Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme glucoamylase trong quy trình sản xuất rượu nếp

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG VÕ PHAN HẢI ÂU NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG VÕ PHAN HẢI ÂU Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU NẾP Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Ts. NGUYỄN CÔNG HÀ VÕ PHAN HẢI ÂU MSSV: 2051615 Lớp: CNTP K31 Cần Thơ, 2009 i LỜI CẢM TẠ Xin thể hiện lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn Nguyễn Công Hà đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành biết ơn Tất cả Quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm bổ ích để hoàn thành đề tài luận văn cũng như trang bị cho tôi những kinh nghiệm để bước vào đời. Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Xin cảm ơn Tập thể lớp Công nghệ thực phẩm khóa 31 đã giúp đỡ, động viên, góp ý chân thành giúp bài luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. Bạn bè của tôi tại Tp Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. Kính dâng cha mẹ đã nuôi con khôn lớn Sinh viên thực hiện Võ Phan Hải Âu ii TÓM LƯỢC Đề tài thực hiện nhằm mục tiêu tiếp nối nghiên cứu của Võ Văn Tuấn nhằm tối ưu hóa quá trình thủy phân dịch nếp có sử dụng chế phẩm enzyme amylase. Trên cơ sở những kết quả đã đạt được từ đề tài nghiên cứu “Ứng dụng enzyme α- amylase và glucoamylase và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp”, trong đề tài này chúng tôi tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố cần thiết cho quá trình đường hóa nguyên liệu nếp trắng có sử dụng kết hợp chế phẩm enzyme α- amylase và glucoamylase. Kết quả thu được như sau: Đối với quá trình đường hóa sử dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase: nồng độ enzyme glucoamylase thích hợp nhất là 0,4%, nhiệt độ thích hợp cho quá trình xử lý enzme glucoamylase là 600C, pH xử lý là 4,0 tương ứng với thời gian sử dụng glucoamylase thích hợp cho hiệu quả kinh tế cao là 30 phút. iii MỤC LỤC CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1 1.1 Đặt vấn đề ..............................................................................................................1 1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................................1 1.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về gạo nếp ...........................................................................................3 2.2 Enzyme amylase ...................................................................................................3 2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase .........................................................3 2.2.2 Thành phần hệ enzyme amylase.................................................................4 2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của các loại amylase ......................................5 2.2.4 Hoạt lực của enzyme amylase ..................................................................11 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase.......................12 2.3 Nấm men ..............................................................................................................16 2.3.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men .......................................................16 2.3.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men...............................................17 2.3.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang ...........................................17 2.4 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp......................................19 2.4.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp..................................................................19 2.4.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu nếp .........................................20 2.4.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp .....................................21 2.5 Quy trình sản xuất .............................................................................................23 2.5.1 Sơ đồ quy trình .......................................................................................23 2.5.2 Thuyết minh quy trình.............................................................................24 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 26 3.1 Phương tiện thí nghiệm .....................................................................................26 3.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................26 3.1.2 Nguyên liệu .............................................................................................26 3.1.3 Dụng cụ trang thiết bị ..............................................................................26 3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................26 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu..............................................................................26 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................27 3.3 Bố trí thí nghiệm.................................................................................................27 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng ..........................................................27 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. .........................................................29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. ..............................................................31 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra do hoạt động của enzyme glucoamylase trên nguyên liệu nếp trắng. ..............................................................35 iv CHƯƠNG 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................39 5.1 Kết luận................................................................................................................39 5.2 Đề nghị .................................................................................................................39 5.3 Quy trình thủy phân tinh bột đề nghị ..............................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................41 v DANH SÁCH BẢNG, HÌNH Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp.............................................................3 Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................6 Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................6 Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men ..............................................16 Bảng 4.1 Hàm lượng đường khử theo pH và nồng độ enzyme glucoamylase.......32 Bảng 4.2 Hàm lượng đường khử khi đường hóa bằng enzyme glucoamylase ở các mức nồng độ enzyme và nhiệt độ khác nhau. .......................................................35 Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase .........................................4 Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của amylase lên phân tử tinh bột....................................5 Hình 2.4 Tác dụng của β-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin ..............9 Hình 2.5 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột.........................................10 Hình 2.6 Tổng quát hóa quá trình thủy phân tinh bột của amylase........................11 Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men ........................17 Hình 4.1 đồ thị biểu hiện sự thay đổi hàm lượng đường khử theo pH và nồng độ enzyme.................................................................................................................32 Hình 4.2 Đồ thị mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với pH và nồng độ enzyme.................................................................................................................33 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase xử lý.............................................................................36 Hình 4.4 Đồ thị mối quan hệ giữa hàm lượng đường khử với nhiệt độ và nồng độ enzyme……………………………………………………………………………37 1 CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Rượu vang là một thức uống có độ cồn thấp, có hương vị đặc trưng của từng loại nguyên liệu tạo thành, điều đặc biệt là rượu vang có độ cồn thấp, chỉ vào khoảng từ 11% cho đến 14%, so với rượu mạnh là từ 40% cho đến 45%. Vì vậy nếu sử dụng rượu này một cách điều độ, vừa phải thì rất có lợi cho sức khỏe. Ở điều kiện nước ta, ngoài các loại rượu vang được sản xuất bằng phương pháp lên men dịch nước ép trái cây như nho, khóm,…các nhà sản xuất còn áp dụng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau, chẳng hạn gạo nếp than, gạo nếp trắng,… nhờ đó sản phẩm rượu vang ở nước ta ngày càng đa dạng, phong phú. Trong đó sản phẩm rượu từ gạo nếp trắng vừa cho sản phẩm có hương thơm đặc trưng vừa là nguyên liệu được trồng phổ biến ở nước ta nên có giá thành tương đối rẻ rất thích hợp cho việc đi sâu nghiên cứu cho sản phẩm này. Ngày nay, với việc ứng dụng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hoá và lên men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như đảm bảo chất lượng rượu vang thành phẩm sẽ giảm chi phí sản xuất, đảm bảo chất lượng và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm này. 1.2 Mục tiêu đề tài Như đã biết trong công nghệ sản xuất rượu nếp, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu suất thu hồi rượu thành phẩm như các yếu tố tối ưu cho hoạt động của enzyme sử dụng, loại và chất lượng nguyên liệu, loại nấm men sử dụng… Trên cơ sở kế thừa những thành quả đã đạt được từ đề tài nghiên cứu của Võ Văn Tuấn, chúng tôi tiếp tục thực hiện để tìm ra các yếu tố tối ưu cho quá trình đường hóa có sử dụng kết hợp enzyme α-amylase và glucoamylase. Vì vậy, đề tài này tập trung nghiên cứu hướng đến những mục tiêu chính sau: Tìm ra pH, nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme glucoamylase cho quá trình đường hóa. Tìm ra nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thích hợp cho quá trình đường hóa. Bổ sung kết quả đạt được vào quy trình sản xuất để thu được sản phẩm rượu có chất lượng cao góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho sản phẩm. 1.3 Nội dung nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình đường hóa. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng đường khử sinh ra trong quá trình đường hóa. 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về gạo nếp Nguồn gốc Gạo nếp là loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở vùng Nam Bộ. Hạt gạo này có màu đục và có mùi thơm đặc trưng. Thành phần hóa học Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 (Nguyễn Đức Lượng, 2003) 2.2 Enzyme amylase 2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme amylase Nguồn enzyme amylase từ vi sinh vật Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase do chúng có khả năng tích trữ một lượng lớn enzme này trong những điều kiện xác định. Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các loại amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và thậm chí các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzyme khác nhau. Có nhiều nguồn thu enzyme amylase như các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus…. Nhiều loại thuộc giống này như Asp. Oryzae, Asp. Niger,…(Nguyễn Đức Lượng, 2006) 3 2.2.2 Thành phần hệ enzyme amylase Dựa theo tính chất và cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột. người ta xếp enzyme amylase thành hai nhóm là endoamylase (enzyme nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân). Chúng gồm sáu loại: Endoamylase (enzyme nội phân) gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành hai loại, khử trực tiếp là pullulanase (α- dextrin-6-glucanohydrolase), khử gián tiếp là tranglucosidase và amylase-1,6- glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết trong chuỗi polysaccharide. Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm β-amylase và glucoamylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase (Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2003) Amylase Khử gián tiếp là tranglucosidase và amylase-1,6-glucosidase) Khử trực tiếp là pullulanase (α- dextrin-6-glucanohydrolase) β-amylase Endoamylase Exoamylase Glucoamylase Enzyme khử nhánh α-amylase 4 2.2.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của các loại amylase Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của amylase lên phân tử tinh bột 2.2.3.1 α-amylase Đặc tính Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau. Enzyme α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionine, có khoảng 7 ÷ 10 gốc cysteine. Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu enzyme α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion đơn hóa trị như Cl- > Br- > I-. Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+. Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. Điều kiện hoạt động và độ bền của các enzyme α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau thì không giống nhau. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) 5 Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau Nguồn gốc Ph tối thích Nhiệt độ tối thích Malt 5,5 ÷ 5,7 72 ÷ 75 Vi khuẩn 5,0 ÷ 6,0 50 ÷ 60 Nấm mốc 6,0 ÷ 7,0 60 ÷ 70 (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu) Nhiệt độ Malt Nấm mốc Vi khuẩn 65 100 100 100 70 100 52 100 75 58 3 100 80 25 - 92 85 1 - 58 90 - - 52 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội phân (endo enzyme). Enzyme α-amylase không những có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân cắt thành oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6 ÷ 7 gốc glucose), sau đó các oligosaccharide lại tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi ngắn hơn và tạo thành maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19% glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và 6 isomaltose (8%) do α-amylase không cắt được liên kết 1,6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase + Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số cơ chất bị thuỷ phân nhánh tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh. + Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thuỷ phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose. Các chất này bị thuỷ phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosacharide. Dưới tác dụng của α- amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6 ÷ 7 gốc glucose. Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm các maltotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Dextrin phân tử lương thấp Tinh bột α-Amylase Di và monosaccharide Dextrin Tetra và trimaltose Amylose Oligosaccharide Polyglucose Maltotetrose Maltotriose Maltose α-Amylase Hình 2.3 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin α-Amylase 7 2.2.3.2 β-amylase Đặc tính Enzyme β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc –SH, - COOH, cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. Enzyme β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nẩy mầm. Trong vi khuẩn không có β- amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định. Enzyme β-amylase rất bền khi không có Ca2+, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, acetanic, iod, ozon. pH tối thích trong dịch bột thuần khiết là 4 ÷ 6, trong dung dịch nấu là 5 ÷ 5,6. Nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40 ÷ 500C, trong dung dịch nấu là 60 ÷ 650C. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 700C. Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glycoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự gốc maltose một ở đầu không khử. Maltose có cấu hình β được tạo thành, β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exoenzyme). Enzyme β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54 ÷ 58% amylopectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có 20 ÷ 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10 ÷ 12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4 glycoside gắn với α-1,6 glycoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Các dextrin này có chứa nhiều liên kết α-1,6 glycoside bắt màu đỏ tím với iod. 8 Tinh bột Maltose (54 ÷ 58%) + Dextrin (42 ÷ 46%) Nếu sử dụng đồng thời α-amylase và β-amylase thì có thể thủy phân đến 5% tinh bột. Hình 2.4 Tác dụng của β-amylase lên phân tử amylose và amylosepectin 2.2.3.3 γ-amylase (glucoamylase) Đặc tính Enzyme γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần có sự tham gia của các enzyme amylase khác. Nó thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với polysacchacaride có phân tử nhỏ. So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone, không bền với ion kim loại nặng Cu2+,Hg2+. Enzyme này có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn . Enzyme này hoạt động tốt ở 500C. Hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose, là enzyme ngoại phân (exo enzyme). Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một. Chúng không thủy phân được các dextrin vòng. Khi thủy phân tinh bột, cùng với việc tạo thành glucose còn có thể được tạo thành oligosaccharide. Ngoài ra, γ-amylase còn có thể phân cắt cả liên kết α-1,2 và 1,3 glycoside. β-amylase 9 Amylose Amylosepectin Hình 2.5 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột 2.2.3.4 Oligo-1,6-glucosidase Enzyme oligo-1,6-glucosidase thủy phân liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm (malt, thóc mầm). Ngoài oligo- 1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylosepectin-1,6- glucosidase và α-dextrin-1,6-glucosidase. Cả hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase nên trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1. 2.2.3.5 Pullulanase Enzyme pullulanase thủy phân các liên kêt α-1,6-glycoside trong tinh bột và glycogen. Phân tử lượng của nó là 145000. Enzyme này có khả năng thủy phân những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6- glycoside. pH tối thích cho enzyme này hoạt động là 5,0 và nhiệt độ là 47,50C 2.2.3.6 Transglucosidase Enzyme transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase. Nó có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây sự nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltotriose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kêt α-1,6-glucosid để tạo thành panose hoặc izomaltose. 10 Hình 2.6 Tổng quát hóa quá trình thủy phân tinh bột của amylase 2.2.4 Hoạt lực của enzyme amylase Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của nó. Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Các chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase. Vì vậy, hoạt lực tổng hợp của chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm. Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng rất khác nhau. Để xác định hoạt độ của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau: • Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần. • Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod. • Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất. Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau: Hoạt độ của enzyme α-amylase dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của α- 11 amylase là lượng enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ. Hoạt độ của glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến glucose. Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành. Glucose trong hỗn hợp các đường thường được xác định bằng các phương pháp đặc hiệu. Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 30oC và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucose oxydase). Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử. Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1 giờ ở 30oC và pH thích hợp làm phân giải được 1g tinh bột thành đường khử khi mức độ thủy phân cơ chất không vượt 30%. 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase 2.2.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng Khi có lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme bằng biểu thức: v = k.[E] Trong đó: v: vận tốc phản ứng k: hằng số tốc độp phản ứng [E]: nồng độ enzyme sử dụng Nồng độ của enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều. Tuy nhiên khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm lại. 2.2.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Phản ứng khi có enzyme xảy ra theo ba giai đoạn: Giai đoạn đầu enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Ở trường hợp này xảy ra ba giai đoạn khác biệt: 12 Ở giai đoạn đầu, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Ở giai đoạn kế tiếp tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Ở giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng thêm. Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn được. E + S ES P + E (1) Trong đó: K1: hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES K2: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại chất ban đầu và enzyme K3: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P Vận tốc phản ứng tỷ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ ES càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn. Sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất theo chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian phản ứng thuỷ phân của amylase. 2.2.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ Cũng như các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme amylase tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên do enzyme amylase cũng có bản chất là protein nên nó kém bền đối với nhiệt độ. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao, enzyme amylase cũng không ngoại lệ. Nhiệt độ vô hoạt tùy thuộc vào loại và nguồn gốc của enzyme. Tốc độ phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tại nhiệt độ mà enzyme có thể tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1,4 ÷ 2 lần khi nhiệt độ tăng 100C. Tuy nhiên tốc độ phản ứng tăng đến nhiệt độ nhất định. Vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng bị giảm và enzyme có thể bị vô hoạt. Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Mỗi loại enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc nguồn gốc của chúng. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính của enzyme bị giảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của có các chất, kim loại, pH và chất bảo vệ. Ta K1 K3 K2 13 thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng theo yêu cầu của chế biến. 2.2.5.4 Ảnh hưởng của pH Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường. Do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme – cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Mỗi loại enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ một ít enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid hay kiềm mạnh. 2.2.5.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa Chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành trạng thái hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động mạnh. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học khác nhau, chúng có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển hóa nhóm, chuyển gốc hóa học. - Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm chất hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme. - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động. - Ngoài ra một số kim loại có bán kính 0,34 ÷ 1,65 A0 (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa các ion có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa các enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme. - Các chất hoạt hóa này chỉ có tác dụng tốt ở một nồng độ nhất định, vượt qua nồng độ này chúng sẽ ức chế hoạt động của enzyme. 2.2.5.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch. Trong chất kìm hãm thuận nghịch, ta có thể phân biệt hai dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh. 14 Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong trường hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất thật, nó kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme. Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm tốc độ phản ứng. Kiềm hãm bởi sản phẩm phản ứng: các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thành chất kìm hãm tốc độ thể tạo của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu S1 + S2 P1 + P2 Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2. Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + S ES E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu2+, Ag+. 2.2.5.7 Ảnh hưởng của cơ chất Cơ chất của enzyme amylase là tinh bột. Tinh bột là nhóm carbohydrate thực vật có chủ yếu trong các loại ngũ cốc như gạo, nếp, ngô, trong các loại củ như khoai lang, khoai mì, sắn,…Công thức tổng quát của tinh bột là (C6H12O6)n. Tinh bột được cấu tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng. Các loại tinh bột đều có chứa từ 20 ÷ 30% amylose và 70 ÷ 80% amylosepectin. Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylosepectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo nhánh. 15 Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 850C. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian dextrin, sau đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và glucose. Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành phần amylose và amylosepectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột. Chính vì vậy để quá trình thủy phân đạt hiệu quả ta cần chọn loại enzyme amylase và nhiệt độ hồ hóa phù hợp với loại nguyên liệu tinh bột. 2.3 Nấm men 2.3.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men Nấm men có cấu tạo đơn bào. Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như hình hình cầu, hình elip, hình trứng,…Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 8 ÷ 15µm. Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men Thành phần Hàm lượng (%) Carbon 49,8 CaO 12,4 Nitro 6,7 Hydro 3,54 P2O5 2,34 K2O 0,04 SO3 0,42 MgO 0,38 Fe2O3 0,035 SiO 0,09 (Nguyễn Đức Lượng, 1996) 16 2.3.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Tế bào nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi, tế bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình này xảy ra sau 2 giờ. Giai đoạn a (giai đoạn tiền phát) : giai đoạn này tế bào nấm men làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng. Giai đoạn b (giai đoạn phát triển logarit): đây là giai đoạn phát triển rất nhanh của tế bào nấm men, tốc độ sinh khối của tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân. Trong giai đoạn này có sự thay đổi mạnh mẽ thành phần của dịch lên men. Giai đoạn c (giai đoạn ổn định): số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết. Giai đoạn d (giai đoạn chết): số lượng tế bào nấm men giảm dần do tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản chậm lại. Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men 2.3.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang Trong sản xuất cồn, rượu vang và bia người ta thường sử dụng chủng nấm men Saccharomyces, chủng này được phân chia thành các dạng: Đặc điểm của lên men nổi là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho đến khi lên men gần kết thúc. Theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành chuỗi. Đối với lên men nổi thì nhiệt độ lên men thích hợp ở 20 ÷ 280C. Nấm men chìm chỉ phát triển ở lơ lửng và ở đáy môi trường lên men, chúng không tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men xít, bám chắc ở đáy thùng. Nhiệt độ thích hợp cho nấm men loại này là 5 ÷ 100C. Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α- galactosidase lên men hoàn toàn đường rafinose. Còn nấm men nổi thì chỉ có một số ít chủng có khả năng chuyển hóa được 1/3 đường rifanose thành rượu và CO2. a b c d 17 Ngoài tính chất chung là nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO2 thì trong mỗi ngành sản xuất đều có những đòi hỏi đặc thù. Ví dụ: nấm men dùng trong sản xuất bia và rượu vang phải cho sản phẩm mùi đặc trưng thơm ngon; đồng thời phải lắng tốt và giúp cho dịch lên men nhanh chóng. Các nòi nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường có khoảng nhiệt độ thích hợp 18 ÷ 250C. Ở 350C, sinh sản của chúng bị ức chế, ở 400C sinh sản bị ngừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 160C sinh sản và lên men bị kéo dài. Các điều kiện lý hóa, thành phần và chất liệu dịch quả cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm men. Ngày nay trong công nghệ sản xuất rượu vang, người ta còn sử dụng các chủng nấm men như: Saccharomyces ellipsodues, Saccharomyces oriformis (Osterwalder) (Lê Minh Châu, 2007). Các chủng nấm men này có tốc độ lên men mạnh mẽ, tạo ra các sản phẩm chứa 18 ÷ 20% ethanol. Đặc trưng của nấm men vang là có hình elip hoặc elip kéo dài. Trong điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sản bằng cách nảy chồi; trong điều kiện không thuận lợi chúng sinh sản bằng cách tạo bào tử (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Saccharomyces vini: đây là tên dùng phổ biến hiện nay, trước đây người ta gọi là Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus, theo Lodder là Saccharomyces cerevisiae Hansen. Trong quá trình lên men nước quả, nấm men này sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon là đường, cồn và acid hữu cơ; có tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinzit, tiamin và piridoxin; ngoài ra chúng còn có các đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp cho rượu vang có mùi đặc trưng riêng biệt. Nhiều nòi của nấm men này trong lên men tạo được một lượng rượu chỉ đạt 8 ÷ 10% so với thể tích. Ở giai đoạn cuối của quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong rượu. Sau đó chúng thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. Saccharomyces oviformic: Nấm men này được tách từ nước nho tự lên men, có khả năng chịu được lượng đường và cồn cao, lên men kiệt đường và tạo ra lượng cồn tới 18 độ cồn. Giống này lên men được glucose, fructose, manose, saccarose, maltose và 1/3 rafinose và không lên men được lactose, pectose (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Loại nấm men thường được sử dụng trong sản xuất rượu vang nếp là Saccharomyces cerevisiae. Loại nấm men này có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như glucose, fructose, saccharose, maltose, galactose từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, nếp, ngô, khoai, sắn. Nấm men này có thể lên men tốt với lượng đường trong dung dịch từ 12 ÷ 14% có khi từ 16 ÷ 18%, nồng độ rượu trong dịch lên men từ 10 ÷ 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 320C. 18 Yêu cầu đối với nấm men rượu vang:
Khả năng lên men cao
Chịu được nhiệt độ thấp
Bền với etanol và nồng độ đường cao. 2.4 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp 2.4.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp Hồ hóa tinh bột nhằm mục đích giúp quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra dễ dàng hơn. Đầu tiên hạt tinh bột sẽ hút nước và trương lên, tăng khối lượng và thể tích. Khi nấu tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C tinh bột bắt đầu trương nở. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên thì hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng nhất gọi là sự trương nở vô hạn. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của hạt tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần. Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh bột tan ra gọi là sự hồ hoá tinh bột . Ở trạng thái này chỉ mới một phần nhỏ tinh bột bị phá vỡ. Điều này chứng tỏ rằng sự cấu tạo bền vững của tinh bột là do sự kết hợp giữa các phân tử lớn của các chuỗi tinh bột giữa các mạch chính và nhánh thành những mạng, giữa các mạng là amylose và amylosepectin . Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết hydro. Ngoài các liên kết trên trong tinh bột còn có các liên kết khác chắn chắn hơn (do sự xoắn mạch của các mạch amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính hiện tượng này làm cho quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một nhiệt lượng cần thiết. Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu hạt, người ta thường bổ sung một lượng nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu. Khi làm nguội, dung dịch amylosepectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 550C chúng biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng. Đối với dung dịch amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được. Do đó làm giảm khả năng đường hoá. Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm nguội nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 620C và đường hoá. Một biện pháp kĩ thuật thường dùng là sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) 19 2.4.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu nếp Nguyên liệu tinh bột của nếp không thể trực tiếp lên men được, mà cần phải qua giai đoạn đường hoá. Tác nhân xúc tác thường dùng là enzyme amylase. Enzyme này sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường để nấm men sử dụng trong quá trình lên men. Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Nhiệt độ Tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme amylase chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ. Tốc độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ tối thích của enzyme. Nếu vượt quá nhịêt độ này thì chúng sẽ bị biến tính và sẽ trở nên trơ hơn đối với cơ chất. Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần của sản phẩm đường hóa. Khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dexrtin tạo ra nhiều hơn so với đường khử. Mặt khác, trong nấm men không có hoặc rất ít α-amylase và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường nên giảm hiệu suất thu hồi. pH Bản chất của enzyem là protein do vậy tính chất của nó cũng giống như protein. Những nhóm hoá học cơ bản của enzyem có khả năng ion hoá. Sự hiện diện của ion H+ làm giảm khả năng ion hoá của các nhóm này. Nếu nhóm này là trung tâm hoạt động của enzyem thì sẽ kiềm hãm hay kích thích enzyem tuỳ theo nồng độ. pH tối thích của enzyem amylase trong khoảng 4,5 ÷ 5,5. Thời gian đường hóa Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, phụ thuộc vào khả năng làm nguội dịch nấu và phương pháp đường hoá. Thời gian đường hoá quyết định năng suất của thiết bị, chất lượng của dịch đường hoá và hiệu suất thu hồi. Thời gian đường hoá có ảnh hưởng đến sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Khi đường hoá khối nấu ở nhiệt độ 55 ÷ 580C trong thời gian 15 ÷ 150 phút hầu như đường lên men không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Nồng độ enzyme Trong điều kiện không thay đổi về chủng loại enzyme, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme tăng thì tốc độ đường hóa tăng. Trong sản xuất tốc độ của sự phân hủy là một hàm số, là sự tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme. Phức hệ enzyme, nếu có sự khác nhau về loại, lượng, hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau. Chất sát khuẩn: 20 Để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn trong quá trình đường hoá, các nhà máy sản xuất rượu thường sử dụng Na2SiF6, formol. Nồng độ chất sát trùng cao không gây ức chế có khi lại kích thích sự hoạt động của enzyem. 2.4.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men). Tùy theo sản phẩm sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic… Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện của O2 như quá trình lên men acid accetic, citric… Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2. Người ta còn gọi quá trình này là quá trình rượu hóa. Cơ chế của quá trình lên men Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được lớn hơn 100 triệu tế bào trong 1ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường khử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men và sau đó khuyếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2. Rượu etylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hòa tan không lớn, ở áp suất 800mmHg nhiệt độ 25 ÷ 30 0C là 0,856 ÷ 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị phá vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men luôn ở trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men 21 và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo các thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng quá trình lên men. (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004). Các giai đoạn của quá trình lên men Giai đoạn đầu: khoảng 60 giờ kể khi cho nấm men tiếp xúc với dịch men. Sự lên men xảy ra rất chậm. Giai đoạn 2: đây là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 ÷ 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. Giai đoạn 3: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau. Giai đoạn lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường, sau mỗi giờ nồng độ đường trong dung dịch lên men sẽ giảm đi, mức độ giảm tùy theo sản phẩm, dây chuyền sản xuất. Trong giai đoạn lên men, sự đường hoá cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hoà tan. Do đó tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự thuỷ phân hàm lượng dextrin không lên men còn lại. Tuy vậy, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, chu kì lên men cuối phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme . Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng, càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004). Vì vậy, tuỳ theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ đường của dịch đường hoá, phương pháp lên men, nhà sản xuất sẽ tạo ra một quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng và thành phần mong muốn của họ (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống của tế bào nấm men, do đó cũng ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men và chất lượng rượu thành phẩm. Nấm men 22 phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 ÷ 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 ÷ 220C có năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 ÷ 450C. Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết. (Nguyễn Thanh Vũ, 2007) Ảnh hưởng của pH pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Mỗi loại nấm men phát triển tốt ở một pH nhất định gọi là pH tối thích. Nấm men trong sản xuất rượu vang có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 ÷ 8 nhưng thích hợp nhất là 4 ÷ 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH khoảng 3,8 ÷ 4,0. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Nồng độ đường Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 ÷ 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 ÷ 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men. Ảnh hưởng của nồng độ rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. 2.5 Quy trình sản xuất 2.5.1 Sơ đồ quy trình 23 2.5.2 Thuyết minh quy trình 2.5.2.1 Nghiền Việc nghiền nhỏ nguyên liệu là khâu rất quan trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình hồ hóa tinh bột và quá trình thủy phân của enzyme. Nghiền nhằm tạo điều kiện để tăng tốc độ quá trình lý học và hóa sinh học trong khi hòa thấm hạt vào nước. Đồng thời nghiền nhỏ còn có tác dụng làm tăng cường tiếp xúc giữa nước và hạt giúp các chất hòa tan dễ dàng vào nước khi nấu. Việc nghiền nhỏ nguyên liệu được thực hiện bằng máy nghiền búa. 2.5.2.2 Nấu Mục đích: quá trình nấu nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không hòa tan thành trạng thái hòa tan trong nước, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme amylase dễ dàng thủy phân tinh bột. Tiến hành: cho khoảng 10% enzyme vào nếp đã được pha loãng sẵn sau đó nâng nhiệt độ lên 70 ÷ 720C và giữ ở nhiệt độ đó 15 phút để enzyme thực hiện quá trình dịch hóa. Tiếp tục đun dịch cháo đến nhiệt độ sôi và giữ ở đó khoảng 10 phút để quá trình hồ hóa xảy ra hoàn toàn. Làm nguội dịch cháo đến khoảng 65 ÷ 750C và cho toàn bộ lượng enzyme còn