Nghiên cứu bảo quản quả dâu tây với màng bán thấm chitosan

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Trang 28 2.1. PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO MÀNG BÁN THẤM CHITOSAN: 2.1.1. NGUYÊN VẬT LIỆU: Trong vỏ tôm cua có chứa khoảng 20 – 25% chitin, 22 – 28% protid và 45 – 55% CaCO3. Chitin là một polime mạch thẳng của N-acetyl-D-glucosamin liên kết với nhau bằng những nối β-1,4 glucosid. Chitin chỉ có thể tan trong dung dịch HCl 40% hoặc trong dung dịch NH4OH hay Cu(OH)2. Để tăng tính hoà tan người ta khử nhóm acetyl của chitin cho ra chitosan, một polime mạch thẳng có thể tan trong dung dịch acid yếu như acetic acid 0,2% hay citric acid 0,15%. Trong đề tài này chúng tôi điều chế chitosan từ vỏ tôm cua phế liệu theo quy trình sinh hoá gồm 2 giai đoạn: - Khử muối vô cơ với các chủng vi sinh vật Bacillus sp. ký hiệu Y – 108, vừa có tác dụng carbonatase và protease. - Phân giải protein và cắt nối peptid NH – CO trong chitin với chủng vi sinh vật Enterobacter G-1 sinh tổng hợp enzym protease và chitindeacetylase. - Các hoá chất dùng để điều chế môi trường nuôi cấy thuộc loại P mua của công ty Kana Nhật Bản. 2.1.2. PHƯƠNG PHÁP: Dùng Bacillus Y – 108 để khử CaCO3 và protein trong vỏ tôm cua cho ra chitin. - Kiểm tra quá trình khử CaCO3 bằng cách lấy 0,5g vỏ tôm cua đã xử lý, đun sôi trong 2cc dd HCl 10% ở 100oC trong 15 phút. Lọc lấy nước, nhỏ vào vài giọt dd H2SO4 đậm đặc, nếu không thấy kết tủa thì quá trình loại khoáng đã kết thúc. - Kiểm tra quá trình khử protein bằng cách lấy 0,5g vỏ tôm cua đã xử lý, đun sôi trong 2cc dd NaOH 10% ở 100oC trong 15 phút. Lọc lấy nước, Trang 29 dùng HCl chỉnh pH trong khoảng 3,5 – 4,5, nếu không thấy kết tủa thì quá trình loại protein đã kết thúc. Dùng Enterobacter G-1 để khử acetyl chuyển chitin thành chitosan. Kiểm tra quá trình khử acetyl bằng cách lấy 0,5g vỏ tôm cua đã xử lý hoà tan trong 5cc dd acetid acid 2%. Nếu thấy vỏ tôm cua tan hoàn toàn thì quá trình khử acetyl đã đạt yêu cầu. 2.2. PHƯƠNG PHÁP TẠO MÀNG TRÊN QUẢ DÂU TÂY: Quả dâu tây được mua ở chợ rau quả huyện Đức Trọng, Lâm Đồng thuộc giống HO trồng ở Đà Lạt. Quả dâu tây mua về được rứt cuống tránh không làm dập quả và sát trùng với dung dịch ozon 140 ppm trong 5 phút. Sau đó cho dâu tây vào rổ thưa nhúng vào dung dịch màng chitosan trong 1 phút, để hong khô trong 3 giờ và đưa ngay vào tủ bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0 – 2oC, ẩm độ 90 – 95%. Mẫu đối chứng cũng được xử lý giống như trên nhưng không có nhúng dung dịch chitosan mà chỉ đưa ngay vào tủ bảo quản lạnh. 2.3. PHƯƠNG PHÁP ĐO CÁC CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG: 2.3.1. TÍNH CHẤT CƠ BẢN CỦA MÀNG BÁN THẤM CHITOSAN: Nhúng ngập 3 trái xoài vào dung dịch tạo màng chitosan trong 1 phút, lấy ra để ráo nước, hong khô trong 60 phút dưới quạt gió ở nhiệt độ phòng. Dùng dao mỏng bổ trái xoài và gỡ lấy lớp màng chitosan, cắt từng ô vuông 25x25mm để kiểm nghiệm tính chất cơ bản của màng. 2.3.1.1. Bề dày lớp màng: Bề dày lớp màng được đo bằng máy đo vi sai Mitutoyo Tokyo Model 293-766 ở nhiệt độ phòng 32oC, ẩm độ RH 45%. 2.3.1.2. Độ trong suốt của màng: Trang 30 Độ trong suốt T của màng được đo theo phương pháp chuẩn ASTM D1746-92 dựa vào độ hấp thu của màng ở độ dài sóng λ = 600nm với công thức: b AT 600= A600 : độ hấp thu của màng ở λ = 600nm b: bề dày của màng 2.3.1.3. Độ hút ẩm của màng: Độ hút ẩm của màng chitosan được xác định bằng cách nhúng một lượng màng chitosan vào dung dịch đệm muối phosphat ở pH = 7,4 trong 30 phút, sau đó dùng miếng giấy lọc hút hết nước còn dư ngoài bề mặt màng. Cân trọng lượng màng trước và sau khi ngâm. Độ hút ẩm của màng được xác định theo công thức: Wab : tỷ lệ phần trăm nước hấp thu trong màng. W30 : trọng lượng màng sau khi nhúng 30 phút vào dung dịch đệm. W0 : trọng lượng màng trước khi nhúng vào dung dịch đệm. 2.3.1.4. Độ hoà tan trong nước của màng: Độ hoà tan trong nước của màng S% được xác định theo phương pháp Gontard bằng cách ngâm màng trong nước 24 giờ ở nhiệt độ 25oC và được tính theo công thức: Wt0 : trọng lượng của màng trước khi ngâm. Wt24 : trọng lượng của màng sau khi ngâm nước 24 giờ. W30 – W0 Wab = x 100 W0 Wt0 – Wt24 S% = x100 Wt0 Trang 31 2.3.2. QUẢ DÂU TÂY BẢO QUẢN BẰNG MÀNG BÁN THẤM: 2.3.2.1. Tỉ lệ giảm trọng lượng: - Cân trọng lượng qủa dâu trước khi đưa vào tủ bảo quản: Po - Cân trọng lượng qủa dâu ở thời điểm đo: P Tỉ lệ giảm trọng lượng được tính theo công thức: 100(%) x P PPP o o − =∆ 2.3.2.2. Cường độ hô hấp: Khi hô hấp rau qủa thải ra khí CO2, cường độ hô hấp của rau quả được biểu thị qua đại lượng này. Đo nồng độ CO2 trong mỗi bình sau một thời gian xác định với máy đo O2/CO2 hiệu OXYBABY V của hãng WITT GASETECHNIK Đức. Hình 6: Máy đo O2/CO2 hiệu OXYBABY V của hãng WITT GASETECHNIK Đức Trang 32 2.3.2.3. Tổng chất rắn hoà tan (TSS): Tổng chất rắn hoà tan (độ Brix) được đo bằng khúc xạ kế (digital refractometer) model MR10ATC của hãng MILKAUKEE (Đức) 2.3.2.4. Độ acid (TA): - Độ acid được thể hiện qua hàm lượng acid hữu cơ toàn phần và được xác định bằng phương pháp chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1N. - Lấy thịt của 30 qủa đem nghiền kỹ (xay bằng máy xay sinh tố), sau đó lọc qua vải mỏng để lấy nước qủa dùng để xác định dộ acid, đường tổng số và hàm lượng vitamin C. - Lấy 10 ml nước qủa vừa lọc chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N, dùng dung dịch phenoltalein 1% làm chất chỉ thị. Chuẩn dộ kết thúc khi dung dịch nước quả chuyển sang màu hồng nhạt ổn định trong vài phút. - Độ acid được tính với đơn vị là mg acid citric khan/100 ml nước qủa theo công thức sau: m = VNaOH . 193/3 Trong đó: m: lượng acid citric khan có trong 100 ml nước qủa (mg/100ml) VNaOH: thể tích dung dịch NaOH dùng chuẩn độ (ml) 193: khối lượng phân tử của acid citric 3: hệ số đương lượng - Độ acid là kết qủa trung bình của 2 lần lặp lại. Hình 7: Khúc xạ kế MR10ATC của hãng MILKAUKEE (Đức) Trang 33 2.3.2.5. Hàm lượng vitamin C: Hàm lượng vitamin C được đo trên máy sắc ký lỏng cao áp HPLC hiệu AGILENT 1100 ở λ = 254nm, RT = 4.573nm 2.3.2.6. Định lượng đường (fructose, glucose, saccharose): 2.3.2.6.1. Phương pháp: Các loại đường được chiết bằng nước cất. Sau đó, làm sạch dịch chiết và định lượng các loại đường trên máy HPLC. Chương trình chạy của máy HPLC: - Thành phần dung môi rửa giải (pha động): 15% H2O + 85% ACN. - Cột sắc ký (pha tĩnh): Water Spherisorb S5 NH2 - Tốc độ dòng: 0.25 ml/phút. - Đầu dò đo chỉ số khúc xạ: RID (Refractive Index Detector) Xây dựng đường chuẩn: Lần lượt tiêm vào máy HPLC các dung dịch chuẩn chứa 3 loại đường chuẩn: fructose, glucose, saccharose có nồng độ thay đổi từ 0.1 mg/ml đến 1 mg/ml. Đo các diện tích hấp thu và vẽ đường chuẩn: Bảng 2: Số liệu của đường chuẩn fructose Nồng độ (mg/ml) 0.1 0.3 0.5 1 Hình 8: Máy HPLC AGILENT 1100 Trang 34 fructose y = 665574x + 1701.3 R2 = 0.9999 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 0 0.5 1 1.5 fructose Linear (fructose) glucose y = 639231x + 3743.6 R2 = 0.9997 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 0 0.5 1 1.5 glucose Linear (glucose) Diện tích mũi fructose 67628 199834 337779 666155 Hình 9: Đường chuẩn của đường fructose Bảng 3: Số liệu của đường chuẩn glucose Nồng độ (mg/ml) 0.1 0.3 0.5 1 Diện tích mũi glucose 66021 193237 329508 640748 Hình 10: Đường chuẩn của đường glucose Bảng 4: Số liệu của đường chuẩn saccharose Nồng độ (mg/ml) 0.1 0.3 0.5 1 Trang 35 saccharose y = 693930x + 1431.8 R2 = 0.9999 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 0 0.5 1 1.5 succarose Linear (succarose) Diện tích mũi saccharose 67734 210842 352237 693382 Hình 11: Đường chuẩn của đường saccharose 2.3.2.6.2. Tính toán kết quả: Hệ số pha loãng k 5.12 20 25 5.0 5 =×=k Dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính của mỗi loại đường ta có công thức tính nồng độ theo bảng sau: Loại đường Nồng độ đường (mg/ml) Glucose 639231 6.3743− = y x Fructose 665574 3.1710− = y x Saccharose 693930 8.1431− = y x Ứùng với mỗi loại đường ta có: Trang 36 % đường có trong 10g mẫu x xkx ×= × ××× = × ××× = 25.6 100010 100505.12 100010 10050% (%) Trong đó k: hệ số pha loãng. 1000: hệ số chuyển đổi g ra mg. 100: hệ số chuyển thành %. 10: khối lượng mẫu (g). 50: thể tích dịch chiết ban đầu (ml). % đường tổng số: % = %fructose + %glucose + %saccharose 2.3.2.6.3. Cách tiến hành: - Xay nhỏ mẫu cần phân tích trên máy xay sinh tố, lấy 10g mẫu cho vào erlen, thêm 25 ml nước lắc đều, để yên trong 30 phút. Sau đó, lọc gạn trên phễu thủy tinh, tráng bằng 15 ml nước. Lấy dịch lọc định mức lên 50 ml, hút 20 ml dung dịch sau định mức vào bình định mức 25 ml, thêm 0.5 ml dung dịch caress 1 (Zn(AcO)2) lắc đều và thêm tiếp 0.5 ml dung dịch caress 2 (K4Fe(CN)6), lắc đều và định mức lên 25ml. Sau đó lọc khô (lọc bằng giấy lọc khô và bỏ đi 3ml dịch lọc đầu). - Lấy 0.5 ml dịch lọc, 1 ml nước và acetonitril thành 5ml. Đây là dung dịch để tiêm vào máy sắc ký HPLC. 2.3.2.7. Định lượng tinh bột: 2.3.2.7.1. Nguyên tắc: Thủy phân hoàn toàn tinh bột thành glucose, sau đó xác định lượng glucose tạo thành và nhân với hệ số 0,9 cho ra hàm lượng tinh bột. (C6H10O5)n + nH2O nC6H10O5 162,1.n 18.n 180,12.n Trang 37 9,0 12,180 1,162 ==F 2.3.2.7.2. Tính kết quả: Hệ số pha loãng 50 5 25 5.0 5 =×=k % tinh bột có trong 5g mẫu x xkx ×= ×××× = × ×××× = 180 5000 1009.020050 10005 1009.0200% (%) Trong đó. x: nồng độ dung dịch glucose tiêm vào máy (mg/ml) 639231 6.3743− = y x y: diện tích mũi glucose k: hệ số pha loãng 0.9: hệ số quy chuyển glucose thành tinh bột (F) 100: hệ số chuyển thành % 1000: hệ số chuyển đổi g ra mg 200: thể tích dung dịch sau thủy phân (ml) 10: khối lượng mẫu lấy (g) 2.3.2.7.3. Cách tiến hành: - Xay nhỏ mẫu cần phân tích trên máy xay sinh tố, cân chính xác 5g mẫu cho vào erlen 100 ml, thêm 10ml dung dịch đệm ammoni oxalat, đổ nước tới vạch 100 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút. Sau đó, lọc qua giấy lọc, rửa sạch. Cặn thu được cho vào erlen 100 ml thêm vào đó 100 ml HCl 13%. Đậy kín bình bằng nút cao su, lắp ống sinh hàn đun hoàn lưu trong 3 giờ. Để biết tinh bột thủy phân hết hay chưa ta dùng iod để thử. Trang 38 - Sau khi tinh bột đã thủy phân hoàn toàn, làm lạnh dung dịch, trung hòa hỗn hợp bằng NaOH đến pH=5. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức và dùng nước cất định mức lên 200 ml. Sau đó rút 5ml từ dung dịch trên định mức lên 25ml. - Lấy 0.5 ml dịch lọc và acetonitril thành 5ml. Đây là dung dịch để tiêm vào máy sắc ký HPLC để định lượng đường glucose. 2.3.2.8. Đánh giá cấp độ thối trái: Cấp độ thối trái được đánh giá theo thang điểm từ 0 đến 5, trong đó: 0: không có trái bị thối 1: lượng trái bị thối ít hơn 5% 2 : lượng trái bị thối trong khoảng từ 5% - 10% 3 : lượng trái bị thối trong khoảng từ 10% - 20% 4 : lượng trái bị thối trong khoảng từ 20% - 30% 5 : lượng trái bị thối nhiều hơn 30%