Mức độ tồn lưu của Malachite Green và Leucomalachite trong nguyên liệu cá tra

dụng MG trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản. 2.1.4.2 Thiệt hại về kinh tế 7 Nếu sản phẩm thủy sản xuất khẩu có chứa các lượng tồn dư chất độc hại và bị cấm sử dụng như MG thì toàn bộ lô hàng sẽ bị trả về và có thể bị nước sở tại kiện, dẫn đến những thiệt hại về kinh tế là không nhỏ. 2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản MG được sử dụng như một loại thuốc kháng sinh có hiệu quả trong nghề nuôi trồng thuỷ sản từ năm 1936 (Foster and Woodurg, 1936). Nó được sử dụng để trị bệnh ký sinh trùng ngoài da, nấm, những bệnh do các động vật nguyên sinh gây ra ( bệnh protozoa) trong cá và trứng cá. Cho đến ngày nay, nó vẫn còn là một trong những hoá chất có hiệu quả nhất cho mục đích này và được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới. 2.1.6 Chất thay thế malachite green Để giải quyết tạm thời vấn đề cần phải có những chất khác thay thế MG trong công tác phòng trị bệnh trên các loài thủy sản. BRONOPOL là chất có tác dụng diệt kí sinh trùng trên cá thay thế MG. Đây là chất được EU cho phép sử dụng trị bệnh cho cá từ năm 2001 và không qui định giới hạn về dư lượng. Theo đánh giá của cơ quan bảo vệ Môi Trường Hoa Kì (EFA) thì Bronopol không là chất gây ung thư, có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn. Chất bronopol có công thức hóa học: C3H6BrNO4. Tên hóa học của chất này là 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol. Bronopol được cung cấp ra thị trường với các tên thương mại như: Pyceze, Onyxide 500…. Nhằm mục tiêu phát triển xuất khẩu thủy sản ổn định trong thời gian tới, thiết nghĩ các hộ nuôi thủy sản cần tuân thủ nghiêm các qui định của nhà nước và các cơ quan chuyên môn trong việc sử dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản để đảm bảo uy tín, chất lượng và giữ vững thương hiệu, đồng thời tránh ra các thiệt hại lớn về kinh tế do bị phát hiện có dư lượng cá hóa chất và kháng sinh có hại trong các lô hàng thủy sản xuất khẩu. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005). 2.2 Nguyên liệu cá tra 2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi trồng thủy sản đang được phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (tập trung chủ yếu ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp) là một trong 8 những loài cá có giá trị xuất khẩu cao. Có thân dẹp, da trơn, có râu ngắn, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng. Cá sống chủ yếu ở vùng nước ngọt, có thể sống ở vùng nước lợ (10-14 % độ muối), chịu được nước phèn với pH >5. Chịu được nhiệt độ nóng đến 39 0C, nhưng dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15 0C. Cá trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm. Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kg hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m. Cá nuôi sau một năm đạt 1-1,5 kg (năm đầu), những năm sau cá tăng trọng nhanh hơn có khi đạt 5-6 kg/năm. Tài liệu phân loại gần đấy nhất của tác giả W.Rainboth xếp cá tra nằm trong giống cá tra dầu và được phân loại như sau: Bộ cá nheo Siluriformes. Họ cá tra dầu Pangasiidae. Giống cá tra dầu Pangasianodon. Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus. Mùa sinh sản: từ tháng 2 – 10 Mùa thu hoạch: quanh năm. Kích thước thu hoạch: 30 – 40 cm, lớn nhất 90 cm. Sản phẩm xuất khẩu: dưới dạng nguyên con, philê đông lạnh, các mặt hàng chế biến và hàng giá trị gia tăng. 2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra Trong họ cá tra có một số loài được nuôi trong hồ từ lâu đời, đặc biệt là cá tra (cá tra nuôi). Ngày nay ngành cá nuôi trở thành một công nghiệp nuôi và chế biến mà họ cá tra là trọng điểm. Trên đà nghiên cứu cho ngành cá nuôi có rất nhiều báo cáo về môi trường sống, thức ăn... của họ cá tra trong điều kiện thiên nhiên và trong điều kiện "gia ngư hóa". Hình thức nuôi: Nuôi thâm canh, bán thâm canh với các mô hình nuôi bè, nuôi trong ao hầm. Hình thức khai thác: Lưới, rùng, đăng, vó. 2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green MG là một thuốc sát trùng không đắt, được sử dụng có hiệu quả trong ngành nuôi cá từ những năm 30, chủ yếu trong những nước Châu Á. Việc sử dụng 9 MG được xem là bất hợp pháp, bởi vì có liên quan đến những tác hại lâu dài đối với con người. Do đó, đã có rất nhiều phương pháp kiểm tra dư lượng MG và hợp chất chuyển hóa của nó là LMG trong các sản phẩm cá. Nhưng theo sự quyết định của Hội đồng Châu Âu EC / 657 / 2002, một phương pháp kiểm nghiệm có thể được tiến hành, phải có độ phát hiện tổng hàm lượng MG và LMG trong thịt cá là 2 µg/kg. Theo Julie Kowalski, một nhà hóa học nhiều sáng kiến, đã đưa ra một phương pháp đo sắc ký chung để xác định dư lượng MG và LMG. Đó là phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp, với hệ hấp phụ pha ngược HPLC. Để phân tích MG và LMG bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, với hệ hấp phụ pha ngược HPLC, cột chứa octadecylsilane đặc trưng làm cột bảo vệ, đồng thời cũng đóng vai trò là pha tĩnh. Thành phần pha động là hỗn hợp dung dịch đệm và chất hữu cơ, với một tỷ lệ 50 : 50, acetonitrile là hợp chất hữu cơ sử dụng phổ biến nhất. Dung dịch đệm có pH thích hợp từ 4,0 đến 4,5. Chiều dài cột là 100 mm hoặc dài hơn. Ngày nay, có 3 loại detector được dùng cho kỹ thuật HPLC để xác định MG và LMG là detector đo phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phổ huỳnh quang phân tử và phổ khối lượng MS. MG có cực đại hấp phụ ở 620 nm và LMG ở 265 nm, làm chúng ta khó quan sát cả hai trong một phép đo phổ hấp thu. Điều này có thể được khắc phục bằng cách nối thêm vào sau cột phân tích HPLC một cột chứa chất oxi hóa (như chì oxit) để chuyển LMG về MG. N CH3 N CH3 CH3 H3C N CH3 N CH3 CH3 H3C Cl- Reduction Oxidation - HCl Malachite green (MG) Leucomalachite green (LMG) LMG sau khi chuyển về dạng MG cũng được xác định trên sắc đồ, MG này có thể được phân biệt với MG trước bởi thời gian lưu khác nhau. 10 Detector phát phổ huỳnh quang được gắn vào đường dẫn dung môi rửa giải, để phát hiện ra LMG bởi sự kích thích phát xạ ở 265 nm và sự phát xạ ở 360 nm. Với phép ghi phổ khối lượng cho phép phát hiện cả hai hợp chất mà không sự oxi hóa hoặc sử dụng hai detector. Sau đây, một vài phương pháp xác định dư lượng MG và chất chuyển hóa của nó trong cá của nhiều nhóm tác giả: ∗ Phương pháp xác định dư lượng malachite green và leucomalachite green trong nguyên liệu cá tra bằng sắc kí lỏng ghép với phổ khối lượng (LC- MS/MS). Nhóm tác giả Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA, Burns BG. ∗ Phương pháp xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite green bằng sắc ký lỏng (LC) với sự oxi hóa Leucomalachite green. Nhóm tác giả Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB. ∗ Phương pháp xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite green trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng. Nhóm tác giả Halme K, Lindfors E, Peltonen K. 2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) Một phương pháp phân tích bằng LC-MS khác đã được phát triển trong việc xác định dư lượng MG và LMG trong nhiều cá nước ngọt bởi nhóm tác giả: Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA, Burns BG. MG và hợp chất chuyển hóa của nó được chiết từ những mẫu thịt cá đã được nghiền đồng nhất bằng dung dịch acetonitrile – perchloric acid. Sau khi ly tâm, dịch trong được lấy và đem cô đặc rồi chuyển vào cột chiết chứa pha rắn octadecyl C18. Tiếp theo, ta tiến hành rửa giải bằng cách cho dung dịch acetonitrile qua cột, thu dịch rửa giải đem cô quay đến khô cạn. Phần cặn đã khô cạn được hòa tan với acetonitrile và pha loãng với nước cất để chuẩn bị phân tích LC-MS. MG và hợp chất chuyển hóa của nó sẽ được phân tích bằng LC pha đảo sử dụng cột Luna C18 với dung dịch đệm ammonium hydroxide-formic acid trong gradient acetonitrile. Phép ghi phổ khối lượng phát hiện định phân ở nhiều giai đoạn phản ứng. Các mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 1 ng/g có hiệu suất thu hồi là 81 % đối với LMG và 98 % cho MG. Phương pháp này có giới hạn phát hiện cho cả hai hợp chất trên là 0,1 ng/g. 11 2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC) với sự oxi hóa LMG Một phương pháp sắc ký lỏng (LC) khác đã được tìm ra để xác định dư lượng MG trong cá bởi nhóm tác giả: Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB. Dư lượng MG và LMG được trích từ thịt cá hồi bằng dung dịch đệm acetate và acetonitrile. Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng dichloromethane. LMG sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4- benzoquinone. Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm alumina và propylsulfonic acid. Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC với bước sóng phát hiện ở 618 nm sử dụng cột rửa giải phân tách C18. Phương pháp đã phân tích được 35 mẫu cá hồi nuôi với sự thêm chuẩn ở 1, 2, 4, và 10 ng/g (ppb) thì có được hiệu suất thu hồi trung bình là 95,4 %, độ sai số ± 11,1 %. Với 5 mẫu cá hồi trong hộp với sự thêm chuẩn ở 10 ng/g thì hiệu suất thu hồi trung bình là 88,9 %, độ sai số ± 2,6 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 1 ng/g. 2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng được báo cáo bởi nhóm tác giả: Halme K, Lindfors E, Peltonen K , có giới hạn phát hiện tương ứng là 0,8 và 0,6 µg/kg. Hai hợp chất trên được chiết với một hỗn hợp dung dịch đệm acetate-acetonitrile và được chiết tách lại trong methylene chloric. Sử dụng hệ thống chiết pha rắn tự động gồm những cột chiết chứa pha rắn acid propylsufonic và alumina để làm sạch dịch chiết. Sự phân tách MG và LMG hoàn toàn trên cột Chrompher 5B, sử dụng pha động là dung dịch đệm acetate-acetonitrile. LMG được chuyển về dạng MG bằng phản ứng sau cột trước khi đo phổ ở bước sóng 600 nm. Hiệu suất thu hồi của MG và LMG trong một dãy mẫu kiểm soát có thêm chuẩn từ 2 đến 50 µg/kg tương ứng là 65 % (trong dãy 63,4 – 65,9 %, độ sai số 3,9 – 16,1 %) và 74 % (trong dãy 58,3 – 82,6 %, độ sai số 3,3 – 11,4 %). Việc xác định dư lượng các cặn bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phép ghi phổ khối lượng, phương pháp này có giới hạn phát hiện là 2,5 và 1 µg/kg tương ứng với MG và LMG. 2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh 12 Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản Hàn Quốc- NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau 30 ngày, đối với Lươn sự đào thải của Ciprofloxacine và Ofloxacin là 35 ngày. Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá Chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002). Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh trùng cho thấy (www.vietlinh.com.vn): Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35 ppb Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10 ppb Sau 3 tháng : MG = 0. Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn còn. Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng. Việc tích lũy MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lũy dần trong thịt và tế bào mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lũy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong thịt. Như vậy, nếu tích lũy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng sau khi ăn cá bị nhiễm. 2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc và hoá chất Trước tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản một cách tràn lan, Bộ Thủy Sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 về ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản; Chỉ đạo các cơ quan Báo, Đài tại địa phương tuyên truyền về tác hại của các loại thuốc thú y, hoá chất, kháng sinh trong danh mục hạn chế sử dụng và cấm sử dụng theo quy định của Bộ Thủy sản, đặc biệt là MG ( cập nhật ngày 27/9/2006). Khối EU có những qui định nghiêm ngặt cho phép sử dụng kháng sinh, hoá chất trong nuôi trồng thủy sản, Theo chỉ thị EC số 2377/90 qui định danh mục cấm sử dụng gồm 10 kháng sinh và 01 hoá chất Malachite green, 31chất hạn chế sử dụng (Theo website: NAFIQAVED cập nhật ngày 25/3/2006). 13 Mỹ là Quốc gia có qui định nghiêm ngặt về việc cho phép sử dụng thuốc, hoá chất trong nuôi trồng thủy sản. Danh mục các chất cấm sử dụng là 11 chất ( NAFIQAVED, cập nhật ngày 7/9/2006). Theo qui định của Bộ Thủy sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá Chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm không dưới 10 tháng. (Raoul et al, 2002). 14 Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm Thực hiện trong khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ Thời gian từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009 3.1.2 Nguyên vật liệu Nguyên liệu cá tra 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ Bể thí nghiệm có thể tích 500 L. Các hoá chất, dụng cụ và phương tiện sử dụng trong phòng thí nghiệm Bộ Môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Trang thiết bị Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. Máy li tâm lạnh. Hệ thống máy LC-MS. Máy lắc vortex. Máy cô quay chân không và bình cầu quả lê 100 ml. 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ Mục đích: chọn ra phương pháp có hiệu suất tốt nhất từ đó áp dụng tiến hành cho thí nghiệm xác định sự tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra. Phương pháp gây nhiễm 15 Cá được chọn là sạch bệnh, không nhiễm MG. Tiến hành gây nhiễm bằng cách cho trực tiếp MG và LMG với nồng độ 1 ppm vào mẫu cá sau khi chuẩn bị mẫu xong để phân tích. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố với 2 lần lặp lại. Nhân tố phương pháp kiểm tra dư lượng MG trong nguyên liệu cá tra. M1: Phương pháp 1 M2: phương pháp 2 M3: phương pháp 3 Số nghiệm thức: 3 nghiệm thức. Số mẫu thí nghiệm: 3 nghiệm thức × 3 lần lặp lại = 9 mẫu. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Cá tra Chuẩn bị mẫu Nghiền đồng nhất mẫu M1 M2 M3 Máy phân tích Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Tiến hành thí nghiệm Cá Tra fillet tiến hành xay nhỏ qua cối xay thịt có đường kính lỗ sàng 2-3 mm. Mẫu thử sau khi đã chuẩn bị xong được gây nhiễm hóa chất MG, LMG ở nồng độ biết trước và tiến hành khảo sát 3 phương pháp kiểm ra dư lượng MG, LMG trong cá tra. 16 3.2.1.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) I. Nguyên tắc MG, LMG được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch hydroxylamine.HCl và acetonitrile. Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0.2 µm rồi đem phân tích bằng LC-MS. II. Trang thiết bị 1. Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2. Ống ly tâm nhựa loại 15 ml. 3. Syrings dung tích 2 ml, 1 ml, 0.5 ml, 2 , 1µl. 4. Lọc màng, kích thước lỗ 0.2 µm. 5. Máy lắc Vortex. 6. Hệ thống máy LC-MS. III. Hóa chất, dung dịch 1. Hydroxylamine.HCl 5g/l. 2. Acetonitrile loại tinh khiết phân tích HPLC. 3. Pha động A: Ammonium acetate 0.1M có pH = 4,5. 4. Pha động B: Acetonitrile. 5. Chuẩn MG tinh khiết, loại có giấy chứng nhận hàm lượng. 6. Chuẩn LMG tinh khiết, loại có giấy chứng nhận hàm lượng. 7. Dung dịch chuẩn MG gốc 1000 ppm: Hòa tan 100 mg MG bằng methanol trong bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC). Dung dịch bền 6 tháng. 8. Dung dịch chuẩn trung gian MG 10 ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn MG gốc 1000 ppm với methanol trong bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC). Dung dịch bền 6 tháng. 9. Dung dịch chuẩn trung gian MG 1ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn MG gốc 10 ppm trong bình định mức 10 ml. Định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC). Dung dịch bền 6 tháng. 17 10. Dung dịch chuẩn LMG gốc 1000 ppm: Hòa tan 100 mg LMG bằng methanol trong bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC). Dung dịch bền 12 tháng. 11. Dung dịch chuẩn trung gian LMG 10 ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn LMG gốc 1000 ppm với methanol trong bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC). Dung dịch bền 6 tháng. 12. Dung dịch chuẩn trung gian LMG 1ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn LMG gốc 10 ppm trong bình định mức 10 ml. Định mức đến vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC). Dung dịch bền 6 tháng. 13. Mẫu cá phân tích là các mẫu cá tra fillet sạch bệnh. IV. Quy trình phân tích 1. Chuẫn bị mẫu: Nghiền đồng nhất 50 g mẫu cá. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng, mẫu cá đã được rã đông hoàn toàn. 2. Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm falcon 15 ml. Tiến hành ly trích MG và LMG. 3. Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: Cân 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm falcon 15 ml. Thêm 39 µl dung dịch chuẩn MG 1 ppm và LMG 1 ppm. Tiến hành ly trích MG và LMG. 4. Ly trích MG và LMG - Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml. - Thêm vào ống nghiệm 3 ml dung dịch hydroxylamine.HCl 5 g/l. Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút rồi để yên khoảng 10 phút. - Sau đó thêm tiếp 5 ml acetonitrile, rồi lắc bằng máy với vận tốc trung bình khoảng 15 phút. Tiếp theo đem ly tâm 4000 rpm trong 3 phút. Thu lấy dịch trong, cho vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml khác thật sạch. 18 - Phần cặn còn lại được thêm tiếp 5 ml acetonitrile, rồi lắc đều khoảng 15 phút. Tiếp theo đem ly tâm 4000 rpm trong 3 phút Thu lấy dịch trong cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết ban đầu. Phần cặn sau cùng được bỏ. - Mang ống nghiệm đã chứa toàn bộ dịch chiết trong 2 lần chiết ly tâm 4000 rmp trong 10 phút - Dung dịch tách 2 lớp, hút lớp trên vào bình cầu 100 ml, sau đó đem cô quay đến khô. Hình 3.2: Hệ thống cô quay chân không - Hòa tan cặn khô bằng 1 ml hỗn hợp dung dịch đệm : ACN (50:50) trong bể siêu âm. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình. - Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 µm vào vial HPLC và đem phân tích. 19 Tóm tắt quá trình ly trích MG và LMG Hình 3.3: Qui trình li trích MG ở phương pháp 1 Đo LC-MS xác thịt Hỗn hợp tách 2 lớp bỏ - 3 ml hydroxylamine (5 g/l) - lắc mạnh, để yên 15 phút - 5 ml acetonitrile ống nghiệm ly tâm 15 ml - ống nghiệm ly tâm 15 ml khác Cân 3 g cá đã nghiền đồng nhất dịch chiết (lần 1) Hỗn hợp tách 2 lớp - 5 ml acetonitrile - lắc mạnh 15 phút - ly tâm 4000 rpm/3 phút dịch chiết (lần 2) Hút lấy lớp dung dịch phía trên - lắc mạnh 15 phút - ly tâm 4000 rpm trong 3 phút - ly tâm 4000 rpm/3 phút xác thịt Lấy khoảng 1 ml dịch trong đem lọc qua đầu lọc 0.2 µm Cô quay chân không đến khô Hoà tan cặn bằng 1 ml dung dịch đệm acetate : ACN (50:50) 20 3.2.1.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) I. Nguyên tắc MG và LMG được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch đệm acetate - acetonitrile. Dịch trích được làm sạch bằng qui trình chiết lỏng - lỏng với chloroform. Dịch chiết sau đó được cô đến khô ở 48 °C. Hòa tan cặn thu được trong pha động. Lọc dung dịch qua đầu lọc 0.2 µm và đem phân tích bằng LC- MS. II. Trang thiết bị 1. Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2. Ống ly tâm nhựa loại 2 ml, 5 ml, 50 ml. 3. Syrings dung tích 2 ml, 1 ml, 0,5 ml, 2 , 1µl. 4. Lọc màng, kích thước lỗ 0.2 µm. 5. Bình chiết dung tích 250 ml, 500 ml. 6. Máy lắc Vortex. 7. Bể siêu âm. 8. Máy ly tâm lạnh. 9. Máy cô quay chân không và bình cầu quả lê 100 ml. 10. Hệ thống máy LC-MS. III. Hóa chất, dung dịch Tất cả các hóa chất sử dụng trong quy trình là loại tinh khiết phân tích. 1. Acetonitrile loại tinh khiết HPLC. 2. Chloroform loại tinh khiết HPLC. 3. Methanol loại tinh khiết HPLC. 4. Nước cất hai lần. 5. Diethylene glycol (DEG). 6. Sodium acetate trihydrate. 7. p-toluen sulfonic acid monohydrate (TSA). 8. N,N,N,N-tetramethyl-1,4-phenilenediamine dihydrochloride (TMPD). 9. Acid acetic. 10. Hydroxylamine.HCl (HA). 21 11. Dung dịch đêm acetate pH = 4,5: Hòa tan 7,7 g amonium acetate trihydrate vào nước, thêm tiếp 8 ml acid acetic và 5 ml dung dịch TSA 1M, chỉnh pH về 4,5 bằng acid acetic. Thêm nước để được 1 lít. 12. Dung dịch hydroxylamine trong nước: hòa tan 25 g Hydroxylamine.HCl trong 100 ml nước. 13. Dung dịch p-toluensulfonic acid monohydrate (TSA): Hòa tan 19 g TSA trong 100 ml nước. 14. Dung dịch N,N,N,N-tetramethyl-1,4-phenilenediaminedihydrochloride (TMPD): Hòa tan 1,03 g TMPD trong 50 ml nước. 15. Các dung dịch MG, LMG chuẩn được chuẩn bị giống như mục III.Hóa chất, dung dịch của Phương pháp I. IV. Quy trình phân tích 1. Chuẫn bị mẫu: Nghiền đồng nhất ít nhất 50 g mẫu. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng mẫu cá phải được rã đông hoàn toàn. 2. Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Tiến hành ly trích MG và LMG. 3. Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: Cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Thêm 39 µl dung dịch chuẩn MG và LMG 1 ppm. Tiến hành ly trích MG và LMG. 4. Ly trích MG và LMG - Thêm vào các ống nhựa chứa mẫu 30 µl TMPD, 0,5 ml dung dịch HA, 0,5 ml dung dịch TSA và 1,5 ml dung dịch đệm acetate. Lắc đều. - Thêm 10 ml acetonitrile, siêu âm 10 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển dịch trong vào bình chiết thủy tinh 250 ml đã chứa sẵn 20 ml nước và 1ml DEG. 22 Hình 3.4: Thiết bị li tâm lạnh - Thêm 10 ml acetonitrile vào ống chứa mẫu. Siêu âm 10 phút. Chuyển dịch trong vào cùng bình chiết thủy tinh 250 ml ở bước trên. - Thêm 10 ml chloroform vào trong bình chiết. Lắc nhẹ và để yên cho tách lớp. Chuyển lớp chloroform (ở dưới) vào trong bình cầu quả lê 100 ml. - Thêm 10 ml chloroform vào trong bình chiết. Lắc nhẹ và để yên cho tách lớp. Chuyển lớp chloroform (ở dưới) vào trong cùng bình cầu quả lê 100 ml ở bước trên. 23 Hình 3.5: Bình chiết - Cô dịch chloroform trong bình cầu quả lê cho đến khô trên máy cô quay chân không - Hòa tan cặn khô bằng 1 ml hỗn hợp dung dịch đệm : ACN (50:50) trong bể siêu âm. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình. - Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 µm vào vial HPLC. Chú ý: Các bước thao tác trong quy trình phải được tiến hành trong tối. Tóm tắt quá trình ly trích MG và LMG 24 Hình 3.6: Qui trình li trích MG ở phương pháp 2 xác thịt - 30 µl TMPD - 0.5 ml HA - 0.5 ml TSA - 1.5 ml dung dịch đệm acetate ống nghiệm ly tâm 15 ml Cân 3 g cá đã nghiền đồng nhất dịch chiết (lần 1) Hỗn hợp tách 2 lớp - 10 ml acetonitrile - siêu âm 10 phút - ly tâm 4000 rpm/5 phút Hỗn hợp tách 2 lớp dịch chiết (lần 2) Đo LC-MS lấy dung dịch đem lọc qua đầu lọc 0.2 µm bỏ - lắc mạnh 1 phút - 10 ml acetonitrile và siêu âm 10 phút - ly tâm 4000 rpm trong 5 phút, 50C xác thịt bình chiết 250 ml đã chứa - 20 ml H2O - 1 ml DEG - 10 ml chloroform - lắc mạnh, để yên cho tách lớp Hỗn hợp tách 2 lớp lớp dưới cho vào bình cầu quả lê 250 ml lớp trên vẫn giữ trong bình - 10 ml chloroform - lắc mạnh, để yên cho tách lớp Hỗn hợp tách 2 lớp bỏ lớp dưới lớp trên cô quay chân không đến khô hoà tan cặn bằng 1 ml dung dịch đệm acetate : ACN (50:50) 25 3.2.1.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) I. Nguyên tắc MG và LMG được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch acetonitrile. Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô còn 0,5 ml ở 48 °C. Định mức dịch chiết còn lại tới 1 ml bằng pha động. Cuối cùng, dung dịch được lọc qua đầu lọc 0,2 µm và đem phân tích bằng LC-MS. II. Trang thiết bị 1. Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2. Ống ly tâm nhựa loại 2 ml, 5 ml, 50 ml. 3. Syrings dung tích 2 ml, 1 ml, 0,5 ml, 2 , 1µl. 4. Lọc màng, kích thước lỗ 0.2 µm. 5. Máy lắc Vortex. 6. Hệ thống máy LC-MS. III. Hóa chất, dung dịch 1. Acetonitrile, methanol, dichloromethane - Mallin krodt (loại dùng cho phân tích HPLC). 2. Perchloric acid 70 % - May và Baker Pronalys (loại thuốc thử dùng trong phân tích). 3. Các dung dịch chuẩn Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị như phương pháp 1 IV. Quy trình phân tích 2. Chuẫn bị mẫu: Nghiền đồng nhất 50 g mẫu. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng mẫu cá phải được rã đông hoàn toàn. 3. Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Tiến hành ly trích MG và LMG. 4. Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: Cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Thêm 39 µl dung dịch chuẩn MG 1 ppm và LMG 1 ppm. Tiến hành ly trích MG và LMG. 5. Ly trích MG và LMG 26 - Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nắp đậy 15 ml. - Thêm vào ống nghiệm 1 ml dichloromethane, 5 ml acetonitrile và 0,5 ml perchloric acid trong acetonitrile 0,4 M. - Hỗn hợp dung dịch được khuấy đồng nhất bằng máy vortex với vận tốc cao nhất, khoảng 1 phút. Sau đó, hỗn hợp dung dịch đồng nhất được lắc đều bằng máy quay với vận tốc 60 rpm trong 3 giờ. Quá trình này được tiến hành trong tối. - Sau đó đem ly tâm 4000 rpm trong 5 phút. Lấy dung dịch trong ở trên cho vào ống falcon có chia vạch. Dung dịch được cô quay đến khô ở 48 0C. - Dịch chiết được định mức đến 1 ml bằng dung dịch đệm acetate : ACN (50:50). Dung dịch mẫu này được lắc mạnh khoảng 30 giây bằng máy vortex. Cuối cùng hút dung dịch cho qua đầu lọc 0,2 µm. Dịch lọc thu được cho vào vial HPLC và đem phân tích. Tóm tắt quá trình ly trích MG và LMG 27 Hình 3.7: Qui trình li trích MG ở phương pháp 3 Cân 3 g cá đã nghiền đồng nhất ống nghiệm ly tâm 15 ml Hỗn hợp tách 2 lớp - lắc mạnh trong tối (3h, 60 rpm) - ly tâm 4000 rpm trong 5 phút - 1 ml dichloromethan - 5 ml acetonitrile - 0.5 ml perchloric acid 0.4M Đo LC-MS Định mức dung dịch còn lại tới 1ml bằng dung dịch đệm acetate : ACN (50:50) xác thịt - lắc mạnh 30 giây lấy dịch trong ở trên cho vào ống Falcon có chia vạch bỏ Cô quay chân không đến khô Hút dung dịch cho qua đầu lọc 0.2 µm 28 3.2.2 Thí nghiệm 2: xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra Mục đích: xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra. 3.2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Cá thí nghiệm được mua từ trại giống ở Cần Thơ, có khối lượng từ 15- 20 g/con. Chọn cá khỏe như có màu sắc tươi sáng tự nhiên, đồng cỡ, hoạt động khỏe mạnh, không bị dị tật và không có dấu hiệu bệnh tật. Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm viên dạng nổi có hàm lượng đạm 30 %, mỗi ngày cho cá ăn 2 lần (lúc 8 giờ và 16 giờ), khẩu phần ăn từ 5-6 % khối lượng than. Hệ thống thí nghiệm được thiết kế có sục khí liên tục, có thể cho nước chảy liên tục. 3.2.2.2 Phương pháp gây nhiễm Malachite green Cá được gây nhiễm MG 2 lần trong quá trình thí nghiệm. Cụ thể là: Gây nhiễm lần 1: giảm mức nước trong bể xuống 30 % và cho MG vào bể đạt các nồng độ qui định, sau 6 giờ thì nâng mức nước lên đầy bể. Gây nhiễm lần 2: sau khi gây nhiễm lần 1 và thu mẫu ở thời điểm 72 giờ thì tiến hành giảm 30 % mực nước và gây nhiễm MG lần 2 và sau 6 giờ ta tiến hành nâng nước lên đầy bể. Thể tích nước sau khi hạ 30 % là: 231 L. 3.2.2.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố với 3 lần lặp lại Nhân tố nồng độ MG: A: mẫu đối chứng B: nồng độ MG 0,1 ppm C: nồng độ MG 0,15 ppm D: nồng độ MG 0,2 ppm Số nghiệm thức: 3 + 1 (đối chứng) = 4 nghiệm thức Số mẫu thí nghiệm 29 4 nghiệm thức x 3 lần lặp lại x 9 mức thời gian thu mẫu = 108 mẫu Mật độ bố trí cá là 70 con/bể. Bể nuôi: chọn bể còn nguyên, tốt, không rỉ nước, dung tích 500 L, nhưng nuôi ở mực nước 330 L. Nhằm tạo điều kiện cho cá phát triển tốt và dễ theo dõi trong quá trình nuôi. Hình 3.8: Bể nuôi Mỗi nghiệm thức bố trí 3 bể, mỗi bể có thể tích là 500 L nhưng mực nước trong bể là 330 L. Bể màu xanh, được xếp thành hàng và đặt nơi thoáng mát có mái che (trại cá). Hệ thống bể được thiết kế có sục khí liên tục, có hệ thống chảy tràn. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Cá Tra Bể nuôi Thu mẫu (T0) Gây nhiễm lần 1 A B C D T1 T2 T1 T2 T1 T2 T1 T2 Gây nhiễm lần 2 A B C D T3 T4… T8 T3 T4… T8 T3 T4… T8 T3 T4… T8 Nghiền đồng nhất mẫu Bảo quản Phân tích Hình 3.9: Sơ đồ bố trí nghiệm xác định mức độ tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá tra 31 A: không có MG (mẫu đối chứng) B: nồng độ MG 0,1 ppm cho vào bể nuôi C: nồng độ MG 0,1 5ppm cho vào bể nuôi D: nồng độ MG 0,2 ppm cho vào bể nuôi T: thời gian lấy mẫu tương ứng với các nồng độ để phân tích 3.2.2.4 Tiến hành thí nghiệm Cá mua về, cho ăn, sau thời gian T0- trước khi gây nhiễm lần 1, tiến hành thu mẫu ở các bể. Sau khi thu mẫu ở thời gian T0, tiến hành gây nhiễm lần 1 với các nồng độ MG (0,1; 0,15; 0,2 ppm), ứng mỗi nồng độ trên ta tiến hành thu mẫu ở các mức thời gian sau khi gây nhiễm 6 giờ (T1), 72 giờ (T2). Khi thu mẫu ở thời gian sau gây nhiễm lần 1 72 giờ, tiến hành gây nhiễm lần 2 cũng ứng với các nồng độ đối với mỗi bể giống lần 1, và sau đó tiếp tục thu mẫu để đem phân tích với các thời gian: 6 giờ (T3), 72 giờ (T4), 7 ngày (T5), 14 ngày (T6), 28 ngày (T7), 56 ngày (T8). Cá sau khi thu ở mỗi thời gian tiến hành fillet, xay nhỏ mẫu. Mẫu thử sau khi đã chuẩn bị xong, trong điều kiện bình thường phải tiến hành phân tích ngay trong vòng 4 giờ, nếu không đem trữ mẫu trong tủ đông -800C. 3.2.2.5 Thời gian thu mẫu Thu mẫu cá ban đầu trước khi gây nhiễm kháng sinh. Cho cá thí nghiệm ăn thức ăn và gây nhiễm MG 2 lần, sau mỗi lần gây nhiễm tiến hành thu mẫu ở các mức thời gian. Lần thu mẫu ứng với thời gian T0: trước khi gây nhiễm MG. Lần thu mẫu ứng với thời gian T1: sau khi gây nhiễm MG (lần 1) 6 giờ. Lần thu mẫu ứng với thời gian T2: sau khi gây nhiễm MG (lần 1) 72 giờ. Lần thu mẫu ứng với thời gian T3: sau khi gây nhiễm MG (lần 2) 6 giờ. Lần thu mẫu ứng với thời gian T4: sau khi gây nhiễm MG (lần 2) 72 giờ. Lần thu mẫu ứng với thời gian T5: sau khi gây nhiễm MG (lần 2) 7 ngày. Lần thu mẫu ứng với thời gian T6: sau khi gây nhiễm MG (lần 2) 14 ngày. Lần thu mẫu ứng với thời gian T7: sau khi gây nhiễm MG (lần 2) 28 ngày. Lần thu mẫu ứng với thời gian T8: sau khi gây nhiễm MG (lần 2) 56 ngày. 32 3.3 Xử lý số liệu Tất cả số liệu được xử lý bằng Microsoft Excel 2003. 33 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng đường chuẩn MG, LMG Bảng 4.1: Tín hiệu trên máy LC-MS đọc được ứng với nồng độ chuẩn Diện tích peak đo được Nồng độ dãy chuẩn (ppb) MG LMG 1 11300 3350 2 21800 2020 5 68600 13600 10 126000 33700 20 289000 76900 30 401000 106000 40 610000 163000 y = 14884x - 11398 R2 = 0,9931 y = 4033,9x - 5298 R2 = 0,9924 -100000 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 0 10 20 30 40 50 Nồng Độ (ppb) Tí n Hi ệ u đ o đ ư ợ c MG LMG Hình 4.10: Đồ thị đường chuẩn 4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ Cách tính hiệu suất thu hồi: Khi thêm 39 µl dung dịch chuẩn MG 1 ppm và LMG 1 ppm. 34 Ta có: 1 ppm ≈ 1 µg/ml = 1µg / 1000µl. Vậy khi hút 39 µl MG, LMG ta được lượng X là: ngggx l lX 39039,01 1000 39 === µµ µ µ Vậy lượng MG, LMG đem ly trích là: ppbmlng ml ng 39/39 1 39 == 4.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) Hiệu suất thu hồi - Đối với MG: % MG = 815,13100 39 388,5 =x - Đối với LMG: 925,32100 39 841,12% == xLMG Bảng 4.2: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn MG, LMG 39 ppb Số lần lập lại Kết quả phân tích (ppb) Hiệu suất thu hồi (%) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) MG LMG MG LMG MG LMG 1 2 3 5,388 13,464 6,854 6,346 12,841 6,916 13,816 34,523 17,571 16,271 32,925 17,733 21,970±1,907 22,310 ±1,992 * Bàn luận kết quả Qua quá trình khảo sát ta thấy ở phương pháp này ít tốn kém hóa chất, thời gian phân tích ngắn, thao tác thực hiện lại đơn giản, đây là ưu điểm rất lớn đối với 35 1 phương pháp phân tích, nhưng với bảng kết quả thu được từ thực nghiệm trên, ta thấy hiệu suất thu hồi trung bình ở phương pháp này quá thấp, hiệu suất thu hồi đối với MG chỉ đạt 21,970 % và LMG 22,310 %, độ sai số tương ứng là 1,907 % và 1,992 %. Trong khi đó, một phương pháp tối ưu thì phải có hiệu suất từ 70 % trở lên. Vì vậy, phương pháp 1 không được xem là phương pháp tốt nhất, không được chọn để tiến hành làm thí nghiệm 2. 4.2.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) Hiệu suất thu hồi - Đối với MG 28,78100 39 529,30% == xMG - Đối với LMG: 483,77100 39 218,30% == xLMG Bảng 4.3: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG và LMG Kết quả phân tích (ppb) Hiệu suất thu hồi (%) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) Số lần lập lại MG LMG MG LMG MG LMG 1 2 3 30,529 31,067 28,648 30,218 29,252 28,979 78,280 79,658 73,457 77,483 75,004 74,305 77,132±0,717 75,600±1,298 * Bàn luận kết quả Qua quá trình khảo sát ta thấy, phương pháp này tốn nhiều hóa chất, thời gian phân tích ngắn, thao tác thực hiện tương đối phức tạp hơn phương pháp 1. Nhưng kết quả thu được có thể xem rất tốt, qua bảng kết quả thu được từ thực nghiệm trên, ta thấy hiệu suất thu hồi trung bình ở phương pháp này khá cao, hiệu suất thu hồi đối với MG đạt 77,132 % và LMG 75,600 %. So với một phương 36 pháp được xem là tối ưu thì phải có hiệu suất là 70 – 80 % thì phương pháp này đạt yêu cầu. Vì vậy, phương pháp 2 được xem là phương pháp tốt nhất, được chọn để tiến hành thí nghiệm 2. 4.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) Hiệu suất thu hồi - Đối với MG 59,36100 39 27,14% == xMG - Đối với LMG: 15,35100 39 708,13% == xLMG Bảng 4.4: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG, LMG Kết quả phân tích (ppb) Hiệu suất thu hồi (%) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) Số lần lập lại MG LMG MG LMG MG LMG 1 2 3 14,270 14,875 14,539 13,708 12,816 11,973 36,590 38,141 37,279 35,150 32,861 30,700 37,337±0,777 32,904±2,225 * Bàn luận kết quả Qua quá trình khảo sát ta thấy, phương pháp này ít tốn hóa chất, thao tác thực hiện tương đối đơn giản, nhưng thời gian phân tích dài, trong khi đó MG là chất dễ bị biến đổi dưới ánh sáng. Nên ở phương pháp này kết quả thu được không cao, qua bảng kết quả thu được từ thực nghiệm trên, ta thấy hiệu suất thu hồi trung bình ở phương pháp này thấp, hiệu suất thu hồi đối với MG đạt 37,337 % và LMG 32,904 %. Vì vậy, phương pháp 3 không được xem là phương pháp tối ưu, nên không được chọn để tiến hành thí nghiệm 2. 37 4.3 Thí nghiệm 2: Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 4.3.1 Sự tồn lưu của MG + LMG Bảng 4.5: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm Gây nhiễm Trước khi gây nhiễm Lần 1 (ppb) Lần 2 (ppb) Nồng độ (ppm) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 ĐC 0 <LOD <LOD 0,697 <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD 0.1 0 21,40 4,15 34,44 10,69 4,00 2,74 0,88 0,31 0.15 0 37,17 7,11 38,53 16,69 14,79 9,59 1,45 0,44 0.2 0 48,97 13,54 55,15 26,05 18,05 10,91 5,62 2,42 4,15 34,44 10,69 7,11 38,53 16,69 55,15 26,05 <LOD<LOD0,70<LOD 0,31 21,40 0,44 37,17 2,24 13,54 48,97 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 ĐC 0,1 ppm 0,15 ppm 0,2 ppm <LOD Hình 4.11: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm T4 T5 T6 T7 T8 T3 T2 T1 THỜI GIAN T0 N Ồ N G Đ Ộ (pp b) 38 * Nhận xét: Sau khi cá bị gây nhiễm MG ở các nồng độ (0,1 ppm, 0,15 ppm và 0,2 ppm) thì vào thời điểm 6 giờ sau khi gây nhiễm lần 1, MG và LMG tồn tại trong cơ và da cá với hàm lượng cao (trung bình từ 21,40 đến 48,97 ppb). Sau 72 giờ sau khi gây nhiễm lần 1 thì hàm lượng MG và LMG trong cơ và da cá giảm nhanh đạt 4,15-21,4 ppb. Nhưng sau 6 giờ gây nhiễm MG lần 2 thì nồng độ MG và LMG trong cơ và da cá tồn tại với hàm lượng rất cao so với 6 giờ sau khi gây nhiễm lần 1. Nồng độ MG tìm thấy trong cơ và da cá khi gây nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều giảm xuống sau 72 giờ gây nhiễm lần 2 và đến ngày 28 thì đạt giá trị 0,88 ppb; 1,33 ppb và 5,62 ppb lần lượt ở các nghiệm thức 0,1 ppm; 0,15 ppm và 0,2 ppm. Hàm lượng MG phát hiện trong cá ở nghiệm thức 0,1 ppm và 0,15 ppm cho thấy sau 28 ngày gây nhiễm nồng độ MG thấp hơn mức ấn định dư lượng tối đa của MG và LMG (không được vượt quá hai phần tỉ (ppb)) trong sản phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu Châu và Úc Châu (Quyết định số 2002/657/EC ngày 22/12/2003). Trong khi đó ở Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng nguyên tắc “zero tolerance” nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ một dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG trong sản phẩm. ( Sau 56 ngày gây nhiễm nồng độ tồn lưu của MG, trong cơ thịt và da cá vẫn còn 0,31; 0,44; 2,42 ppb ứng với nồng độ gây nhiễm 0,1; 0,15; 0,2 ppm. Điều này cho thấy sau thời gian 56 ngày gây nhiễm thì hàm lượng MG vẫn còn tồn lưu trong cá. Khả năng chuyển hóa và đào thải của MG khác nhau tùy từng loài cá và môi trường sống của chúng. Ở cá nheo Mỹ nuôi ở 21oC và gây nhiễm 0,8ppm MG trong 1 giờ thì MG tồn trong cơ cá ở mức 0,710 ppb và 26.7 mg/kg cơ cá sau 336 giờ (Plakas S.M., và ctv., 1996). Ở cá, hơn 80% MG bị hấp thu và chuyển hóa thành LMG. Ngoài ra, MG có thể tồn tại trong môi trường nước khoảng 80 ngày, nó còn ảnh hưởng đến các sinh vật trong nước khác như tảo, động vật nguyên sinh (E. Sudova1, J. Machova1, Z. Svobodova1, T. Vesely3, 2007) MG là một loại hóa chất cấm nhưng rẻ tiền, hiệu quả cao vì vậy đôi khi nó vẫn còn được sử dụng và tìm thấy sự hiện diện của chúng trong các sản phẩm thủy sản. Hơn nữa, MG được sử dụng rộng rãi trong ngành dệt, đồ gốm và giấy. Nước thải từ những nhà máy dệt và sản xuất giấy dễ bị ô nhiễm MG, vì thế những 39 loài cá nuôi hay cá tự nhiên gần khu vực này cũng có nguy cơ nhiễm loại hóa chất độc hại này. 4.3.2 Sự tồn lưu của MG Bảng 4.6: Sự tồn lưu của MG theo thời gian thí nghiệm Gây nhiễm Trước khi gây nhiễm Lần 1 (ppb) Lần 2 (ppb) Nồng độ (ppm) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 ĐC 0 <LOD <LOD 0,26 <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD 0.1 0 10,59 1,78 17,22 4,82 1,64 0,79 0,44 0,31 0.15 0 11,34 3,42 19,50 8,24 7,33 5,36 0,94 0,44 0.2 0 15,66 6,62 27,82 12,59 8,33 5,23 3,82 1,81 * Nhận xét Kết quả phân tích (bảng 4.5) cho thấy ngay sau khi kết thúc gây nhiễm MG với nồng độ 0,1, 0,15, 0,2 ppm cho thấy sự tồn lưu MG tương ứng là 17,22; 19,50; 27,82 ppb. Kết quả cho thấy sự tồn lưu MG ngay sau khi sử dụng là rất cao. Tuy nhiên, sự tồn lưu của MG giảm dần theo thời gian và đến ngày 56 sau khi gây nhiễm thì hàm lượng MG còn lại trên cá là 0,31-1,81 ppb. Sự giảm dần tồn lưu MG trong cá tra theo thời gian được thấy rõ hơn trong hình 4.12. 40 17,22 27,82 <LOD<LOD 0,26 <LOD <LOD 0,31 10,59 11,34 19,50 15,66 1,81 0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 ĐC 0,1 ppm 0,15 ppm 0,2 ppm Hình 4.12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm 4.3.3 Sự tồn lưu của LMG Bảng 4.7: Sự tồn lưu của LMG theo thời gian thí nghiệm Gây nhiễm Trước khi gây nhiễm Lần 1 (ppb) Lần 2 (ppb) Nồng độ (ppm) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 ĐC 0 <LOD <LOD 0,44 <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD 0.1 0 10,81 2,37 17,22 5,87 2,36 1,94 0,44 0,00 0.15 0 25,83 3,69 19,03 8,46 7,45 4,23 0,51 0,00 0.2 0 33,31 6,92 27,32 13,46 9,72 5,68 1,80 0,61 * Nhận xét: Bảng 4.6 cho thấy có sự chuyển hóa MG thành LMG tồn lưu trong cơ thể cá, và cho thấy sự chuyển hóa nhanh chóng từ MG sang LMG ngay sau khi ngưng sử dụng là rất cao. Hàm lượng LMG được chuyển hóa từ MG ngay sau khi T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 THỜI GIAN N Ồ N G Đ Ộ (pp b) 41 gây nhiễm là 17,22; 19,03; 27,32 ppb tương ứng nồng độ gây nhiễm 0,1; 0,15; 0,2 ppm. Sự đào thải LMG giảm theo thời gian và đến ngày 56 sau khi kết thúc gây nhiễm với nồng độ 0,1; 0,15; 0,2 ppm thì hàm lượng LMG không còn phát hiện trong mẫu cá, hoặc còn với hàm lượng rất thấp. 42 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ có thể nghiên cứu và khảo sát thí nghiệm với ba phương pháp xác định dư lượng MG trong nguyên liệu cá tra. Trải qua những ngày tháng miệt mài nghiên cứu, học tập và tiến hành khảo sát thực nghiệm qua ba phương pháp 1, 2 và 3, cho thấy phương pháp 2 được chọn là một phương pháp tốt nhất. Phương pháp 2 có độ nhạy cao, xác nhận và xác định được tổng hàm lượng MG và LMG trong thủy sản (cá). Phần dư lượng MG và LMG được ly trích khỏi thủy sản bằng dung dịch đệm acetate - acetonitrile. Dịch trích được làm sạch bằng qui trình chiết lỏng - lỏng với chloroform. Dịch chiết sau đó được cô đến khô ở 48 °C. Hòa tan cặn thu được trong pha động. Lọc dung dịch qua đầu lọc 0.2 µm và đem phân tích bằng LC-MS. Sau khi cá bị gây nhiễm MG ở các nồng độ (0,1 ppm, 0,15 ppm và 0,2 ppm) thì vào thời điểm 6 giờ sau khi gây nhiễm lần 1, MG và LMG tồn tại trong cơ và da cá với hàm lượng rất (trung bình từ 21,40 đến 48,97 ppb). Nhưng sau 72 giờ sau khi gây nhiễm lần 1 thì hàm lượng MG và LMG trong cơ và da cá giảm nhanh đạt 4,15-21,4 ppb. Nhưng sau 6 giờ gây nhiễm MG lần 2 thì nồng độ MG và LMG trong cơ và da cá tồn tại với hàm lượng rất cao so với 6 giờ sau khi gây nhiễm lần 1. Nồng độ MG tìm thấy trong cơ và da cá khi gây nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều giảm xuống sau 72 giờ gây nhiễm lần 2 và đạt giá trị 0,88 ppb; 1,33 ppb và 5,62 ppb lần lượt ở các nghiệm thức 0,1 ppm; 0,15 ppm và 0,2 ppm. Sau 56 ngày sau khi gây nhiễm lượng MG vẫn còn tồn lưu nhưng ở nồng độ thấp 0,31- 2,42 ppb và một phần MG đã chuyển thành LMG. Chú ý hạn chế sự gián đoạn của quá trình phân tích chung 43 5.2 Đề xuất Cần phải nghiên cứu thêm để tìm hiểu những nguyên nhân gây ra hiệu suất thấp cho cả hai phương pháp 1 và 3. Từ đó có những biện pháp khắc phục để hoàn thiện cả hai phương pháp hơn, cho hiệu suất cao và được áp dụng rộng rãi hơn. Tìm hiểu và nghiên cứu thêm những phương pháp mới phân tích Malachite green trong thủy sản, để đưa ra nhiều phương pháp tối ưu. Tiến hành thí nghiệm với thời gian dài hơn nhằm xác định chính xác thời gian đào thải hoàn toàn MG và LMG trên cá tra. Nghiên cứu sự tồn lưu MG, LMG trên quy mô ao nuôi. Tiến hành nghiên cứu sự tồn lưu trên nhiều cơ quan khác như: gan, huyết tương, não,... 44 PHỤ LỤC 1 DANH MỤC HOÁ CHẤT, KHÁNG SINH CẤM VÀ HẠN CHẾ SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT, KINH DOANH THỦY SẢN T.S. Nguyễn Công Thành Trung Tâm Chuyển Giao TBKT, Viện Lúa ĐBSCL Danh mục các hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng: Gồm có 17 hóa chất, kháng sinh TT Tên hoá chất, kháng sinh Đối tượng áp dụng 1 Aristolochia spp và các chế phẩm từ chúng 2 Chloramphenicol 3 Chloroform 4 Chlorpromazine 5 Colchicine 6 Dapsone 7 Dimetridazole 8 Metronidazole 9 Nitrofuran (bao gồm cả Furazolidone) 10 Ronidazole 11 Green Malachite (Xanh Malachite) 12 Ipronidazole 13 Các Nitroimidazole khác 14 Clenbuterol 15 Diethylstibestrol (DES) 16 Glycopeptides 17 Trichlorfon (Dipterex) Thức ăn, thuốc thú y, hóa chất, chất xử lý môi trường, chất tẩy rửa khử trùng, chất bảo quản, kem bôi da tay trong tất cả các khâu sản xuất giống, nuôi trồng động thực vật dưới nước và lưỡng cư, dịch vụ nghề cá và bảo quản, chế biến. 45 Danh mục các hóa chất, kháng sinh hạn chế sử dụng: gồm có 34 hóa chất, kháng sinh TT Tên hoá chất, kháng sinh Dư lượng tối đa (ppb) 1 Amoxicillin 50 2 Ampicillin 50 3 Benzylpenicillin 50 4 Cloxacillin 300 5 Dicloxacillin 300 6 Oxacillin 300 7 Danofloxacin 100 8 Difloxacin 300 9 Enrofloxacin 100 10 Ciprofloxacin 100 11 Oxolinic Acid 100 12 Sarafloxacin 30 13 Flumepuine 600 14 Colistin 150 15 Cypermethrim 50 16 Deltamethrin 10 17 Diflubenzuron 1000 18 Teflubenzuron 500 19 Emamectin 100 20 Erythromycine 200 21 Tilmicosin 50 22 Tylosin 100 23 Florfenicol 1000 34 Lincomycine 100 25 Neomycine 500 26 Paromomycin 500 27 Spectinomycin 300 28 Chlortetracycline 100 29 Oxytetracycline 100 46 30 Tetracycline 100 31 Sulfonamide (các loại) 100 32 Trimethoprim 50 33 Ormetoprim 50 34 Tricaine methanesulfonate 15-330 47 PHỤ LỤC 2 CHỈ TIÊU VÀ MỨC GIỚI HẠN TỐI ĐA CHO PHÉP ĐỐI VỚI SẢN PHẨM THỦY SẢN XUÁT KHẨU VÀO THỊ TRƯỜNG EU (NAFIQAVED, cập nhật ngày 25/3/2006) Chỉ tiêu và mức giới hạn tối đa cho phép đối với sản phẩm thủy sản xuất khẩu vào thị trường EU Tên chỉ tiêu Sản phẩm Mức giới hạn (đơn vị được ghi theo TL tham chiếu) Căn cứ pháp lý Chloroform Chlorpromazin Colchicine Dapsone Dimetridazole Metronidazone Rinodazole Aristolochia spp và các chế phẩm từ chúng Sản phẩm thủy sản nuôi Không cho phép Qui định (EC) Số 2377/90 Tổng Malachite green và Leucomalachite green Sản phẩm thủy sản nuôi Không cho phép (Giới hạn phân tích tối thiểu MRPL= 2 µg/kg) Quyết định 2004/25/EC Không cho phép Qui định (EC) số 2377/90 Chloramphenicol Sản phẩm thủy sản nuôi MRPL= 0.3 µg/kg Quyết định 2003/181/EC Kháng sinh cấm Các chất chuyển hóa của Sản phẩm thủy sản nuôi Không cho phép 2377/90/EC 48 Nitrofurans MRPL= 1 µg/kg Quyết định 2003/181/EC Các chất thuộc nhóm Sulfonamide Động vật thủy sản 100 µg/kg Qui định (EC) số 2377/90 Trimethoprim Động vật thủy sản 50 µg/kg Danofloxacin Động vật thủy sản 100 µg/kg Difloxacin Động vật thủy sản 300 µg/kg Enrofloxacin (tính theo tổng Enrofloxacin và Ciprofloxacin) Động vật thủy sản 100 µg/kg Động vật thủy sản (trừ cá) 200 µg/kg Flumequine Cá 600 µg/kg Sarafloacin Họ cá hồi 30 µg/kg Qui định (EC) số 2377/90 Oxolinic acid Cá 100 µg/kg Qui định 739/2003/EC Chlortetracycline Động vật thủy sản 100 µg/kg Oxytetracycline Động vật thủy sản 100 µg/kg Tetracycline Động vật thủy sản 100 µg/kg Amoxicilline Động vật thủy sản 50 µg/kg Ampicillin Động vật thủy sản 50 µg/kg Benzylpenicillin Động vật thủy sản 50 µg/kg Cloxacillin Động vật thủy sản 300 µg/kg Dicloxacillin Động vật thủy sản 300 µg/kg Kháng sinh hạn chế sử dụng Oxacillin Động vật thủy sản 300 µg/kg Qui định (EC) số 2377/90 Colistin Động vật thủy sản 150 µg/kg Erythomycin Động vật thủy sản 200 µg/kg Tilmicosin Động vật thủy sản 50 µg/kg Tylosin Động vật thủy sản 100 µg/kg 49 Lincomycin Động vật thủy sản 100 µg/kg Neomycin Động vật thủy sản 500 µg/kg Paromomycin Động vật thủy sản 500 µg/kg Spectinomycin Động vật thủy sản 300 µg/kg Cypermethrin Họ cá hồi 50 µg/kg Deltamethrin Các loài cá 10 µg/kg Diflubenzuron Họ cá hồi 1000 µg/kg Florfenicol Các loài cá 1000 µg/kg Teflubenzuron Họ cá hồi 500 µg/kg Emamectin Các loài cá 100 µg/kg 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 2. 3. 4. 5. hppt:// www.vietnamnet.vn 6. hppt://www.khoahoc.net 7. hppt://www.Intrafish.com 8. Dương Hải Toàn, 2006. Luận văn tốt nghiệp đại học “nghiên cứu sự ảnh hưởng của Malachite green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống”. 9. Đào Thị Hồng Sen, 2007. Luận văn tốt nghiệp đại học “nghiên cứu độ tồn lưu và sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) có sử dụng kháng sinh Enrofloxacine và Nofloxacine”. 10. Đoàn Đức Bảo, 2007. Luận văn tốt nghiệp đại học “xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite green trong các sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao ghép cặp khối phổ (LC- MS/MS)”. 11. Huỳnh Minh Hiển, 2007. Luận văn tốt nghiệp đại học “ khảo sát phương pháp xử lý các ảnh hưởng đến chất lượng cá Tra fillet đông lạnh tại xí nghiệp AGIFISH”. 12. Trần Thị Kim Giang, 2006. Luận văn tốt nghiệp đại học “xác định dư lượng Malachite green trong thủy sản bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ”. 13. KS. Trần Minh Phú, 2006. Bài Giảng “ Phương pháp phân tích thực phẩm thủy sản”. 14. Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 2005 của Bộ Trưởng Bộ Thủy Sản về việc ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản. 51 15. Quyết định số 26/2005/QĐ-BTS ngày 18/8/2005 của bộ trưởng bộ thủy sản về việc bổ sung danh mục kháng sinh nhóm Fluorquinolones cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ. 16. Quyết định số 29/2005/QĐ –BTS ngày 1/11/2005 của bộ trưởng bộ thủy sản về việc tăng cường việc kiểm tra hàng thủy sản xuất khẩu vào Hoa Kỳ và Canada.