Nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen

h­: - ChÞu chÊt diÖt cá Ng­êi ta dïng gen tæng hîp EPSP chuyÓn vµo c©y trång ®Ó chÞu ®­îc Glyphosphat. NhiÒu loµi thùc vËt ®· biÕn n¹p vµ ®ang ®­îc thö nghiÖm nh­ cñ c¶i ®­êng, ®Ëu t­¬ng, nho. c¶i h¹t dÇu, b«ng, cµ chua vµ thuèc l¸. C©y ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen chÞu thuèc diÖt cá khèng chÕ cá d¹i tèt h¬n, gãp phÇn n©ng cao hiÖu qu¶ cña c¸c trang tr¹i nhê tèi ­u ho¸ n¨ng suÊt vµ sö dông hiÖu qu¶ ®Êt trång trät, tiÕt kiÖm thêi gian cho n«ng d©n. Gièng míi nµy hoµn toµn gièng c¸c gièng ®Ëu t­¬ng kh¸c vÒ dinh d­ìng, cÊu t¹o vµ ph­¬ng thøc chÕ biÕn thµnh thùc phÈm vµ thøc ¨n gia sóc. §­îc trång nhiÒu ë Achentina, óc, Braxin, Canada, EU, NhËt b¶n, Hµn Quèc, Mexico, Nga, Thôy §iÓn, Mü vµ uruguay. C¶i dÇu chÞu thuèc diÖt cá ®­îc trång t¹i óc, Canada vµ Mü. - Kh¸ng bÖnh virus Ng­êi ta ®ang nghiªn cøu c¸c gen kh¸ng bÖnh virus ë thùc vËt. Ngoµi ra ®ang nghiªn cøu kh¶ n¨ng kh¸ng virus b»ng biÕn n¹p gen tõ ®éng vËt. §u ®ñ ®­îc chuyÓn gen cña virus m· ho¸ cho protein vá cña virus ®èm vßng. Protein nµy t¹o cho c©y kh¶ n¨ng tù b¶o vÖ chèng l¹i bÖnh ®èm vßng. Mét gen tõ nguån bÖnh ®· ®­îc sö dông ®Ó kh¸ng l¹i chÝnh nã. C©y khoai t©y ®· ®­îc chuyÓn gen gióp kh¸ng virus g©y xo¨n l¸, c©y bÝ chuyÓn gen gióp kh¸ng virus g©y bÖnh. - Kh¸ng c¸c loµi g©y h¹i ChuyÓn gen ®éc tè tõ Bacillus thuringiensis (Bt) ®Ó t¹o gièng chÞu c«n trïng cã h¹i. C©y b«ng chuyÓn gen Bt kh¸ng s©u ®ôc qu¶ vµ ¨n l¸, ®­îc trång phæ biÕn ë nhiÒu n­íc nh­ Trung quèc, Nam phi, Achentina,... C¸c c©y b«ng, lóa mang gen chuyÓn nµy cã kh¶ n¨ng chèng chÞu s©u ®ôc th©n rÊt tèt. - Chèng chÞu c¸c bÖnh nÊm Ng­êi ta ®ang ph©n lËp gen 1,3-glucanase (m· hãa enzym ph©n hñy thµnh tÕ bµo cña c¸c mÇm bÖnh nÊm) tõ thùc vËt kh¸ng bÖnh ®Ó chuyÓn vµo c¸c loµi c©y mÉn c¶m. - Thay ®æi thµnh c¸c axit bÐo Ng­êi ta lµm t¨ng hµm l­îng axit bÐo ®¬n kh«ng no vµ c¸c thµnh phÇn dÇu thùc vËt. C©y ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen axit oleic cã hµm l­îng axit oleic cao, mét axit bÐo cã mét liªn kÕt kh«ng no. Theo c¸c nhµ dinh d­ìng th× chÊt bÐo kh«ng no ®­îc xem lµ tèt h¬n so víi chÊt bÐo no, ®­îc t×m thÊy ë thÞt bß, lîn, phomat vµ mét sè thøc ¨n th­êng ngµy kh¸c. C¶i dÇu chuyÓn gen cã hµm l­îng Laurate cao, ®­îc dïng trong c«ng nghiÖp thùc phÈm ®Ó lµm líp phñ ngoµi kÑo chocolate, b¸nh ngät, líp kem, b¬, ®­îc trång ë Canada vµ Mü. C¶i dÇu cã hµm l­îng axit oleic cao ®­îc trång ë Canada. - Lµm chËm chÝn qu¶ ë cµ chua C©y cµ chua mang mét gen chuyÓn lµm chËm qu¸ tr×nh lµm mÒm qu¶ tù nhiªn khi qu¶ chÝn. §©y lµ lo¹i thùc phÈm chuyÓn gen ®Çu tiª n ®­îc s¶n xuÊt ë c¸c n­íc ph¸t triÓn. Gièng cµ chua nµy cã thêi gian l­u trªn gi¸ b¸n hµng dµi h¬n. Ngoµi ra gièng chuyÓn gen cã c¸c ®Æc tÝnh nh­: - §iÒu chØnh sinh tæng hîp tinh bét ®Ó lµm chñ møc tinh bét trong s¶n phÈm. - C¶i thiÖn chÊt l­îng ®¹m tÝch lòy trong h¹t. - T¨ng hµm l­îng vitamin A trong h¹t g¹o, [7]. ë n­íc ta, mét sè phßng thÝ nghiÖm lín ®· vµ ®ang ®i s©u vµo c«ng t¸c c¶i thiÖn gièng c©y trång b»ng kü thuËt chuyÓn gen. T¹i phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, c¸c b­íc c¬ b¶n trong giai ®o¹n chuÈn bÞ ®· ®­îc thùc hiÖn. §ã lµ: Thu thËp vµ cÊt gi÷ c¸c nguån gen cã gi¸ trÞ nh­ gen CryIA(b), CryIA(c), gen øc chÕ tryspin ®Ó trõ s©u, gen Xa21 chèng b¹c l¸ vi khuÈn, gen chÞu l¹nh, gen protein giµu tryptopha. ThiÕt kÕ c¸c vector mang gen chuyÓn vµ thö nghiÖm thµnh c«ng c¸c kü thuËt chuyÓn gen: gi¸n tiÕp th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens, trùc tiÕp b»ng sóng b¾n gen. §Õn nay, nhiÒu dßng lóa chuyÓn gen Xa21, CryIA(c), ®u ®ñ chuyÓn gen chÝn chËm vµ kh¸ng virus ®èm vßng ®· ®­îc t¹o ra. C¸c dßng c©y chuyÓn gen nµy sÏ ®­îc ®­a vµo ph©n tÝch ph©n tö ChuÈn bÞ thiÕt bÞ ®Ó tiÕn hµnh c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö phôc vô viÖc ®¸nh gi¸ theo dâi c©y chuyÓn gen nh­ PCR, lai Southern, RFLP, AFPD. Nh­ vËy, cã thÓ tiÕn hµnh chuyÓn gen vµ ®­a kü thuËt nµy vµo c«ng viÖc t¹o gièng c©y trång ë ViÖt Nam [1]. 1.2. C¸c kü thuËt Ph©n tÝch ph©n tö ADN c©y chuyÓn gen Cïng víi c¸c ph©n tÝch vµ ®¸nh gi¸ sù biÓu hiÖn cña gen chuyÓn ë c¸c c©y chuyÓn gen nh­ c¸c chØ tiªu ho¸ sinh, n«ng sinh, møc ®é kh¸ng s©u bÖnh, chèng chÞu c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh v.v., ph©n tÝch gen chuyÓn ë møc ph©n tö còng ®­îc tiÕn hµnh song song b»ng nhiÒu kü thuËt kh¸c nhau nh­ PCR, lai Southern, Western blost. Chóng t«i xin giíi thiÖu hai kü thuËt c¬ b¶n vµ quan träng ®Ó ph©n tÝch ph©n tö c©y chuyÓn gen lµ PCR vµ lai Southern. 1.2.1. Kü thuËt PCR Ph­¬ng ph¸p PCR (Polymerase Chain Reaction - ph¶n øng chuçi trïng hîp) do Karl Mullis vµ céng sù ph¸t minh n¨m 1985. Thùc chÊt ®©y lµ mét ph­¬ng ph¸p t¹o dßng ADN invitro kh«ng cÇn cã sù hiÖn diÖn cña tÕ bµo [5], [6]. 1.2.1.1. Nguyªn t¾c cña ph¶n øng PCR TÊt c¶ c¸c ADN polymeraza khi ho¹t ®éng tæng hîp mét m¹ch ADN míi tõ m¹ch khu«n ®Òu cÇn sù hiÖn diÖn cña nh÷ng ®o¹n måi. Måi lµ nh÷ng ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ xung víi mét ®Çu cña m¹ch khu«n tõ ®ã ADN polymeraza sÏ g¾n c¸c dNTP tù do ®Ó nèi dµi ®o¹n måi, h×nh thµnh m¹ch míi. Do ®ã, nÕu ta cung cÊp hai ®o¹n måi ®ÆchiÖu b¾t cÆp bæ xung víi 2 ®Çu cña mét tr×nh tù ADN (måi xu«i vµ måi ng­îc) ta sÏ tæng hîp ®o¹n ADN n»m gi÷a 2 måi ®ã [5], [9]. 1.2.1.2. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR: Thµnh phÇn cña mét ph¶n øng PCR bao gåm ADN khu«n tøc lµ ®o¹n tr×nh tù ADN cÇn ®­îc nh©n lªn; 2 ®o¹n måi, mçi måi dµi 18-24 nucleotid; ADN polymeraza (th­êng hiÖn nay sö dông lµ Taq polymeraza - lµ mét lo¹i enzym chÞu nhiÖt); bèn lo¹i deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) vµ dung dÞch ®Öm vµ ion Mg2+ [12]. Ph¶n øng PCR tèi ­u khi ADN khu«n tinh s¹ch, nh­ng mét ­u ®iÓm lín cña ph­¬ng ph¸p PCR lµ cho phÐp nh©n c¶ nh÷ng mÉu ADN kh«ng ®­îc b¶o qu¶n tèt, ®· bÞ ph¸ huû tõng phÇn nh­ nh÷ng vÕt m¸u ®Ó l©u ngµy, tinh dÞch ®· kh«, ho¸ th¹ch, tãc, mãng tay cña ng­êi ®· chÕt... Måi lµ chØ tiªu quan träng nhÊt ®Ó ®¹t ®­îc mét sù khuyÕch ®¹i mét ®o¹n ADN ®Æc tr­ng. Måi lu«n g¾n víi ADN khu«n ë ®Çu 3’ vµ ADN Polymeraza kÐo dµi chuçi tæng hîp theo chiÒu 5’ ® 3’ [5]. Tr×nh tù måi, nhiÖt ®é g¾n måi vµ nång ®é trong ph¶n øng PCR lµ nh÷ng nh©n tè quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña ph¶n øng PCR. ViÖc chän måi còng ph¶i tu©n thñ mét sè nguyªn t¾c sau: Tr×nh tù cña måi ®­îc chän sao cho kh«ng cã sù b¾t cÆp bæ sung gi÷a måi “xu«i” vµ måi “ng­îc”, vµ còng kh«ng cã nh÷ng cÊu tróc “kÑp tãc” do sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a c¸c phÇn kh¸c nhau cña mét måi. Tm cña måi xu«i vµ måi ng­îc kh«ng c¸ch biÖt nhau mét c¸ch qu¸ xa. C«ng thøc nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm=81,5 + 16,6(log10[J+] + 0,41(%G+C) - (600/I) - 0,63(% FA) Trong ®ã [J+] : Nång ®é c¸c cation ho¸ trÞ 1 FA : ChÊt dïng g©y biÕn tÝnh ADN I : ChiÒu dµi måi C¸c måi chän ph¶i ®Æc tr­ng cho tr×nh tù ADN cÇn khuyÕch ®¹i kh«ng trïng víi c¸c tr×nh tù lÆp l¹i trªn gen. Tr×nh tù n»m gi÷a 2 måi kh«ng qu¸ lín. Ph¶n øng PCR sÏ tèi ­u nÕu ®o¹n tr×nh tù nhá h¬n 1kb [5], [12]. Tr­íc ®©y trong ph¶n øng PCR ng­êi ta th­êng dïng ADN polymeraza I t¸ch chiÕt tõ E. coli vµ ADN polymeraza cña Phage T4. V× ®©y lµ enzyme kh«ng chÞu nhiÖt nªn thao t¸c phøc t¹p vµ hiÖu qu¶ thÊp (ph¶i thªm enzyme míi vµo sau mçi lÇn biÕn tÝnh v× enzyme cò ®· bÞ nhiÖt ph©n huû). ViÖc ph¸t hiÖn ra c¸c ADN polymeraza chÞu nhiÖt nh­ Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza, ®· cho phÐp qu¸ tr×nh nh©n b¶n ®­îc thùc hiÖn mét c¸ch tù ®éng ho¸. Th«ng dông nhÊt lµ Taq Polymerse ®­îc t¸ch ra tõ vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus sèng ë suèi n­íc nãng 94-1000C. Enzym nµy cã ho¹t tÝnh cao nhÊt ë nhiÖt ®é 70-800C, cã träng l­îng ph©n tö lµ 94kD, gåm 832 axit amin do gen cã 2499 cÆp baz¬ tæng hîp nªn [28]. N¨m 1988, Saiki ®· chØ ra r»ng ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza gi¶m 50% sau 130 phót ë nhiÖt ®é 92,50C, sau 40 phót ë 950C vµ sau 5-6 phót ë 970C. MÆt kh¸c, nång ®é ion Mg2+ vµ d NTP trong hçn hîp ph¶n øng còng ¶nh h­ëng rÊt nhiÒu ®Õn ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza [14], [28]. Ngµy nay, nhiÒu enzym polymeraza chÞu nhiÖt kh¸c ®· ®­îc ®­a ra thÞ tr­êng víi nhiÒu chøc n¨ng chuyªn biÖt hay hoµn thiÖn h¬n. Tth pal lµ mét enzyme t¸ch tõ Thermus thermophilus cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh­ mét enzyme phiªn m· ng­îc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ Mg2+ , mÆt kh¸c Tth pal l¹i xóc t¸c ph¶n øng khuyÕch ®¹i ADN nÕu trong m«i tr­êng cã ADN khu«n vµ Mg2+. Bèn lo¹i nucleotit th­êng ®­îc sö dông ë nång ®é lµ 20 – 200 mM/mçi lo¹i nucleotit, nÕu sù mÊt c©n b¨ng trong thµnh phÇn c¸c nucleotit xÈy ra sÏ dÉn tíi c¸c lçi sao chÐp cña ADN polymeraza. Nång ®é ion Mg2+ còng lµ nh©n tè ¶nh h­ëng m¹nh ®Õn ph¶n øng PCR. Tuy nhiªn kh«ng cã mét quy luËt chung cho vÊn ®Ò nµy. Nång ®é tèi ­u ph¶i ®­îc x¸c ®Þnh cho tõng ph¶n øng qua thö nghiÖm. Trong thùc tÕ sè chu kú cña ph¶n øng PCR kh«ng v­ît qu¸ 40 chu kú. Së dÜ nh­ vËy lµ v× ph¶n øng PCR diÔn ra qua 2 giai ®o¹n. Trong giai ®o¹n ®Çu sè l­îng b¶n sao t¨ng theo cÊp sè nh©n tû lÖ víi l­îng mÉu ban ®Çu. Sau ®ã hiÖu qu¶ khuyÕch ®¹i gi¶m do c¸c nguyªn nh©n sau: Ho¹t tÝnh cña polymeraza gi¶m theo thêi gian ë nhiÖt ®é cao Sù c¹n kiÖt c¸c thµnh phÇn cña ph¶n øng. C¸c b¶n sao võa ®­îc tæng hîp kh«ng kÕt hîp víi måi mµ kÕt hîp víi nhau Sù xuÊt hiÖn cña c¸c s¶n phÈm phô øc chÕ ph¶n øng [5]. 1.2.1.3. C¸c b­íc cña ph¶n øng PCR Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n sau: Giai ®o¹n 1: BiÕn tÝnh ADN ë nhiÖt ®é tõ 94-950C trong thêi gian ng¾n 30 gi©y ®Õn 1 phót. §©y lµ giai ®o¹n m¹ch ®«i t¸ch thµnh 2 m¹ch ®¬n. Giai ®o¹n 2: G¾n måi, nhiÖt ®é ®­îc h¹ thÊp (thÊp h¬n Tm cña måi) cho phÐp c¸c måi b¾t cÆp víi khu«n. NhiÖt ®é nµy dao ®éng tõ 40-600C tuú thuéc vµo Tm cña måi mµ thêi gian b¾t cÆp kh¸c nhau. §©y lµ giai ®o¹n quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Giai ®o¹n 3: Giai ®o¹n kÐo dµi. NhiÖt ®é t¨ng lªn 72 0C. §ã lµ ®iÒu kiÖn ®Ó cho Taq polymeraza ho¹t ®éng tæng hîp kÐo dµi m¹ch theo nguyªn t¾c bæ xung tõ 2 ®Çu sîi khu«n ban ®Çu. Theo Geifand vµ White (1990), tèc ®é tæng hîp cña Taq lµ 150 nucleotit/gi©y ë nhiÖt ®é 75oC - 80oC; 60 nucleotit/gi©y ë 70oC; 24 nucleotit/gi©y ë 55oC; 1,5 nucleotit/gi©y ë 37oC vµ ë nhiÖt ®é 22oC chØ cßn 0,25 nucleotit/gi©y [14]. Sau mét chu kú gåm ba giai ®o¹n nh­ trªn, mét ph©n tö ADN khu«n ®­îc nh©n lªn thµnh hai, c¸c ®o¹n ADN võa ®­îc nh©n trong chu kú l¹i lµm khu«n cho chu kú nh©n b¶n tiÕp theo v× hai ®Çu tËn cïng cña s¶n phÈm bæ sung víi måi. Do ®ã sau mçi chu kú sè l­îng ®o¹n ADN ®­îc tæng hîp sÏ t¨ng lªn gÊp ®«i vµ nh­ vËy sau n chu kú nh©n b¶n sÏ t¹o ra 2n b¶n ADN tõ mét khu«n ban ®Çu [6]. 1.2.1.4. øng dông cña kü thuËt PCR PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch bé genom cña ®éng vËt vµ thùc vËt v× nã cho phÐp t¹o ra mét l­îng lín c¸c ®o¹n tr×nh tù ®Æc hiÖu. PCR cã nhiÒu øng dông vµo c¸c môc ®Ých kh¸c nhau, nh­ viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù cña ADN ®­îc nh©n b¶n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen. ph©n tÝch tiÕn ho¸, ph©n tÝch sù ®a d¹ng di truyÒn ë møc ®é ADN trong vµ gi÷a c¸c quÇn thÓ. HiÒn nay PCR ®­îc xem lµ mét ph­¬ng ph¸p nhanh vµ t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n ®Ó ph©n tÝch s¬ bé c©y chuyÓn gen [1]. 1.2.2. Kü thuËt lai Southern vµ øng dông 1.2.2.1. Nguyªn lý cña lai Southern Kü thuËt lai ph©n tö (molecular hybridization) nãi chung vµ lai Southern nãi riªng dùa trªn nguyªn lý lµ lai ph©n tö gi÷a mÉu dß ADN (ARN) víi c¸c ph©n tö ADN (ARN, protein) ®­îc l­u gi÷ trªn gi¸ thÓ ®Ó dß t×m c¸c ph©n tö sinh häc ®Æc tr­ng. Kü thuËt nµy cã hiÖu qu¶ cao trong nghiªn cøu ph¸t hiÖn c¸c ®¹i ph©n tö sinh häc cã cÊu tróc ph©n tö phøc t¹p. Nã cã thÓ ¸p dông cho mäi lo¹i ®¹i ph©n tö sinh häc cã kh¶ n¨ng g¾n kÕt vµo gi¸ thÓ l­u gi÷ nh­ mµng nitrocellulose, mµng nylon, mµng giÊy cellulose, nh­ng vÉn duy tr× ®­îc kh¶ n¨ng g¾n kÕt víi c¸c nhãm chÊt hiÓn thÞ kh¸c [1]. §èi víi ADN, ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc Edwind M. Southern x©y dùng vµ thö nghiÖm thµnh c«ng vµo n¨m 1975. ë ®©y, qu¸ tr×nh lai ph©n tö x¶y ra khi hai ®o¹n m¹ch ®¬n ADN b¾t cÆp vµ g¾n kÕt víi nhau trªn nguyªn t¾c bæ xung cho nhau. C¸c b­íc tiÕn hµnh trong kü thuËt nµy cã thÓ ®­îc tãm t¾t nh­ sau: ADN bé gen ®­îc c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n cã kÝch th­íc kh¸c nhau b»ng mét hay nhiÒu enzym giíi h¹n (RE) vµ ®­îc ph©n t¸ch b»ng ®iÖn di trªn b¶n gel. ADN ®­îc biÕn tÝnh ngay trªn b¶n gel råi ®­îc thÊm truyÒn lªn mµng lai. Trong qu¸ tr×nh thÊm truyÒn vÞ trÝ c¸c ®o¹n ADN trªn mµng lai ®­îc gi÷ nguyªn nh­ trªn b¶n gel. ADN cè ®Þnh trªn mµng ®­îc ®em lai víi mÉu dß ADN cã ®¸nh dÊu b»ng phãng x¹ hoÆc ho¸ häc . Sau qu¸ tr×nh lai ng­êi ta röa mµng lai ®Ó lo¹i bá c¸c mÉu dß kh«ng b¾t cÆp. Cuèi cïng ng­êi ta dïng kü thuËt phãng x¹ hoÆc ho¸ häc tù ghi ®Ó ®Þnh vÞ c¸c ph©n tö lai vµ hiÓn thÞ trªn phim thµnh tõng b¨ng d¹ng v¹ch ngang. Kü thuËt nµy ®­îc gäi lµ kü thuËt ph©n tÝch mµng thÊm chuyÓn Southern (Southern blot analysis), gäi t¾t lµ lai Southern [1], [5]. Khi øng dông lai Southern ®èi víi c¸c ARN, kü thuËt nµy ®­îc ®Æt tªn lµ lai Northern. B­íc ph¸t hiÖn c¸c b¨ng ARN ®­îc tiÕn hµnh th«ng qua lai víi mÉu ADN hoÆc ARN ®¸nh dÊu. Cßn khi tiÕn hµnh kü thuËt nµy víi protein th× gäi lµ lai Western ®Ó ph¸t hiÖn c¸c b¨ng protien b»ng kh¸ng thÓ ®¸nh dÊu. Tíi nay ®· cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p c¶i tiÕn, h×nh thµnh nhiÒu kü thuËt phèi hîp nh­ Southwestern, ph¸t hiÖn b¨ng protein b»ng ADN ®¸nh dÊu hoÆc Western xa, dïng mÉu protein kh«ng ph¶i kh¸ng thÓ (non-antibody) [5]. VÒ nguyªn t¾c, kü thuËt thÊm chuyÓn kh«ng thay ®æi nhiÒu tõ khi ®­îc ph¸t minh, nh­ng chñng lo¹i c¸c mµng vµ kü thuËt ph¸t hiÖn c¸c lo¹i ®¹i ph©n tö th«ng qua lai ®¸nh dÊu hay miÔn dÞch ®¸nh dÊu kÌm víi c¸c bé kit lu«n ®­îc c¶i tiÕn cho tiÖn lîi vµ an toµn. Mµng nitrocellulose ®­îc dïng rÊt nhiÒu, nh­ng gÇn ®©y trong hai lo¹i mµng nylon trung tÝnh vµ mµng tÝch ®iÖn th× lo¹i mµng sau do tÝch ®iÖn nªn cã søc g¾n ADN cao h¬n. §­¬ng nhiªn trong kü thuËt Western, chÊt liÖu nitrocellulose vÉn ®ang ®­îc sö dông réng r·i, ngoµi ra cßn cã mµng polyvinylidene diflouride (PVDF) vµ mµng nylon [6]. ViÖc ph¸t hiÖn c¸c ph©n tö trªn mµng ®­îc tiÕn hµnh th«ng qua kü thuËt ®¸nh dÊu. Trong nhiÒu n¨m kü thuËt ®¸nh dÊu b»ng ®ång vÞ phãng x¹ ®· ®­îc øng dông mét c¸ch réng r·i, phæ biÕn nhÊt lµ g¾n c¸c nucleotide víi c¸c ®ång vÞ phãng x¹ 32P d¹ng 32P-dNTP. ¦u ®iÓm lín cña ph­¬ng ph¸p phãng x¹ nµy lµ cã ®é nh¹y rÊt cao, cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc vÕt ADN ë møc ng (10-9 g) vµ thÊp h¬n. Tuy nhiªn ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu phãng x¹ ®ßi hái phßng thÝ nghiÖm cã nh÷ng thiÕt bÞ kiÓm tra vµ b¶o ®¶m an toµn phãng x¹ ®ång bé. Nh÷ng n¨m gÇn ®©y kü thuËt phi phãng x¹ (non-radioactive) hay kü thuËt ®¸nh dÊu l¹nh (cold labelling) ®ang tõng b­íc thay thÕ kü thuËt phãng x¹. Trong ®ã næi bËt lµ kü thuËt ph¸t quang ho¸ häc kÝch ho¹t (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) vµ kü thuËt sö dông ®¸nh dÊu víi digoxigenin (DIG) [1]. 1.2.2.2. HÖ thèng phi phãng x¹ DIG HÖ thèng phi phãng x¹ DIG lµ ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu vµ ph¸t hiÖn axÝt nucleic rÊt nh¹y vµ h÷u hiÖu. HÖ thèng nµy mang nhiÒu tÝnh ­u viÖt nh­ an toµn, mÉu dß ®¸nh dÊu cã ®é bÒn cao vµ dung dÞch lai cã thÓ dïng l¹i vµi lÇn. So víi ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu b»ng chÊt phãng x¹, ph­¬ng ph¸p nµy còng cã thuËn lîi nh­ ®é nh¹y cao vµ ph«ng nÒn s¹ch. Nh­ng l¹i tr¸nh ®­îc nh÷ng bÊt lîi nh­ sù rñi ro trong khi sö dông chÊt phãng x¹, chÊt th¶i ®éc h¹i, thêi gian hiÖn phim l©u, tÝnh kh«ng bÒn cña mÉu dß ®· ®¸nh dÊu. H×nh 1: CÊu tróc cña Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP Trong hÖ thèng DIG, mÉu dß lµ ADN, ARN ®­îc ®¸nh dÊu b»ng c¸ch g¾n víi digoxigenin (DIG). §èi víi mÉu dß lµ ADN, yÕu tè DIG-11-dUTP ®­îc dïng ®Ó ®¸nh dÊu vµ ®­îc g¾n kÕt víi ph©n tö ADN th«ng qua ph¶n øng PCR hay lai víi c¸c ®o¹n nucleotit ngÉu nhiªn (h×nh 1). ë ph­¬ng ph¸p thø nhÊt (h×nh 2a), víi DIG-dUTP cã trong hçn hîp ph¶n øng PCR, s¶n phÈm mÉu dß ®­îc t¹o ra rÊt ®Æc hiÖu vµ cã ®é nh¹y cao. ChØ cÇn 10 pg ®èi víi ADN plasmit hoÆc 10 ng ®èi víi ADN genom lµ ®ñ ®Ó t¹o ra mÉu dß lai Southern. Ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu ADN b»ng PCR ®Æc biÖt thuËn lîi trong dß t×m b¶n gen ®¬n lÎ trªn mµng thÊm genom hay ARN th«ng tin hiÕm trªn mµng thÊm Northern. Trong ph­¬ng ph¸p thø hai (h×nh 2b), enzym Klenow sao chÐp khu«n mÉu ADN víi sù cã mÆt cña c¸c ®o¹n måi 6 nucleotit ngÉu nhiªn, c¸c nucleotit tù do trong ®ã cã DIG-dUTP. Trung b×nh cø 20-25 nucleotit trªn m¹ch ADN míi tæng hîp cã mét ph©n tö DIG g¾n vµo. Nh­ vËy, mÉu dß t¹o ra ®­îc ®¸nh dÊu ®ång ®Òu, rÊt nh¹y, cã thÓ dß t×m ®Ých trong 0.10-0.03 pg ADN. S¶n phÈm mÉu dß lµ tæ hîp cña c¸c ®o¹n cã ®é dµi kh¸c nhau. Kh«ng gièng nh­ ®¸ng dÊu b»ng PCR, ph­¬ng ph¸p nµy ®ái hái ph¶i cã khu«n mÉu ADN rÊt s¹ch. TÝn hiÖu tõ mÉu dß sau khi ®· lai víi axit nucleic trªn mµng ®­îc ph¸t hiÖn nhê kü thuËt ho¸ miÔn dÞch. §ã lµ ph¶n øng liªn kÕt gi÷a kh¸ng thÓ cña Digoxigenin vµ Digoxigenin g¾n trong mÉu dß. TiÕp theo, c¸c ph©n tö liªn kÕt nµy ®­îc nh×n thÊy nhê vµo ph¶n øng víi hîp chÊt t¹o s¾c hoÆc ph¸t quang. C¸c hîp chÊt t¹o s¾c t¹o ra tÝn hiÖu mÇu trùc tiÕp trªn mµng. Cßn c¸c hîp chÊt ph¸t quang cã ®é nh¹y cao th× s¶n sinh ra ¸nh s¸ng r»ng cã thÓ ghi nhËn l¹i trªn phim X-quang gièng nh­ ë ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu b»ng chÊt phãng x¹ 32P hay 35S [16]. DIGG dUTP DIG dUTP DIG DIG DIG + Taq ADN polymeraza + Måi + Klenow a b H×nh 2: C¸c ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÉu cña DIG: a: §¸nh dÊu b»ng PCR, b: §¸nh dÊu b»ng c¸c ®o¹n 6 nucletit ngÉu nhiªn vµ DIG 1.2.2.3. øng dông cña kü thuËt lai Southern Kü thuËt lai Southern lµ mét trong nh÷ng kü thuËt sinh häc ph©n tö rÊt quan träng vµ ®­îc sö dông nhiÒu trong c¸c ph©n tÝch ph©n tö nh­: LËp b¶n ®å giíi h¹n cña mét gen Ph¸t hiÖn c¸c ®a h×nh ®é dµi (fragment polymorphism) cña cïng mét gen ë c¸c chñng kh¸c hay gi÷a c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau qua sù so s¸nh b¶n ®å giíi h¹n gi÷a chóng Ph¸t hiÖn c¸c ®ét biÕn mÊt ®o¹n, ®ét biÕn ®iÓm hay t¸i tæ hîp trªn mét gen v× chóng lµm thay ®æi b¶n ®å giíi h¹n Ph¸t hiÖn sinh vËt chuyÓn gen, ®¸nh gi¸ sè l­îng b¶n gen vµ ®iÓm g¾n cña gen chuyÓn. Trong b¶n luËn v¨n nµy chóng t«i ®i s©u vµo c¸c chi tiÕt tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ph©n tÝch ph©n tö c¸c dßng c©y b«ng chuyÓn gen th«ng qua kü thuËt lai Southern b»ng hÖ thèng DIG [1]. 1.3. nghiªn cøu c¶i t¹o c©y b«ng ë ViÖt Nam 1.3.1. Sù ph¸t triÓn trong s¶n xuÊt vµ nghiªn cøu c¶i t¹o c¸c gièng b«ng ë ViÖt Nam Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, s¶n xuÊt b«ng ë ViÖt Nam kh«ng ngõng t¨ng tr­ëng vÒ diÖn tÝch, n¨ng suÊt vµ s¶n l­îng. §Æc biÖt, trong vô trång b«ng 2001/2002, diÖn tÝch ®¹t xÊp xØ 30.000 ha, cao nhÊt tõ tr­íc ®Õn nay, t¨ng h¬n 20% so víi n¨m 2000 vµ gÊp 3 lÇn so víi c¸c n¨m tõ 1990 ®Õn 1996. §ång thêi s¶n l­îng ®¹t trªn 10.000 tÊn x¬, gÊp 5 lÇn so víi c¸c n¨m tõ 1990 ®Õn 1996. Cã thÓ kh¼ng ®Þnh sù t¨ng tr­ëng kh«ng ngõng vÒ mäi mÆt cña ngµnh b«ng ë n­íc ta trong thêi gian qua cã sù ®ãng gãp quan träng cña c«ng t¸c nghiªn cøu khoa häc, t¹o ®iÒu kiÖn cho s¶n xuÊt b«ng thùc sù ®em l¹i hiÖu qu¶ kinh tÕ cao vµ ®ñ søc c¹nh tranh víi c¸c c©y trång kh¸c trong hÖ thèng n«ng nghiÖp n­íc ta. Trong c¸c thµnh tùu cña c«ng t¸c nghiªn cøu c©y b«ng cã thÓ kÓ ®Õn viÖc x©y dùng ®­îc ng©n hµng gen c©y b«ng gåm h¬n 1.800 mÉu gièng, l­u gi÷ vµ cung cÊp nguån vËt liÖu khëi ®Çu phong phó cho c«ng t¸c gièng. NhiÒu dßng, gièng b«ng thuÇn ®· ®­îc t¹o ra ®Ó lµm bè mÑ cho s¶n xuÊt h¹t gièng lai. Næi bËt lµ tõ n¨m 1995, ®· lai t¹o vµ ®­a vµo s¶n xuÊt thµnh c«ng 3 gièng lai ®¬n F1 (L18, VN20 vµ VN35). C¸c gièng nµy ®Òu cã ­u thÕ lai cao vµ æn ®Þnh, chèng chÞu ®­îc s©u bÖnh h¹i vµ ngo¹i c¶nh bÊt lîi, chÊt l­îng x¬ ®¹t yªu cÇu c«ng nghiÖp dÖt, gãp phÇn t¹o nªn b­íc nh¶y vät vÒ diÖn tÝch, n¨ng suÊt vµ s¶n l­îng. Quy tr×nh s¶n xuÊt h¹t gièng lai ®­îc x©y dùng hoµn thiÖn cho n¨ng suÊt h¹t cao (1,5 tÊn h¹t/ha) víi chÊt l­îng ®¶m b¶o vµ gi¸ thµnh s¶n xuÊt h¹ chØ b»ng mét nöa so víi gi¸ nhËp tõ n­íc ngoµi. Nghiªn cøu sö dông tÝnh bÊt dôc ®ùc cho thµnh c«ng b­íc ®Çu rÊt kh¶ quan gãp phÇn gi¶m ®¸ng kÓ chi phÝ s¶n xuÊt tõ 20% ®Õn 30% t¹o ®iÒu kiÖn t¨ng n¨ng lùc s¶n xuÊt h¹t gièng víi gi¸ thµnh h¹ [3]. 1.3.2. Nghiªn cøu c©y b«ng chuyÓn gen kh¸ng s©u h¹i C©y b«ng chuyÓn gen kh¸ng s©u (b«ng Bt) chøa mét protein do gen CryIA qui ®Þnh cã nguån gèc tõ vi sinh vËt ®Êt tù nhiªn lµ Bacillus thuringiensis (Bt). Protein Bt ®em l¹i cho c©y b«ng kh¶ n¨ng kh¸ng s©u æn ®Þnh. Do tÝnh kh¸ng s©u cao, protein Bt ®· ®­îc sö dông lµm thuèc trõ s©u sinh häc an toµn trong h¬n 40 n¨m qua. Do vËy, ®èi víi c©y b«ng chuyÓn gen Bt th× nhu cÇu sö dông thuèc trõ s©u ®Ó diÖt nh÷ng s©u bÖnh nµy sÏ ®­îc h¹n chÕ hay gi¶m tèi ®a. Ngoµi ra, c©y b«ng Bt còng lµm gi¶m sù nhiÔm ®éc do nÊm trªn nh÷ng vÕt th­¬ng hë g©y nªn. Víi nh÷ng lîi Ých thùc tiÔn, c©y b«ng Bt ®· nhanh chãng ®­îc sö dông vµ mang l¹i lîi Ých to lín ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi. T¹i Trung Quèc, trång b«ng Bt ®· lµm t¨ng gÊp ®«i thu nhËp so víi viÖc trång c©y b«ng th­êng. Nh÷ng n«ng d©n trång nh÷ng gièng b«ng nµy gi¶m ®­îc 20-23% chi phÝ s¶n xuÊt so víi nh÷ng gièng b«ng kh«ng ph¶i lµ c©y b«ng Bt. Sö dông b«ng Bt còng lµm gi¶m l­îng thuèc trõ s©u kho¶ng 47 kg/ha. ë Nam Phi, diÖn tÝch trång b«ng kho¶ng trªn 80.000 ha vµ hµng n¨m bÞ thiÖt h¹i ®¸ng kÓ do s©u bÖnh g©y nªn. Tõ n¨m 1997, ngµy cµng nhiÒu n«ng d©n lùa chän viÖc trång b«ng Bt do lîi Ých nh­ t¨ng n¨ng suÊt vµ gi¶m l­îng thuèc trõ s©u. N¨m 1998-1999, diÖn tÝch trång b«ng Bt lµ 200 ha, n¨m 1999-2000 lªn tíi 789 ha vµ n¨m 2000-2001 lµ 1250 ha. ViÖc trång b«ng Bt ë Achentina còng ®em l¹i nh÷ng lîi Ých t­¬ng tù cho nh÷ng ng­êi n«ng d©n ®Þa ph­¬ng. Trong mïa 1999-2000, lîi nhuËn t¨ng tíi 65,05 ®« la/ha. §iÒu nµy cã ®­îc lµ do t¨ng s¶n l­îng, c¶i thiÖn chÊt l­îng vµ tiÕt kiÖm ®­îc chi phÝ sö dông thuèc trõ s©u. C¸c nghiªn cøu thùc ®Þa ë ch©u ¸ ®Òu kh¼ng ®Þnh nh÷ng lîi Ých cña trång b«ng Bt. Ch¼ng h¹n, ë In®«nªxia, gièng b«ng Bt ­u viÖt h¬n c¸c gièng b«ng ®Þa ph­¬ng ë tÊt c¶ 15 ®Þa ®iÓm ®­îc kiÓm tra vµ hiªn nay ®ang ®­îc trång réng r·i ë Nam Sulawesi. Ngoµi ra c¸c nghiªn cøu ë Ên §é, Philipin còng cho nh÷ng kÕt qu¶ t­¬ng tù [7]. Tõ nh÷ng kinh nghiÖm vÒ b«ng Bt ë Trung Quèc, Nam Phi vµ Achentina, nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ë ViÖt Nam, c¸c c¸n bé ngµnh b«ng ®· chó träng thu thËp, trao ®æi c¸c nguån gièng kh¸ng ®­îc mét sè lo¹i s©u h¹i chÝnh ë trong n­íc. TÊt c¶ c¸c dßng b«ng nµy ®Òu thuéc loµi b«ng luåi (Gosipium hirsutum L.) lµ loµi b«ng trång trät chÝnh t¹i ViÖt Nam. C¸c dßng nµy ®­îc ®¸nh gi¸ lµ kh¸ng ®­îc s©u xanh (Helicoverpa armigera) vµ s©u hång (Spodoptera gossypiella), hai lo¹i s©u h¹i b«ng nguy hiÓm nhÊt ë trong n­íc. Trªn c¬ së nguån vËt liÖu ban ®Çu nh­ trªn, c¸c c¸n bé khoa häc ®· tiÕn hµnh lai nh÷ng dßng b«ng kh¸ng s©u víi gièng trong n­íc vµ ®· chän läc ra ®­îc mét sè dßng cã biÓu hiÖn kh¸ng s©u hång vµ s©u xanh ë ngoµi ®ång ruéng. GÇn ®©y ®· ®­a vµo s¶n xuÊt thö nghiÖm c¸c dßng b«ng lai kh¸ng s©u cña ViÖt Nam nh­ VN15, VN01-4, VN01-2 trong ®iÒu kiÖn mËt ®é s©u cao vÉn cho n¨ng suÊt cao h¬n c¸c gièng lai F1 thÕ hÖ tr­íc. Chóng cã thÓ trång ®­îc ë c¸c vô, vïng cã ¸p lùc s©u lín [2]. §Ó ph©n tÝch c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ë møc ®é ph©n tö, chóng t«i sö dông kü thuËt PCR vµ lai Southern kiÓm tra sù cã mÆt cña gen CryIA vµ ®¸nh gi¸ sè l­îng c¸c ®iÓm g¾n kÕt vµ b¶n gen chuyÓn trong c¸c dßng b«ng nµy. Qua ®ã, cã thÓ t×m hiÓu mèi liªn quan gi÷a sè l­îng c¸c b¶n gen chuyÓn nÕu cã vµ møc kh¸ng s©u cña c©y b«ng. KÕt qu¶ cña nh÷ng thùc nghiÖm nµy cã ý nghÜa to lín trong viÖc hoµn thiÖn quy tr×nh lai Southern vµ n¾m v÷ng c¸c thao t¸c kü thuËt. §©y lµ b­íc ®Çu trong qu¸ tr×nh ph©n tÝch hµng lo¹t c¸c dßng chuyÓn gen kh¸c nhau mµ phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, viÖn C«ng nghÖ Sinh häc ®· t¹o ra trong thêi gian qua vµ trong t­¬ng lai. Dông cô t¸ch chiÕt ADN: Cèi, chµy sø (nÕu kh«ng cã dïng chÐn vµ ®òa thñy tinh): sè l­îng b»ng hoÆc h¬n l­îng mÉu cÇn t¸ch ADN. H20: n­íc cÊt khö trïng 2 lÇn vµ ®· ®­îc lo¹i ion (deion). CÇn 500ml dïng dÇn. èng effpendox khö trïng 1.5ml giÊy thÊm khö trïng II. Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè ADN tæng sè ®­îc t¸ch tõ l¸ mÇm hay l¸ non cña c©y b«ng tr­ëng thµnh. PCR vµ lai Southern lµ hai kü thuËt ®­îc sö dông ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch ph©n tö gen chuyÓn CryIA ë c¸c c©y b«ng kh¸ng s©u. C¸c ho¸ chÊt, dung dÞch cÇn chuÈn bÞ, thiÕt bÞ sö dông vµ quy tr×nh tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm liªn quan ®­îc nªu chi tiÕt ë d­íi ®©y. 2.2.1. T¸ch chiÕt ADN tõ l¸ b«ng 2.2.1.1. Ho¸ chÊt, dung dÞch vµ thiÕt bÞ Ho¸ chÊt: Tris-HCl; NaCl; EDTA-Na2; Sorbitol; CTAB; Sodium bisulfite (NaH2PO4); Chloroform; Isomylalcohol; Isopropanol ; Ethanol; ARN-ase vµ n­íc cÊt hai lÇn khö ion. C¸c dung dÞch mÑ: 1M Tris-HCl, pH 8.0; 5M NaCl; 0,5 EDTA-Na2; Sorbitol 2M; Chloroform isomylalcohol (CIA 24:1); Isopropanol l¹nh (-20oC); Ethanol 70%; TE ( 10 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA, pH 8,0). C¸c dung dÞch t¸ch chiÕt ADN: bao gåm dung dÞch ®Öm röa vµ ®Öm chiÕt cã c¸c thµnh phÇn vµ nång ®é ®­îc nªu ë b¶ng 2 vµ 3. B¶ng 2: Dung dÞch ®Öm röa STT Dung dÞch mÑ Nång ®é pha cuèi cïng ThÓ tÝch 10 ml 1 1M Tris HCl, pH8,0 100 mM 1 ml 2 0,5 M EDTA, pH8,0 5 mM 100 ml 3 2 M Sorbitol 0,35 M 1,75 ml 4 Sodiumbisulfite (NaH2PO4) 0,4% 0,04 g 5 H2O - 8.15 ml B¶ng 3: Dung dÞch ®Öm chiÕt STT Dung dÞch mÑ Nång ®é pha cuèi cïng ThÓ tÝch 10 ml 1 1M Tris HCl, pH8,0 200 mM 2 ml 2 0,5 M EDTA, pH8,0 50 mM 1 ml 3 CTAB 2 % 0,2 g 4 5M NaCl 2 M 4 ml 5 H2O - 6 ml ThiÕt bÞ: Nåi æn nhiÖt; m¸y ly t©m (Sigma), m¸y ®iÖn di (Biorad); m¸y soi gel (Gel Doc-Pharmacia), m¸y chôp ¶nh (Poloriod). 2.2.1.2. Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN Thu l¸ vµ b¶o qu¶n l¸ b«ng Nh÷ng h¹t b«ng ch¾c, ®Òu ®­îc ®Æt trong cèc nhùa cã lãt giÊy thÊm. T­íi n­íc Êm kho¶ng 60oC vµ ®Ó trong tñ Êm ë 37oC hai ngµy. Sau ®ã chuyÓn ra ngoµi, t­íi Èm hµng ngµy. Khi mÇm c©y ®­îc hai ngµy tuæi th× thu l¸ mÇm ®Ó t¸ch ADN, nÕu kh«ng t¸ch ADN ngay th× lµm l¹nh trong nit¬ láng vµ b¶o qu¶n ë tñ l¹nh s©u (-84oC). C©y mÇm cã thÓ ®­a ra trång trong nhµ l­íi ®Ó thu l¸ non cña c©y tr­ëng ®Ó t¸ch ADN. Trung b×nh 200-300 mg (2l¸) cho thu ho¹ch 5-7 m ADN tæng sè. T¸ch ADN tæng sè tõ l¸ b«ng Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè thùc hiÖn theo ph­¬ng ph¸p Haiwen vµ CS (2001). Chóng t«i l­îc bá b­íc bæ xung sarcosine ë b­íc 2. §Æt mÉu l¸ trong èng eppendorf 2 ml, ®æ nit¬ láng vµ nghiÒn nhanh, kü b»ng ®òa thuû tinh. Bæ sung 0,8 ml ®Öm röa, vortex trong 40 gi©y. Ly t©m 12.000 vßng/phót ë nhiÖt ®é phßng trong 15 phót, lo¹i bá dÞch næi. Cã thÓ lÆp l¹i b­íc 2 vµ 3. Bæ sung 200 ml ®Öm röa, vortex trong kho¶ng 40-60 gi©y, sau ®ã bæ sung thªm 2-4ml RNase (nång ®é 10mg/ml). Bæ sung 800 ml ®Öm chiÕt, ®¶o ng­îc èng eppendorf kho¶ng 20-40 lÇn. ñ ë 65 0C trong 30-45 phót. Bæ sung 600 ml CIA vµ l¾c m¹nh trong 15-20 phót cho ®Õn khi dung dÞch chuyÓn sang mÇu s÷a. Ly t©m 12.000 vßng/phót ë 40C trong 15 phót, nhÑ nhµng hót vµ chuyÓn dÞch chiÕt næi sang èng eppendorf 1,5 ml míi. Cã thÓ lÆp l¹i c¸c b­íc 8 vµ 9 nÕu dÞch chiÕt kh«ng trong. Bæ sung 700 ml Isopropanol l¹nh, gi÷ dÞch chiÕt ë -200C trong 30 phót cã thÓ ®Ó qua ®ªm. Ly t©m 13.000 vßng/phót ë 40C trong 10 phót. Röa cÆn ADN trong Ethanol 70%. Lµm kh« vµ hoµ tan cÆn ADN b»ng 50 ®Õn 100 ml TE hoÆc n­íc khö ion. X¸c ®Þnh hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN b»ng ®o quang phæ Hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN ®­îc x¸c ®Þnh b»ng ®o quang phæ mÉu ADN pha lo·ng 200 lÇn (995 ml n­íc + 5 ml ADN) ë b­íc sãng 260 nm vµ 280 nm theo c¸c c«ng thøc d­íi ®©y: Hµm l­îng ADN = 50 x HSPL x OD260 §é s¹ch ADN = OD260/OD280 Trong ®ã: HSPL : HÖ sè pha lo·ng. 50 : h»ng sè. OD260 : ChØ sè ®o d­îc ë b­íc sãng l = 260 nm. OD280 : ChØ sè ®o ®­îc ë b­íc sãng l = 280 nm. NÕu ®é s¹ch n»m trong kho¶ng tõ 1,8-2,0 th× mÉu ®­îc coi lµ s¹ch. X¸c ®Þnh hµm l­îng vµ chÊt l­îng ADN b»ng ®iÖn di trªn gel agarose Hµm l­îng ADN cã thÓ ®­îc x¸c ®Þnh chÝnh x¸c b»ng ch¹y ®iÖn di trªn gel agarose 0,6% khi so s¸nh víi mét l­îng ADN ®· ®­îc x¸c ®Þnh trªn cïng mét b¶n gel. Trªn b¶n gel ta cßn x¸c ®Þnh ®­îc ®é s¹ch cña ADN nh­ s¹ch ARN, kh«ng chøa c¸c chÊt cao ph©n tö kh¸c vµ kh«ng bÞ gÉy. Ph­¬ng ph¸p nµy rÊt tiÖn lîi cho c¸c thÝ nghiÖm víi ADN. 2.2.2. Ph¶n øng PCR nh©n gen CryIA Thµnh phÇn, nång ®é c¸c hîp chÊt vµ chu k× nhiÖt PCR Thµnh phÇn, nång ®é c¸c chÊt tham gia 25 ml ph¶n øng PCR mµ chóng t«i tiÕn hµnh ®Ó nh©n gen CryIA ®­îc nªu trong b¶ng 4. B¶ng 4: Thµnh phÇn vµ nång ®é c¸c ho¸ chÊt trong ph¶n øng PCR (25ml) STT Thµnh phÇn ph¶n øng Nång ®é cuèi cïng ThÓ tÝch 1 H20 - 2 §Öm PCR (Buffer) 1 X 2,5 ml 3 25mM MgCl2 2,5 mM 2,5 ml 4 2,5mM dNTPs 200 nM 2 ml 5 10 pM Primer 0.4pM 0,5 ml 6 5u/ml Taq pol 0,1 u 0,2 ml 7 ADN 25 ng Tæng thÓ tÝch 25ml Nång ®é AND cña mÉu pha ®Ó lµm sao lÊy 2ml §Ó nh©n gen CryIA(b) vµ CryIA(c) chóng t«i sö dông cÆp måi T1, T2 cã tr×nh tù nh­ sau: T1: 5’-AGGTGCTGGGTTCGTTCTCG-3’. T2: 5’-CATTGTTGTTCTGTGGTGGGATTT-3’. Chu kú nhiÖt cña ph¶n øng PCR lµ: 95 0C , 3 phót. 94 0C , 30 gi©y. 56 0C , 35 gi©y. 72 0C , 1,5 phót. 72 0C , 8 phót. l­u gi÷ ë 4 0C. Tõ b­íc 2 ®Õn b­íc 4 tiÕn hµnh lÆp l¹i 30 chu kú. ThiÕt bÞ: M¸y PCR (Gene Amp* PCR System 9700 - Appied Biosystems); m¸y ®iÖn di (Biorad); m¸y soi gel (Gel Doc-Pharmacia), m¸y chôp ¶nh (Poloriod). 2.2.3. Kü thuËt lai Southern 2.2.3.1. Ho¸ chÊt, dung dÞch vµ thiÕt bÞ Ho¸ chÊt: NaCl; NaOH; Na-Citrat; Tris-HCl; SDS; axit maleic; N-lauroylsarcosine; Tween 20; bé kit lai DIG (DIG-High Prime DNA labeling and Detction Starter Kit II- Roche); n­íc cÊt 2 lÇn vµ khö trïng; thuèc hiÖn phim X-quang. Dung dÞch: Dung dÞch biÕn tÝnh ADN: 0,4M NaOH, 0,6M NaCl, tiÖt trïng. 20X SSC: 3M NaCl, 300 mM Na-Citrat, 5X SSC, 2X SSC vµ 0.5X SSC, tiÖt trïng. §Öm axit maleic: 0,1M axit maleic, 0,15M NaCl, pH7,5 (chØnh pH b»ng tinh thÓ NaOH), tiÖt trïng. N-lauroylsarcosine 10%, SDS 10% läc qua mµng läc v« trïng. Dung dÞch c¶n 10% (10X): nÊu 10 g bét g©y c¶n trong 100 ml ®Öm axit maleic, tiÖt trïng. Dung dÞch nµy cã thÓ cã s½n trong bé kit. Dung dÞch c¶n 1X: Pha lo·ng dd c¶n 10X (10%) trong ®Öm axit maleic, chuÈn bÞ tr­íc khi dïng. Dung dÞch tiÒn lai: 5X SSC, 0,1% N-lauroylsarcosine, 0,02% SDS, 1% dung dÞch c¶n, chuÈn bÞ tr­íc khi dïng. Dung dÞch lai: Dïng 64 ml n­íc cÊt hai lÇn tiÖt trïng ®Ó hoµ tan bét lai chøa trong mçi lä trong bé kit. §Öm röa: 0,3% thÓ tÝch tween 20 trong dung dÞch ®Öm axit maleic. §Öm dß: 0,1M Tris-HCl , 0,1M NaCl, pH 9,5, tiÖt trïng. Dung dÞch röa: 2X SSC, 0,1% SDS vµ 0,5X SSC, 0,1% SDS. Dung dÞch kh¸ng thÓ: Li t©m èng kh¸ng thÓ anti-DIG-AP trong bé kit ë 10.000v/p trong 5 phót. Pha lo·ng 1:10 000 (75 mU/ml) trong dung dÞch c¶n, chuÈn bÞ tr­íc khi dïng. ChÊt nÒn ph¸t quang: CSPD lµ dung dÞch nÒn ph¸t quang cã s½n trong bé kit. Dông cô vµ thiÕt bÞ: GiÊy thÊm (Whatman); mµng nylon (Positive charges 1417240 - Roche Diagroshc Gmh); bÓ thÊm chuyÓn (khay nhùa hoÆc thuû tinh); tñ Êm; èng lai; lß ph¶n øng lai (Bio-labo), hép chôp phim X-quang (Kodak X-OMATIC Cassette); phim X-quang vµ n­íc hiÖn. 2.2.3.2. Quy tr×nh thÊm chuyÓn vµ lai Southern C¾t ADN genom b»ng enzym giíi h¹n vµ ph©n gi¶i trªn gel Cho 5 mg ADN genom vµo èng eppendorf, bæ sung dung dÞch ®Öm, enzym (40-50 u) vµ n­íc tíi thÓ tÝch 35 ml. ñ ë 37oC, trong 16-18 giê. Ch¹y ®iÖn di ADN c¾t giíi h¹n trªn gel agarose 0,8%, ®iÖn thÕ 40-50V, 12-14 giê. ThÊm chuyÓn ADN lªn mµng nylon ADN ë d¹ng sîi ®¬n ®­îc chuyÓn lªn mµng nylon theo ph­¬ng ph¸p thÊm ng­îc (h×nh 7). C¸c b­íc tiÕn hµnh nh­ sau: Xö lý b¶n gel ®iÖn di ADN trong dung dÞch biÕn tÝnh, l¾c nhÑ 20 phót. §æ dung dÞch thÊm chuyÓn (0,4M NaOH vµ 0,6M NaCl) vµo bÓ. ThÊm ­ít 3 líp giÊy thÊm trong bÓ thÊm chuyÓn, ®Æt lªn vËt ®ì lµ tÊm kÝnh hay mét vËt cøng kh¸c t¹o thµnh cÇu giÊy cã chiÒu dµi ®ñ ngËp trong dung dÞch vµ réng khÝt víi chiÒu réng cña b¶n gel. §Æt óp mÆt b¶n gel lªn cÇu giÊy. ThÊm ­ít mµng nylon cã kÝch th­íc nh­ b¶n gel. §Æt mµng nylon lªn b¶n gel. §Æt 3 líp giÊy thÊm cã kÝch th­íc b»ng b¶n gel lªn mµng nylon. H×nh 3: BÓ thÊm chuyÓn Southern §Æt mét líp dÇy c¸c giÊy thÊm máng cã kh¶ n¨ng thÊm nhanh c¸c dung dÞch thÊm ng­îc tõ d­íi lªn; §Æt vËt nÆng kho¶ng 300-500 g ë trªn cïng, bªn d­íi vËt nÆng nªn ®Æt mét tÊm kÝnh máng ®Ó ph©n bè ®Òu träng lùc cña vËt nÆng lªn c¸c líp giÊy thÊm. Cho thÊm chuyÓn 10-12 giê. Röa mµng nylon trong dung dÞch 2X SSC. §Ó mµng kh« trong nhiÖt ®é phßng, sau ®ã xö lý ë nhiÖt ®é 65oC, trong 2 giê. B¶o qu¶n mµng nylon ë nhiÖt ®é phßng cho ®Õn khi tiÕn hµnh lai víi mÉu dß. §¸nh dÊu mÉu dß vµ thang ADN chuÈn b»ng lai víi måi ngÉu nhiªn §¸nh dÊu mÉu dß lai Southern víi DIG ®­îc tiÕn hµnh theo c¸c b­íc sau ®©y: BiÕn tÝnh ADN: Bæ sung H2O vµo 30 ng ADN (s¶n phÈm PCR nh©n gen CryIA(b), 1,1 kb) thµnh thÓ tÝch 15 ml trong eppendorf. §Æt eppendorf vµo n­íc s«i, ñ trong 10 phót. LÊy èng ra vµ ®Æt ngay vµo ®¸. G©y ph¶n øng: Bæ sung hçn hîp 10X Hexanuleotide; 2ml 10X dNTPs vµ 1 ml enzym Klenow (nång ®é cuèi cïng lµ 100 u/ml). NÕu c¸c thµnh phÇn trªn cã s½n trong kit víi nång ®é 5X th× lÊy 4 ml bæ xung vµo 16 ml ADN ®· biÕn tÝnh. Trén ®Òu hçn hîp. ñ ë 37 OC qua ®ªm th× cã thÓ thu ®­îc kho¶ng 1050 ng ADN ®¸nh dÊu. Dõng ph¶n øng b»ng xö lý ë 65 0C, 10 phót. B¶o qu¶n ë -20 0C. Thang ADN chuÈn ®­îc ®¸nh dÊu nh­ trªn. ChØ cÇn g©y ph¶n øng trong 1 giê, thu ho¹ch 130 ng ADN ®¸nh dÊu lµ ®ñ cho nhiÒu thÝ nghiÖm lai. TiÕn hµnh lai Southern Lai Southern cã thÓ ®­îc tiÕn hµnh trong èng thuû tinh hay hép nhùa. NÕu dïng èng thuû tinh th× cÇn ph¶i cã trôc quay ®Ó quay ®Òu èng trong suèt qu¸ tr×nh lai. NÕu dïng hép lai th× dïng m¸y l¾c. Trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i sö dông èng thuû tinh ®Ó lai vµ lß lai. Qui tr×nh lai mÉu dß trªn mµng Southern ®­îc tiÕn hµnh theo c¸c b­íc nh­ sau: Röa mµng trong dung dÞch 2X SSC, 5 phót. §Æt mµng vµo èng lai. §æ 50 ml dung dÞch tiÒn lai ®· ®­îc lµm nãng tr­íc vµo èng. Quay èng lai 12 vßng/phót ë nhiÖt ®é 67 OC, 2-3 giê. ChuÈn bÞ dung dÞch lai: §un s«i 10 phót mÉu dß vµ thang ADN chuÈn ®· ®¸nh dÊu, ®Æt nhanh lªn ®¸ vµ dïng pipet cho vµo dung dÞch lai ®· ®ung nãng ë 67 0C. ThÓ tÝch dung dÞch lai trung b×nh 3-4 ml/100 cm2 mµng. §Ó lai dß mét b¶n gen chuyÓn th­êng dïng mÉu dß 20-50 ng/ml. Cßn ®èi víi thang ADN chuÈn chØ cÇn 2-3 ng cho mét mµng. §æ dung dÞch tiÒn lai ®i. Thay thÕ nhanh b»ng dung dÞch lai. Quay èng lai ë nhiÖt ®é vµ tèc ®é nh­ ë tiÒn lai. Lai 10-20 giê. Chó ý: nhiÖt ®é lai lu«n ®­îc gi÷ æn ®Þnh trong suèt qu¸ tr×nh lai. §æ dung dÞch lai vµo èng, bäc b»ng giÊy b¹c vµ cÊt gi÷ tñ l¹nh s©u ®Ó cã thÓ dïng l¹i. Röa mµng lai trong 200 ml dung dÞch röa 2X ®· ®­îc lµm nãng ë 67 oC, 5 phót, 2 lÇn vµ röa b»ng c¸ch cho èng quay liªn tôc trong lß lai. Röa tiÕp mµng lai trong 200 ml dung dÞch röa 0.5X ®· ®­îc lµm nãng ë 67 OC, 15 phót, 2 lÇn. Ph¶n øng dß t×m ADN ViÖc dß ®Þnh vÞ c¸c ®iÓm lai gi÷a mÉu dß vµ ADN genom ®­îc tiÕn hµnh dùa trªn c¬ së ph¶n øng liªn hîp phosphatase kiÒm gi÷a kh¸ng thÓ cña DIG vµ chÊt nÒn ph¸t quang. §æ ®Öm röa (100 ml/100 cm2 mµng) vµo khay hay hép nhùa vµ röa mµng lai 2 phót, bá ®Öm röa ®i. Bæ sung dung dÞch c¶n (100 ml/100 cm2), ñ trªn m¸y l¾c 30 phót (cã thÓ tíi 3 giê), bá dung dÞch c¶n ®i. Bæ xung dung dÞch kh¸ng thÓ (20 ml/100 cm2), ñ trªn m¸y l¾c 30 phót, bá dung dÞch kh¸ng thÓ ®i. Röa mµng trong ®Öm röa (100 ml/100 cm2), 15 phót, 2 lÇn. C©n b»ng mµng trong ®Öm dß (20 ml/100 cm2). Nhá chÊt nÒn ph¸t quang CSPD (1 ml/100 cm2) lªn ®¸y mét khay thuû tinh hoÆc nhùa s¹ch, ®Æt óp mÆt mµng lªn giät chÊt nÒn ®ã. Chó ý: kh«ng ®­îc ®Ó mµng bÞ kh«, nÕu bÞ kh« sÏ cã ph«ng nÒn ®en khi hiÖn phim ; dïng cÆp máng di chuyÓn nhÑ mµng sao cho kh«ng ®Ó cã bät khÝ gi÷a chÊt nÒn vµ mµng nh»m môc ®Ých ph©n bæ ®Òu chÊt nÒn trªn bÒ mÆt cña mµng. ñ mµng 5 phót. Dïng kÑp g¾p mµng lªn vµ ®Ó ch¶y bít chÊt nÒn. §Æt nhanh mµng vµo tói ni l«ng vµ d¸n kÝn l¹i. ñ mµng ë nhiÖt ®é phßng, 5 phót. Cã thÓ ñ mµng tiÕp sau ®ã ë 37 0C, 10 phót ®Ó t¨ng c­êng ph¶n øng ph¸t quang. HiÖn phim X-quang §Æt phim X-quang vµo hép chôp phim vµ ®Æt mµng trong tói nylon lªn trªn. Cµi chÆt hép chôp phim vµ bäc kÝn trong v¶i ®en. Sau 1 giê ®em röa phim trong phßng tèi. NÕu tÝn hiÖu ph¸t quang yÕu th× kÐo dµi thêi gian chôp phim (cã thÓ ®Ó qua ®ªm). Ch­¬ng 3. kÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè §Ó thùc hiÖn ®­îc c¸c ph©n tÝch ph©n tö c©y b«ng kh¸ng s©u b»ng kü thuËt PCR vµ lai Southern, ADN t¸ch chiÕt ph¶i ®¶m b¶o ®é tinh s¹ch vµ hµm l­îng cao. Chóng t«i ®· tham kh¶o vµ ¸p dông ph­¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN tæng sè cña c©y b«ng ®­îc c«ng bè gÇn ®©y nhÊt (Haiwen vµ cs, 2001) vµ thu ®­îc mét sè l­îng ®¸ng kÓ trong n¨ng suÊt ADN. Tuy nhiªn, khi b¸m s¸t theo c¸c b­íc cña quy tr×nh nµy chóng t«i chØ thu ®­îc l­îng ADN cßn thÊp vµ ch­a s¹ch. Sau 3 lÇn thö nghiÖm, lo¹i bá thµnh phÇn N-Lauroylsarcosine nh­ ®· nªu trong môc 2.2.1.2, n¨ng suÊt ADN ®­îc t¨ng lªn, ®ång thêi ADN còng s¹ch h¬n rÊt nhiÒu. KÕt qu¶ kiÓm tra ADN cho thÊy c¸c mÉu ADN thu ®­îc ®Òu cã chÊt l­îng tèt vµ nång ®é cao, ®ñ ®iÒu kiÖn ®Ó tiÕn hµnh c¸c c«ng viÖc nghiªn cøu tiÕp theo. Khi ®o OD cña ADN ë c¸c b­íc sãng 260-280 nm, phæ hÊp phô chØ cã mét ®Ønh cùc ®¹i ë 260 nm (h×nh 4). C¸c mÉu ADN thu ®­îc ®Òu cã ®é tinh s¹ch cao, cã tû lÖ OD260/OD280 thÊp nhÊt lµ 1.810 ë dßngCS00-15 vµ cao nhÊt lµ 1.985 ë dßngCS00-35 (b¶ng 5). H×nh 4: Phæ hÊp phô cña ADN t¸ch tõ c¸c dßng b«ng ë b­íc sãng 260- 280 nm B¶ng 5: Hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña c¸c mÉu ADN Tªn gièng Hµm l­îng ADN (ng/ml) §é tinh s¹ch Tªn gièng Hµm l­îng ADN (ng/ml) §é tinh s¹ch CS00-1 1070 1.896 CS01-29 754 1.895 CS00-2 3820 1.865 CS01-30 986 1.921 CS00-3 1264 1.856 CS01-31 2064 1.869 CS00-10 1120 1.985 CS01-32 1341 1.911 CS00-11 1257 1.852 CS01-33 1245 1.896 CS00-15 1052 1.810 CS01-34 2405 1.852 CS00-19 924 1.985 CS01-35 1248 1.985 CS00-20 1124 1.954 CS01-36 1243 1.874 CS00-22 1452 1.852 CS01-38 874 1.981 CS00-23 1248 1.984 CS01-39 862 1.897 CS00-24 1355 1.852 CS01-40 984 1.853 1520 1243 1.845 CS01-42 1452 1.930 CS01-26 957 1.954 CS01-43 1532 1.850 CS01-27 862 1.953 CS92 1596 1.852 CS01-28 489 1.954 CS95 965 1.869 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 H×nh 5: KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra ADN tæng sè t¸ch tõ c¸c dßng b«ng, trong ®ã 1: ADN lamda, 50 ng; 2-16: ADN cña c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ¶nh ®iÖn di kiÓm tra ADN trªn gen agaroza 0,6% chØ ra ADN tËp trung thµnh mét b¨ng, gän, kh«ng cã ADN bÞ ®øt gÉy (h×nh 5). Nång ®é ADN cña c¸c mÉu ®­îc ®¸nh gi¸ dùa trªn 1 mÉu ADN ®èi chøng cã nång ®é chuÈn ch¹y song song víi c¸c mÉu kiÓm tra. Nång ®é 50-200 ng/ml ADN trªn mçi giÕng ®iÖn di ®­îc ®¸nh gi¸ kh¸ chuÈn x¸c. Chóng t«i th­êng thu ®­îc 5-10 mg ADN tõ 200 mg l¸ b«ng. Nång ®é ADN x¸c ®Þnh trªn b¶n gel ®iÖn di thÊp h¬n so víi nång ®é tÝnh theo ®é hÊp phô quang phæ ®­îc gi¶i thÝch do l­îng ARN cßn cao trong c¸c mÉu ADN. Nh­ vËy, kÕt qu¶ ®iÖn di vµ ®o quang phæ hÊp phô c¸c mÉu ADN cho thÊy ®· thu ®­îc ADN s¹ch vµ cã träng l­îng ph©n tö lín, ®ñ tiªu chuÈn ®Ó tiÕn hµnh c¸c kü thuËt PCR vµ lai Southern. 3.2. Ph©n tÝch c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u b»ng kü thuËt PCR C¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ®­îc ®­a vµo ph©n tÝch ph©n tö do viÖn Nghiªn cøu C©y b«ng vµ C©y cã sîi cung cÊp. §©y lµ c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u cã nguån gèc tõ n­íc ngoµi, kh«ng cã lý lÞch chøng minh nguån gen chuyÓn. Nãi c¸ch kh¸c, chóng t«i kh«ng n¾m ®­îc c¸c dßngnµy ®­îc chuyÓn gen CryIA(b) hay CryIA(c). Kh¶ n¨ng kh¸ng s©u xanh cña c¸c dßng nµy ®· ®­îc kiÓm ®Þnh khi thö nghiªm trong nhµ l­íi vµ ngoµi ®ång ruéng. Sè liÖu ®¸nh gi¸ tØ lÖ s©u ¨n l¸ chÕt trong phßng thÝ nghiÖm cña mét sè dßng ®­îc nªu trong b¶ng 1, môc 2.1. §Ó ph©n tÝch c©y b«ng kh¸ng s©u b»ng kü thuËt PCR, chóng t«i sö dông cÆp måi ®Æc hiÖu T1 vµ T2 cã chiÒu dµi vµ tr×nh tù nh­ ®· nªu ë ch­¬ng 2. §©y lµ cÆp måi ®­îc thiÕt kÕ ®Ó cã thÓ nh©n 1 ®o¹n ADN nh­ nhau cã ®é dµi 1,1 kb tõ gen CryIA(b) hoÆc CryIA(c). Khi ¸p dông cÆp måi nµy vµo ph¶n øng PCR ®èi víi c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u, chóng t«i nhËn ®­îc s¶n phÈm PCR víi ®é lín nªu trªn, dßngnh­ s¶n phÈm nh©n ®­îc tõ mÉu ®èi chøng lµ plasmit mang gen CryIA(c) hay CryIA(b). Dùa vµo l­îng s¶n phÈm PCR, chóng t«i cã thÓ ®¸nh gi¸ s¬ bé sè l­îng b¶n gen CryIA cã trong c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. KÝch th­íc cña plasmit mang CryIA kho¶ng 11.5kb vµ cña genom b«ng kho¶ng 2118 Mb (2n). TØ lÖ träng luîng ph©n tö gi÷a chóng lµ 1/151000. NghÜa lµ, nÕu trén 0,07 pg plasmit-CryIA víi 25 ng genom b«ng ta cã hçn hîp t­¬ng ®­¬ng 1 genome b«ng vµ 1 b¶n gen CryIA . Dùa trªn tÝnh to¸n ®ã, chóng t«i lËp ph¶n øng PCR ®èi chøng du¬ng lµ genom b«ng cã 5, 3, 1 b¶n gen CryIA t­¬ng øng. KÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u trong h×nh 6a vµ 6b chØ ra r»ng c¸c c©y chuyÓn gen nµy mang tõ mét ®Õn h¬n mét b¶n gen CryIA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1.1 Kb H×nh 6a. KÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. 1: thang ADN chuÈn (Marker Mix), 2-4: ®èi trøng d­¬ng (genom b«ng + 5, 3, 1 b¶n gen CryIA); 5: ®èi trøng ©m (genom b«ng kh«ng chuyÓn gen), 6-21: c¸c dßng kh¸ng s©u. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1.1 Kb H×nh 6b. KÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. 1: thang ADN chuÈn (Marker Mix), 2-4: ®èi trøng d­¬ng (genom b«ng + 5, 3, 1 b¶n gen CryIA); 5: ®èi trøng ©m, genom b«ng kh«ng chuyÓn gen, 6-19: c¸c dßng kh¸ng s©u Trong 30 dßng b«ng ®­a vµo ph©n tÝch, chóng t«i thu ®­îc 26 dßng cã kÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA d­¬ng tÝnh (b¶ng 6). Sù cã mÆt cña gen CryIA sÏ ®­îc kh¼ng ®Þnh b»ng lai Southern. Ngoµi ra, c¸c v¹ch s¶n phÈm PCR trªn b¶n gel ®iÖn di ®«i khi mê h¬n c¶ ®èi chøng d­¬ng cña 1 b¶n gen CryIA. §iÒu nµy cã thÓ ®­îc gi¶ thÝch bëi qu¸ tr×nh ®ãng më cña c¸c sîi chromatin trong c¸c m¹ch ADN cña c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u lµm c¶n trë qu¸ tr×nh b¾t cÆp måi nh©n gen CryIA, trong khi ë ®èi chøng d­¬ng, CryIA n»m trong plasmit cã ®é dµi chØ 11.5 kb, nªn qu¸ tr×nh th¸o xo¾n ADN x¶y ra dÔ dµng vµ nhanh h¬n, g©y thuËn lîi cho PCR. B¶ng 6: KÕt qu¶ nh©n gen CryIA(b) vµ CryIA(c) b»ng PCR ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u STT Tªn gièng Kªt qu¶ STT Tªn gièng KÕt qu¶ 1 CS00-1 + 16 CS01-29 + 2 CS00-2 + 17 CS01-30 - 3 CS00-3 + 18 CS01-31 + 4 CS00-10 + 19 CS01-32 + 5 CS00-11 + 20 CS01-33 + 6 CS00-15 + 21 CS01-34 - 7 CS00-19 + 22 CS01-35 + 8 CS00-20 + 23 CS01-36 + 9 CS00-22 + 24 CS01-38 + 10 CS00-23 - 25 CS01-39 + 11 CS00-24 + 26 CS01-40 + 12 1520 + 27 CS01-42 + 13 CS01-26 + 28 CS01-43 + 14 CS01-27 - 29 CS92 + 15 CS01-28 + 30 CS95 + Ghi chó: + lµ kÕt qu¶ PCR d­¬ng tÝnh - lµ kÕt qu¶ PCR ©m tÝnh 3.3. KÕt qu¶ ph©n tÝch c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u b»ng lai Southern 3.3.1. ChuÈn bÞ mÉu dß MÉu dß trong thùc nghiÖm lai Southern ph©n tÝch c©y b«ng kh¸ng s©u lµ gen CryIA. Chóng t«i dïng s¶n phÈm PCR nh©n gen nµy tõ plasmit p2300 mang gen CryIA(b). Plasmit p2300 cã b¶n ®å ph©n tö ®­îc nªu ë h×nh 7. §Ó chuÈn bÞ mÉu dß, b­íc ®Çu tiªn chóng t«i ph¶i nh©n dßng tÕ bµo E.coli mang plasmit p2300 vµ b­íc tiÕp theo lµ t¸ch ADN plasmit. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN plasmit ®¹t yªu cÇu, khi ®iÖn di trªn gel agarose 0,8% ta thÊy plasmit t¸ch thµnh nh÷ng b¨ng kh¸c nhau ®Æc tr­ng cho c¸c d¹ng kh¸c nhau cña plasmit ®ã lµ: d¹ng d·n vßng, d¹ng so¾n vµ d¹ng siªu so¾n (h×nh 8a). S¶n phÈm PCR nh©n gen CryIA b»ng cÆp måi T1 vµ T2 cã ®é dµi 1,1 kb (h×nh 8b), ®­îc lµm s¹ch, x¸c ®Þnh nång ®é vµ sö dông ®Ó ®¸nh dÊu víi DIG. Kanamycin(R) p2300-CryIA(b) 11.5Kb Kpn I Hind III T-Border(L) T-Border(R) Sac I Xba I CryIA(b) Nos ter 35S promoter Kanamycin(R) 35S Promoter H×nh 7: B¶n ®å ph©n tö cña plasmit p2300-CryIA(b) 1.1Kb a b H×nh 8: ChuÈn bÞ mÉu dß. a. ADN plasmit mang gen CryIA(b) ®uîc t¸ch tõ c¸c dßng tÕ bµo E.coli; b. S¶n phÈm PCR nh©n gen CryIA Chóng t«i dïng 30 ng CryIA ®Ó ®­a vµo ph¶n øng lai víi hçn hîp c¸c ®o¹n måi 6 nucleotit ngÉu nhiªn vµ DIG-UTP trong thêi gian dµi tèi ®a cho phÐp lµ 20 giê. Dïng l­îng ADN khu«n mÉu Ýt vµ ®¸nh dÊu trong thêi gian dµi cho chóng ta thu ®­îc dung dÞch mÉu dß cã thµnh phÇn ®­îc ®¸nh dÊu lµ chñ yÕu, gi¶m bít c¸c ph©n tö ADN ch­a ®­îc ®¸nh dÊu, tèi ­u qu¸ tr×nh lai cña c¸c ®o¹n dß mang DIG ®¸nh dÊu. Sau 20 giê l­îng ADN ®¸nh dÊu lµ 1050 ng trong 20 ml, nång ®é 52 ng/ml [16]. C¾t genom b«ng b»ng enzym giíi h¹n Khi dïng enzym h¹n chÕ ®Ó c¾t genom thµnh c¸c ®o¹n ng¾n, ta ph¶i b¶o ®¶m enzym ®ã kh«ng c¾t vôn, lµm lo¹i mÊt gen ®Þnh dß t×m ra khái c¸c ®o¹n ADN cã thÓ ®­îc gi÷ l¹i trªn b¶n gen ®iÖn di. V× vËy, tr­íc khi thùc nghiÖm c¾t ADN genom b»ng enzym h¹n chÕ ®Ó tiÕn hµnh lai Southern, chóng t«i nghiªn cøu b¶n ®å enzym c¾t h¹n chÕ cña gen CryIA(b) vµ CryIA(c). Tr×nh tù hai gen nµy sau khi quÐt trªn ch­¬ng tr×nh PC/GENE, cã danh s¸ch c¸c enzym kh«ng c¾t bªn trong gen nh­ ë b¶ng 7. Trong danh s¸ch c¸c enzym nµy chän ra ®­îc 2 enzym HindIII vµ KpnI ®Ó thö c¾t genom c©y b«ng. v× ®©y lµ 2 enzym phæ biÕn, th­êng ®­îc dïng trong c¸c thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö. B¶ng 7: Danh s¸ch c¸c enzym giíi h¹n kh«ng c¾t trong gen CryIA(b) vµ CryIA(c) Chóng t«i thö nghiÖm c¾t ADN genom c©y b«ng ë 2 l­îng kh¸c nhau lµ 5 mg vµ 10 mg. ADN ®­îc c¾t víi enzym h¹n chÕ ë nång ®é 10 u/mg, ë thÓ tÝch 30 ml, trong 12-14 giê. ADN c¾t b»ng enzym sau ®ã ®­îc ch¹y ®iÖn di ë hiÖu ®iÖn thÕ thÊp, 40-50 V, trong 10-14 giê. ¶nh chôp b¶n ®iÖn di s¶n phÈm c¾t ADN cho thÊy ADN ®­îc c¾t hoµn toµn b»ng HindIII, nh­ng kh«ng hoµn toµn b»ng KpnI (h×nh 9). V× vËy, chóng t«i sö dông HindIII ®Ó c¾t genom b«ng trong c¸c thùc nghiÖm lai Southern tiÕp theo, vÒ l­îng ADN chän c«ng thøc 5 hoÆc 7 mg ®Ó c¾t. a b H×nh 9: KÕt qu¶ thö nghiÖm c¾t genom c©y b«ng b»ng: a. KpnI (5 mg); b. HindIII (5 mg vµ 10 mg genom) ThÊm chuyÓn ADN genom lªn mµng nylon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 H×nh 10: B¶n ®iÖn di ph©n gi¶i genom c©y b«ng ®­îc c¾t bëi HindIII tr­íc khi thÊm chuyÓn lªn mµng nylon. 1: Thang ADN chuÈn; 2-14: ADN c©y b«ng kh¸ng s©u (5 mg) C¸c mÉu ADN cña c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ®­a vµo lai Southern ®­îc c¾t bëi HindIII. H×nh 10 ghi l¹i ®é ph©n gi¶i tèt cña c¸c mÉu 5 mg ADN trªn b¶n gel ®iÖn di tr­íc khi thÊm chuyÓn. H×nh 11 lµ ¶nh ®iÖn di cña 7 mg ADN ®­îc c¾t b»ng cïng enzym HindIII. §é dµi cña b¶n gel ®iÖn di theo chÕ ®é ®· nªu ë trªn th­êng lµ 10-11 cm. V× vËy, kÝch th­íc cña mµng lai t­¬ng øng lµ 100-110 cm2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 H×nh 11: B¶n ®iÖn di ph©n gi¶i genom c©y b«ng ®­îc c¾t bëi HindIII tr­íc khi thÊm chuyÓn lªn mµng nylon. 1: Thang ADN chuÈn; 2-12: ADN c©y b«ng kh¸ng s©u (7 mg) Trong thùc nghiÖm thÊm chuyÓn ADN lªn mµng lai, chóng t«i dïng lo¹i giÊy läc cã s½n trong phßng thÝ nghiÖm ®Ó lµm cÇu dÉn dung dÞch chuyÓn, mµ kh«ng dïng ®óng chñng lo¹i Whatman nh­ quy tr×nh chuÈn khuyªn dïng. TÇng giÊy thÊm ë phÝa trªn mµng lµ lo¹i giÊy ¨n b¸n trªn thÞ tr­êng. ë thùc nghiÖm ®Çu tiªn, thÊy r»ng sù thÊm ng­îc lªn tÇng giÊy thÊm x¶y ra qu¸ nhanh. Sau 3 giê, dung dÞch chuyÓn ®· thÊm hÕt tÇng giÊy cao 15 cm. Do ®ã ph¶i thay tÇng giÊy thÊm nµy trong qu¶ tr×nh thÊm chuyÓn. Tuy nhiªn, khi kiÓm tra b¶n gel sau thÊm chuyÓn cho thÊy ADN ®· ®­îc chuyÓn hÕt mµ kh«ng sãt l¹i trªn gel. ë thùc nghiÖm sau, 3 líp giÊy läc cña cÇu giÊy ®­îc thay b»ng 2 líp. Cßn 3 líp giÊy läc trªn mµng ®­îc thay b»ng mét líp cã ®é dµy 1.5 cm. Trong ®iÒu kiÖn nµy, qu¸ tr×nh thÊm chuyÓn chËm l¹i, sau 10-12 giê ®é dµi thÊm ­ít cña tÇng giÊy thÊm lµ 6-7 cm, ®­îc coi lµ b×nh th­êng theo kinh nghiÖm. KÕt qu¶ lai Southern C¸c c«ng bè vÒ kÕt qu¶ ph©n tÝch gen chuyÓn b»ng lai Southern ë c©y lóa, lóa m×, lóa m¹ch, yÕn m¹ch chØ ra r»ng sè l­îng ®iÓm g¾n cña gen chuyÓn thay ®æi phô thuéc vµo kü thuËt ®· ¸p dông khi chuyÓn gen [15], [26]. Khi t¹o c©y chuyÓn gen b»ng b¾n gen, ®iÓm g¾n gen chuyÓn th­êng lµ ®a ®iÓm, thay ®æi tõ 1 ®Õn nhiÒu ®iÓm, cã khi tíi 10 ®iÓm kh¸c nhau [10], [11], [13], [17]. Trong khi ®ã, ë c¸c c©y chuyÓn gen th«ng qua Agrobacterium, gen chuyÓn ®a phÇn g¾n ë ®¬n ®iÓm [21], [29], [30]. Trong thÝ nghiÖm cña chóng t«i, ®Ó t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu qu¸ tr×nh lai gi÷a mÉu dß gen CryIA vµ genom b«ng chuyÓn gen, chóng t«i tiÕn hµnh lai ë nhiÖt ®é cao lµ 67 0C. Qu¸ tr×nh lai x¶y ra trong 14-16 giê. Trong thÝ nghiÖm ®Çu ®· kh«ng thu ®­îc ¶nh lai cña gen CryIA mµ chØ cã thang ADN chuÈn. §iÒu nµy chøng tá quy tr×nh lai ®­îc thùc hiÖn ®óng, chØ cã qu¸ tr×nh lai cña gen CryIA lµ kh«ng x¶y ra hoÆc x¶y ra qu¸ yÕu. Khi t¨ng nång ®é mÉu dß lªn tèi ®a lµ 50 ng/ml dung dÞch lai trong thÝ nghiÖm lÇn thø 2, ®· thu ®­îc c¸c b¨ng lai ë 4/12 dßng trªn mµng lai, trong ®ã mét dßng mang gen chuyÓn ë hai ®iÓm kh¸c nhau, sè cßn l¹i cã gen chuyÓn ë mét ®iÓm (h×nh 12). ë ®©y qu¸ tr×nh lai gi÷a mÉu dß vµ gen CryIA trong c©y b«ng chuyÓn gen ®· x¶y ra, nh­ng kh«ng ph¶i ë tÊt c¶ c¸c mÉu ADN. Theo chóng t«i, cã yÕu tè ®· c¶n trë qu¸ tr×nh lai trªn genom c©y b«ng. Trªn mµng lai thø 3, chóng t«i còng chØ nhËn ®­îc b¨ng lai ë 1/16 dßng. §iÒu nµy cµng nhÊn m¹nh sù c¶n trë qu¸ tr×nh lai gen CryIA trong genom c©y b«ng. ë c¶ 3 mµng, ¶nh lai c¸c v¹ch cña thang ADN chuÈn rÊt râ. Tµi liÖu tham kh¶o vÒ c¸c thÝ nghiÖm ph©n tÝch lai Southern c©y b«ng chuyÓn gen rÊt h¹n chÕ. Chóng t«i ch­a t×m ®­îc mét c«ng bè ®Çy ®ñ vµ cô thÓ nµo liªn quan ®Õn kÕt qu¶ lai Southern ë c©y b«ng trªn c¸c m¹ng l­u tr÷ tµi liÖu khoa häc nh­ PubMed, PNAS online. Chóng t«i sÏ tiÕn hµnh lai Southern cña gen CryIA(c) ë c¸c c©y lóa chuyÓn gen kh¸ng s©u. Qua so s¸nh kÕt qu¶ chóng t«i cã thÓ kh¼ng ®Þnh quy tr×nh sö dông hÖ thèng DIG ®· ®­îc hoµn thiÖn hay cÇn söa ®æi chi tiÕt nµo. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 H×nh 12: KÕt qu¶ lai Sothern cña gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. 1: Thang ADN chuÈn; 2-13: C¸c dßng b«ng kh¸ng s©u KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ KÕt luËn: §Ó ph©n tÝch ph©n tö c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u, ADN tæng sè ®· ®­îc t¸ch tõ l¸ mÇm hoÆc l¸ non cña c©y b«ng. Hµm l­îng ADN thu ®­îc 7-10 mg tõ 200 mg l¸. ADN ®ñ chÊt l­îng ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch ph©n tö. Ph¶n øng PCR nh©n gen CryIA ®­îc tiÕn hµnh víi 30 dßng b«ng kh¸ng s©u, trong ®ã 26 dßng cã kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh. §· thùc hiÖn thµnh c«ng kü thuËt lai Southern bao gåm c¸c b­íc nh­ sau: Chän HindIII lµm enzym c¾t ADN genom b«ng; ADN ph©n gi¶i ®Òu trªn b¶n gel ®iÖn di vµ ®­îc thÊm chuyÓn hoµn toµn lªn mµng lai nylon; ®¸nh dÊu mÉu dß b»ng hÖ thèng phi phãng x¹ DIG vµ thu ®­îc kÕt qu¶ ë 5 dßng, trong ®ã 1 dßng mang 2 ®iÓm g¾n gen, sè cßn l¹i mang 1 ®iÓm g¾n. KiÕn nghÞ: §©y lµ kÕt qu¶ b­íc ®Çu hoµn thiÖn quy tr×nh lai Southern b»ng sö dông hÖ thèng phi phãng x¹ DIG. §Ò nghÞ øng dông kü thuËt nµy vµo ph©n tÝch tiÕp c¸c loµi chuyÓn gen kh¸c (lóa kh¸ng s©u, chÞu bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn, ®u dñ kh¸ng bÖnh virus ®èm vßng).