l¾ng g¹n : hót dÞch phÝa trªn thïng lªn men sang thïng kh¸c b»ng èng hót cao su v« trïng tr­íc. CÆn ë d­íi vøt bá. Sau 4-5 lÇn t¸ch cÆn ta thu ®­îc r­îu vang non. *) Lªn men phô: r­îu vang no ®­îc t¨ng tr÷ nh»m æn ®Þnh h­¬ng vÞ cña vang ®­îc tiÕn hµnh ë chç d©m m¸t (<200C) cã thÓ bæ sung 2-3% cån thùc phÈm. Thêi gian tõ 2-3 th¸ng hoÆc dµi h¬n nÕu sau thêi gian nµy cßn xuÊt hiÖn cÆn mÞn th× tiÕp tôc l¾ng g¹n vµ qua m¸y läc tr­íc khi ®ãng chai. PhÇn 5 KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ 1. KÕt luËn. §· ph©n lËp 35 mÉu Sacharomyces cerevisiae vµ tuyÓn chän ®­îc hai mÉu nÊm men H7 vµ C13 cã ho¹t lùc lªn men m¹nh, nhanh, t¹o ®­îc nång ®é cån kh¸ cao, hµm l­îng ®­êng sãt trong dÞch lªn men thÊp, ®é trong s¶n phÈm cao, cã h­¬ng vÞ th¬m ngon. X¸c ®Þnh ®­îc ho¹t lùc lªn men vµ nghiªn cøu ®éng th¸i ph¸t triÓn hai chñng H7 vµ C13 trong m«i tr­êng nh©n gièng. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña m«i tr­êng dinh d­ìng ®Õn sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 trong qu¸ tr×nh lªn men vµ x¸c ®Þnh ®­îc m«i tr­êng dinh d­ìng phï hîp nhÊt lµ: hµm l­îng ®­êng saccaroza 210g/l, NaCl 20/00, KH2PO4 10/00. §· nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña hµm l­îng men gièng, pH ban ®Çu, nhiÖt ®é ®Õn sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 trong qu¸ tr×nh lªn men vµ x¸c ®Þnh ®­îc ®iÒu kiÖn lªn men thÝch hîp víi chñng Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 cho hiÖu qu¶ kinh tÕ cao, hµm l­îng men gièng 12%, pH ban ®Çu 4,5, nhiÖt ®é 25 – 300C. §· x©y dùng ®­îc quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt vang v¶i thiÒu. 2. §Ò nghÞ Víi kÕt qu¶ thu ®­îc chóng t«i rÊt mong muèn chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae H7 vµ C13 ®­îc nhanh chãng ¸p dông vµo s¶n xuÊt r­îu vang v¶i thiÒu lµm phong phó chñng lo¹i r­îu vang trªn thi tr­êng. Tµi liÖu tham kh¶o [1]. NguyÔn ThÞ Thuý B¹ch, NguyÔn Thanh Nga, NguyÔn Ngäc Linh, Vò Thanh Thuû, §inh ThÞ Kim Nhung. 2000. TuyÓn chän chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae øng dông vµo lªn men r­îu vang víi quy m« phßng thÝ nghiÖm. Th«ng b¸o khoa häc tr­êng §HSP Hµ Néi 2, n¨m 2000 sè 1, trang 351-357 [2]. NguyÔn L©n Dòng. 1986. Men gia sóc vµ men r­îu. NXB KHKT. [3]. NguyÔn L©n Dòng vµ céng sù. 1976.Mét sè ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu vi sinh vËt häc tËp I, II, III. NXB KHKT Hµ Néi. [4]. NguyÔn L©n Dòng. 1983. Thùc tËp vi sinh vËt häc. NXB Mir Maxc¬va [5]. NguyÔn Thµnh §¹t. 1980. C¬ së vi sinh vËt häc. NXB GD . [6]. NguyÔn Quang Hµo, Lª V¨n Nh­¬ng, TrÇn Quý Th¾ng. 1999. §éng th¸i qu¸ tr×nh lªn men vang ®µo lén hét. T¹p chÝ khoa häc c«ng nghÖ th¸ng 01/1999 [7]. NguyÔn Thanh H»ng, Ph¹m ThÞ Thuû. 2001. Nghiªn cøu n©ng cao chÊt l­îng r­îu vang nho ViÖt Nam. ViÖn c«ng nghÖ sinh häc vµ c«ng nghÖ thùc phÈm §H B¸ch Khoa Hµ Néi. [8]. Vò C«ng HËu. 1982. ChÕ vang tr¸i c©y trong gia ®×nh. NXB N«ng nghiÖp. [9].§inh ThÞ Kim Nhung. 2001. Nghiªn cøu ®Æc tÝnh sinh häc cña hai chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae N9 vµ P6 øng dông lªn men r­îu vang. Th«ng b¸o khoa häc, §HSPHN 2. Trang 331-342. [10]. §inh ThÞ Kim Nhung. 2003. tuyÓn chän vµ nghiªn cøu nÊm men Sacharomyces cerevisiae øng dông vµo lªn men r­ou vang. B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi cÊp bé. [11]. Lª V¨n Nh­¬ng. 1977. B¹n vµ thï d­íi èng kÝnh hiÓn vi. NXB KHKT Hµ Néi. [12]. NguyÔn ThÞ Tè Nga. 2004. TuyÓn chän vµ nghiªn cøu ®Æc tinh sinh häc cña chñng nÊm men Sacharomyces cerevisiae, øng dông lªn men vang v¶i thiÒu luËn v¨n tèt nghiÖp. [13]. §inh ThÞ Kim Ph­¬ng. 1993. Nghiªn cøu tuyÓn chän chñng nÊm men phï hîp víi yªu cÇu s¶n xuÊt r­îu vang. LuËn ¸n tiÕn sü sinh häc. [14]. NguyÔn §×nh Sinh 1997. NÊm men vµ kh¶ n¨ng sö dông chóng trong c«ng nghÖ sinh häc §HSP-§HQGHN [15]. NguyÔn Quang Th¶o, NguyÔn Thµnh §¹t, Lª V¨n Nh­¬ng.2000 Nghiªn cøu ®éng häc qu¸ tr×nh lªn men vang v¶i thiÒu. T¹p chÝ c«ng nghiÖp vµ n«ng nghiÖp thùc phÈm sè 9. Trang 470-471 [16]. §oµn V¨n T©n. 2004. TuyÓn chän chñng nÊm men Saccharomyces cerevisiae luËn v¨n tèt nghiÖp. [17]. NguyÔn Quang Th¶o. 2000. Nghiªn cøu lªn men vang v¶i thiÒu. Tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sü sinh häc. Tr­êng §HSP - §HQG Hµ Néi. [18]. TrÇn Quý Th¾ng.1999. Ph©n lËp, tuyÓn chän mét sè ®Æc ®iÓm sinh häc cña nÊm men dïng lªn men qu¶ ®iÒu. Tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sü sinh häc tr­êng §HSP - §HQG HN .