Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự ra hoa in vitro

Chương 1 Mở đầu Ra hoa là bước chuyển hoá quan trọng trong đời sống thực vật. Quá trình này bao gồm sự cảm ứng, sự phát triển hoa và các cơ quan của chúng. Những quá trình này đã được nghiên cứu và thực hiện trên nhiều loại thực vật trong ống nghiệm. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã cung cấp một hệ thống nuôi cấy thuận tiện cho việc nghiên cứu về sinh lý và sinh học phân tử của ngành thực vật học bao gồm sự ra hoa. Năm 1943 đã đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong lịch sử ngành thực vật học khi White nuôi cấy thành công rễ cây cà chua trong ống nghiệm. Thành công này đã mở ra cho ngành thực vật học một con đường rộng lớn và mới mẻ với biết bao điều lý thú đã được khám phá, tìm tòi và nghiên cứu. Nói cách khác, giờ đây các nhà khoa học đã có thêm một công cụ hỗ trợ đắt lực trong nghiên cứu và có cái nhìn rõ hơn về thới giới thực vật. Trong các nghiên cứu về thực vật thì nghiên cứu về sinh lý được xem là rất quan trọng với mục đích trả lời những câu hỏi tại sao, khi nào và như thế nào? Việc nghiên cứu điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm cũng là một phần của mục đích trả lời các câu hỏi trên. Với ưu điểm của việc nghiên cứu sự ra hoa in vitro là có thể nuôi cấy được các cơ quan riêng biệt của thực vật và sử dụng các mô đó đặt dưới điều kiện tác động của các yếu tố kích thích ra hoa. Nếu con người hiểu rõ cơ chế này và có thể điều khiển thực vật ra hoa trong ống nghiệm dễ dàng thì đây sẽ là một công cụ rất hữu ích trong việc nghiên cứu sinh lý thực vật, rút ngắn giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng ở các thực vật có giai đoạn sinh trưởng dài, làm cây ra hoa sớm, và một đóng góp to lớn cho nông nghiệp đó là xây dựng một hệ thống có ý nghĩa trong vi nhân giống, cải thiện giống cây trồng, phục hồi các tính trạng quý, tạo cây có năng suất cao, chất lượng tốt,… Hơn nữa, việc thưởng thức hoa là một phần không thể thiếu trong cuộc sống hiện đại của xã hội ngày nay. Chính vì vậy, việc thương mại hóa hoa trong ống nghiệm rất có tiềm năng phát triển trong tương lai do hoa trong ống nghiệm có nhiều ưu điểm vượt trội như nhỏ gọn, không tốn diện tích, không tốn công chăm sóc,…rất thích hợp để trang trí trong những văn phòng làm việc hiện đại cũng như làm quà tặng. Chương 2 Đối tượng nghiên cứu 2.1. Giới thiệu về cây Dừa cạn Nguồn gốc phân loại Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Magnoliophyta Ngành phụ : Spermatophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae Tên khoa học : Catharanthus roseus Tên tiếng Việt : Dừa cạn Dừa cạn có khả năng chịu hạn và đất nghèo dinh dưỡng, là loài hoa có xuất xứ từ Madagascar và phổ biến ở miền Nam Carolina (Taiz và Zeiger, 1998). Hình 1: Một số loại hoa dừa cạn 2.1.1. Đặc điểm hình thái và sinh học Dừa cạn là cây hàng năm, cây cao khoảng 40 – 80 cm tuỳ theo loài, có nhựa trắng, phân nhánh từ các nách lá thật. Lá đơn, mọc đối, bóng loáng, hình bầu dục, mép nguyên không có răng cưa. Hoa mọc thành cặp ở nách lá, hoa gồm 5 cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần trên của ống vành, tâm bì rời ở noãn sào. Cây được trồng từ hạt, giâm cành hoặc từ cây con in vitro. Dừa cạn thích hợp trồng ở đất tơi xốp, thông thoáng, pH đất thích hợp là từ 5,4 đến 5,8. Dừa cạn trồng từ cây con in vitro 1 tháng tuổi sẽ ra hoa sau 3 tháng và hầu như có thể trổ hoa quanh năm, chúng không cần bấm đọt để duy trì sự ra hoa. Dừa cạn là một trong những loại cây hàng năm ít bị sâu bệnh nhất, tuy nhiên vẫn có một số bệnh hại xảy ra như: bệnh tàn lụi, đốm lá...(Phạm Hoàng Hộ, 2000) 2.1.2. Một số loại Dừa cạn - Cooler Series: có khả năng chịu được điều kiện ẩm ướt. màu sắc sặc sỡ. - Heat Wave Series: loại này trổ hoa sớm. - Mediterranean Series: cao chỉ 12 cm nhưng có độ trải rộng lớn, thích hợp để trồng trong các giỏ, bậu cửa sổ, hoa có màu trắng, hồng, tím. - Pacifica Series: các cánh hoa chồng lên nhau, nở sớm, màu trắng, hồng, đỏ, tím. - Tropicana Series: hoa to, nở sớm. Trong đó có một số giống phổ biến: + Apricot Delight: hoa màu hồng nhạt và “mắt” màu đỏ tươi. + Blue Pear: hoa màu xanh nhạt hơi đỏ với “mắt” trắng. + Passion: hoa màu tím đậm với “mắt” màu vàng. (Nguồn: 2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự ra hoa trong tự nhiên Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi đặc trưng phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vòng đời. Ở thực vật có hoa, sự ra hoa là bước chuyển quan trọng đánh dấu bước phát triển mới của thực vật và có ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật. Hoa được thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; tượng hoa; tăng trưởng và nở hoa. - Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh tiền hoa. Các biểu hiện đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa không thấy được bằng mắt thường, chỉ biết được bởi các phân tích tế bào học hay sinh hóa học, với sự tăng mạnh hoạt tính biến dưỡng (tổng hợp RNA, ribosom, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh. Sự chuyển tiếp ra hoa xảy ra đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh dưỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do hoạt động mạnh của vùng dưới ngọn của mô phân sinh tiền hoa. - Sự tượng hoa: Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày để dẫn tới sự tượng hoa, tức sự sinh cơ quan hoa (quan sát được dưới kính hiển vi). Sự phát triển của các sơ khởi hoa nói chung xảy ra nhanh chóng, làm chồi phồng lên thành nụ hoa (dễ thấy dưới kính lúp, qua lát cắt dọc). - Sự tăng trưởng và nở hoa: Khi sự tượng hoa hoàn thành, nụ hoa có thể tiếp tục tăng trưởng và nở (trường hợp các cây nhất niên). Tuy nhiên nụ hoa có thể vào trạng thái ngủ (ví dụ: nụ hoa Lilas được tạo vào cuối mùa hè, nhưng hoa chỉ nở vào mùa xuân nhờ nhiệt độ lạnh mùa đông gỡ trạng thái ngủ). 2.2.1 Độ tuổi cây Tùy theo các loài thực vật khác nhau mà có chu kỳ phát triển khác nhau. Để một chồi dinh dưỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trưởng thành ra hoa. Trạng thái này có thể rất sớm ở Arachis (phát thể hoa thành lập ở nách tử điệp), khoảng 13 lóng ở cà chua, 5-7 năm ở các cây ăn trái, và khoảng 50 năm ở cây sồi. 2.2.2. Môi trường 2.2.2.1. Dinh dưỡng Mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triển của thực vật có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dưỡng không nhiều nhưng phải cân đối. Lượng dinh dưỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép: - Giới hạn trên là giới hạn mà ở đó sự phát triển dinh dưỡng chiếm ưu thế. - Giới hạn dưới là giới hạn mà dưới đó, dinh dưỡng không đủ cho sự ra hoa. Thông thường, sự dinh dưỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh dưỡng và ngược lại, sự dinh dưỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa. Do đó, việc lựa chọn tỉ lệ C/N cao thích hợp sẽ kích thích sự ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dưỡng cao, nếu tỉ lệ này quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trưởng của thực vật. Tóm lại, có nhiều yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh giữa phát triển dinh dưỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dưỡng nhẹ (trên mức tối thiểu), và cân bằng C/N. 2.2.2.2. Nhiệt độ Nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng đến sự ra hoa, trong đó có nhiệt độ thực tại và tổng tích ôn. - Nhiệt độ thực tại: mỗi thực vật thường có một nhiệt độ thích hợp để ra hoa. - Tổng tích ôn: một số thực vật không phụ thuộc vào nhiệt độ thực tại mà phụ thuộc vào tổng nhiệt độ tích luỹ được trong suốt giai đoạn sinh trưởng. Khi đạt được một tổng nhiệt độ thích hợp thì trổ hoa. 2.2.2.3. Quang kỳ Quang kỳ là sự xen kẽ giữa sáng và tối trong giai đoạn 24 giờ (trong thực nghiệm, giai đoạn này có thể dài hoặc ngắn hơn), và quang kỳ tính (quang chu kỳ) là phản ứng của thực vật đối với quang kỳ tức là đối với sự biến thiên theo mùa của độ dài ngày. Độ dài ngày là một yếu tố quan trọng để điều khiển thời gian ra hoa. Đã có nhiều thí nghiệm chứng minh rằng độ dài ngày có ảnh hưởng sâu sắc đối với sự ra hoa của thực vật. Thí nghiệm của Tournois (1912, Pháp) lần đầu tiên chứng minh cây gai dầu có khả năng ra hoa trong nhà kính, nếu giai đoạn chiếu sáng được rút ngắn. Năm 1913, Klebs trên ví dụ của cây cỏ trường sinh (Sempervivum) đã chỉ ra rằng có thể làm cây ra hoa vào mùa đông bằng cách chiếu ánh sáng bổ sung. Garner và Allard (1920, Mỹ) thực hiện một hệ thống các thí nghiệm trên loại thuốc lá ra hoa vào mùa thu: Maryland mammoth. Bằng cách thay đổi nhiệt độ và quang kỳ (thay đổi chiều dài ngày và đêm), họ kết luận, ở thứ thuốc lá này, không phải nhiệt độ mà chính là quang kỳ ảnh hưởng tới sự ra hoa: cây chỉ ra hoa nếu chiều dài ngày dưới 13-14 giờ. Đây là cây ngày ngắn, giống như cây gai dầu. Như vậy, khi đạt tới tuổi trưởng thành, nhiều thực vật phải chờ một dấu hiệu nào đó để tượng hoa, mà quan trọng nhất là quang kỳ. Dựa theo những quan sát và phân tích cách đáp ứng của thực vật đối với quang kỳ, người ta phân biệt cây theo quang kỳ như sau: - Cây bất định: có thể ra hoa bất chấp quang kỳ, miễn là giai đoạn sáng cho phép quang hợp đủ. Đặc trưng cho các loại thực vật thuộc nhóm này là: cà chua, đậu Hà lan, phần lớn các thứ thuốc lá, bắp, Lilas, anh đào,… - Cây ngày ngắn: chỉ có thể ra hoa nếu giai đoạn sáng ngắn hơn một giai đoạn sáng tới hạn và giai đoạn tối dài hơn giai đoạn tối tối thiểu; giai đoạn tối không được gián đoạn (sự chiếu sáng trong giai đoạn tối, dù chỉ vài phút, sẽ cản sự ra hoa). Các cây tiêu biểu cho nhóm này là: gai dầu, đậu nành, tía tô, thược dược,… - Cây ngày dài: chỉ có thể ra hoa nếu giai đoạn sáng dài hơn giai đoạn sáng tới hạn. Trong nhóm này có: hành, cà rốt, cải đường, xà lách, thuốc phiện, lúa mạch… Ngoài các nhóm cây nêu trên, còn một số cây không lệ thuộc quá chặt chẽ vào quang kỳ. Trong quang kỳ thích hợp, chúng ra hoa nhanh chóng hoặc trong quang kỳ không thích hợp, chúng vẫn ra hoa nhưng chậm hơn. Đó là các cây thích ngày ngắn (vài thứ cúc, Cosmos, Euphorbia), hay các cây thích ngày dài (lúa mì, lúa mạch đen mùa xuân). Hiếm hơn, một vài loài có thể ra hoa trong đêm tối liên tục như huệ dạ hương từ giò, khoai tây từ chồi trên củ. Một số cây có đồng thời hai giá trị tới hạn: một trên và một dưới. Đây là các cây ngày dài- ngày ngắn hay cây ngày ngắn- ngày dài. Các yếu tố môi trường có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp trên sự ra hoa: quang kỳ được nhận bởi lá trưởng thành, nhiệt độ bởi cả thực vật, nước bởi hệ thống rễ,…Các yếu tố này tương tác mạnh trong sự ra hoa, và mỗi yếu tố có thể làm thay đổi giá trị ngưỡng của những yếu tố khác. Sự điều hòa chuyển tiếp ra hoa bằng tín hiệu môi trường có ảnh hưởng quan trọng đảm bảo cho sự ra hoa đồng loạt và giao phối cùng loài của hầu hết các loài thực vật, hoàn tất sự sinh sản hữu tính dưới các điều kiện bên ngoài thích hợp. Cho đến nay cơ chế của sự ra hoa trên thực tế vẫn chưa được hiểu rõ và vẫn còn gây nhiều thắc mắc tranh cãi đối với những người làm nghiên cứu khoa học. Tuy nhiên, những thí nghiệm trên đây đã phần nào hé mở và đưa ra những hướng đi mới để chúng ta có thể đi sâu nghiên cứu một cách rõ ràng hơn nữa cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng trên sự ra hoa ở thực vật. 2.2.2.4. Hiện tượng xuân hóa (hay sự thọ hàn) Hiện tượng xuân hóa ở thực vật là hiện tượng cảm ứng thực vật nẩy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý nhiệt độ lạnh (cây chỉ ra hoa sau khi trải qua một giai đoạn nhiệt độ lạnh nhất định) đặc biệt là thực vật ôn đới. Dựa vào yêu cầu của sự thọ hàn có thể phân thực vật ra làm 3 loại: - Cây cần thọ hàn tuyệt đối (thường có dạng hoa hồng): phải trải qua một thời gian nhiệt độ lạnh mới ra hoa thường là cây hai năm ( cải đường, cà rốt,…), cây nhiều năm (Lolium, Dactylis glomerata,…),… - Cây cần thọ hàn không bắt buộc (ra hoa sớm hơn nếu được thọ hàn): lúa mạch đen Petkus ra hoa khi có 7 lá nếu hạt được thọ hàn, nhưng cần 16-25 lá nếu không được thọ hàn. - Cây không cần thọ hàn: cây một năm không qua mùa đông, cây đa niên tượng hoa trước mùa đông. Cơ quan để cây tiếp nhận kích thích của nhiệt độ thấp là phôi hay chồi. Nhiệt độ thấp là yếu tố khởi động hoạt tính phân sinh của phôi hay chồi và làm cho tất cả các chồi xuất phát từ đó cũng được xuân hóa. Việc hiểu biết ảnh hưởng của nhiệt độ thấp hay hiện tượng xuân hóa đến sự phát triển của cây có ý nghĩa trong sản xuất. Bằng biện pháp xử lý nhiệt độ thấp thích hợp, người ta có thể biến lúa mì đông thành lúa mì xuân, biến cây hai năm thành cây một năm. Hơn nữa, với hầu hết các loại cây trồng, việc xử lý nhiệt độ thấp hoặc bảo quản nhiệt độ thấp cho hạt giống, củ hoặc căn hành sẽ làm tăng khả năng rút ngắn thời gian sinh trưởng, xúc tiến sự ra hoa nhanh và làm tăng năng suất, phẩm chất thu hoạch. 2.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự ra hoa in vitro 2.3.1 Độ tuổi cây Trong điều kiện in vitro, cây có thể ở trạng thái phát triển sinh dưỡng mãi mãi mà không cần hoàn thành vòng đời như trong điều kiện in vivo. Tuy nhiên, đối với giai đoạn ra hoa, cả cây in vitro lẫn cây in vivo đều phải hội đủ các yếu tố cần thiết mới hình thành hoa hay nói cách khác thực vật phải trải qua giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, đạt đến một giai đoạn trưởng thành nhất định thì mới ra hoa. Thực vật còn non không ra hoa vì chúng chưa có khả năng ra hoa hoặc đỉnh sinh trưởng không đáp ứng với nhân tố tạo hoa. Ở đây, độ tuổi của mẫu cấy ban đầu có thể có hoặc không ảnh hưởng như là một yếu tố cần thiết cho sự ra hoa của cây in vitro. Cho đến nay vẫn chưa có báo cáo rõ ràng nào về sự ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đối với sự ra hoa của cây trong điều kiện in vitro. 2.3.2 Dinh dưỡng 2.3.2.1 Nồng độ đường Đường cần thiết cung cấp nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự ra hoa và phát triển hoa. Các loại đường sucrose, glucose, maltose, lactose và raffinose đã được sử dụng thành công trong đó sucrose là loại đường thường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro nhất. Nồng độ đường tối ưu cho sự ra hoa khác nhau giữa các loài. Ngoài ra, hiệu quả của việc sử dụng đường cũng chịu ảnh hưởng của ánh sáng và sự xuân hóa trong tác động riêng biệt của chúng. 2.3.2.2 Hàm lượng photpho và nitơ Như chúng ta đã biết, nitơ là thành phần cơ bản của chất nguyên sinh trong tế bào, quyết định sự sinh trưởng của cây. Ngoài ra, nitơ còn là thành phần cấu tạo của enzyme và diệp lục tố. Sự dinh dưỡng giàu nitơ giúp cây phát triển sinh dưỡng mạnh, cây cao lớn, lá xanh tốt; thiếu nitơ, lá nhỏ, vàng úa, cây cằn cỗi, phát triển chậm và ra hoa sớm. Trong nuôi cấy mô, nitơ được cung cấp thống qua các các muối nitrat (NO3- )và muối amon (NH4+). Ngoài nitơ, phospho cũng là yếu tố không thể thiếu cho cây, có vai trò quan trọng trong tổng hợp nucleoprotein của nhân tế bào, vận chuyển năng lượng, tham gia vào cấu trúc màng, thúc đẩy sự phát triển rễ và làm cây phát dục nhanh. Do vậy, trong nghiên cứu ra hoa in vitro, môi trường thường được sử dụng là môi trường ½ MS hoặc kết hợp giảm lượng nitơ và tăng lượng phospho. Điều này đã đem lại những kết quả đáng kể trong các nghiên cứu ra hoa in vitro. 2.3.3 Các chất điều hòa sinh trưởng 2.3.3.1 Cytokinin Cytokinin là một trong các chất điều hòa sinh trưởng bắt buộc được sử dụng trong điều khiển ra hoa in vitro do có vai trò kích thích sự phân chia tế bào và hình thành cơ quan, tạo chồi và tăng trưởng nụ nách thông qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trưởng. Ngoài ra, cytokinin còn thúc đẩy một số thực vật bậc cao chuyển sang giai đoạn sinh sản trong điều kiện in vitro. 2.3.3.2 Auxin Anton và cộng sự (1991) nghiên cứu sự tạo hoa của cây Nicotiana tabacum cv Samsun bằng cách áp dụng những loại hormone khác nhau trong những thời gian khác nhau cho thấy rằng auxin tuy không có vai trò trong sự tượng hoa nhưng nó quan trọng trong sự biệt hoá của chồi hoa sau đó. 2.3.3.3 Gibberellins Trong điều kiện in vitro, gibberellins thường được sử dụng trong các nghiên cứu điều khiển ra hoa trong ống nghiệm. Có nhiều báo cáo chứng minh rằng GA3 có tác dụng tăng cường sự nở hoa của mẫu cấy trên nhiều loài khác nhau, theo Lang (1965) cho rằng gibberellins có tác dụng đối với sự phát triển của hoa hơn là cảm ứng tạo hoa. 2.3.4 Các yếu tố khác Ngoài các chất cơ bản có trong môi trường nuôi cấy như: các chất vô cơ và hữu cơ, chất điều hoà sinh trưởng thì còn có một số chất khác cũng đóng vai trò là tác nhân kích thích hoặc ức chế sự ra hoa trong ống nghiệm. Các chất kích thích sự ra hoa in vitro thường là các hợp chất phenol như p-coumaric acid và coumarin, nước dừa, dịch chiết từ cây L. annua đang nở hoa hoặc chưa nở hoa, orotic acid, thymine, adenine, abscisic acid,... - pH và trạng thái vật lý của môi trường: pH môi trường ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Đối với điều khiển ra hoa in vitro, pH thích hợp cho sự ra hoa thường ở mức thấp hơn so với pH của môi trường thông thường (5,2- 5,8). - Quang kỳ: Ở điều kiện tự nhiên, quang kỳ đóng vai trò rất quan trọng cho sự ra hoa và qua nhiều nghiên cứu quang kỳ cũng cần thiết cho sự ra hoa in vitro đặc biệt là ở các loài nhạy cảm với chiều dài ngày. Các xử lý quang kỳ nhìn chung thường ứng dụng cho các mẫu cấy còn non, qua các thí nghiệm cho thấy rằng sự cảm nhận kích thích của ánh sáng ở thực vật phụ thuộc vào sự hiện diện của lá, đỉnh sinh trưởng hoặc cả cây hoàn chỉnh. 2.4. Sự phát triển hoa in vitro Sự khởi đầu ra hoa ở cây xảy ra thường theo sau sự cảm ứng của các tín hiệu môi trường. Trong điều kiện in vivo và in vitro, giai đoạn này thường được nhận biết bởi sự tích lũy và lưu giữ tinh bột, sự phân bố lại phức tạp hơn của mạng lưới nội chất trong toàn bộ tế bào chất, sự tăng tổng hợp DNA, tăng cường hoạt động của ty thể, của các enzyme thủy giải, tăng mật độ ribosome, tăng hoạt động của các quá trình nguyên phân và hệ số hô hấp ở đỉnh sinh trưởng hoa (Trần Thanh Vân và Chlyah, 1976). Thông thường các hoa tạo ra trong ống nghiệm có kích thước nhỏ hơn hoặc có hình dạng khác thường so với hoa ngoài tự nhiên. Chẳng hạn ở cây nhân sâm, hoa tạo ra trong điều kiện in vitro có kích thước nhỏ hơn so với hoa trong điều kiện tự nhiên mặc dù hoa vẫn có đầy đủ các cơ quan hoa), ở cây hoa hồng, đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chưa chuẩn hoặc có khi chưa ra được màu giống với hoa trồng trong môi trường thiên nhiên...Ngoài ra, việc điều khiển ra hoa trong ống nghiệm còn một hạn chế đó là tỉ lệ nở hoa không đạt được 100% như mong đợi. 2.5. Một số nghiên cứu ra hoa in vitro 2.5.1 Trên thế giới - Chang và Hsing (1980) tạo phôi từ các mô sẹo rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) và các phôi này ra hoa khi nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l GA3. - G. R. Rout và P. Das (1994) nghiên cứu tạo phôi soma và ra hoa trong ống nghiệm ở 3 loài tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và Dendrocalamus strictus. Đốt thân của cây con tái sinh từ phôi soma được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng ra hoa: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l adenin sulphate; 0,25 mg/l IBA; 0,5 mg/l GA3 và 3% sucrose. Sau 12 tuần nuôi cấy thì cho hoa, môi trường lỏng cảm ứng ra hoa tốt hơn môi trường có agar (60-70% so với 25-30%). - Rajani S. Nadgauda và ctv (1997) báo cáo rằng khi nuôi cấy cây con in vitro của giống tre Babusa arundinacea trong môi trường MS lỏng chứa 2% sucrose, 5% nước dừa và 2,2 µM BA, sau 3 - 6 tháng có 70 % mẫu cấy ra hoa. - Nadgauda et al (2000): Cảm ứng tạo hoa in vitro ở cây Dendrocalamus strictus. Cây được nuôi cấy trong môi trường ½ MS có bổ sung các nồng độ khác nhau của TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; và 1mg/l); 2% sucrose và để trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 ± 20C. Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả mẫu được chuyển sang môi trường ½ MS không chứa TDZ. Kết quả thí nghiệm cho tỷ lệ ra hoa cao nhất sau 2 tuần nuôi cấy trên những mẫu cấy được cấy chuyền từ môi trường ½ MS có chứa 0,5mg/l TDZ sang môi trường ½ MS. - Kachonpadungkitti Yong sak Romchatngoen Supot Hasegewa Koji và Hisajima Shigeru (2001): cảm ứng tạo hoa in vitro từ mẫu chồi cây lúa kiều mạch nuôi cấy in vitro. Trên môi trường ½ MS, với nitrat là nguồn nitro duy nhất, 5% sucrose, 0,1µm kinetin trong điều kiện nuôi cấy 27± 20C ở quang kỳ là 8 giờ chiếu sáng và 16 giờ trong tối, mẫu cấy được cảm ứng tạo hoa trên 100% số lượng với 16 hoa trên mẫu và số hoa nở trên mẫu là 9 sau 8 tuần nuôi cấy. - Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) đã thành công khi callus có được từ thân rễ của Cymbidium ensifolium var. misericors ra hoa in vitro trên môi trường 1/2 MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng độ từ 3,3–10 µM) hay 2iP (nồng độ 10–33 µM) sau 100 ngày nuôi cấy. 2.5.2. Các nghiên cứu trong nước - Nguyễn Hồng Vũ và ctv (2003) lần đầu tiên điều khiển thành công ra hoa trong ống nghiệm ở cây hoa hồng. Đặc biệt, tác giả đã phát hiện 2 yếu tố quan trọng mang tính chất quyết định đối với sự nở hoa của thực vật là cytokinin và đường, trong đó, đường là yếu tố tác động chính lên sự hình thành hoa in vitro, còn cytokinin giúp làm tăng tỉ lệ hình thành hoa và giúp biệt hoá các cấu trúc hoa ở giai đoạn sau khi tượng hoa, làm chất kích thích sự hình thành hoa. Tuy nhiên đề tài vẫn còn một số điểm chưa hoàn thiện lắm: đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chưa chuẩn hoặc có khi chưa ra được màu giống với hoa trồng trong môi trường thiên nhiên...do vậy cần tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện quy trình ra hoa của cây hoa hồng trong ống nghiệm. - Phạm Thị Minh Thu và ctv (2005) đã cho loài hoa Torenia màu tím (Torenia Fournieri) trổ hoa thành công trong ống nghiệm từ mẫu chồi được tái sinh từ lá cây Torenia mọc lên từ hạt. Tiếp theo Nguyễn Ngọc Thi và ctv đã tiếp tục tiến hành thí nghiệm làm thay đổi màu sắc hoa torenia trong ống nghiệm từ màu tím sang trắng bằng cách bổ sung yếu tố vi lượng vào môi trường sống của cây. Hình 2: Hoa Torenia màu tím ra hoa in vitro - Vũ Quốc Luận, Dương Tấn Nhựt (2006) đã điều khiển làm cho những đóa hoa lan đầu tiên nở trong ống nghiệm ở loài lan Dendrobium Mild Yumi. - Nguyễn Thị Mỹ Duyên và ctv (2007) đã tiến hành thí nghiệm nở hoa trong ống nghiệm trên hai giống lan Dendrobium mini và Giả Hạc và đã đạt được thành công đáng kể khi hai loại hoa lan này đã lần lượt ra nụ hoa trong ống nghiệm. Hình 3: Hoa lan Dendrobium mini và Giả Hạc ra nụ hoa in vitro Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1. Vật liệu - Trang thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon... - Dụng cụ: pince, đèn cồn, dao cấy, bình tam giác... - Mẫu cấy + Cây dừa cạn in vitro 1 tháng tuổi cao 2 – 3 cm. - Điều kiện nuôi cấy + Cường độ ánh sáng: 1000 - 2000lux. + Nhiệt độ phòng cấy: 24 + 20C. + Ẩm độ phòng cấy: 55% – 60%. + Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. - Môi trường nuôi cấy + Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) + Chất điều hòa sinh trưởng: Napthalen Acetic Acid (NAA) + 6- Benzyladenine (BA) + Thidiazuron (TDZ; N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea). Sử dụng bình nuôi cấy 500ml, mỗi bình chứa 70 ml môi trường được hấp tiệt trùng bằng Autoclave ở điều kiện 121oC, 1,2 atm trong 25 phút trước khi sử dụng. 3.2. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 1 mẫu. 3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ TDZ và NAA đến sự ra hoa in vitro ở cây dừa cạn Bảng 1: Các nghiệm thức của thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ TDZ và NAA đến sự ra hoa in vitro ở cây dừa cạn Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) 1 (Đ/C) 0 0 2 0,05 0,1 3 0,1 0,1 4 0,5 0,1 5 1,0 0,1 6 1,5 0,1 3.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự ra hoa in vitro ở cây dừa cạn Bảng 2: Các nghiệm thức của thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BAZ và NAA đến sự ra hoa in vitro ở cây dừa cạn Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) 1 (Đ/C) 0 0 2 0,1 0,1 3 0,5 0,1 4 1,0 0,1 5 1,5 0,1 6 2,0 0,1 7 0,1 0,3 8 0,5 0,3 9 1,0 0,3 10 1,5 0,3 11 2,0 0,3 3.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi Theo dõi sự sinh trưởng - Chiều cao cây (cm): đo từ mặt thạch đến đỉnh sinh trưởng. - Số lá (lá/cây): đếm tổng số lá đã thấy rõ cuống lá trên cây. Chiều cao và số lá được ghi nhận sau 30 ngày và 60 ngày. Theo dõi sự ra hoa - Tỉ lệ cây ra nụ (%): là tỉ lệ giữa tổng số cây ra nụ và tổng số mẫu cấy. - Thời gian ra nụ (ngày): tính từ lúc cấy đến khi cây có nụ đầu tiên. - Thời gian hoa nở (ngày): tính từ lúc cấy đến khi nụ nở thành hoa đầu tiên. - Tỉ lệ hoa nở (%): là tỉ lệ giữa tổng số hoa và tổng số nụ. - Số hoa (hoa/cây): là tổng số hoa trên 1 cây. 3.2.4. Xử lý số liệu: Số liệu thu thập được ghi nhận bằng Excel và xử lý bằng chương trình thống kê Statgraphics 7.0 Chương 4 Kết quả nghiên cứu 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ TDZ và NAA đến sự ra hoa in vitro ở cây dừa cạn Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ TDZ và NAA đến sự sinh trưởng ở cây dừa cạn in vitro Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây (cm) Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 0 0 4,89a 7,72a 21,67a 31,67a 2 0,05 0,1 4,50ab 6,89ab 17,78b 24,56b 3 0,1 0,1 4,39ab 6,56b 16,78ab 21,67b 4 0,5 0,1 4,11b 6,33b 13,67cd 18,00c 5 1,0 0,1 3,07bc 4,44c 10,56de 14,56c 6 1,5 0,1 2,89c 4,28c 8,22e 11,00d Ghi chú: Trong cùng một cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Kết quả xử lý số liệu cho thấy chiều cao cây và số lá/cây ở các nghiệm thức so với đối chứng khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Sau 60 ngày nuôi cấy chiều cao cây ở nghiệm thức 2 tương đồng với đối chứng và khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Số lá/cây ở các nghiệm giảm dần và ít hơn so với đối chứng. Như vậy khi giữ nguyên nồng độ NAA(0,1 mg/l), tăng dần nồng độ TDZ thì sự sinh trưởng của cây giảm dần. Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ TDZ và NAA đến sự ra hoa in vitro của cây dừa cạn Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Tỉ lệ cây ra nụ (%) Thời gian ra nụ (ngày) Thời gian hoa nở (ngày) Tỉ lệ hoa nở (%) Số hoa/cây 1 0 0 0a - - - 0a 2 0,05 0,1 100b 58,17 68,00 100 4,25b 3 0,1 0,1 33,33c 59,00 69,17 100 5,67c 4 0,5 0,1 33,33c 62,33 71,67 100 2,33d 5 1,0 0,1 0a - - - 0a 6 1,5 0,1 0a - - - 0a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Kết quả xử lý số liệu cho thấy tỉ lệ cây ra nụ ở các nghiệm thức 1, 5, 6 tương đồng với nhau và khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại về phương diện thống kê. Các nghiệm thức 2, 3 và 4 hình thành nụ và tất cả những nụ này đều nở thành hoa, trong đó nghiệm thức 2 tỉ lệ cây ra nụ cao nhất tiếp theo là nghiệm thức 3 và 4. Cây dừa cạn in vitro hình thành nụ hoa sau 58 ngày nuôi cấy và sau 68 ngày thì hoa nở. Số hoa/cây nhiều nhất ở nghiệm thức 3, đạt 5,67 hoa/cây. Từ kết quả trên có thể nhận thấy rằng, môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 0,05 mg/l TDZ là mội trường thích hợp nhất cho cây dừa cạn ra hoa trong ống nghiệm. Hoa có màu đỏ hồng, “mắt” váng giống như hoa trồng ngoài vườn. Đường kính hoa trung bình khoảng 2 cm, hoa có độ bền từ 2 đến 3 ngày. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự ra hoa in vitro ở cây dừa cạn Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự sinh trưởng ở cây dừa cạn in vitro Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây cm Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 30 ngày 60 ngày 1 (ĐC) 0 0 4,89a 7,72a 25,56a 31.67a 2 0,1 0,1 4,61ab 7,71a 23,78a 27,89a 3 0,5 0,1 4,44ab 6,50bc 14,00bc 21,56cd 4 1,0 0,1 4,17bcd 5,67cde 13,00c 18,56cde 5 1,5 0,1 3,67cde 5,11e 9,11de 13,00f 6 2,0 0,1 2,83f 4,06f 8,89e 11,22f 7 0,1 0,3 4,56ab 6,78b 25,11a 27,22ab 8 0,5 0,3 4,33abc 6,46bc 13,67bc 20,11cd 9 1,0 0,3 4,44bcd 6,22bcd 17,22b 22,78bc 10 1,5 0,3 3,50def 5,39de 14,78bc 17,89de 11 2,0 0,3 3,22ef 4,94e 12,67cd 14,11ef Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy, chiều cao cây và số lá/cây ở nghiệm thức 2 tương đồng với đối chứng, các nghiệm thức 3, 8, 9 tương đồng nhau và khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Như vậy khi bổ sung NAA kết hợp với tăng dần nồng độ BA thì chiều cao cũng như số lá/cây giảm dần, BA ở nồng độ 1,5 mg/l và 2 mg/l ức chế sự sinh trưởng của cây. Bảng 6: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự ra hoa ở cây dừa cạn in vitro Nghiệm thức Tỉ lệ cây ra nụ (%) Thời gian ra nụ (ngày) Thời gian hoa nở (ngày) Tỉ lệ hoa nở (%) Số hoa/cây 1,2,3,4,5,6,8,9,10,11 0a - - - 0a 7 33,33a 61,33 71,33 50 0,33a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Trong 11 nghiệm thức chỉ có nghiệm thức 7 cây hình thành nụ nhưng không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại về mặt thống kê. Qua thí nghiệm có thể thấy, sự kết hợp giữa NAA và BA hầu như không mang lại hiệu quả trong việc ra hoa trong ống nghiệm ở cây dừa cạn. Một số nụ không nở có thể là do các cánh hoa không được thành lập hoàn thiện hoặc được thành lập nhưng không phát triển. Tượng hoa và tăng trưởng hoa là hai giai đoạn tách biệt nhau, các chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường kích thích sự tượng hoa nhưng không làm nụ hoa tăng trưởng. Hình 4: Hoa dừa cạn in vitro Chương 5 Kết luận và kiến nghị 5.1. Kết luận - Môi trường thích hợp nhất để dừa cạn ra hoa trong ống nghiệm là môi trường MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA. Ở nồng độ 0,1 mg/l NAA kết hợp với 0,1 hay 0,5 mg/l TDZ Dừa cạn cũng ra hoa nhưng tỉ lệ thấp hơn. - Cây dừa cạn in vitro hình thành nụ hoa sau 58 ngày nuôi cấy và sau 68 ngày thì hoa nở. Hoa có đường kính 2 cm, độ bền là 2-3 ngày. - Khi tăng nồng độ TDZ hoặc BA kết hợp với NAA thì sự sinh trưởng của cây giảm và ức chế ở nồng độ từ 1-2mg/l. 5.2. Kiến nghị - Nghiên cứu các yếu tố khác như thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng, nhiệt độ trong giai đoạn hình thành nụ để khảo sát sự ảnh hưởng đến quá trình ra hao in vitro. - Nghiên cứu độ tuổi của mẫu cấy ảnh hưởng đến thời gian ra hoa. - Nghiên cứu sử dụng mẫu cấy cắt bỏ ngọn để giảm chiều cao cây đồng thời cây phân nhiều nhánh, từ đó có nhiều hoa hơn. Tài liệu tham khảo Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp. HCM, trang 122 – 168, 298 – 308. Dương Tấn Nhựt, Trần Trọng Tuấn, Trịnh Thanh Vân. 2011. Một số nhân tố ảnh hưởng đến quá trình ra hoa in vitro. Tạp chí Công nghệ Sinh học (3): 265-290. Lê Hồng Thuỷ Tiên. 2006. Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) và Dã yên thảo (Petunia hybrida). Luận văn tốt nghiệp. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Nguyễn Thị Lý Anh, Hồ Thị Thu Thanh, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Tấn Hưng. 2009. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây hoa đào nhật tân (Prunus persica L.). Tạp chí Khoa học và phát triên 2009, tập 7, số 4: 387-393. Phạm Hoàng Hộ. 2000. Cây cỏ Việt Nam. NXB Trẻ Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt. 2006. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nghiên cứu sự phát triển của phát hoa Dendrobium sonia. Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số 9-2006. Ralph Scorza. 1982. In vitro flowering, Horticultural reviews (Ralph Scorza). P. 106-119 Taiz and Zeiger. 1998. Plant Physiolog. Benjamin/Cummings. Inc. P. 721 Wang G.Y.; Yuan M.F.; Hong Y, 2002. In vitrro flowering induction in rose. In vitro Cellular and Development Biology - Plant, Volume 38, Number 5, pp. 513-518(6).