Nghiên cứu chế biến glucosamin từ vỏ tôm

Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 1 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………..3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN................................................................... 5 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên. ................................5 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin...........................................................6 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin. .....................................................................................6 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin. .......................................................................................8 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan...............8 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan. ...............................................................................9 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan................................................................................10 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan. .........................................................................11 1.3.4. Độc tính của chitosan. ..............................................................................................11 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên thế giới. ................................................................................12 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin..........................................15 1.6. Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin. ............17 1.6.1. Glucosamin hydroclorua..........................................................................................17 1.6.2. Glucosamin sulfat. .......................................................................................................17 1.6.3. Acetyl glucosamin.........................................................................................................18 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó......................18 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam...........................................................................................................................................................21 1.8.1. Trên thế giới. ....................................................................................................................21 1.8.2. Ở Việt Nam........................................................................................................................23 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl). .................................25 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến. .....................................25 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng. .......................................26 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ......................................................................................................................................................................27 2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................................27 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................27 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 2 CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ......................................29 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua. ..............29 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................30 3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin. ........................................................31 3.4. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl). ......................................................32 3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin. .....................................................................................32 3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan..................................................................................33 3.4.3. Tinh chế glu.HCl. ..........................................................................................................34 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin.........................................................................................................................................................39 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin .........................................................................................................................................................39 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin. ..............................................................................................................................40 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................41 4.1. Điều chế chitin từ vỏ tôm. ................................................................................................41 4.1.1.Quá trình khử khoáng..................................................................................................41 4.1.2. Quá trình loại bỏ protein.........................................................................................41 4.1.3. Quá trình tẩy màu (loại bỏ Astaxanthin). ......................................................42 4.2. Điều chế chitosan. ..................................................................................................................43 4.3. Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl)........................................................43 4.3.1. Điều chế glu.HCl đi từ chitin. ...............................................................................44 4.3.2. Điều chế glu.HCl từ chitosan. ...............................................................................45 KẾT LUẬN......................................................................................................................................48 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................49 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3]. Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin 1, chitosan 2, glucosamin 3 và các sản phẩm có giá trị khác. Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất quan trọng, để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường. Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế. Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp. Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động. Gân và dây chằng phân đoạn, đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và dễ bị tổn thương. Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt với nhiều tinh thể canxi làm khớp đau. Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch mỏng và khô dần [1]. Trước đây, trong điều trị các bệnh thoái hóa khớp người ta thường dùng các thuốc thuộc nhóm corticoid hoặc nhóm kháng viêm giảm đau không steroid NSAID (Non - Steroidal Anti - Inflammatory Drugs), nhưng các thuốc thuộc Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 4 nhóm này chỉ điều trị triệu chứng và có nhiều tác dụng phụ. Với các thuốc thuộc nhóm corticoid thường gây nên các tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dạ dày, giảm miễn dịch…. Đối với các NSAID thì gây viêm loét dạ dày…[12]. Từ thập kỷ 90 người ta đã phát hiện ra glucosamin phục hồi được các sụn khớp, tức là chữa được căn nguyên của bệnh viêm, thoái hoá khớp [2]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp của glucosamin, nhất là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên. Trên thực tế glucosamin thường được sử dụng ở các dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl glucosamin 6. Hiện nay thuốc chứa glucosamin đã được lưu hành trên 70 quốc gia. Tại Việt Nam, glucosamin và các thành phẩm đi từ glucosamin vẫn chủ yếu là nhập khẩu và xu thế sử dụng ngày càng nhiều. Trong khi đó nguồn nguyên liệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế ra glucosamin thì dồi dào. Để tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh thoái hoá khớp và là nguyên liệu cho việc nghiên cứu các ứng dụng khác của glucosamin chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm”. Mục tiêu của đề tài nhằm giải quyết các vấn đề sau : 1. Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải. 2. Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan.. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 5 Chương I: TỔNG QUAN 1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật . Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... [13]. Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1 : Chitin và vỏ tôm Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 6 Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5]. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose. O NHCOCH3 OH CH2OH O O O NHCOCH3 OH CH2OH O O NH2 OH CH2OH O O O NH2 OH CH2OH O O OH OH CH2OH O O O OH OH CH2OH O 2) 3) 1) H×nh 2 :1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose 1.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin 1.2.1. Cấu trúc hoá học của chitin Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α, β, γ - chitin [15]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 7 Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mô tả như sau: α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitin: O O HO NHCCH3 O OH OH NHCH2CH3 HO O O HO NHCH2CH3 O OH O O O 1 Tên gọi : Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose. α - Chitin β - Chitin γ - Chitin Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 8 Công thức phân tử: [C8H13O5N]n Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitin [3] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoro- isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [16]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 - 890cm-1. Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan: Chitn CH2OH OH NHCOCH3 Chitosan CH2OH OH NH2 NaOH 40-50% T0cao Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamin: CH2OH OH NHCOCH3 CH2OH OH NH2 Glucosamin HCl 36%Chitn T0cao Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. 1.3. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 9 1.3.1. Cấu trúc hoá học của chitosan [3] Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [13]. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitosan: O O HO NH2 O OH OH NH2 HO O O HO NH2 O OH 2 Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 10 1.3.2. Tính chất lý hoá của chitosan [3] Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6]. Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Một số dẫn xuất chitosan [26]: OO HO HN O OH OO HO NH O OH OO HO NH3+ O OH OO HO NH3+ O OCH2CH2SO3- OO HO NHCH2COOH O OCH2COOH OO HO NHAc O OCH2CH2CN OO HO NHAc O OCS2-Na+ OO HO N=CHR O OH OO HO NHR O OH OO HO NHCH2COOH O OH OO HO NHAc O OCH2CHOHR OO HO NH2 O OH OO -O NHAc O O-Na+ OO RH2CO NHAc O OCH2R OO HO NHAc O OCH2COOH OO HO NHAc O OH Na+ Chitosan Chitin Crosslinked Chitosan Chitosan salts Sulfoethylchitosan N,O-carboxymethylchitosan Cyanoethylchitin Chitin xanthogenate Alkalichitin Alkylchitin Carboxmethylchitin Hydroxyalkylchitin N-carboxymethylchitosan N-alkylchitosan Schiff base Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 11 1.3.3. Tính chất sinh học của chitosan [5] Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18]. Chúng có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20]. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [21]. Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23]. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [24]. 1.3.4. Độc tính của chitosan [5] Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [25]. Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [25]. Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích luỹ ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách. Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương [27]. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 12 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên Thế giới [3] Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [16]. Việc nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phuc vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thuỷ sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin - chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin - chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin - chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2. Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thuỷ sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa Học Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 13 Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam,… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin - chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm. Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [7]. Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzym như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên. Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ xung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng. Những ứng dụng của chitin - chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày càng phát triển. Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo [4], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu [10], trị bỏng nhiệt [11]… Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi. Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng. Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả. Chitin - chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh. Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng nhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ. Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzym và tế bào. Enzym cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzym trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích. Enzym cố định được Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 14 sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác. Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzym cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao. Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học. Do có cấu trúc tương tự như xellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy. Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn. Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in [5]. Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được axit và kiềm nhẹ. Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải col… Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH+4. Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng. Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm. Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm. Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước. Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau : • Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin - chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+. Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu. • Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào. • Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 15 Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó. 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan). Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axit không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn. Công thúc cấu tạo của glucosamin: C C C C C CH2OH O O OH OH NH2 OH CH2OHH OH NH2H HHO OHH H O HO HO NH2 OH OH 3 OHC OH NH2 OH OH OH Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D- glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine. Công thức phân tử: C6H13O5N Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 16 Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform. Một số phản ứng của glucosamin [14]: • Phản ứng tráng bạc: Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng: C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OH C5H12O4NCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O 500C • Phản ứng với Cu(OH)2. Sản phẩm có màu xanh nhạt. CHO CHNH2 CHOH CHOH CHOH CH2OH + Cu(OH)22 CHO CHNH2 CHO CHO CHOH CH2OH CHO CHNH2 CHOH CH2OH Cu H OHC OHCH + 2 H2O • Phản ứng với C6H5CH=O. Phản ứng xác nhận có mặt của NH2. Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo sánh màu nâu: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 17 CHO CHNH2 CHOH CHOH CHOH CH2OH CHO CHN CHOH CHOH CHOH CH2OH + CHO HC H2SO4d 500C + H2O 1.6. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc. 1.6.1. Glucosamin hydroclorua. Công thức cấu tạo: OHC OH NH2 OH OH OH HCl 4 Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride. Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63 Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi. Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C Tan được trong nước 0,1g/ml 1.6.2. Glucosamin sulfat Công thức cấu tạo: OHC OH NH2 OH OH OH H2SO4 5 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 18 Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate. Công thức phân tử: C6H13O5N.H2SO4 Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24 1.6.3. Acetyl glucosamin Công thức cấu tạo: OHC OH NHAc OH OH OH 6 Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D- (+)-glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine. Công thức phân tử: C8H15O6N Phân tử lượng: Macetylglucosamin = 221,21 Điểm nóng chảy: 201 - 2100C Tan được trong nước, 0,1g/ml 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9] Glucosamine là một aminomonosacharit được thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan. Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường. Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp. Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen và proteoplycan. Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào sụn. Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản Hình 5 : Đau xương cột sống Hình 6 : Khớp nối Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 19 mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [ 9]. Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển. Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển [9]. Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp. Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80). Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]. Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp. Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là: • Glucosamin hydroclorua. • Glucosamin sulfat. • Acetyl glucosamin. Trong thực nghiệm trên thỏ con, người ta thấy glucosamin chỉ làm tăng thành phần các proteoglycan trong các vị trí mô sụn hư cần phải sửa chữa mà không có tác dụng tương tự trên phần sụn khớp bình thường. Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp. Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald Hình 7 :Các vị trí khớp nối Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 20 Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau. Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều. Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID. Nhược điểm của thuốc NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ. Một vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc. Trước đây glucosamin được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin, chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp. Hiện nay cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp. Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yếu cầu trên lâm sàng. Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như : Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9]. Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài. Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [8]: 1. Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài. Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt Nam Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 21 2. Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID. 3. Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn. Sau đó ngưng sử dụng NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục được duy trì theo kiểu tuyến tính. 4. Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc. Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó. 5. Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy. Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn có trong dạ dày. Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫn với một lượng lớn ion Cl- và ion H+. Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muối glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có mặt trong dạ dày. 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và tại Việt Nam 1.8.1. Trên thế giới 1.8.1.1. Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3] Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%). Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô. Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 1500C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70%. Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 22 Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất. 1.8.1.2. Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3] Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C; tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C, và đem xay nhỏ. Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần bã. Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã. Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete. Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem. Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin. 1.8.1.3. Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3] Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ. Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C, sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp. Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính, thu được chitosan. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 23 Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố. Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác aceton có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao. Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay. 1.8.1.4. Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17] Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40C trong thời gian 48 giờ. Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7. Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5%. Sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm. Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7. Sản phẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng ở 90 - 1000C trong 2,5 giờ. Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7, sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether. Sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm. Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g. Hiệu suất 44,3%. 1.8.2. Tại Việt Nam 1.8.2.1. Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3] Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính. Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1 giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin. Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan. Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp. Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 24 1.8.2.2. Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam [3] Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau. Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửa trung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính. Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan. Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn. 1.8.2.3. Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3] Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửa trung tính. Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên. Sản phẩm đem làm khô thu được chitin. Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu. Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hóa chất xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm. 1.8.2.4. Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học [3] Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực hiện theo các bước : khử khoáng, khử protein và deacetyl. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 25 Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hóa học. Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng proteaza và deacetyl bằng enzym deacetylaza. Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5giờ. Rửa sạch đến pH= 7. Sau đó khử protein bằng papain 13%, tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 - 5,5, ở nhiệt độ 70 - 800C trong thời gian 4 giờ. Rửa sạch, tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng. Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ. Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan sạch. Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp, trong và mềm mại. Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Tuy nhiên điều kiện khó khăn do việc tìm mua hoặc sản xuất enzym deacetylaza nên công đoạn deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc. 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3] Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7. Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ. Tẩy màu rửa sạch, sấy khô. Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ. Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện. Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh. Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C. 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14] Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô. Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô. Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%, đun sôi. Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô. Chitin thu được có màu trắng Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 26 phớt hồng. Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 1000C, tẩy màu băng than hoạt tính, để kết tinh và lọc. Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng. Hiệu suất quá trình 51,4%. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 27 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu *Vật liệu: Vỏ tôm *Hóa chất: Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết như axit hydroclorua (HCl), natri hydroxit (NaOH), kali permanganat (KMnO4), axit oxalic (C2H2O4), oxi già (H2O2), axit acetic CH3COOH, ngoài ra còn có các dung môi khác như nước cất, methanol, ethanol… *Dụng cụ thí nghiệm: Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế, thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinh hàn hồi lưu, dụng cụ lọc… 2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thu được chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thu được chitosan. 2. Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan. 3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng. 4. Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR, 1H-NMR, 13C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam. So sánh với các số liệu phổ đã công bố để xác định cấu trúc sản phẩm. - Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãng Nicolet. - Đo phổ 1H – NMR và 13C – NMR trên máy Bruker AC- 500MHz trong dung môi D2O. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 28 5. Kiểm tra, đo một số thông số như nhiệt độ nóng chảy trên máy Boetius – MK (Đức). 6. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. 7. Phưong pháp xác định hàm lượng chất không tan. a) Nguyên lý: Chitosan tan được trong axit acetic loãng, còn chitin và các tạp chất khác thi không tan. b) Tiến hành : Cân chính xác a gam chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1%, khuấy đảo 60 phút cho chitosan tan hết rồi lọc, rửa cặn bằng axit acetic loãng, sau đó rửa lại bằng nước cất và đem sấy khô đến khối lượng không đổi. Hàm lượng chất không tan được tính theo công thức: (%)100*(%) a BAX −= Trong đó: A : khối lượng phễu lọc + giấy + tạp chất sau khi sấy (g). B : khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g). a : khối lượng chitosan sử dụng (g). X : Hàm lượng chất không tan (%). 8. Phương pháp xác định hiệu suất quá trình bằng phương pháp trọng lượng. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 29 Chương III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua