Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẩn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐỖ HOÀNG KHIÊM MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG KHIÊM BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006 KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS AND DOG SPERM CAPACITATION Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: A.Professor. Dr. TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM Veterinarian. QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006 Engineer. NGUYEN VAN UT Ho Chi Minh City 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Cô Trần Thị Dân đã hết lòng hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, một tấm gƣơng lao động, một phong cách làm việc cần đƣợc noi theo. Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh và thầy Nguyễn Văn Út đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm sống và làm việc, tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Thầy Trần Ngọc Hùng đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Nguyễn Văn Thuận và thầy Nguyễn Thanh Bình đã truyền đạt những kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tôi. Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh và gia đình anh Phƣớc đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 và những ngƣời bạn thân đã chia sẽ những vui buồn cũng nhƣ hỗ trợ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Thủ Đức, ngày 15-08-06 Đỗ Hoàng Khiêm v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đỗ Hoàng Khiêm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ” Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN 2. BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH 3. KSCNSH. NGUYỄN VĂN ÚT Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày càng đƣợc hoàn thiện và có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng nhân giống nhanh ở những thú cao sản hoặc thú quý hiếm. Để tiếp cận kỹ thuật này chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hoàn thiện dần các công đoạn trong việc nâng cao tỉ lệ chó quý hiếm đƣợc tạo ra từ kỹ thuật thụ tinh in vitro. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh hơn với phƣơng pháp vuốt và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo. 2. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamelle) cho tỉ lệ thành công 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”) trong khi phƣơng pháp không sử dụng lá kính cho kết quả thất bại. 3. Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Chất lƣợng của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian bảo quản 0 giờ là tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). vi MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa 1 .................................................................................................................................i Bìa 2 ............................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ..........................................................................................................iv Mục lục ........................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii Danh sách các bảng .................................................................................................... viii Danh sách các hình ........................................................................................................ix PHẦN I. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ................................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu .................................................................................................................... 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng ....................................................................... 3 2.1.1. Cấu tạo ............................................................................................................ 3 2.1.2. Chức năng ....................................................................................................... 4 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng ............................................. 4 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............. 4 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể .................................... 4 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào .............................................................. 6 2.3.1. Bề mặt chai cấy ............................................................................................... 6 2.3.2. Các đặt tính vật lý ........................................................................................... 6 2.3.2.1. pH .......................................................................................................... 6 2.3.2.2. Dung dịch đệm ...................................................................................... 7 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu .................................................................................. 7 2.3.2.4. Nhiệt độ ................................................................................................. 7 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí ........................................................................ 7 2.3.2.6. Độ nhớt ................................................................................................... 8 2.3.3. Tủ cấy .............................................................................................................. 8 2.3.4. Kháng sinh ...................................................................................................... 8 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào ........................................................................ 8 2.4.1. Nguồn nhiễm ................................................................................................... 8 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật ...................................................... 8 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác ....................................................................... 9 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào ................................................. 9 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng ............................................................. 10 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp ............................................................................................. 10 2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp ........................................................................................... 11 2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue .................. 11 2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................... 11 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi ........ 11 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó ........................ 12 2.9. Tinh trùng .............................................................................................................. 13 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng ............................................................ 13 vii 2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng ................................................................................... 14 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng .................................................................................. 15 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong dƣờng sinh dục cái ..................................... 16 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó ................................................ 17 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng .......................................... 17 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó ............................................... 19 2.11. Hoạt hóa tinh trùng .............................................................................................. 20 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 23 3.1. Nội dung ................................................................................................................ 23 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 23 3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 23 3.3.1. Nguồn mẫu .................................................................................................... 23 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 23 3.3.3. Hoá chất ........................................................................................................ 24 3.4. Phƣơng pháp .......................................................................................................... 25 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................................................. 25 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ ......................................................... 25 3.4.1.2. Xử lí ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm ............................................ 25 3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ................................................ 26 3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............................................... 28 3.4.1.5. Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng trypan blue ...................... 29 3.4.2. Chuẩn bị tinh trùng cho quá trình thụ tinh in vitro ...................................... 30 3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm ............ 30 3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng ............................................................................... 30 3.5. Xử lí số liệu ........................................................................................................... 34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 35 4.1. Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ........................................ ..35 4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng ................ ..35 4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa ............. 37 4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng.................................................................................. 37 4.3.2. Nồng độ của tinh trùng ................................................................................. 38 4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................................. 39 4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome .......................................... 40 4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng .............................................................. 41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 44 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 44 5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 45 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 47 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AR: acrosome reaction BOEC: bovine oviductal epithelial cells BSA: bovine serum albumin DNA: deoxyribonucleic acid DNP: deoxyribonucleoprotein ECS: estrous cow serum EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme linked immunosorbent assay ET: embryo stransfer FBS: phosphate buffered saline FCS: fetal calf serum FGF: fibroblast growth factor HSA: human serum albumin IGF: insulin – like growth factor IVC: in vitro culture IVF: in vitro fertilization IVM: in vitro maturation M II: metaphase II PCR: polymerase chain reaction PDGF: platelet – derived growth factor RNA: ribonucleic acid ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị pH......................................................................................................... 7 Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES ...................................................... 9 Bảng 2.3 Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó của Iguer và Verstegen ............... 19 Bảng 2.4 Công thức pha chế 4 môi trƣờng ................................................................... 20 Bảng 4.1 Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy ................. 35 Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng ................................................................... 37 Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng .......................................................................... 38 Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ...................................................... 39 Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome ............... 40 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................ 42 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy ................................... 36 Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) ............................... 36 Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa ......................................... 41 Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa ............................................ 41 Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng ........................................................................ 43 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng ................................................................. 37 Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng ................................................................ 38 Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................ 39 Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome ............................ 40 Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................. 42 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình. Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi hỏi sâu sắc hơn. Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt, thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003): - Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản. - Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao. - Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống. - Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai thác tế bào mầm. Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro (IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn khá thấp (Farstad, 2000). Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện. 1.2. Mục tiêu Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó. 2 1.3. Yêu cầu - Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. - Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên khả năng hoạt hóa tinh trùng. 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng 2.1.1. Cấu tạo Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng. Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ ngoài. - Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm. Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có lông, tế bào đáy và tế bào trung gian. Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen. Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết. Những tế bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống dẫn trứng. Tế bào đáy: nhỏ, nằm rải rác, có bào tƣơng sáng, ít bào quan, nhân bắt màu mạnh. Chức năng còn chƣa rõ ràng. Tế bào trung gian: nằm chen vào giữa những tế bào có lông và tế bào chế tiết. Nhân cũng bắt màu mạnh. Lớp đệm ngăn cách với biểu mô ở màng đáy, có những chỗ lồi, đẩy biểu mô lên và tạo thành những nếp nhăn của niêm mạc. Lớp đệm là một mô liên kết chứa nhiều mạch máu và mạch bạch huyết. Trong lớp đệm có những tế bào hình thoi nhƣ những nguyên bào sợi, một số tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân nằm trong một lƣới sợi. Những tế bào hình thoi có tiềm năng phát triển giống nhƣ những tế bào ở lớp đệm của nội mạc tử cung. 4 - Tầng cơ gồm hai lớp cơ trơn: lớp trong có các bó sợi cơ xếp theo hƣớng vòng; ở lớp ngoài, các bó sợi xếp theo hƣớng dọc. - Tầng vỏ ngoài: là một mô liên kết chứa mạch máu, dây thần kinh. 2.1.2. Chức năng 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng - Ống dẫn trứng là cơ quan tiếp nhận noãn đã đƣợc phóng thích từ buồng trứng rồi vận chuyển về phía tử cung. Sự vận chuyển noãn trong lòng ống dẫn trứng đƣợc tiến hành nhờ ba yếu tố: + Sự co bóp tầng cơ ống dẫn trứng là chủ yếu (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004). + Nhu động của các lông nhung theo hƣớng về phía tử. Estrogen có tác dụng gây ra sự biệt hóa của tế bào có lông, còn progesterone có tác dụng tăng cƣờng sự chuyển động của các lông. + Sự lôi cuốn noãn theo dòng nƣớc màng bụng. Nhờ hệ thống mạch bạch huyết phong phú trong lớp đệm nên ống dẫn trứng là cơ quan hấp thụ nƣớc màng bụng (Trịnh Bình và ctv, 2004). - Sự vận chuyển tinh trùng trong ống dẫn trứng theo hƣớng ngƣợc lại sự vận chuyển noãn, chủ yếu là nhờ sự co bóp của tầng cơ ống dẫn trứng. 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng Những sản phẩm của các tế bào chế tiết nằm trong biểu mô ống dẫn trứng đóng vai trò quan trọng. Chúng tạo ra một môi trƣờng thuận lợi cho sự sống và sự chuyển động của tinh trùng, làm cho tinh trùng đạt đƣợc khả năng gây thụ tinh cho noãn. Chúng còn chứa những chất dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự sống và phát triển của noãn đã thụ tinh tới giai đoạn phôi nang, khiến cho phôi nang có thể làm tổ trong nội mạc tử cung. 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể - Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng những loại tế bào bình thƣờng khác nhau để nuôi cấy duy trì. Kết quả cho thấy mối liên quan nghịch giữa tuổi của mô cấy và vòng đời sinh sản của tế bào. Ví dụ, tế bào gốc có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trƣởng thành (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). 5 - Tế bào đƣợc xem nhƣ đạt đến điểm cuối của vòng đời tái sản nếu mật độ tế bào giảm còn phân nửa mật độ nuôi cấy ban đầu. Vòng đời tái sản có liên quan nghịch với áp lực oxy xung quanh và có liên quan trực tiếp với mật độ nuôi cấy ban đầu (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nhiều nghiên cứu gần đây đã đặt ra câu hỏi: khả năng tái sản có giới hạn của tế bào trong nuôi cấy gắn liền với đặc tính của tế bào hay điều kiện nhân tạo do môi trƣờng nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy có gây ra sự bất tử của tế bào hay không thì vẫn chƣa đƣợc xác minh (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Tuy nhiên, ngƣời ta đã tạo nên các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trƣởng liên tục trong môi trƣờng nuôi cấy chuyền. Đó là những tế bào ung thƣ của cơ thể hoặc tế bào đƣợc làm chuyển dạng “ung thƣ hóa” với những biến đổi di truyền. Ví dụ, tế bào HeLa đƣợc thu nhận từ mô ung thƣ cổ dạ con, tế bào Namalwa là tế bào ung thƣ limphoma của chị Namalwa (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). Có hai kiểu chết tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Chết chƣơng trình: tế bào chết do thay đổi môi trƣờng sống, là quá trình phụ thuộc ATP. Hình dạng tế bào nhăn nhúm, nhân vỡ, xuất hiện các thể tự hủy. Trong cơ thể tế bào chết chƣơng trình sẽ đƣợc thực bào. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào, tế bào chết chƣơng trình thƣờng xảy ra dƣới những điều kiện khác nhau: Những dòng tế bào phụ thuộc yếu tố tăng trƣởng, tế bào chết chƣơng trình do mất đi yếu tố tăng trƣởng. Những dòng tế bào kết thúc sự biệt hóa khi nuôi cấy ngoài cơ thể, kết thúc vòng đời tái sản. Điều kiện nuôi cấy thay đổi hoặc nuôi cấy tế bào đã đạt mật độ cao. Tế bào tiếp xúc với tác nhân gây độc tế bào. + Hoại tử tế bào: tế bào phồng to, nhiễm sắc thể “lên bông”, gây ly giải tế bào trực tiếp, hoại tử tế bào nhanh chóng. Tế bào nuôi cấy ngoài cơ thể chết do quá trình hoại tử, khi nhuộm trypan tế bào bắt màu xanh. Sự sinh trƣởng của tế bào in vitro thƣờng trải qua 3 pha (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005): + Pha chậm (lag phase): là giai đoạn từ khi tế bào đƣợc cho vào môi trƣờng đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Đây là khoảng thời gian tế bào thích nghi với môi 6 trƣờng mới (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô đƣợc trích tế bào. + Pha tiến triển (exponential growth): là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lƣợng tế bào trong khoảng thời gian 15-25 giờ với số lƣợng tế bào đạt 1- 2.10 6 /cm 3 , là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. Độ dài của pha này phụ thuộc dinh dƣỡng, tốc độ phát triển, mật độ mà sự tái sản tế bào bị ức chế. Ở pha này, tốc độ phát triển tế bào cao nhất (90% – 100%), tế bào đồng nhất và khả năng tái sản cao (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). + Pha dừng (stationary phase): là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số lƣợng tế bào không thay đổi, tức là giai đoạn mà môi trƣờng dinh dƣỡng nghèo dần và bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện sự tự hoại tế bào: nhân bị đứt chẻ, trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối (blebs). 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào 2.3.1. Bề mặt chai cấy Sự bám dính và phát triển tế bào có thể cải thiện bằng nhiều cách: dùng chai cấy tái sử dụng tráng phủ một lớp collagen, fibronectin, gelatin… Gelatin thƣờng đƣợc phủ lên bề mặt đĩa nhựa vì có lợi cho sự nuôi cấy tế bào cơ và tế bào biểu mô màng trong (Freshney, 1987). Độ sâu của môi trƣờng: tốt nhất từ 2 – 5 mm ( 0,2 – 0,5 ml/cm2), độ sâu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng thấm nhập của oxy xuyên qua môi trƣờng đến tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). 2.3.2. Các đặc tính vật lý 2.3.2.1. pH Hầu hết các dòng tế bào phát triển ở pH 7,4. pH tối ƣu để phát triển thay đổi rất ít ở những dòng tế bào khác nhau. Phenol red đƣợc bổ sung vào môi trƣờng làm chất chỉ thị pH (Freshney, 1987). Nếu môi trƣờng chuyển dần từ đỏ sang vàng cam là tế bào phát triển tốt, nếu từ đỏ chuyển sang vàng nhạt là môi trƣờng bị nhiễm khuẩn (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). 7 Bảng 2.1. Giá trị pH và màu sắc môi trƣờng (nguồn: Freshney, 1987) * dùng phenol red 2.3.2.2. Dung dịch đệm Đệm bicarbonate vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn các dung dịch đệm khác bởi vì ít độc, giá rẻ và thuận lợi cho quá trình trao đổi chất mặc dù khả năng đệm kém ở pH sinh lý. Hepes có khả năng đệm hiệu quả hơn ở pH từ 7,2 – 7,6 và thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 10 hoặc 20 mM (Freshney, 1987). 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến tế bào nuôi cấy. Ở những loài khác nhau thì áp suất thẩm thấu của huyết tƣơng khác nhau. Ví dụ: ở ngƣời khoảng 290 mOsm/kg, ở chuột khoảng 310 mOsm/kg. Trong thực nghiệm, thƣờng điều chỉnh trong khoảng từ 260 – 320 mOsm/kg (Freshney, 1987). 2.3.2.4. Nhiệt độ (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) - Nhiệt độ giảm sẽ làm giảm sự phát triển nhƣng không làm giảm khả năng sống của tế bào, trừ khi thời gian hạ nhiệt độ kéo dài hơn 3 ngày. - Nhiệt độ gia tăng sẽ làm tăng sự phát triển nhƣng sẽ làm giảm khả năng sống của tế bào. - Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến pH. Ở nhiệt độ thấp, CO2 hòa tan tăng nên làm thay đổi sự ion hóa. 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí Áp lực bề mặt của môi trƣờng hỗ trợ sự bám dính của tế bào vào đáy bình nuôi cấy nhƣng ít đƣợc ứng dụng. Nuôi cấy ở điều kiện 5% CO2 sẽ tạo bọt khí mà bọt khí có liên quan đến lƣợng protein thoái hóa và nguy cơ nhiễm khuẩn (Freshney, 1987). pH Màu* 6,5 7,0 7,4 7,6 7,8 Vàng Cam Đỏ Hồng nhạt Tím 8 2.3.2.6. Độ nhớt Độ nhớt của môi trƣờng đƣợc quyết định chủ yếu bởi huyết thanh và một phần do sự phát triển của tế bào. Tăng độ nhớt của môi trƣờng với carboxy methyl cellulose hoặc polyvinyl pyrolidone sẽ làm giảm sự hƣ hại của tế bào trong lúc khuấy và xử lí trypsin (Freshney, 1987). 2.3.3. Tủ cấy Số lần mở, sự rung lắc của tủ cấy ảnh hƣởng đến sự phát triển và sự phân bố của tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). 2.3.4. Kháng sinh - Kháng sinh đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để làm giảm khả năng nhiễm khuẩn. Tuy nhiên với kỹ thuật thao tác vô trùng có thể không cần sử dụng kháng sinh vì có một số bất lợi nhƣ sau (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Tạo điều kiện thuận lợi cho sự đề kháng kháng sinh của vi sinh vật. + Che dấu sự nhiễm khuẩn tiềm ẩn ở mức độ thấp và nhiễm Mycoplasma. + Ảnh hƣởng tế bào động vật hữu nhũ. + Tạo tâm lý chủ quan trong việc thực hiện kỹ thuật vô trùng. + Nhiễm nấm khó đƣợc kiểm soát. - Nồng độ kháng sinh thƣờng sử dụng (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Streptomycine: 100 µg/ml + Penicilline: 100 UI/ml + Gentamycine S: 250 µg/ml 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào 2.4.1. Nguồn nhiễm (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) Không khí ẩm của tủ nuôi cấy là nguồn nhiễm chính và nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào, thao tác nào. Tác nhân gây nhiễm: vi trùng, nấm men, nấm mốc, Mycoplasma, protozoa… Theo dõi nhiễm: bằng mắt dƣới kính hiển vi. 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) - Thay đổi pH đột ngột dẫn đến thay đổi màu sắc của chỉ thị màu trong môi trƣờng. pH giảm rõ trong trƣờng hợp nhiễm trùng. Khi nhiễm nấm men, pH thay đổi ít, trừ khi nhiễm nấm men nhiều. Tăng pH khi nhiễm nấm sợi. 9 - Đục môi trƣờng hoặc cặn ở đáy. - Dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần, giữa những tế bào có những hạt lấp lánh là môi trƣờng đã bị nhiễm khuẩn, hình tròn có những nụ nhỏ là nấm men. - Nấm sợi: nhiều sợi mảnh, có thể thấy đám đậm độ của bào tử. - Nhiễm Mycoplasma: có những dấu hiệu hủy hoại tế bào. Xác định Mycoplasma bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, PCR, ELISA… 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác (trích dẫn từ Phan Kim Ngọc, 2002) - Mang găng tay khi thao tác. - Sử dụng áo blouse, khẩu trang và nón che kín tóc. - Hạn chế việc mang vật dụng cá nhân khi thao tác vô trùng. - Trƣớc khi vào phòng thí nghiệm: vệ sinh cá nhân tốt, rửa sạch tay bằng xà phòng, sát trùng bằng javel và cồn, chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ, môi trƣờng cần sử dụng trong suốt thời gian làm việc, khử trùng phòng và tủ cấy bằng tia UV. - Sau khi làm việc trong phòng thí nghiệm: dọn vệ sinh tủ cấy và phòng, sắp xếp các dụng cụ và thiết bị gọn gàng đúng qui định, các dụng cụ đã sử dụng cần đƣợc rửa sạch và sấy khô tại khu vực rửa dụng cụ, tắt các thiết bị không cần sử dụng, rửa sạch tay bằng xà phòng và sát trùng bằng javel và cồn. - Tất cả các mẫu vật, hóa chất dƣ thừa phải đƣợc mang ra khỏi khu vực thao tác và đƣợc xử lý cẩn thận. 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Freshney, 1987) - Dung dịch đệm: sự lựa chọn dung dịch đệm phụ thuộc vào nồng độ CO2 (bảng 2.2), dung dịch tách mô, lớp đơn tế bào. Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES (nguồn: Freshney, 1987) Pha khí Pha lỏng CO2 HCO3 - HEPES Không khí 2% 5% 4 mM 8 mM 24 mM 10 mM 20 mM 50 mM - Acid amin: nồng độ acid amin quyết định khả năng duy trì nồng độ tế bào tối đa, ảnh hƣởng đến sự sống còn và tỉ lệ phát triển của tế bào. 10 - Vitamin: thông thƣờng chỉ bổ sung vitamin nhóm B vào môi trƣờng nuôi cấy vì những vitamin khác đã có đủ trong huyết thanh. Việc thêm vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy chứa nồng độ huyết thanh thấp là cần thiết. - Muối: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, SO4 2- , Cl - , PO4 3- , HCO3 -… là thành phần chính tạo áp lực thẩm thấu môi trƣờng. Nồng độ muối NaHCO3 phụ thuộc vào nồng độ CO2 trong pha khí. - Glucose: đƣợc bổ sung vào trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào, đóng vai trò là nguồn năng lƣợng chính. - Chất hữu cơ: gồm nucleosides, những chất trung gian trong chu trình acid citric, pyruvate và lipid. Sự bổ sung những chất này cần thiết cho quá trình tạo dòng hoặc duy trì dòng tế bào đặc biệt. - Hormon và các yếu tố tăng trƣởng: gồm insulin, hydrocortisone, PDGF, EGF, FGF, IGF… Insulin giúp hấp thu glucose, acid amin và ảnh hƣởng đến sự phân bào. IGF gắn đặc hiệu với thụ thể của insulin trên bề mặt của tế bào và có tác dụng tƣơng tự insulin. Hydrocortisone làm tăng sự bám dính, thúc đẩy tăng sinh tế bào (Guner và ctv, 1977; McLean và ctv, 1986), ngăn cản sự phân bào (Freshney và ctv, 1980) và tăng sự biệt hóa tế bào. - Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp hormon, yếu tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, acid amin, vitamin, chất khoáng, chất ức chế, ketoacid, glucose và một số chất dinh dƣỡng khác. 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp Theo Phan Kim Ngọc (2002), nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan. Các tế bào thu đƣợc trong lần nuôi cấy này gọi là tế bào sơ cấp. Các tế bào sơ cấp thƣờng không thuần nhất vì là hậu duệ của nhiều tế bào ban đầu khác nhau. Nuôi cấy sơ cấp gồm 2 phƣơng pháp: nuôi cấy tế bào từ mảnh mô và nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nuôi cấy tế bào từ mảnh mô là phƣơng pháp nuôi cấy những mảnh mô đã đƣợc cắt nhỏ (1 mm3), trên môi trƣờng thể tích nhỏ với nồng độ huyết thanh cao. Áp lực bề mặt giúp mảnh mô tƣơng đối cố định, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám dính vào bề mặt đáy đĩa và phát triển. Phƣơng pháp này không sử dụng enzyme 11 trypsin nên hạn chế đƣợc nguy cơ tổn thƣơng tế bào, nhƣng tế bào phát triển chậm. Vì vậy, phƣơng pháp này thích hợp cho nuôi cấy các loại tế bào dễ bị tổn thƣơng và tránh đƣợc nguy cơ mất tế bào. - Nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme là phƣơng pháp nuôi cấy những tế bào đã đƣợc tách riêng lẻ nhờ phản ứng của enzyme (trypsin, collagenase,…). Phƣơng pháp này tách đƣợc số lƣợng lớn tế bào trong thời gian ngắn trƣớc khi nuôi cấy nhƣng tế bào dễ bị tổn thƣơng và đòi hỏi khối lƣợng mô nhiều hơn phƣơng pháp nuôi cấy tế bào từ mảnh mô. Nồng độ tế bào trƣớc và sau nuôi cấy đƣợc xác định và số lƣợng đặc trƣng cho từng loại tế bào nuôi cấy. Enzyme trypsin thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp nuôi cấy này với 2 dạng là trypsin ấm và trypsin lạnh. Trypsin ấm mặc dù làm tổn thƣơng tế bào nhiều hơn nhƣng tách tế bào nhanh hơn nên đƣợc ƣa chuộng hơn phƣơng pháp trypsin lạnh. Có thể hạn chế tác động của trypsin làm tổn thƣơng tế bào bằng cách nhũ tƣơng hóa cặn sau khi tách tế bào trong môi trƣờng có bổ sung huyết thanh, lƣu trữ tạm trong điều kiện lạnh hoặc làm tăng độ nhớt của môi trƣờng. 2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp Theo Phan Kim Ngọc (2002), sau khi tế bào nuôi cấy sơ cấp đã phân chia đầy đủ (tế bào một lớp đạt 80% bề mặt giá thể), ngƣời ta xử lý chúng với trypsin hoặc trypsin - EDTA để tách rời các tế bào. Một phần trong số tế bào đó đƣợc dùng để nhân số lƣợng tế bào lên trong lần nuôi cấy tiếp theo đƣợc gọi là nuôi cấy chuyền hay nuôi cấy thứ cấp. 2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue Theo Nigel Jenkins 1999, trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào trƣớc khi đếm. Chất nhuộm này thâm nhập vào màng của những tế bào không còn khả năng tồn tại hoặc phát triển, những tế bào này bắt màu xanh. Vì vậy có thể phân biệt đƣợc chúng với những tế bào còn sống (không bắt màu với chất nhuộm này). Dung dịch trypan blue có nồng độ 2%, đƣợc pha trong PBS (phosphate – buffered saline). Dung dịch trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào với tỉ lệ 1:1, thời gian 2 phút ở nhiệt độ phòng. 2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi Năm 1992, Xu và ctv đã thành công trong việc tạo phôi bò in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa phôi bò và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của bò 12 (bovine oviductal epithelial cells, BOEC). BOEC này đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp nuôi cấy tế bào từ mảnh mô, những mảnh BOEC đƣợc tách bằng cách dùng 2 kẹp vuốt mạnh ống dẫn trứng. Sau một đêm nuôi cấy BOEC trong môi trƣờng nuôi cấy, hình ảnh những mảnh BOEC trông giống nhƣ cấu trúc hình sâu (worm-like). Bởi vì trong mảnh BOEC có một số tế bào chết và tế bào sống đƣợc thấy rất rõ khi quan sát dƣới kính hiển vi, thêm vào đó là sự xuất hiện và chuyển động của những lông rung của BOEC. Đến ngày nuôi cấy thứ ba một số BOEC có khả năng hình thành lớp đơn (monolayer) trông giống nhƣ cấu trúc bóng nƣớc (vesicle-like). Sự tồn tại của BOEC đƣợc xác định qua sự chuyển động của lông rung, lông rung này vẫn đƣợc thấy đến ngày nuôi cấy thứ 10. Một số tế bào bắt đầu bám vào đáy đĩa vào ngày thứ tƣ hoặc thứ năm. Nhƣng chúng không hình thành lớp đơn phân tử (tạo vesicle-like), thậm chí đến ngày thứ 10. Những tế bào và những “bóng nƣớc” (vesicle-like) tồn tại đến 7 tuần nuôi cấy. 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó Năm 2002, Luisa Bogliolo và ctv đã thành công trong việc làm tăng tỉ lệ chín của trứng chó in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa trứng và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của chó. Những tế bào biểu mô này đƣợc tách bằng cách dùng dao cạo trên bề mặt trong của ống dẫn trứng và chúng đƣợc tạo huyễn dịch trong môi trƣờng nuôi cấy chín trứng với nồng độ xấp xỉ 104 tế bào/ml. Sau 48 giờ đồng nuôi cấy, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII mà không đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô là 4%. Khi đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô của đoạn loa và đoạn bóng của ống dẫn trứng, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII tƣơng ứng là 15,6% và 16,7%. 2.9. Tinh trùng 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Theo Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy (2001), quá trình này có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo tế bào mầm (giao tử), biệt hóa chức năng để thụ tinh (phân bào giảm nhiễm) và biệt hóa về cấu trúc để có khả năng di chuyển chủ động. - Sự tạo giao tử: trong giai đoạn đầu của bào thai, các tế bào mầm di chuyển đến tuyến sinh dục đang phát triển. Trong trƣờng hợp sinh tinh, các tế bào này vào 13 trong ống tinh của tinh hoàn. Những tế bào mầm này chƣa trƣởng thành gọi là tinh nguyên bào, sẽ phát triển bằng cách phân bào nguyên nhiễm. Tinh nguyên bào nằm dọc bờ ngoài của ống tinh, gần với các tế bào đệm (tế bào Sertoli). Các tế bào Sertoli tồn tại trong suốt cuộc đời tính dục và số lƣợng của chúng là nhân tố hạn chế việc sản sinh tinh trùng. Trƣớc tuổi thành thục tính dục, các tinh nguyên bào không hoạt động. Từ tuổi thành thục sinh dục trở đi, tinh nguyên bào phân chia liên tục bằng quá trình phân bào nguyên nhiễm tạo nên nhiều tế bào và cung cấp liên tục các tế bào mới (tinh trùng). - Sự biệt hóa về chức năng: một vài tế bào dừng phân chia và biệt hóa thành tế bào tinh trùng nguyên thủy. Mỗi tế bào tinh trùng nguyên thủy trải qua quá trình phân bào giảm nhiễm. Phân chia giảm nhiễm đầu tiên tạo ra 2 tế bào tinh trùng thứ cấp, khi quá trình phân chia giảm nhiễm thứ 2 hoàn thành tạo nên 4 tiền tinh trùng đơn bội. Sự sinh tinh nhạy cảm với điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là sự thay đổi về nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp là khoảng 2 độ dƣới nhiệt độ cơ thể. - Sự biệt hóa về cấu trúc: các tiền tinh trùng biệt hóa thành tinh trùng trƣởng thành. Quá trình biệt hóa này gọi là hiện tƣợng sinh tinh. Các tiền tinh trùng dài ra phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. Độ dài thời gian của quá trình sinh tinh trùng là ổn định cho mỗi loài. 2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), nhƣ những tế bào khác, tinh trùng cũng đƣợc bao bọc bởi màng tế bào và cũng có các cấu trúc bên trong (nhân, ty thể…). Cấu tạo gồm 3 phần (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phần đầu chứa vật chất di truyền, phần cổ và đuôi có liên quan đến chức năng vận động. Đầu mang acrosome nổi rõ và đƣợc nối chặt với phần cổ, do đó hiện tƣợng mất đầu trên tinh trùng chó xảy ra với tần số thấp hơn so với ngựa và các loài nhai lại. Tinh trùng chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm. 14 - Đầu tinh trùng: dài khoảng 5,6 µm, có 2 phần gồm nhân và thể chóp acrosome. Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc biệt là những phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp song song và gắn rất chặt chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Nhân chiếm 65% thể tích của đầu tinh trùng. Số nhiễm sắc thể trong tinh trùng là đơn bội, không có RNA. Phần trƣớc đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh. - Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn, dài 1 µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy phía sau của nhân. Tế bào chất ở cổ có chứa 2 trung tử: trung tử gần nằm sát nhân, trung tử xa nằm xa nhân hơn và từ đó bắt nguồn của 9 cặp sợi trục kéo dài đến tận đuôi tinh trùng. - Đuôi tinh trùng: dài khoảng 49,26 - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. Đoạn giữa nằm từ cổ đến vòng nhẫn Jensen, có tiết diện lớn hơn đoạn chính và chót đuôi. Lõi của đoạn giữa và toàn bộ chiều dài của đuôi là một tập hợp bó trục. Tập hợp này gồm 9 cặp vi ống ngoài xếp đồng tâm xung quanh 2 vi ống đơn ở trung tâm và chúng đƣợc bao quanh bằng 9 sợi chắc, dày. Bó trục và những sợi ƣa áp suất của đoạn giữa đƣợc phủ bên ngoài bằng những ty thể. Bọc ty thể chứa các enzyme oxy hóa và oxyphosphoryl hóa. Trong đoạn giữa cũng có nhiều chất dự trữ năng lƣợng: phospholipid, lecithin, plasmalogen… Vì vậy, ty thể đƣợc xem nhƣ nguồn phát sinh năng lƣợng cần thiết cho hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính là đoạn dài nhất của đuôi tinh trùng, bắt đầu từ vòng nhẫn Jensen kéo dài đến chỗ tiếp giáp với chót đuôi. Khác với đoạn giữa, đoạn này không có bọc ty thể. Một vỏ bọc gồm những sợi chắc phủ bên ngoài đoạn chính và đoạn giữa có vai trò duy trì khả năng ổn định cho các yếu tố co rút của đuôi. Chót đuôi là phần tận cùng, ngắn nhất của đuôi. Nó chỉ gồm những sợi của bó trục trung tâm và đƣợc bao bọc bằng màng tế bào. 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn. 15 Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động về phía trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện. Tinh trùng sống thì luôn luôn chuyển động. Đuôi ngoằn ngoèo uốn khúc chuyển động gây một xung động để tự tiến tới trƣớc. Ngoài ra, tinh trùng có đầu giống hình quả lê nên tự nó chuyển động xung quanh trục của thân nó. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu hƣớng lội ngƣợc dòng nƣớc, ngƣợc với trọng lực của giọt tinh dịch. Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định. 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái Sự vận chuyển của tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái đƣợc ghi nhận gồm 3 giai đoạn (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997): vận chuyển nhanh, thành lập các ổ chứa và phóng thích chậm, kéo dài. Ngay sau khi đƣợc phóng thích, tinh trùng di chuyển nhanh chóng nhờ vào khả năng hoạt động của chúng cũng nhƣ nhờ có hoạt động co rút tăng lên của lớp cơ tử cung và màng treo ống dẫn trứng. Thời gian của giai đoạn vận chuyển nhanh này kéo dài khoảng 2 – 10 phút. Khi di chuyển, tinh trùng đƣợc tách khỏi tinh thanh và hoà vào dịch tiết của đƣờng sinh dục cái. Phần lớn tinh trùng đƣợc giữ lại trong những nếp màng nhầy phức tạp của các hốc trong cổ tử cung, thiết lập những ổ chứa tinh trùng. Ở loài chó, ổ chứa tinh trùng khu trú trong các tuyến nội mạc tử cung. Sau khi đã thiết lập đủ các ổ chứa tinh trùng trong đƣờng sinh dục, tinh trùng đƣợc phóng thích liên tiếp trong thời gian dài. Sự phóng thích chậm rãi này đảm bảo cho tinh trùng có khả năng liên tục tiến vào ống dẫn trứng để thụ tinh trứng. Tốc độ và kiểu hoạt động của tinh trùng đƣợc thay đổi khi tinh trùng 16 vận chuyển qua các bộ phận khác nhau của đƣờng sinh dục cái. Sự tăng hoạt hóa của hoạt động tinh trùng xảy ra chủ yếu trong ống dẫn trứng vào lúc sắp rụng trứng, đƣợc kích thích nhờ dịch của đoạn eo và đoạn bóng của ống dẫn trứng. Trong tử cung và dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với trong tinh dịch nguyên. Trong quá trình vận chuyển, một số tinh trùng bị thực bào và bị thất thoát vào trong xoang bụng. Trong thời gian lƣu trú lại nhiều giờ trong đƣờng sinh dục cái, màng tinh trùng trải qua những thay đổi quan trọng nhƣ: những protein cố định trên bề mặt màng sinh chất bằng những mối nối không đồng hóa trị đều đƣợc nới lỏng (theo Villaroya và Scholler, 1987); một số protein cấu trúc (hoặc protein từ dịch hoàn phụ và đƣợc gắn vào màng) bị giảm khối lƣợng phân tử (Esbenshade và Clegg, 1980); các protein có thể di chuyển và phân bố lại một cách cục bộ, hình thành nên những diện tích nhỏ thiếu vắng các protein, là giai đoạn cần thiết cho sự phối hợp áp vào nhau của màng sinh chất và màng ngoài acrosome; cuối cùng là sự thất thoát cholesterol của màng sinh chất và màng ngoài acrosome. Sự phân bố lại các protein của màng sinh chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid này có khả năng làm rách acrosome. 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng - Vai trò của nƣớc cất: trong môi trƣờng pha loãng tinh dịch, các chỉ tiêu của nƣớc cất nhƣ khả năng tích ion, tổng vật chất khô, tổng lƣợng vi khuẩn… sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), tinh dịch heo đƣợc pha loãng trong môi trƣờng bảo quản với nƣớc cất khử ion, thẩm thấu ngƣợc và tiệt trùng bằng tia cực tím, đã cho kết quả bảo tồn trên 5 ngày; ngoài ra, hoạt lực và sức sống tinh trùng tốt hơn so với dùng nƣớc cất thƣờng và nƣớc cất khử ion. - Chất điện giải và không điện giải trong môi trƣờng: theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), chất không điện giải (nhƣ các loại đƣờng) có tác dụng làm giảm độ dẫn điện của môi trƣờng, “bảo vệ” cho tinh trùng tránh đƣợc hiện tƣợng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng. Nhờ đó, ngăn ngừa đƣợc hiện tƣợng tụ dính của tinh trùng, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống thuận lợi hơn. Ngoài ra, chất không điện giải còn giữ vai trò chất khử, ngăn ngừa đƣợc sự oxy hóa của oxygen. Khi pha loãng 17 bằng những dung dịch đƣờng thì hạn chế sự sinh sản của các vi khuẩn gây mủ và tăng độ nhớt của môi trƣờng. Chất điện giải là các cation hóa trị 2 (Ca, Mg, St, Ba) làm cho tinh trùng tụ dính lại và cation hóa trị 3, 4 ( Al, Fe, Ta) làm cho tinh dịch đông lại, tinh trùng chết nhanh chóng. Ngƣợc lại, các anion có mối tƣơng quan thuận: anion hóa trị 2 tác động lên tinh trùng tốt hơn so với anion hoá trị 1, còn anion hoá trị 3 lại càng tốt hơn. - Tác động của pH (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): tinh dịch chó có pH hơi toan tính biến động từ 6,5 – 6,8. Ở pH này, sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế nên thời gian sống lâu hơn. Nếu môi trƣờng hơi kiềm pH từ 7,0 – 7,5 (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng nên thời gian sống ít hơn. Để môi trƣờng có khả năng duy trì m