Một số vấn đề vật lí trong buồng cộng hưởng mini cho laser Nd: YAG

để phân tích. Để phát hiện các vết dịch chuyển có thể soi dưới ánh sáng tử ngoại, hiện màu bằng các thuốc thử thích hợp. Có thể cạo các vết, rửa giải, tinh chế để tiếp tục nghiên cứu. Trong công trình này, chúng tôi sử dụng bản mỏng Silicagel 25 DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck để phân chia, xác định các thành phần polyphenol trong các cây mẫu nghiên cứu. Các hệ dung môi triển khai sắc ký đã dùng: TEAF (Toluene: Ethyl acetate: Acetone : acid Formic): (5:2:2:1) TEAF: (5:3:1:1) Chloroform:methanol: (9:1) Chloroform:ethyacetate: acid formic: (5:3:0,4) Hiện màu: H2SO4 10%, 800C Hơi Amoniac bão hòa 2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase: dịch chiết mẫu được pha loãng nhiều lần để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng độ không ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (điều tra sơ bộ PIA) với cơ chất casein 0,1% giữ ở 37oC trong 4 giờ nhuộm bằng Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, hoạt độ enzyme tỷ lệ thuận với đường kính và độ sáng của vòng phân giải trên đĩa thạch [70]. Phương pháp Anson cải tiến [69] Nguyên tắc dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng acid tricloroaxetic (TCA). Định lượng sản phẩm tạo thành sau phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau, khả năng ức chế proteinase của mẫu nghiên cứu tỉ lệ với hiệu số giữa sản phẩm tạo thành của ống thí nghiệm không có mẫu nghiên cứu và ống nghiệm có chất nghiên cứu. Một đơn vị ức chế (IU) là lượng chất ức chế làm giảm 50% hoạt độ của 2 mg enzyme. Hóa chất thí nghiệm Thuốc thử Folin-Ciocalteau Đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Cơ chất casein 1% trong đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa tách từ Pseudomonas aeruginosa TCA 5% Na2CO3 6% Tiến hành thí nghiệm ống thí nghiệm: lấy hai ống nghiệm, một ống cho vào 400 ml đệm, ống còn lại cho vào 300 ml đệm cùng với 100 ml mẫu nghiên cứu có độ pha loãng thích hợp. Sau đó cho vào mỗi ống 100 ml enzyme, trộn đều, để ở 35,50C trong 10 phút, thêm 1 ml casein 1% và giữ ở 35,50C trong 20 phút. Tiếp theo cho vào mỗi ống 2,5 ml TCA 5%, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau. ống kiểm tra: làm tương tự với ống thí nghiệm, nhưng sau khi ủ 10 phút ở 35,50C cho ngay TCA trước rồi để 20 phút, sau đó mới cho cơ chất casein. Phản ứng màu: cho 250 ml dịch lọc vào 1ml Na2CO3 6%, trộn đều rồi cho tiếp vào 250 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần. Sau 30 phút so màu ở bước sóng 750 nm. Hoạt độ ức chế được tính như sau: DEI = E - EI E = Etn - Ekt EI = EItn - EIkt I (mIU/ml) = DEI/E.n.x Etn : Độ hấp thụ ống thí nghiệm không có chất ức chế. Ekt : Độ hấp thụ ống kiểm tra không có chất ức chế. EItn: Độ hấp thụ ống thí nghiệm có chất ức chế. EIkt: Độ hấp thụ ống kiểm tra có chất ức chế. n: độ pha loãng mẫu nghiên cứu x: hàm lượng enzyme (mg/ml) tương ứng với hoạt độ E I : hoạt độ ức chế Thí nghiệm xác định PIA được tiến hành với nhiều độ pha loãng mẫu nghiên cứu khác nhau đến khi tìm được độ pha loãng thích hợp. Độ pha loãng thích hợp là độ pha loãng mẫu nghiên cứu mà ở đó hoạt độ enzyme khi có chất kìm hãm (dung dịch mẫu nghiên cứu) bằng khoảng một nửa so với hoạt độ enzyme khi có đối chứng là nước. Xác định hoạt độ phân giải protein theo phương pháp Anson cải tiến Đơn vị hoạt độ phân giải protein là lượng enzyme mà trong 1 phút ở 35,5 0C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tương đương với phản ứng màu của 1 mmol tyrosine với thuốc thử Folin-Ciocalteau. OD750 μmol/ml Hình 2.3 Đường chuẩn tyrosine Hoạt độ phân giải protein (HP/ml) của 1 ml dung dịch enzyme được tính theo công thức: HP/ml = (mmol tyrosine x a x b)/t a: Toàn bộ thể tích hỗn hợp sau phản ứng (4 ml) b: Tính trên 1 ml enzyme xác định (nhân với 10 nếu lượng enzyme xác định là 100 ml) t: Thời gian ủ enzyme với cơ chất (20 phút) 2.3.6 Điện di PA trên gel polyacryamide theo phương pháp của Heussen và Dowdle [26] Các bước thực hiện kỹ thuật điện di phát hiện proteinase trên gel polyacrylamide có SDS như sau: * Chuẩn bị dung dịch a. Dung dịch acryamide 30%: Cân 29,2 g acrylamide, 0,8 g bisacrylamide hòa tan thành 100 ml bằng nước cất 2 lần. Dung dịch đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 Cân 18,15g Tris, pha trong 50 ml nước cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 8,8 sau đó thêm nước cất đến 100 ml. Dung dịch đệm Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 Cân 3 g Tris, pha trong 40 ml nước cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 6,8 sau đó thêm nước cất đến 50ml Đệm mẫu Gồm 2,5ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml glycerol, 2 mg bromophenol xanh và 1,5 ml nước cất. * Đổ gel a. Gel tách 12,5 % 2,31 ml acrylamide 30% 0,55 ml casein 1% 0,85 ML đệm Tris-HCl pH 8,8 55 mL SDS 10% 1,76 ml H20 27,5 ml pesunphate amon 2,5 ml TEMED Gel cô 5% 0,3 ml acryamide 30% 0,5 ml Tris-HCl pH 6,8 1,2 ml H2O 10 ml SDS 10% 10 ml Amonium persulfate 4 ml TEMED * Tiến hành điện di Lượng mẫu đạt ~40 mg protein trên mỗi giếng. Điện di theo chiều từ âm sang dương với dòng điện 8mA/1 giếng Sau khi điện di, loại bỏ SDS bằng Triton X-100 2,5% để. Rửa sạch bằng nước cất. Sau đó ủ trong đệm Sorensen pH 7,6 có hoặc không có chất ức chế trong 4 giờ ở 37oC. Nhuộm gel bằng dung dịch Amido Black 10B hoặc Coomassie Brilliant Blue. Các băng proteinase là các băng trắng không bắt màu thuốc nhuộm. 2.3.7 Sắc ký cột silicagel Sắc ký cột được sử dụng để tách các hợp chất hữu cơ dựa trên nguyên tắc tương tự như sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ thường được sử dụng là silicagel hoặc alumina. Dung dịch các chất hữu cơ được đưa lên cột và rửa chiết (eluent) bằng một dung môi hữu hoặc hệ dung môi thích hợp. Các phân tử có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau qua cột. Các phân đoạn khi đó được thu lại và kiểm tra khả năng phân tách trên bản mỏng. Chúng tôi sử dụng silicagel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm làm chất hấp phụ và rửa chiết bằng hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4) và chloroform : ethylacetate (5:3). Các phân đoạn được kiểm tra trên bản mỏng với hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4). 2.3.8 Quang phổ hấp thụ tử ngoại [8, trích theo tài liệu 10] Các phân đoạn sắc ký được hoà tan trong cồn tuyệt đối và xác định phổ tử ngoại trên máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam. Các nhóm flavonoid khác nhau sẽ có phổ hấp thụ tử ngoại đặc trưng khác nhau trong hai dải hấp thụ của các hợp chất flavonoid. Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase ở một số cây thuốc 3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu Để thăm dò sơ bộ khả năng ức chế proteinase (PIA) của các mẫu nghiên cứu chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán là phương pháp tương đối nhanh và nhạy. Kết quả điều tra khả năng ức chế 3 loại proteinase serine là trypsin, chymotrypsin và proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa (PsA) được chỉ ra ở hình 3.1 và bảng 3.1. Các mẫu có PIA cao sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 12 4 3 18 11 (b) (a) 1 7 8 16 15 (c) Hình 3.1a. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E (Enzyme)+H2O; 4-6: E+cây Muối; 7-9: E+Sắn thuyền; 10-12: E+Trâm bầu; 13-15: E+Vỏ thân Tô mộc; 16-18: E+Gỗ Tô mộc 4 3 12 6 7 10 9 1 (b) (a) Hình 3.1b. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E +H2O; 4-6: E+Vỏ hạt Tô mộc chín; 7-9: E+Đơn tướng quân; 10-12: E+Đại hoàng (c) Bảng 3.1. Điều tra sơ bộ PIA (bằng phương pháp khuếch tán) STT Mẫu Bộ phận sử dụng TIA KIA PsIA 1 Muỗng truổng Zanthoxylum avicennae (Lamk.) Họ Cam (Rutaceae) Rễ +++ +++ ++ 2 Dầu giun Chenopodium ambrosioides L. Họ Rau muối (Chenopodiaceae) Lá - - - 3 Tế tân Asarum sieboldii Miq. Họ Mộc thông (Aristolochiaceae) Lá - - - 4 Trâm bầu Combretum quadrangulare Kurz. Họ Trâm bầu (Combretaceae) Lá +++++ +++++ +++++ 5 Khoai nưa Amorphophallus rivieri Dur. Họ Ráy (Araceae) Lá - - - 6 Cây hoa phấn Mirabilis jalapa L. Họ Hoa giấy (Nyctaginaceae) Lá - - - 7 Xoan Melia azedarach Họ Xoan (Meliaceae) Vỏ thân ++ +++ ++ 8 Sử quân tử Quisqualis indica L.Họ Bàng (Combretaceae) Vỏ thân +++ ++ + 9 Cây muối Bischofia Javanica) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Vỏ thân ++ ++ - 10 Lộc mại Mercuriadis indica Lour. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Lá + + + 11 Sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep. Họ Sim (Myrtaceae) Lá +++++ +++++ +++++ Cành +++ +++ +++ 12 Đơn tướng quân Syzygium formosum var. Họ Sim (Myrtaceae) Lá ++++ +++ ++++ 13 Đại hoàng (sapa) Rheum sp. Họ Rau răm (Polygonaceae) Củ ++++ ++++ ++++ 14 Đậu cọc rào Cajanus indicus Spreng. Họ Đậu (Fabaceae) Vỏ quả - - - Lá +++ +++ ++ 15 Xoài Mangifera indica L. Họ Đào lộn hột (Anacadiaceae) Vỏ thân +++ +++ ++ 16 Cây gỗ Vang (Tô mộc) Caesalpinia sappan L. Họ Vang (Caesalpiniaceae) Gỗ ++++ +++++ +++ Vỏ thân ++++ +++++ +++++ Vỏ hạt xanh +++ +++ ++ Vỏ hạt chín +++++ +++++ +++++ 17 Cây me Tamarindus indica L. Họ Vang (Caesalpiniaceae) Vỏ thân + + - 18 Đại Plumeria rubra Họ Trúc đào (Apocynaceae) Lá +++ - - 19 Hạ khô thảo Brunella vulgaris L. Họ Bạc hà (Lamiaceae) Lá ++ +++ ++ Hoa ++ +++ +++ 20 Ngưu bàng Artium lappa L. Họ Cúc (Asteraceae) Rễ + ++ + Ghi chú: + : ức chế < 25% ; + + : ức chế từ 25% đến 50%; + + + : ức chế từ 50% đến 75% ; + + + + : ức chế >75%; + + + + + : ức chế 100% Kết quả điều tra 26 mẫu của 20 cây thuốc thường được sử dụng chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thuộc 17 họ thực vật khác nhau cho thấy có 21 mẫu của 16 cây có hoạt tính ức chế proteinase, chiếm 80% những cây điều tra. Tỉ lệ trên cho thấy có thể có mối quan hệ giữa khả năng ức chế proteinase của dịch chiết các cây thuốc với khả năng chữa bệnh của chúng. Các mẫu có PIA cao tiếp tục được xác định PIA theo phương pháp Anson cải tiến, kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết nước (xác định theo phương pháp Anson cải tiến) STT Mẫu % chất khô TIA ChIA PsIA mIU/g tươi mIU/g khô mIU/g tươi mIU/g khô mIU/g tươi mIU/g khô 1 Trâm bầu 44,6 7.651 17.155 11.960 26.816 1.789 4.011 2 Cây xoan 43,1 1.375 3.190 2.763 6.411 260 603 3 Sử quân tử 42,5 263 619 1.154 2.715 184 433 4 Lộc mại 20,5 222 1.083 171 834 179 873 5 Sắn thuyền 31,7 11.631 36.691 33.332 105.148 8.195 25.852 6 Đơn tướng quân 33,3 2.465 7.402 3.694 11.093 1.518 4.559 7 Đại hoàng 29,7 759 2.556 2.021 6.805 274 923 8 Đậu cọc rào 27,6 632 2.290 805 2.917 372 1.348 9 Cây xoài 34,7 287 827 1.033 2.977 63 182 10 Thân gỗ tô mộc 57,2 14 24 29 51 22 38 11 Vỏ thân tô mộc 47,8 7 15 19 40 13 27 12 Vỏ hạt tô mộc chín 79,1 2.861 3.617 11.454 14.480 5.183 6.552 13 Vỏ hạt tô mộc xanh 33,6 255 759 3.463 10.307 1.271 3783 Từ bảng 3.2 có thể thấy các dịch chiết đều có khả năng ức chế chymotrypsin (ChIA) tốt hơn khả năng ức chế trypsin (TIA), khả năng ức chế proteinase tách từ P. aeruginosa (PsIA) là kém nhất. Khả năng ức chế PsA kém có thể do proteinase tách từ dịch nuôi cấy P. aeruginosa còn có một số loại proteinase khác, các dịch chiết nghiên cứu chỉ có thể ức chế một loại proteinase nào đó (có thể là các proteinase serine) hoặc cũng có thể do trong dịch nuôi cấy còn có các chất khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các chất ức chế. Bảng 3.2 cũng cho thấy có sự khác nhau rất lớn về hoạt độ ức chế proteinase của các mẫu. Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol của 13 mẫu này và nhận thấy các mẫu có hàm lượng polyphenol cao thường có PIA cao như: các mẫu Trâm bầu, Sắn thuyền, tuy nhiên cũng có mẫu có hàm lượng polyphenol thấp nhưng cũng có PIA cao như vỏ hạt Tô mộc chín (bảng 3.3). Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol dịch chiết nước và hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) STT Mẫu Hàm lượng polyphenol (mg/g tươi) TIA (mIU/mg polyphenol) ChIA (mIU/mg polyphenol) PsIA (mIU/mg polyphenol) 1 Trâm bầu 20,1 380,6 5950.0 89,0 2 Cây Xoan 3,3 416,7 837,3 78,8 3 Sử quân tử 5,5 47,8 209,8 33,5 4 Lộc mại 5,7 38,9 30,0 31,4 5 Sắn thuyền 12,3 945,6 2709,9 666,3 6 Đơn tướng quân 8,2 300,6 450,5 185,1 7 Đại hoàng 8,7 87,2 23,2 11,8 8 Đậu cọc rào 3,9 162,0 206,4 95,4 9 Cây Xoài 1,9 151,1 543,7 33,2 10 Gỗ Tô mộc 5,5 2,6 5,3 4,0 11 Vỏ thân Tô mộc 7,5 0,9 2,5 1,7 12 Vỏ hạt Tô mộc chín 2,1 1362,4 5454,3 2468,1 13 Vỏ hạt Tô mộc xanh 1,4 182,1 2473,6 907,9 Bảng 3.3 cũng cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa các mẫu Tô mộc, các mẫu gỗ và vỏ thân có hàm lượng polyphenol cao hơn các mẫu vỏ hạt khoảng 2 đến 5 lần nhưng hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) lại thấp hơn rất nhiều. Do đó có thể thấy có sự khác nhau về thành phần polyphenol của các mẫu Tô mộc. 3.1.2 Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid trong dịch chiết ethanol Ethanol được sử dụng để chiết rút polyphenol tổng số vì là một dung môi phân cực tốt, có khả năng chiết rút tốt các hợp chất tự nhiên, hơn nữa, ở nồng độ cao có thể loại bỏ một số tạp chất và các chất ức chế có bản chất là protein (có thể có). Quá trình chiết rút được thực hiện theo quy trình đã mô tả trong chương 2, dịch chiết này được gọi là dịch chiết polyphenol tổng số. Từ các dịch chiết polyphenol tổng số, flavonoid toàn phần được tách ra theo sơ đồ hình 2.1, các dịch chiết sau đó được định lượng polyphenol và xác định PIA. Bảng 3.4. Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid toàn phần STT Mẫu Hàm lượng (mg/g bột khô) Hàm lượng (mg/g tươi) Polyphenol Flavonoid Polyphenol Flavonoid 1 Sắn thuyền 46,13 6,52 15,91 2,25 2 Đơn tướng quân 62,41 16,11 21,51 5,55 3 Đại hoàng 53,57 20,21 5,58 5,58 4 Đậu cọc rào 13,43 1,78 3,71 0,49 5 Cây Xoài 14,35 5,18 4,98 1,8 6 Gỗ Tô mộc 59,00 44,49 33,75 25,45 7 Vỏ thân Tô mộc 96,84 25,27 46,25 12,07 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 51,93 1,55 41,08 1,23 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 21,39 1,99 7,19 0,67 Bảng 3.4 cho thấy khi chiết bằng ethanol 96%, lượng polyphenol tổng số thu được cao hơn khi chiết bằng nước, mẫu vỏ thân Tô mộc có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất (96,84 mg/g bột khô). Flavonoid Polyphenol tổng số mg/g bột khô Hình 3.2. Hàm lượng polyphenol của dịch chiết nước và dịch chiết EtOH của các mẫu Từ hình 3.2 có thể thấy khả năng chiết rút của ethanol tốt hơn nước nhiều lần, đặc biệt là các mẫu tô mộc, khả năng chiết rút tăng lên từ 5 đến 20 lần. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu chiếm tỉ lệ tương đối thấp từ khoảng 3% (vỏ hạt Tô mộc chín) tới gần 40% (Đại hoàng). Riêng mẫu thân gỗ Tô mộc tỉ lệ này vào khoảng 75%, cao nhất trong các mẫu điều tra. 3.1.3 Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid Bảng 3.5. Hoạt độ ức chế proteinase dịch chiết polyphenol tổng số STT Mẫu TIA (mIU/g bột khô) ChIA (mIU/g bột khô) PsIA (mIU/g bột khô) 1 Sắn thuyền 25.553 73.544 28.923 2 Đơn tướng quân 12.528 37.707 10.053 3 Đại hoàng 416 1.388 454 4 Đậu cọc rào 4.056 11.957 4.615 5 Cây xoài 3.763 11.549 2.099 6 Gỗ Tô mộc 1.976 16.729 4.925 7 Vỏ thân Tô mộc 13.264 44.311 17.320 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 74.016 530.681 99.025 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 18.733 126.556 25.416 Cũng giống như dịch chiết nước, khả năng ức chế các proteinase của polyphenol tổng số giảm dần theo thứ tự chymotrypsin, trypsin, PsA, trong đó dịch chiết polyphenol tổng số mẫu vỏ hạt Tô mộc chín ức chế mạnh nhất cả ba loại enzyme, cũng là mẫu có hàm lượng polyphenol thuộc nhóm cao trong các mẫu nghiên cứu. PIA tính trên 1 gam bột mẫu khô của dịch chiết polyphenol tổng số các mẫu cũng cao hơn nhiều so với dịch chiết nước đặc biệt là các mẫu Tô mộc. Tuy nhiên các mẫu Sắn thuyền và Đại hoàng lại có PIA thấp hơn, phải chăng polyphenol hai mẫu này không phải là thành phần đóng góp chính vào hoạt độ ức chế proteinase. Nghiên cứu ở Việt Nam đã tinh sạch được acid asiatic từ cây Sắn thuyền và cho thấy acid asiatic có thể ức chế nhiều enzyme khác nhau của vi khuẩn Steptococcus mutans [7]. Acid asiatic là một triterpene đã được sử dụng trong nhiều loại thuốc điều trị các bệnh da và được cho là có vai trò trong việc hình thành collagen, một số dẫn xuất triterpene cũng được cho là có khả năng ức chế proteinse serine (trypsin, chymotrypsin), proteinase kim loại (collagenase) [28]. Do vậy acid asiatic có thể giữ vai trò nào đó đối với hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết Sắn thuyền. Flavonoid toàn phần các mẫu đều có PIA nhưng yếu hơn dịch chiết polyphenol tổng số nhiều lần (trừ mẫu Đại hoàng, phân đoạn flavonoid có khả năng ức chế proteinase tốt hơn dịch chiết tổng số của mẫu này). Bảng 3.3 cho thấy trong 4 mẫu của cây Tô mộc, mẫu vỏ thân có hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ethanol cao nhất sau đó đến gỗ, vỏ hạt già cuối cùng là vỏ hạt xanh. Tuy vậy, bảng 3.5 lại cho thấy mẫu vỏ hạt già lại có khả năng ức chế proteinase cao nhất rồi đến hạt non, vỏ thân, gỗ. Do đó có thể thấy PIA các mẫu này phụ thuộc vào thành phần các polyphenol hơn là hàm lượng polyphenol tổng số. Hình 3.3 cũng cho thấy sự khác biệt rất rõ về hoạt độ riêng tính trên mg polyphenol. Hình 3.3 cho thấy sự khác nhau rất lớn về hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) của các mẫu Tô mộc, hoạt độ riêng mẫu vỏ hạt chín rất cao trong khi hoạt độ riêng mẫu gỗ lại thấp nhất trong các mẫu. Có thể đây là một cơ chế chống lại các yếu tố gây hại như sâu bọ, động vật ăn hạt. Nghiên cứu mới đây đã phát hiện ra trong nhân hạt Tô mộc chín có ít nhất 7 băng protein có khả năng ức chế trypsin, chymotrypsin và proteinase của P. aeruginosa bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, tuy nhiên không pháp hiện ra băng protein có PIA nào ở dịch chiết vỏ hạt trong khi PIA vỏ hạt cao hơn PIA nhân hạt. Do đó các tác giả cho rằng PIA vỏ hạt chủ yếu là do các chất phân tử thấp, không phải protein [6]. Khi so sánh hoạt độ riêng tính theo polyphenol tổng số (mIU/mg polyphenol) và độ riêng tính theo protein (mIU/ mg protein) theo công trình nghiên cứu trên của các mẫu này chúng tôi nhận thấy hoạt độ riêng tính theo polyphenol tổng số lớn hơn nhiều, có thể thấy kết quả này đã chứng minh cho nhận định trên. mIU/mg polyphenol TIA mIU/mg polyphenol ChIA mIU/mg polyphenol PsIA Hình 3.3. Biểu đồ so sánh hoạt độ riêng PIA (mIU/mg polyphenol) của dịch chiết polyphenol tổng số (ts) và flavonoid các mẫu nghiên cứu 3.2 Định tính các thành phần polyphenol và flavonoid trong một số cây thuốc trên bản mỏng Sau khi xác định hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid toàn phần, chúng tôi tiến hành sắc ký định tính các thành phần này trên bản mỏng silicagel một số cây thuốc có PIA cao với các hệ dung môi khác nhau như: Chloroform:Methanol (9:1); TEAF (5:2:1:1); TEAF (5:2:2:1). Kết quả cho thấy hệ dung môi TEAF (5:2:2:1) có khả năng phân tách rõ nhất. Sau đó bản mỏng được sấy khô và nhuộm màu bằng H2SO4 10% và sấy ở 1100C trong 10 phút hoặc hơi NH3 bão hòa. 3.2.1 Sắc ký dịch chiết flavonoid các mẫu nghiên cứu Kết quả cho thấy thành phần flavonoid trong các cây thuốc rất đa dạng, khác nhau ở từng loại cây thuốc cũng như các bộ phận của một cây. Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết flavonoid toàn phần một số mẫu (hệ dung môi TEAF (5:2:2:1), nhuộm H2SO4 10%) Gỗ Vang 6. Đơn tướng quân Vỏ thân gỗ Vang 7. Đại hoàng Vỏ hạt Vang già 8. Đậu cọc rào Vỏ hạt Vang non 9. Xoài Sắn thuyền 3.2.2 Sắc ký các thành phần polyphenol mẫu Tô mộc trên bản mỏng Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy các bộ phận mẫu Tô mộc có sự khác nhau rất lớn về PIA, hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid, hình 3.4 cũng cho thấy các thành phần polyphenol rất khác nhau, vì vậy đã tập trung nghiên cứu các mẫu này. Các dịch chiết qua các giai đoạn tách chiết của các mẫu Tô mộc tiếp tục được sắc ký trên bản mỏng và được nhuộm bằng hơn amoniac bão hòa, kết quả chỉ ra ở hình 3.5. Hình 3.5. Sắc ký đồ các thành phần polyphenol trong cây tô mộc với hệ dung môi TEAF (5:2:2:1) (nhuộm hơi Amoniac bão hoà) 1. Acid gallic 2. DC EtOH gỗ Vang 3. Flavonoid gỗ Vang 4. Cặn không tan gỗ Vang 5. DC EtOH vỏ thân 6. Flavonoid vỏ thân 7. Cặn không tan vỏ thân 8. DC EtOH vỏ hạt chín 9. Flavonoid vỏ hạt chín 10. Cặn không tan vỏ hạt chín 11. DC EtOH vỏ hạt xanh 12. Flavonoid vỏ hạt xanh 13. Cặn không tan vỏ hạt xanh Để so sánh thành phần polyphenol của các mẫu nghiên cứu, đã tiến hành sắc ký dịch chiết các mẫu trên bản mỏng silicagel (lượng polyphenol chấm trên bảng sắc ký giống nhau). Hình 3.5 cho thấy sắc ký đồ polyphenol tổng số và flavonoid của gỗ Tô mộc tương tự nhau và có nhiều băng nhất (vị trí thứ 2 và 3 trên sắc ký đồ), khoảng 11 băng; polyphenol hay flavonoid vỏ thân có ít nhất là 7 băng, các băng chính tương ứng với các băng di động chậm của mẫu gỗ. Sắc ký đồ flavonoid của vỏ hạt chín và vỏ hạt xanh khá giống nhau, đều có 4 băng chính, băng đậm nhất có màu sắc và độ di động tương ứng với acid gallic chuẩn (băng này không rõ lắm ở mẫu gỗ). Kết quả trên chứng tỏ polyphenol cũng như flavonoid trong phần gỗ Tô mộc là đa dạng nhất, và có thành phần flavonoid khác nhiều so với vỏ hạt. Phần gỗ cây Tô mộc đã được sử dụng làm dược liệu ở Việt Nam và nhiều nước khác, có thể sự phong phú về thành phần flavonoid góp phần chính tạo nên tác dụng dược lí của cây Tô mộc. Khi xác định PIA các dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid, chúng tôi nhận thấy PIA của flavonoid các mẫu đều thấp hơn dịch chiết polyphenol tổng số nhiều lần nên các chất có thể PIA nằm lại ở phần không tan của dịch chiết polyphenol tổng số nên đã tiến hành hòa tan phần cặn này trong ethanol, sắc ký bản mỏng và nhận thấy phần lớn các chất này không di chuyển trên bản sắc ký. Phải chăng đây là các chất polymer hoá của các hợp chất phenolic và có khối lượng phân tử lớn như các hợp chất tannin. 3.3 Thăm dò PIA của các băng polyphenol sau khi sắc ký bản mỏng Các mẫu Đại hoàng, gỗ Tô mộc, vỏ thân Tô mộc, vỏ hạt Tô mộc xanh, vỏ hạt Tô mộc chín được sử dụng trong thí nghiệm này. Sau khi sắc ký, cắt một dải bản mỏng, nhuộm để xác định vị trí các băng, từ các băng này dóng hàng để cắt riêng các băng/vùng băng, tách rửa polyphenol từ mỗi băng bằng dung dịch ethanol, ly tâm loại bỏ silicagel, thu dịch trong, cho bay hơi dung môi, hoà tan cặn trong dung dịch đệm, xác định PIA. Kết quả cho thấy, trong các mẫu nghiên cứu, PIA tập trung ở các băng có độ di động thấp, đặc biệt là vùng không di động trên bản mỏng. 3.3.1 PIA các băng flavonoid mẫu Đại hoàng ChIA PPsIA TIA 4 1 3 7 11 8 15 12 16 1 2 4 5 6 3 ĐC Hình 3.6. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của mẫu Đại hoàng Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu 1 , 2, 3... ĐC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16 E+6 Mẫu đại hoàng có hai băng ức chế chính là băng 1 và 4, trong đó băng 1 ức chế tốt hơn. Các tài liệu cho thấy trong Đại hoàng có chrysophanol, emodin là các Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của gỗ Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu (1) , 2, 3 …DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5 dẫn xuất của, đã có những nghiên cứu cho thấy các dẫn Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của gỗ, vỏ thân. Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu (1) , 2, 3 …DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5, ở vỏ thân có thêm băng 6, giếng 15, 16: E +6 xuất anthroquinone có khả năng ức chế nhiều loại protease [35, 56]. Vì vậy chúng tôi không đi sâu nghiên cứu vào Đại hoàng. 3.3.2 PIA các băng flavonoid mẫu Tô mộc TIA 4 1 3 7 11 8 15 12 16 1 2 3 4 5 ĐC STT Băng/ vựng băng mg polyphenol 1,68 2,99 3,55 0,49 0,73 ChIA PPsIA Gỗ TIA 1 2 3 5 6 ĐC 4 8,07 1,65 2,04 0,05 0,03 0,06 STT Băng/ vựng băng mg polyphenol ChIA PPsIA Vỏ thõn Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel mẫu gỗ Tô mộc, vỏ thân Tô mộc Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... ĐC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+ĐC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; Mẫu vỏ thân có thêm băng 6: 15,16: E+6 Hình 3.7b. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel vỏ hạt chín Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16: E+6 15, 16: E +6 4 1 3 7 11 8 15 12 16 TIA ChIA PPsIA Hình 3.7b. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel vỏ hạt chín Các băng được đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... DC: đối chứng 1,2: E+nước; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16: E+6 15, 16: E +6 STT Băng/ vựng băng 1 2 3 4 5 6 mg polyphenol DC 0,09 0,13 0,03 0,31 0,51 2,84 Vỏ hạt chớn Kết quả cho thấy cả 4 băng/vùng băng của mẫu gỗ (1, 2, 3, 4) ít nhiều đều có TIA, ChIA, PsIA, trong đó vùng băng 2 có hoạt độ mạnh nhất. Mẫu vỏ thân: chỉ có băng/vùng băng 1 và vùng băng (2+3) tương ứng với vùng băng 2 của gỗ có TIA, ChIA, PsIA; đối với vỏ hạt chỉ có vùng băng 1 có các hoạt tính trên. Sự sai khác này cũng có thể do sai khác về lượng polyphenol trong mỗi băng nhưng cũng có thể do sai khác về thành phần có PIA của mỗi mẫu. Qua các thí nhiệm với các mẫu cây gỗ Vang, PIA của các mẫu nghiên cứu tập trung chủ yếu ở vị trí không di động trên bản sắc ký, do vậy có thể có khả năng vùng này là các hợp chất tannin. 3.4 Hàm lượng tannin của các mẫu Tô mộc Tannin có thể kết tủa không đặc hiệu với protein, làm bất hoạt nhiều enzyme. Vì vậy đã tiến hành định lượng tannin trong các bộ phận của cây Tô mộc bằng phương pháp kết tủa tannin cùng với gelatin theo phương pháp cải tiến mới được công bố năm 2009 [59]. Hàm lượng tannin được tính bằng hiệu số hàm lượng polyphenol trước và sau khi kết tủa với gelatin. Bảng 3.6. Hàm lượng tannin các bộ phận cây gỗ Vang Mẫu Tannin (mg/g chất khô) % tannin so với polyphenol tổng số Gỗ 9,0 15,5 Vỏ thân 19,3 19,9 Vỏ hạt chín 13,8 26,6 Vỏ hạt xanh 2,5 11,8 Mẫu vỏ thân có hàm lượng tannin cao nhất: 19,3 mg/g chất khô, khoảng 19,9 % lượng polyphenol tổng số có trong vỏ thân. Tannin có trong vỏ hạt già là 13,8 mg/g chất khô, 26,6% lượng polyphenol tổng số, cao nhất trong các mẫu. Mẫu vỏ hạt Tô mộc chín có tỉ lệ tannin cao nhất, hàm lượng flavonoid thấp nhất, lại là có PIA cao nhất, phải chăng tannin có vai trò quan trọng đến hoạt tính ức chế proteinase vỏ hạt chín. 3.5 Thăm dò hoạt độ ức chế proteinase bằng phương pháp điện di Proteinase trên gel polyacryamide Khả năng ức chế PsA không cao bằng khả năng ức chế trypsin và chymotrypsin tinh sạch, do đó chúng tôi sử dụng phương pháp điện di PA trên gel có cơ chất casein 1% để nghiên cứu sâu hơn các proteinase và PIA. 3.5.1 Hoạt độ phân giải proteinase của P. aeruginosa và S. aureus Vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus là hai loại vi khuẩn sinh proteinase ngoại bào điển hình. Proteinase của chúng rất đa dạng và tham gia vào nhiều quá trình bệnh học. Vì vậy, đã tiến hành điện di các PA dịch nuôi cấy hai loài trên và nghiên cứu khả năng ức chế của dịch chiết polyphenol tổng số của các mẫu vỏ hạt già và gỗ Tô mộc đối với proteinase của mỗi loài. Trước khi tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi thu nhận chế phẩm protease từ dịch môi trường nuôi cấy bằng cách kết tủa với acetone ở nhiệt độ thấp và xác định hoạt độ phân giải protein (PA) của dịch nuôi cấy hai loài vi khuẩn này. Kết quả cho thấy hoạt độ proteinase của P. aeruginosa là 1,27 HP/ml và của S. aureus là 0,06 HP/ml; hoạt độ thủy phân của S. aureus yếu hơn P. aeruginosa rất nhiều do đó đã không phát hiện được khả năng ức chế ở các thí nghiệm trên. Vì vậy đã nghiên cứu tác dụng ức chế proteinase của S. aureus bằng phương pháp điện di. Bước đầu tìm hiểu các loại proteinase trong dịch nuôi cấy P. aeruginosa và S. aureus đã tiến hành ủ bản gel ở các pH khác nhau: 4,5; 6,5 và 8, độ sáng các băng PA không thay đổi nhiều nhưng có xu hướng sáng rõ hơn ở pH kiềm. Kết quả này phù hợp với đặc tính sinh proteinase kiềm của hai loài vi khuẩn này [52, 54]. (1) (2) Hình 3.8. Điện di đồ PsA (1), StA (2) Kết quả điện di cho thấy proteinase của hai loài rất khác nhau, PsA có ít nhất 3 băng và có độ di động tương đối chậm (P1, P2, P3). StA cũng có ba băng như có độ di động cao hơn nhiều (P4, P5, P6). 3.5.2 Nghiên cứu PIA bằng phương pháp điện di Để tìm hiểu khả năng ức chế protease, chúng tôi tiến hành theo các cách khác nhau: ủ enzyme với dịch nghiên cứu 20 phút trước khi điện di. Trộn dịch nghiên cứu vào bản gel cùng với cơ chất. Sau khi điện di PA, ủ bản gel trong đệm Sorrensen pH 7,6 cùng với dịch nghiên cứu. Kết hợp cả 3 cách trên. Bản điện di sau đó được nhuộm bằng 2 thuốc nhuộm là Amido Black 10B và Coomassie Brilliant Blue R250. (1) ( 2) Hình 3.9. Điện di đồ PsA (1), StA (2) (trên gel có dịch chiết vỏ hạt Tô mộc chín với nồng độ polyphenol là 0,4 mg/ml) Bản gel không chứa mẫu nghiên cứu Bản gel có chứa mẫu nghiên cứu Nghiên cứu cho thấy khi nhuộm bản gel với Amido Black 10B cho kết quả tốt hơn, do đó các băng PA sáng rõ, ít bị ảnh hưởng bởi màu của dịch nghiên cứu. Trong các cách trên, khi trộn dịch nghiên cứu trong bản gel cùng với cơ chất thì khả năng ức chế proteinase rõ ràng nhất. Khi kết hợp cả 3 cách, bản gel bắt màu với thuốc nhuộm khá đậm, vì vậy cách thứ 2 là cách tốt nhất cho thí nghiệm này. Các mẫu nghiên cứu đều làm giảm hoạt độ của các băng PA, thậm chí còn có thể ức chế hoàn toàn các băng yếu. 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn các mẫu Tô mộc Thăm dò khả năng kháng khuẩn của mẫu gỗ lên hai loài vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa, kết quả cho thấy dịch chiết mẫu vỏ hạt chín có khả năng khánh mạnh hai loài này. Các dịch chiết mẫu gỗ ở nồng độ cao cũng kháng cả hai loài. Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus DC flavonoid gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên P. aeruginosa DC polyphenol tổng số vỏ hạt chín tác dụng lên S. aureus DC flavonoid vỏ hạt chín tác dụng lên S. aureus DC polyphenol tổng số vỏ hạt chín tác dụng lên P. aeruginosa 3.7 Phân chia các thành phần flavonoid trên cột silicagel Để tìm hiểu sâu hơn flavonoid toàn phần của dịch chiết gỗ Tô mộc, chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng đồng thời với một số chất chuẩn flavonoid hay gặp như catechin, rutin, quercetin và nhận thấy có một băng sắc ký có độ di động tương đương với chất chuẩn quercetin, do đó đã tiến hành phân chia trên cột silicagel pha thường để tìm hiểu rõ hơn các thành phần có hoạt tính PIA của dịch chiết gỗ Vang. Qua thăm dò trên bản sắc ký, đã chọn được hệ dung môi chloroform : ethylacetate : acid formic (5:3:0,4) là hệ dung môi đơn giản và có khả năng phân tách tốt. Các phân đoạn thu được sau khi sắc ký được kiểm tra sự phân chia trên bản mỏng cũng như hoạt tính PIA bằng phương pháp khuếch tán. Hình 3.11. Sắc ký bản mỏng các thành phần polyphenol sau khi qua cột silicagel (dung môi sắc ký bản mỏng là hệ dung môi chạy cột) I, II, III, IV, V: các phân đoạn 7: quercetin 12: flavonoid toàn phần (dịch lên cột) Dựa vào sắc ký đồ, đã thu riêng các phân đoạn có phổ sắc ký tương đương được 5 phần chín (I, II, III, IV, V) để kiểm tra hoạt tính ức chế proteinase bằng phương pháp khuếch tán, kết quả thể hiện ở hình 3.12. Hình 3.12 cho thấy các phần I, III, IV, V thu được khi sắc ký cột đều có PIA trong đó phần I và III có khả năng ức chế rõ ràng hơn cả. Từ các kết quả trên cho thấy có nhiều thành phần flavonoid của cây gỗ Vang tham gia vào khả năng ức chế proteinase. 1 4 3 12 11 7 8 (a) (b) (c) Hình 3.12. PIA các phân đoạn sắc ký (a) trypsin (b) chymotrypsin (c) PsA 1-2: E + H2O ; 3-4: E + I 5-6: E + II ; 7-8: E + III 9-10: E + IV ; 11-12: E + V Để tìm hiểu sơ bộ bản chất của các băng này, phần I có một băng di động trùng với quercetin là một flavonoid được cho là có khả năng tương tác và ức chế trypsin [11], do vậy đã tiếp tục tái sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi chloroform : ethylacetate (5:3), kết quả chúng tôi đã tách riêng được băng này với độ tinh sạch khá cao kí hiệu là GV1 và GV2. GV1 có độ di động tương đương với quercetin. Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn thu được sau khi tái sắc ký phân đoạn I Chất chuẩn quecertin GV1 GV2 GV1 và GV2 sau đó được thử PIA, kết quả là GV1 có hoạt độ ức chế proteinase rõ rệt. 16 1 7 8 15 18 12 3 Hình 3.14 PIA của các phân đoạn GV1 và GV2 1-2: T(trypsin) + H2O, 3-4: T+ GV2 5-6: T+GV1; 7-8 C(chymotrypsin) + H2O; 9-10: C+GV2; 11-12: C+GV1; 13-14: PsA+H2O; 15-16: PsA+GV2; 17+18: PsA+GV1 11 4 Quecertin GV1 GV2 Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV-Vis của GV1 và GV2 Hình 3.13 cho thấy mặc dù GV1 có độ di động tương tự với quercetin nhưng phổ UV-Vis hình 3.15) lại cho thấy GV1 chỉ có hai đỉnh hấp thụ ở vùng tử ngoại 290nm giống như quercetin (đăc trưng của nhóm flavonol) [8], vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn về hai phân đoạn này. Nhiều tài liệu cho thấy trong gỗ Tô mộc có chứa nhiều dẫn xuất homoisoflavonoid [42,43], homoisoflavonoid cũng có khả năng ức chế protease [57], phải chăng GV1 là một homoisoflavonoid. Chúng tôi đã gửi mẫu GV1 đi phân tích để xác định cấu trúc của chất có mặt trong phân đoạn này. Kết luận 1. Đã thăm dò được 26 mẫu của 20 cây thuốc thuộc 17 họ khác nhau trong đó có 21 mẫu của 16 cây (80% các cây nghiên cứu) có khả năng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa), khả năng ức chế chymotrypsin là cao nhất. Các mẫu có PIA cao là vỏ hạt Tô mộc chín, Đại hoàng, Đơn tướng quân, Trâm bầu, Sắn thuyền, trong đó TIA, PsIA, ChIA theo thứ tự đều cao hơn 3.500, 4.000 10.000 (mIU/g bột khô). Mẫu Sắn thuyền có PIA cao nhất, TIA, PsIA, ChIA, lần lượt vào khoảng: 36.691, 25.852, 105.148 mIU/g bột khô. 2. Dịch chiết ethanol của các mẫu có PIA cao cũng có hàm lượng polyphenol cao: từ 46 đến 62 mg/g bột khô. PIA của dịch chiết ethanol cao hơn nhiều lần dịch chiết nước, đặc biệt dịch chiết polyphenol tổng số vỏ hạt Tô mộc chín là mẫu có PIA cao nhất trong các mẫu nghiên cứu, TIA, PsIA, ChIA lần lượt là 74.016, 99.025, 530.681 mIU/g bột khô. Hoạt độ riêng (mIU/g polyphenol) của các mẫu rất khác nhau. Dịch chiết flavonoid của các mẫu cũng ức chế các proteinase nhưng tương đối thấp. 3. Với các mẫu Tô mộc, polyphenol của gỗ, vỏ thân, vỏ hạt chín và vỏ hạt xanh lần lượt là: 59, 96,84, 51,93 và 21,39 mg/g khô. Hàm lượng tannin hạt Tô mộc chín cao nhất trong 4 mẫu, đạt 26,6% polyphenol tổng số. Hàm lượng flavonoid của các mẫu này chiếm tỉ lệ tương đối thấp từ 3% - 9% polyphenol tổng số. Riêng mẫu gỗ Tô mộc tỉ lệ flavonoid/polyphenol tổng số là 75,4%, cao nhất trong các mẫu điều tra. 4. PIA của các băng flavonoid tách được sau khi sắc ký trên bản mỏng các mẫu Tô mộc cho thấy: hầu hết các băng/vùng băng của mẫu gỗ đều ức chế các proteinase nghiên cứu ở mức độ khác nhau; mẫu vỏ thân: chỉ có vùng băng di động chậm nhất và băng không di động có hoạt độ ức chế; mẫu vỏ hạt: PIA chỉ được phát hiện ở vùng polyphenol không di chuyển trên bản sắc ký. 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết polyphenol tổng số của mẫu vỏ hạt Tô mộc chín và gỗ Tô mộc lên PA của P. aeruginosa và S. aureus bằng phương pháp điện di cho thấy chúng ức chế cả 3 băng PA của hai loài vi khuẩn này. 6. Dịch chiết các mẫu Tô mộc đều có khả năng ức chế sự phát triển của hai loài P. aeruginosa và S. aureus. 7. Đã tiến hành sắc ký cột silicagel flavonoid mẫu gỗ Tô mộc và thu được 5 phân đoạn có PIA. Phân đoạn I được tiếp tục được tái sắc ký thu được 2 phân đoạn kí hiệu là GV1 và GV2 có phổ hấp thụ UV-Vis đặc trưng cho nhóm chất flavonoid, trong đó GV1 có PIA rõ ràng hơn cả. Kiến nghị 1. Tiếp tục điều tra nghiên cứu các cây thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa để làm rõ hơn mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và tác dụng dược lý cũng như mối liên hệ với hàm lượng và thành phần polyphenol của các cây. Nghiên cứu sâu hơn các mẫu có PIA và polyphenol cao. 2. Tìm hiểu thêm hoạt tính ức chế của các mẫu lên các proteinase khác, đặc biệt là các proteinase ngoại bào của các vi khuẩn khác có vai trò hình thành các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa. Xác định ảnh hưởng của các mẫu tới từng loại proteinase của hai loài vi khuẩn đã khảo sát. 3. Tiếp tục tinh sạch và xác định các flavonoid trong gỗ Tô mộc có vai trò ức chế proteinase. Xác định công thức cấu tạo GV1, GV2 và nghiên cứu hoạt độ ức chế các proteinase khác. Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận văn Nguyễn Minh Thắng, Phạm Thị Trân Châu (2008), “Hoạt tính ức chế proteinaza của dịch chiết polyphenol trong cây gỗ Vang (Tô mộc) Caesalpinia sappan L.” Tạp Chí Sinh học, Tập 30, Số 3: 114-120. (có đăng tóm tắt báo cáo ở Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hoá sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, Hà nội 15-17/10/2008, trang 648) Pham Thi Tran Chau, Nguyen Minh Thang, Hoang Thu Ha (2008), "Proteinase inhibitory activity in an aqueous extracts and polyphenol fractions of Caesalpinia sappan wood and seed" , 20th FAOBMB Conference "Frontier in Life Sciences" October 23-25th, 2008, Taipei, Taiwan, Abtracts Book p.158. Tài Liệu Tham Khảo Tiếng Việt Phạm Thị Trân Châu (1992), “Đại cương về các PPI”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 1, tr. 22-24. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2005), Công nghệ sinh học, tập 3: Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo Dục, pp. 81-86. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y Học. Đào Hùng Cường, Giang Kim Liên (2008), “Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của dịch chiết từ gỗ Vang ở Quảng Nam”, Tạp chí khoa học Đại học Đà Nẵng, 24, tr. 63-68. Phan Thị Hà (2000), Nghiên cứu proteinase của Pseudomonas N01 phân lập từ mủ bỏng, tác dụng của Momoseratin đến proteinase của chúng, Luận văn thạc sĩ khoa học, mã số 1.05.12, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trõn Chõu (2008), “Nghiờn cứu điều tra cỏc chất ức chế proteinaza của thõn và hạt Caesapinia sappan L.” Tạp chớ Khoa học ĐHQG Hà nội, KH TN &CN, 24(4), tr. 261 -270. Nguyễn Quang Huy (2008), Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus mutans, Luận án Tiến sĩ sinh học, mã số 62. 42. 30. 15, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 1, Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược liệu, tr. 259-290. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật. Đào Thị Kim Nhung (1996), Một số đặc tính hóa học và tác dụng sinh học của flavonoid trong cây thuốc thanh nhiệt Smilax glabra Roxb, Lactuca indica Linn, Lonicera japonica Thunb, Luận án phó tiến sĩ khoa học, mã số 01.05.10., Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Tiếng Anh Andersen O. M., Markham K. R. (2006), Flavonoids: Chemistry, biochemistry and Applications, Taylor & Francis Group, pp. 433-471. Andrejko M., Cytryńka M., Jakubowicz T., 2005, “Apolipophorin III is a substrate for protease IV from Pseudomonas aeruginosa”, FEMS Microbiology Letters, 243, pp. 331-337. Camp B. J., Zant W. C. (1957), “Proteolytic enzyme from Pseudomonase putrefaciens”, Food Research, 22, pp. 158. Chang T.L. (2009), “Inhibitory effect of flavonoids on 26s proteasome activity”, Journal of Agricuture and Food Chemistry., 57 (20), pp. 9706-9715. Chen D., Landis-Piwowar KR., Chen MS., Dou QP. 2007), “Inhibition of proteasome activity by the dietary flavonoid apigenin is associated with growth inhibition in cultured breast cancer cells and xenografts”, Breast Cancer Research, 9(6), pp. 80. Fang B, Song Y, Ma J, Zhao RC. (2007), “Severe epidermal necrolysis after bortezomib treatment for multiple myeloma”, Acta Haematologica, 118, pp. 65-67. Fuke C., Yamahara J., Shimokawa T., Kinjo J., Tomimatsu T., Nohara T. (1985), “Two aromatic compounds related to brazilin from Caesalpinia sappan”, Phytochemistry, 24(10), pp. 2403-2405. Dewich P. M. (2002), Medicinal natural products, John Wiley & Son, pp. 8-9. Domash V. I. , Sharpio T. P. , Zabreiko S. A.  and Sosnovskaya T. F. (2008), “Proteolytic enzymes and trypsin inhibitors of higher plants under stress conditions”, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 34(3), pp. 318-322. Engel L. S., Hill J. M., Caballero A. R., Green L. C. and O’Callaghan R. J., (1998), “Protease IV, a unique extracellular protease and virulence factor from Pseudomonas aeruginosa”, The Journal of Biological Chemistry, 273(27), pp. 16792-16797. Hagerman E. A. (2002), Tannin chemistry, Department of Chemistry and Biochemistry, Miami University, Oxford, USA. Hahn-Deinstrop E. (2007), Applied Thin-Layer Chromatography, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Harborne, J.B. (1980), “Plant Phenolics. In: Secondary Plant Products” (eds E.A. Bell & B.W.Charlwood), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, 8, pp. 329-402. Harborne J.B. (1994), The flavonoids advances in research since 1986, Chapman & Hall Ltd, London. Họttenschwiler, S. & Vitousek, P.M. (2000), “The role of polyphenols in terrestrial ecosystem nutrient cycling”, Tree, 15, pp. 238–243. Heussen C., Dowdle E. B. (1980), “Electrophoretic analysis of plasminogen ativators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and co-polymerized substrate”, Analytical Biochemistry., 102, pp. 196-202. Hobden J. A. (2002), “Pseudomonas aeruginosa proteases and corneal virulence”, DNA and Cell Biology, 21(5-6) pp. 391-396. Hodges L. D., George Kweifio-Okai and Macrides T. A., (2003), “Antiprotease effect of anti-inflammatory lupeol esters”, Molecular and Cellular Biochemistry, 252(1-2), pp. 97-101. Hu J., Yan X., Wang W., Wu H., Hua L., Du L., (2008), “Antioxidant Activity In Vitro of three Constituents from Caesalpinia sappan L”, Tsinghua Science & Technology, 13(4), pp. 474-479. Iwashina T. (2000), “The structure and distribution of the flavonoids in plants”, Journal of Plant Research, 113, pp. 287-299. John Smith H. and Simons C. (2009) Design of Caspase Inhibitors as Potential Clinical Agents, CRC Press, Taylor & Francis Group, LLC. Kim J.H., Kim H.A, Baek S.H., Kho Y.H., Kim M.R., Lee C.H., (2003), “A caspase inducing inhibitor isolate from Caesalpinia sappan”, Korean medical database, 35(4) pp. 680-683. Kim K.J., Yu H.H., Jeong S.I., Cha J.D., Kim S.M., You Y.O. (2004), “Inhibitory effects of Caesalpinia sappan on growth and invasion of methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, Journal of Ethnopharmacology, 91, pp. 81-87. Lim M.Y., Jeon J.H., Jeong E.Y., Lee C.H., Lee H.S. (2007), “Antimicrobial activity of 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone isolated from Caesalpinia sappan toward intestinal bacteria”, Food chemistry, 100(3), pp. 1254-1258. Lin CW., Tsai FJ., Tsai CH., Lai CC., Wan L., Ho TY., Hsieh CC, Chao PD., (2005), “Anti-SARS coronavirus 3C-like protease effects of Isatis indigotica root and plant-derived phenolic compounds”, Antiviral Research, 68(1), pp. 36-42. Mar W., Lee H.T., Je K.H., Choi H.Y., Seo E.K. (2003), “A DNA strand-nicking principle of a higher plant, Caesalpinia sappan”, Arch Pharm Res, 26(2), pp. 147-150. Mathee K., Narasimhan G., Valdes C.,Qiu X., Matewish J. M., Koehrsen M., Rokas A., Yandava C., N. Engels R., Zeng E., Olavarietta R., Doud M.,Smith R., S. Montgomery P., White J., R. Godfrey P., A. Kodira C., Birren B., Galagan J. E., Lory, (2008), “Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution”, PNAS, 105(8), pp. 3100-3105. Matsumoto K., Shams NB., Hanninen LA,. Kenyon KR., (1992), “Proteolytic activation of corneal matrix metalloproteinase by Pseudomonas aeruginosa elastase”, Curr Eye Res,11(11) pp.1105-1109. Min, B. R., Pinchak, W. E., Merkel, R., Walker, S., Tomita, G. Anderson, R. C. (2008), “Comparative antimicrobial activity of tannin extracts from perennial plants on mastitis pathogens”, Scientific Research and Essay, 3(2), pp. 66-73. Min B. R., Hart S. P., (2003), “Tannins for suppression of internal parasites”, Journal of Animal Science, 81(2) pp. E102-E109. Nagai M., Nagumo S., Lee S.M., Eguchi I., Kawai Ken-ichi, (1986), “Protosappanin A, a novel biphenyl compound from Sappan Ligum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 34 (1) pp. 1-6. Namikoshi M., Nakata H., Saitoh T., (1987), “Homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan”, Phytochemistry, 26(6), pp. 1831-1833. Namikoshi M., Saitoh T. (1987), “Homoisoflavonoid and related compounds, IV. Absolute configuration of homoisoflavonoids from Caesalpinia sappan L.”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 35(9) pp. 3597-3602. Nguyen T. M., Dinh V. B. , ặrskove. R. (2005), “Effect of foliages containing condensed tannins and on gastrointestinal parasites”, Animal feed science and technology, 121(1-2), pp. 77-87. Nguyen T. M. T., Awale S., Tezuka Y., Tran Q. L., Kadota S., (2004), “Neosappanone A, a xanthine oxidase (XO) inhibitory dimeric methanodibenzoxocinone with a new carbon skeleton from Caesalpinia sappan”, Tetrahedron Letters, 45(46), pp. 8519-8522. Page M. J. and Di Cera E., (2008), “Serine peptidases: Classification, structure and function”, Cellular and Molecular of Life Sciences, (65), pp. 1220-1236. Pengelly A. (2004), The constituents of medicinal plants, Sunflower Herbals, 2nd Edition, 109 p. Ravaglia S, Corso A, Piccolo G, Lozza A, Alfonsi E, Mangiacavalli S, Varettoni M, Zappasodi P, Moglia A, Lazzarino M, Costa A. (2008), “Immune-mediated neuropathies in myeloma patients treated with bortezomib”, Cinical Neurophysiology, 119(11), pp. 2507-2512. Rawlings N. D., Tolle D. P., Barrett A. J., (2004), “Evolutionary families of peptidase inhibitors”, Biochemical Journal, 378, pp. 705-716. Rawlings, N.D., Morton, F.R., Kok, C.Y., Kong, J. & Barrett, A.J. (2008) “MEROPS: the peptidase database”. Nucleic Acids Ressearch, 36, pp. D320-D325. Sabeh F., Ryoko Shimizu-Hirota, and Weiss S. J., (2009), “Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited”, The Journal of Cell Biology, 185(1), pp.11-19. Shaw L., Golonka, E. Potempa J., Foster S. J. (2004), “The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus”, Microbiology, 150, pp. 217-228. Smagur J., Guzik K., Bzowska M., Kuzak M., Zarebski M., Kantyka T., Walski M., Gajkowska B,  Potempa J., (2009), “Staphylococcal cysteine protease staphopain B (SspB) induces rapid engulfment of human neutrophils and monocytes by macrophages”, Biological Chemistry, 390(4), pp. 361-371. Smith L., Rose B., Tingpej P., Zhu H., Conibear T., Manos J., Bye P., Elkins M., Willcox M., Bell S., Wainwrigh C., and Harbour C., (2006), “Protease IV production in Pseudomonas aeruginosa from the lungs of adults with cystic fibrosis”, Journal of Medical Microbiology, 55, pp. 1641-1644. Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S., and Rattanasuwan, P., (2003), “HIV-1 protease inhibitory effects of some selected plants in Caesalpiniaceae and Papilionaceae families”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 2003, 25(4), pp. 509-514 Tewtrakul, S., Subhadhirasakul, S., Rattanasuwan, P and Puripattanavong, J, 2007, “HIV-1 protease inhibitory substances from Cassia garrettiana”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 29(1), pp. 145-149. Tsukamoto S., Wakana T., Koimaru K., Yoshida T., Sato M. and Ohta T., (2005), “7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman and Broussonin B: neurotrophic compounds, isolated from Anemarrhena asphodeloides BUNGE, function as proteasome inhibitors”, Biological and Pharmaceutical Bulletin 28(9), pp. 1798-1800. Valera A. G., Dớaz-Hernỏndez M., Hernỏndez F., Ortega Z, Lucas J. J. (2005), “The ubiquitin-proteasome system in Huntington's disease”, Neuroscientist, 11, pp. 583-594. Vu N. K. P., Phan V. H. N., Vo T. B. H. (2008), “Determination of tannin contents in plants by improved Folin-Ciocalteu method”, Conference proceeding Analytica Vietnam 2009, pp. 175-180. Waterman W. P., (1992), Secondary metabolites: their function and evolution, Chapter: Roles for secondary metabolites in plants, JohnWiley & Sons, pp. 255-275. Waterhouse, A.L., 2001, “Determination of total phenolics, in current protocols in food” Analytical Chemistry, pp. I1.1.1-I1.1.8. Wink M. (2008), Evolution of Secondary Plant Metabolism. In: Encyclopedia of Life Sciences (ELS), JohnWiley&Sons. Ye M., Xie W.D., Lei F., Meng Z., Zhao Y., Su H. and Du L.J (2006) “Brazilein, an important immunosuppressive component from Caesalpinia sappan L.” International Immunopharmacology, 6(3), pp. 426-432. Yohei S., Tomokazu H., Masahiro N. and Seiji N., (2007), “In Vitro Study for Inhibition of NO Production about Constituents of Sappan Lignum”, Biologial and Pharmaceutical Bulletin, 30(1) pp. 193-196. Yoon J.H., Baek S.J. (2008), “Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties”, Yonsei Med, 46(5), pp. 585-596. Yuan, J., Shaham, S., Ledoux, S., Ellis, H. M. & Horvitz, H. R. (1993), “The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian Interleukin-1b-converting enzyme”, Cell, 75, pp. 641-652 Zhao H., Bai H., Wang Y., Li W., Koike K. (2008), “A new homoisoflavan from Caesalpinia sappan”, Jounal of Natural Medicines, 62, pp. 325–327. Zhao Y. N., Pan Y., Tao J. L., Xing D. M., Du L. J. (2006) “Study on cardioactive effects of brazilein”, Pharmacology, 76, pp. 76-83. Tiếng Nga Pietrova J. S., M. M. Wincjunajte (1966), “Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologichskovo proiskhozhdenia”, Priklad. Biochim. I Microbiol., 2, pp. 232. Tiếng Ba lan Leluk J., Pham T.C, Kieleczawa J. (1985), “Zastosawanie edestyny do badania aktywnosci proteinaz ich inhibitorow”, XXI meet.Pol.Biochem.Soc., Krakow, Abstract, pp.139. Các trang wed