Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn

và sưng phù đầu ở lợn. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này ngoài việc chế tạo kháng thể chống lại các kháng nguyên thân của vi khuẩn, còn phải chế tạo được các kháng thể đặc hiệu để trung hòa độc tố của vi khuẩn. Để có thể chế tạo được kháng thể kháng độc tố, bước đầu tiên là chế tạo được kháng nguyên độc tố an toàn để miễn dịch cho động vật thí nghiệm. 3.2.1. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của E. coli Từ bộ giống gồm 10 chủng E. coli phân lập được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu động thái sinh trưởng của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Chúng tôi nuôi cấy 10 chủng E. coli ở điều kiện 370C, sau đó theo dõi sự biến động về số lượng vi khuẩn và pH sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 11. Bảng 11: Động thái sinh trưởng của các chủng E. coli trong bộ giống đã chọn Chủng E. coli Thời gian nuôi cấy (điểm khảo sát)T 0h (1) 24h (2) 48h (3) 72h (4) Hanco 1 CFU(107/ml) 0 142.0 85.5 52.25 pH 7.2 5.62 7.01 7.31 Hanco 2 CFU(107/ml) 0 115 83.5 52 pH 5.76 6.46 7.73 Hanco 3 CFU(107/ml) 0 129.5 75.5 22.6 pH 7.2 5.72 6.01 7.81 Hanco 4 CFU(107/ml) 0 103.5 73.9 32.5 pH 7,2 5.61 6.03 6.21 Hanco 5 CFU(107/ml) 0 107 74.9 40 pH 7,2 5.66 5.98 6.39 Hanco 6 CFU(107/ml) 0 108 74.6 39 pH 7,2 5.73 6.95 7.48 Hanco 7 CFU(107/ml) 0 26.5 18.7 16 pH 7,2 5.88 6.52 7.17 Hanco 8 CFU(107/ml) 0 141 98.5 64 pH 7,2 5.96 6.58 7.77 Hanco 9 CFU(107/ml) 0 129.5 62.1 35.7 pH 7,2 5.65 6.25 7.12 Hanco 10 CFU(107/ml) 0 132 68.5 24 pH 7,2 5.74 6.72 7.30 3.2.2. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố E. coli. Song song với nghiên cứu động thái sinh trưởng của vi khuẩn, chúng tôi đã tiến hành thử độc lực của dịch nuôi cấy theo từng công thức và môi trường khác nhau bằng cách tiêm cho chuột bạch. Chúng tôi đã chế tạo 9 loại môi trường với các chỉ tiêu dinh dưỡng khác nhau (phù hợp với yêu cầu dinh dưỡng của E. coli trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo) nhằm tìm kiếm một môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và sản sinh độc tố của E. coli. Chỉ tiêu dinh dưỡng của các loại môi trường được trình bày ở bảng 12. Bảng 12: Chỉ tiêu dinh dưỡng của các môi trường nuôi cấy Môi trường Đạm amin (mg/ml) Tryptophan (mg%) Pepton (gr%) NaCl (%) pH MT1 1.297 17.5 2.1 0.351 7.15 MT2 2.330 50.0 2.8 1.390 7.00 MT3 1.760 25.0 2.2 0.769 7.13 MT4 0.440 11.0 2.4 0.910 7.26 MT5 1.205 34.0 2.6 0.806 7.40 MT6 2.160 20.0 3.0 0.720 7.22 MT7 2.820 15.0 3.0 0.860 6.97 MT8 1.650 24.0 3.0 0.430 7.04 MT9 1.360 20.9 2.07 0.183 7.27 Với 9 loại môi trường ở trên, chúng tôi nuôi cấy chủng Hanco 3 với các công thức nuôi cấy khác nhau để theo dõi sự liên quan giữa động thái sinh trưởng với độc lực của nước lọc canh trùng (độc tố) trên động vật thí nghiệm Sau khi nuôi cấy trên các môi trường có các công thức nuôi cấy khác nhau, dịch nuôi cấy sống được ly tâm ở 7000g/15 phút, thu phần nước trong, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 μm, dung dịch thu được sau khi lọc gọi là dịch chứa độc tố, ký hiệu là T2, chúng tôi tiến hành tiêm dịch qua lọc T2 cho chuột bạch 18 – 20 gam. Kết quả xác định độc lực giết chuột được trình bày ở bảng 13. Bảng 13: Độc lực của dịch nuôi cấy được xác định bằng cách tiêm dịch qua lọc T2 Môi trường Tỷ lệ chết/ tiêm Đường tiêm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 MT1 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT2 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 1/4 1/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 0/4 1/4 0/4 MT3 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 MT4 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 0/4 1/4 0/4 MT5 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 1/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 MT6 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT7 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 MT8 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT9 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 1/4 1/4 1/4 1/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 2/4 2/4 1/4 2/4 Qua bảng 13 chúng tôi thấy độc tố này yếu, tiêm dưới da không phát hiện được (chuột không chết) mà chỉ phát hiện được bằng tiêm phúc xoang hoặc tĩnh mạch. Cũng từ kết quả trên, chúng tôi thấy môi trường 9 là môi trường mà E. coli sản sinh độc tố mạnh nhất. Các công thức nuôi cấy 5, 6, 7, 8, 9 là những công thức nuôi cấy mà E. coli có thể sản sinh độc tố. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại những công thức này trên môi trường 9. Kết quả được trình bày ở bảng 14. Bảng 14: Độc lực được xác định với liều tiêm và đường tiêm khác nhau Tỷ lệ chuột chết Công thức Tiêm phúc xoang Tiêm tĩnh mạch ∑số chuột chết /chuột tiêm 0,2ml 0,4ml 0,2ml 0,4ml CT5 1/4 2/4 1/4 3/4 7/12 CT6 0/4 1/4 0/4 2/4 3/12 CT7 0/4 1/4 1/4 2/4 4/12 CT8 0/4 1/4 0/4 1/4 2/12 CT9 0/4 1/4 0/4 2/4 3/12 ĐC 0/4 0/4 0/4 0/4 0/16 Ghi chú: ĐC - Đối chứng là môi trường vô trùng Qua bảng 14 chúng tôi thấy với công thức 5 E. coli sản sinh độc tố mạnh nhất. Lặp lại và mở rộng, chúng tôi chế tạo dịch nuôi cấy độc tố với từng chủng E. coli bằng môi trường 9 và nuôi cấy theo công thức 5, sau đó kiểm tra độc lực dịch nuôi cấy với từng chủng và đa chủng (trộn 10 chủng) bằng cách: tiêm 0,4 ml/con dịch qua lọc T2 vào tĩnh mạch chuột bạch, theo dõi tỷ lệ chuột chết/tiêm. Kết quả được trình bày ở bảng 15. Bảng 15: Độc lực của độc tố T2 do các chủng E. coli riêng rẽ và kết hợp tạo ra Giống Hanco Đường tiêm/ liều tiêm (ml) Số chuột TN (con) Số chuột ốm/tiêm Tỷ lệ ốm (%) Số chuột chết/tiêm Tỷ lệ chết (%) Hanco 1 TM/0.4 5 4/5 80 0/5 0 Hanco 2 TM/0.4 5 5/5 100 0/5 0 Hanco 3 TM/0.4 5 5/5 100 1/5 20 Hanco 4 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 5 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 6 TM/0.4 5 5/5 100 5/5 100 Hanco 7 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 8 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 9 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 10 TM/0.4 5 4/5 80 0/5 0 Poly (Đa giá) TM/0.4 5 5/5 100 4/5 80 Đối chứng TM/0.4 5 0/5 0 0/5 0 Ghi chú: ĐC - Đối chứng là môi trường vô trùng “chuột ốm” là chuột sau khi tiêm rất mệt, thở mạnh, thở dốc, lông dựng lên, nằm gục, không muốn hoạt động, tụ thành từng đám, bỏ ăn. Có con thỉnh thoảng bị co dật, có con điên cuồng, chạy lung tung, có con liệt chân sau, đi kéo lê trên sàn. Trước khi chuột chết có thể co dật hoặc không; cũng có trường hợp chuột chết nhanh, co dật mấy lần rồi chết, sau 48 giờ con nào không chết thì hồi phục dần. Kết quả cho thấy từng chủng có độc lực của độc tố khác nhau, từng chủng có thể làm chuột chết hoặc ốm khác nhau (chuột đối chứng không có hiện tượng này). Nhưng ở độc tố poly (trộn nhiều chủng) thì độc lực thể hiện rõ rệt. Đó là sự cộng hưởng của các độc tố. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi là chế tạo kháng nguyên có chứa hỗn hợp độc tố của nhiều chủng E. coli, để kháng thể thu được có thể đối phó với tính phức tạp của E. coli và tính đa dạng bệnh của nó gây ra cũng như dịch tễ học của các bệnh này trong thực tế chăn nuôi. 3.3. Nghiên cứu phương pháp bất hoạt và giải độc kháng nguyên 3.3.1. Nghiên cứu phương pháp làm bất hoạt và giải độc Kế thừa những nghiên cứu trước đây về E. coli và độc tố E. coli, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bất hoạt và giải độc kháng nguyên bằng các phương pháp sau: + Bất hoạt và giải độc ở nhiệt độ 700C trong 30 phút. + Bất hoạt và giải độc bằng formol 3 0/00. + Bất hoạt và giải độc bằng phenol 5 0/00. + Bất hoạt và giải độc bằng thiomersal 0,40/00. Môi trường sau khi nuôi cấy đạt tiêu chuẩn được gọi là dịch nuôi chứa độc tố, được bất hoạt và giải độc bằng các phương pháp trên. Dịch nuôi sau khi xử lý, được đặt trong tủ ấm 370C trong 24h. Sau đó chúng tôi tiến hành kiểm tra vô trùng theo thường quy trên các môi trường khác nhau để xem ở điều kiện đó có bất hoạt được vi khuẩn hay không. Kết quả được trình bày ở bảng 16. Bảng 16: Kết quả kiểm tra vô trùng dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt Canh trùng xử lý Kết quả kiểm tra trên môi trường Kết quả NA NB BA SA Thio 700C/30 phút - - - - - Đạt Formol 3 0/00 - - - - - Đạt Phenol 5 0/00 - - - - - Đạt Thiomersal 0.4 0/00 - - - - - Đạt (-): không có vi khuẩn mọc (+): có vi khuẩn mọc Bằng kết quả kiểm tra vô trùng chúng tôi nhận thấy cả 4 phương pháp vô hoạt và giải độc trên đều có khả năng bất hoạt E. coli. Tiếp theo chúng tôi kiểm tra hiệu quả giải độc của các phương pháp trên bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt, lấy nước trong lọc qua màng 0,2 mm thu được dịch lọc gọi là “giải độc tố”, sau đó tiêm giải độc tố đó cho chuột bạch 18 - 20 gam với liều tiêm 0,4 ml vào tĩnh mạch và so sánh với tiêu chuẩn độc tố ở trên (tiêu chuẩn để đánh giá độc tố E. coli đó là cứ 0,4ml độc tố khi tiêm tĩnh mạch cho chuột 18 – 20g, phải gây chết ít nhất là 40% tổng số chuột được tiêm). Nếu giải độc tố gây chết tới 40% số chuột thí nghiệm thì độc tố đó chưa được giải độc, tức là phương pháp giải độc đó không đạt và ngược lại. Kết quả được trình bày ở bảng 17. Bảng 17: Tính an toàn của dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc Phương pháp bất hoạt Liều tiêm (ml) Đường tiêm Tỷ lệ chuột chết/chuột tiêm % chuột chết Hiệu quả giải độc 700C/30 phút 0,4 TM 2/10 20% Đạt Formol 3 0/00 0,4 TM 1/10 10% Đạt Phenol 5 0/00 0,4 TM 6/10 60% Không đạt Thiomersal 0,40/00 0,4 TM 10/10 100% Không đạt Kết quả trên cho thấy: Phương pháp giải độc bằng phenol và thiomersal không những không mang lại hiệu quả giải độc mà còn làm tăng tính độc của độc tố, do đó không thể dùng hai hóa chất này để giải độc được. Phương pháp giải độc bằng formol 30/00 và 700C/30 phút có hiệu quả giải độc tương đối tốt. 3.3.2. Kiểm tra tính kháng nguyên của dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt Tiếp theo chúng tôi kiểm tra tính kháng nguyên của dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc bằng formol 30/00 và 700C/30 phút. Chúng tôi dùng dịch nuôi chứa độc tố đã đựơc bất hoạt và giải độc để tiêm miễn dịch cho chuột bạch 18 - 20 gam liều 0,4 ml/con vào dưới da. Sau tiêm 21 ngày lấy máu chuột, chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giá ngưng kết. Kết quả trình bày ở bảng 18. Bảng 18: Tính kháng nguyên của dịch nuôi chưa độc tố sau khi đã bất hoạt và giải độc Phương pháp bất hoạt Đường tiêm Liều tiêm (ml) Số lượng (con) Hiệu giá ngưng kết HGKT trung bình Formol 30/00 DD 0.4 5 1/128 1/64 1/64 1/256 1/128 1/128 700C/30 phút DD 0.4 5 1/128 1/32 1/64 1/64 1/32 1/64 * “DD”: dưới da Qua bảng 18 chúng tôi thấy chuột tiêm dịch nuôi chứa độc tố đã được xử lý bằng formol nồng độ 30/00 cho hiệu giá kháng thể cao hơn (trung bình 1/128). Như vậy phương pháp bất hoạt và giải độc bằng formol 30/00 ở 37oC trong 24h có hiệu quả tốt nhất. Dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc, độc lực giảm đi nhưng vẫn có tính kháng nguyên. 3.3.3. Xác định tính kháng nguyên của giải độc tố Độc tố của E. coli là một yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình gây bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu ở lợn. Vì vậy, sau khi đã chế tạo được dịch nuôi chứa giải độc tố như trên, cần xác định tính kháng nguyên của giải độc tố trong dịch nuôi chứa độc tố đã giải độc. 3.3.3.1. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của giải độc tố Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của giải độc tố trên đối tượng là chuột bạch với phương pháp như sau: Chế tạo giải độc tố E. coli (Kháng nguyên độc tố T2): dịch nuôi cấy chứa độc tố (hỗn hợp 10 chủng E. coli) được gọi là dịch nuôi chứa độc tố E. coli đa giá được giải độc bằng focmol 30/00 ở 37oC/24h, ly tâm với tốc độ 7000g/15phút, lấy nước trong lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 μm, thu dịch lọc, dịch lọc đó gọi là giải độc tố  E. coli đa giá (hỗn hợp giải độc tố 10 chủng E. coli). Nếu chế tạo với một chủng E. coli thì gọi là giải độc tố T2 chủng E. coli đó. Chế tạo kháng huyết thanh: Chuột bạch được tối miễn dịch bằng giải độc tố đa giá theo quy trình sau: Lần tiêm 1 2 3 4 5 6 Đường tiêm DD DD FX DD FX DD Liều tiêm (ml) 0.5 0.8 0.4 1.0 0.8 1.2 Mỗi mũi được tiêm cách nhau 1 tuần. 21 ngày sau khi tiêm mũi cuối cùng thì tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh. Kiểm tra sự đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp kiểm tra kháng thể trong huyết thanh chuột miễn dịch bằng các phản ứng huyết thanh học sau: 3.3.3.2. Phản ứng kết tủa trong ống nghiệm giữa giải độc tố với huyết thanh của chuột miễn dịch giải độc tố Huyết thanh được ly tâm (tối thiểu 4500g/phút) loại hết cặn (nếu có). Huyết thanh được pha loãng theo cấp số 2 như thường quy, bổ sung kháng nguyên độc tố vào huyết thanh đã pha loãng theo tỷ lệ thể tích 1:1. Hiệu giá được xác định là độ pha loãng huyết thanh cao nhất mà vẫn thấy kết tủa. Kết tủa xuất hiện rõ sau 36 – 48 giờ và kết luận ở 72 giờ sau phản ứng. Kết quả của phản ứng được trình bày ở bảng 18. Hình 3: Phản ứng kết tủa trên ống nghiệm giữa độc tố T2 với kháng huyết thanh Bảng 18: Phản ứng kết tủa trong ống nghiệm giữa kháng nguyên độc tố đơn giá và đa giá E. coli với huyết thanh chuột tiêm giải độc tố E. coli đa giá (hiệu giá huyết thanh đa giá kháng độc tố E. coli) Kháng nguyên Định tính Định lượng Đối chứng 1 Đối chứng 2 T2Hanco 1 + 1/16 - - T2Hanco 2 + 1/8 - - T2Hanco 3 + 1/4 - - T2Hanco 4 + 1/4 - - T2Hanco 5 + 1/8 - - T2Hanco 6 + 1/2 - - T2Hanco 7 + 1/4 - - T2Hanco 8 + 1/8 - - T2Hanco 9 + 1/4 - - T2Hanco 10 + 1/16 - - T2 Poli + 1/16 - - Đối chứng 1: Huyết thanh kháng E. coli + Môi trường Đối chứng 2: Huyết thanh âm tính + Độc tố Qua bảng 18 chúng tôi thấy, phản ứng giữa kháng nguyên độc tố đơn giá và đa giá E. coli với huyết thanh chuột đều cho kết quả dương tính, ngoài ra còn xác định được hiệu giá của kháng độc tố, tức là đã có sự kết hợp giữa độc tố và kháng thể đặc hiệu tương ứng. Điều này chứng tỏ kháng nguyên độc tố E. coli đã gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch. 3.3.3.3. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trong thạch (ADP) giữa kháng nguyên độc tố với huyết thanh chuột được miễn dịch giải độc tố. Để phân tích thêm về độc tố E. coli trong hỗn hợp độc tố, chúng tôi tiến hành phản ứng ADP theo kỹ thuật Owchterlony. Thành phần tham gia phản ứng gồm có, kháng nguyên độc tố được bố trí ở giếng trung tâm, còn các giếng xung quanh là huyết thanh chuột miễn dịch được pha loãng theo cấp số 2. Kết quả được trình bày ở bảng 19. Bảng 19: Phản ứng ADP giữa kháng nguyên độc tố E. coli đơn giá và đa giá với huyết thanh chuột miễn dịch giải độc tố E. coli (hiệu giá huyết thanh đa giá kháng độc tố E. coli) Kháng nguyên Định tính Hiệu giá kết tủa Đối chứng 1 Đối chứng 2 T2Hanco 1 + 1/4 - - T2Hanco 2 + 1/8 - - T2Hanco 3 + 1/4 - - T2Hanco 4 + 1/8 - - T2Hanco 5 + 1/4 - - T2Hanco 6 + 1/8 - - T2Hanco 7 + 1/4 - - T2Hanco 8 + 1/8 - - T2Hanco 9 + 1/4 - - T2Hanco 10 + 1/8 - - T2 Poli + 1/16 - - * Đối chứng 1: Huyết thanh kháng E. coli + Môi trường Đối chứng 2: Huyết thanh âm tính + Độc tố Hình 4. Phản ứng ADP giữa độc tố T2 với kháng huyết thanh Phản ứng ADP dương tính một lần nữa khẳng định chắc chắn về tính kháng nguyên của độc tố, ngoài ra ta còn xác định được hiệu giá kết tủa, nghĩa là kháng nguyên độc tố gây miễn dịch mạnh. Kết quả của các phản ứng huyết thanh trên cho thấy: Giải độc tố E. coli có tính kháng nguyên tốt, đã kích thích đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch. Kháng độc tố trong huyết thanh chuột được miễn dịch giải độc tố có thể được phát hiện qua phản ứng kết tủa với kháng nguyên độc tố E. coli trong ống nghiệm, qua phản ứng ADP trong gel thạch. Qua hai phản ứng đó có thể xác định được hiệu giá của kháng độc tố. Mỗi chủng E. coli có khả năng sản sinh độc tố với hàm lượng khác nhau. Độc tố đa giá mạnh hơn và gây miễn dịch tốt hơn độc tố đơn giá. 3.4. Nghiên cứu các chất bổ trợ làm tăng miễn dịch Chúng tôi sử dụng các chất bổ trợ: ISA và IMS của hãng Septic, Al(OH)3 và alum của SPI Pharma. Mỗi chất bổ trợ được bổ sung vào dịch nuôi chứa độc tố đã được bất hoạt và giải độc (gọi là tắt là kháng nguyên) với tỷ lệ thích hợp. Trước tiên chúng tôi tiến hành thử an toàn trên động vật thí nghiệm là chuột bạch 18 – 20 gam. Kết quả thu được trình bày ở bảng 20. Bảng 20: Tính an toàn của kháng nguyên có chứa các chất bổ trợ khác nhau Kháng nguyên có chất bổ trợ Tỷ lệ chuột chết/tiêm theo đường tiêm Kết luận Dưới da (1 ml) Phúc xoang (0,5) Nhũ hóa ISA 6/10 7/10 Không đạt Nhũ hóa IMS 4/10 4/10 Không đạt AL(OH)3 0/10 0/10 Đạt Alum 0/10 0/10 Đạt Từ kết quả thử an toàn, chúng tôi nhận thấy 2 sản phẩm có bổ trợ Al(OH)3 và alum khi bổ sung vào kháng nguyên E. coli an toàn hơn so với sản phẩm có bổ trợ dầu khoáng ISA, IMS. Từ đây chúng tôi sử dụng 2 sản phẩm này để tiếp tục nghiên cứu hiệu lực trên động vật thí nghiệm là chuột bạch. Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hiệu lực của hai sản phẩm trên bằng cách miễn dịch liều 0,4ml/con theo đường tiêm dưới da trên chuột bạch và so sánh với đối chứng (đối chứng là chuột miễn dịch kháng nguyên không có chất bổ trợ). Sau khi tiêm 21 ngày, tiến hành lấy máu chuột, chắt huyết thanh, kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Kết quả cụ thể như sau: Bảng 21: Kiểm tra tính miễn dịch của kháng nguyên có bổ sung các chất bổ trợ Chất bổ trợ Nồng độ Hiệu giá từng con Hiệu giá trung bình Al(OH)3 10/00 1/128 1/64 1/128 1/128 1/128 1/115,2 20/00 1/256 1/128 1/256 1/256 1/128 1/204,8 30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/128 1/179,2 40/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 Alum 0.50/00 1/128 1/64 1/128 1/128 1/64 1/102,4 10/00 1/256 1/128 1/128 1/256 1/128 1/179,2 20/00 1/128 1/512 1/128 1/256 1/128 1/230,4 30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 Đối chứng (không có chất bổ trợ) 1/128 1/64 1/64 1/128 1/128 1/102,4 Nhìn chung chuột được miễn dịch bằng kháng nguyên có chất bổ trợ có hiệu giá kháng thể cao hơn so chuột đối chứng, cụ thể: Đối với chất bổ trợ là Al(OH)3 ở mỗi nồng độ khác nhau thì gây ra đáp ứng miễn dịch khác nhau trên động vật thí nghiệm. Trong đó nồng độ 20/00 cho kết quả tốt nhất thể hiện qua hiệu giá kháng thể của huyết thanh chuột là cao nhất (hiệu giá trung bình đạt 1/204,8). Nồng độ tối ưu của chất bổ trợ alum cũng là 20/00 (hiệu giá trung bình đạt 1/230,4). Từ những kết quả trên, chúng tôi quyết định chọn alum bổ sung với nồng độ 2 0/00 làm chất bổ trợ cho kháng nguyên và sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.5. Nghiên cứu tính an toàn của kháng nguyên Sau khi đã chọn được chất bổ trợ thích hợp là alum 20/00 chúng tôi sản xuất 3 lô liên tục để khảo sát tính an toàn của kháng nguyên này trên nhiều loại động vật khác nhau: chuột lang 250 - 300 gam , thỏ 1800 - 2000 gam và bản động vật là gà hậu bị. Mỗi loài động vật có một liều lượng kháng nguyên khác nhau, đường đưa thuốc vào là tiêm dưới da, riêng đối với gà đường đưa thuốc vào là tiêm bắp. Sau khi tiêm, chúng tôi tiến hành theo dõi các phản ứng của động vật thí nghiệm và số lượng động vật bị chết trên tổng số động vật được tiêm. Kết quả thí nghiệm được thống kê ở bảng 22. Qua bảng kết quả, chúng tôi thấy rằng với công thức chế tạo là kháng nguyên + alum 2 0/00, khi tiến hành thử an toàn với ba lô sản xuất khác nhau, đều cho kết quả an toàn trên các động vật thí nghiệm. Cụ thể là không có trường hợp nào động vật thí nghiệm bị chết hoặc hoặc phản ứng với chế phẩm. Bảng 22: Kết quả thử tính an toàn của các lô kháng nguyên trên động vật Lô thí nghiệm Số chuột lang phản ứng /số tiêm Số thỏ phản ứng/số tiêm Số gà phản ứng/số tiêm Liều dd (ml) Liều dd (ml) Liều dd (ml) Liều tiêm bắp (ml) 1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3,0 2,0 3,0 4,0 2,0 3,0 4,0 Lô 1 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/7 0/8 0/8 0/8 0/8 0/7 ĐC lô 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/5 0/4 Lô 2 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/6 0/6 0/7 0/7 0/7 0/7 ĐC lô 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/3 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Lô 3 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/9 ĐC lô 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Tổng TN 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/21 0/22 0/23 0/23 0/23 0/23 Tổng ĐC 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/11 0/12 0/12 0/12 0/13 0/12 Ghi chú: Động vật không có phản ứng khi được tiêm chế phẩm. Đối chứng:Môi trường + formol 30/00 + alum 20/00 3.6. Nghiên cứu tính miễn dịch của kháng nguyên và nghiên cứu thời gian sản sinh miễn dịch sau khi tiêm Để nghiên cứu tính miễn dịch và thời gian tạo miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên chuột bạch 18-20 gam, với số lượng là 40 con cho một lần thí nghiệm. Cứ một tuần sau khi miễn dịch, tiến hành lấy máu 10 con để kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu của các chuột thí nghiệm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm cụ thể như sau: Bảng 23: Tính miễn dịch và thời gian tạo miễn dịch Tiêm dưới da 0,4ml/con HGKT trung bình trong huyết thanh chuột sau tiêm 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần HGKT thí nghiệm lần 1 - 1/32 1/218 1/230 HGKT thí nghiệm lần 2 - 1/34 1/230 1/230 HGKT thí nghiệm lần 3 - 1/28 1/205 1/218 HGKT chuột đối chứng (chuột tiêm kháng nguyên không có chất bổ trợ) - 1/28 1/128 1/115 Bảng 23 và hình 5 cho thấy sau khi miễn dịch một tuần các chuột thí nghiệm chưa có sự đáp ứng miễn dịch, sang tuần thứ hai trong huyết thanh chuột đã bắt đầu có kháng thể kháng lại kháng nguyên E. coli nhưng hiệu giá vẫn còn thấp (khoảng 1/32). ở tuần thứ ba thứ tư hiệu giá kháng thể là cao nhất (khoảng 1/128 – 1/256). Kết quả trên cho thấy, kháng huyết thanh của những động vật thí nghiệm được miễn dịch kháng nguyên có thêm chất bổ trợ alum 2 0/00 có hiệu giá cao hơn so với huyết thanh của những con đối chứng (được miễn dịch kháng nguyên không có chất bổ trợ). Điều này chứng tỏ kháng nguyên có bổ sung thêm chất bổ trợ alum 2 0/00 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch tốt. 3.7. chế tạo kháng nguyên thích hợp gây miễn dịch cho gà Với bộ giống chuẩn đã được chọn lọc và ổn định, chúng tôi tiến hành chế tạo kháng nguyên để miễn dịch cho gà. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy E. coli theo công thức môi trường và công thức nuôi cấy đã được nghiên cứu ở trên, để chế tạo kháng nguyên, phục vụ cho quá trình miễn dịch gà. Có 15 lô kháng nguyên đã được chế tạo và được kiểm tra các tính chất về: đậm độ vi khuẩn, độ thuần khiết, vô trùng và an toàn. Kết quả ở bảng 24. Bảng 24: Kiểm tra chất lượng các lô kháng nguyên thử nghiệm Lô kháng nguyên Đậm độ vi khuẩn (CFU/ml) Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra vô trùng Độ an toàn Đánh giá chung Lô 1 8 x108 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 2 8.5 x108 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 3 1.5 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 4 2 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 5 1x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 6 3 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 7 1.5 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 8 2,5 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 9 1.5 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 10 2 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 11 3,5 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 12 1 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 13 8,5 x108 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 14 3 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 15 2 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Theo kết quả bảng 24: 15 lô kháng nguyên đã sản xuất đều đạt tiêu chuẩn và được đưa vào sử dụng, gây miễn dịch cho gà. 3.8. nghiên cứu quy trình miễn dịch cho gà Chúng tôi chọn ra 3 lô kháng nguyên đã chế tạo là: lô 6, lô 11 và lô 14 để tiến hành thử nghiệm với 3 qui trình miễn dịch trên 3 đàn gà mái đẻ, mỗi đàn 10 con. Lấy máu gà kiểm tra HGKT trong huyết thanh gà theo định kỳ. Kết quả thử nghiệm miễn dịch được trình bày trong bảng 25. Bảng 25: Kết quả thử nghiệm các qui trình miễn dịch trên gà Qui trình miễn dịch Qui trình 1 Qui trình 2 Qui trình 3 HGKT trung bình trong huyết thanh gà (sau khi miễn dịch) Tuần 1 1/3,2 1/4,3 1/2 Tuần 2 1/21,6 1/28,8 1/26,4 Tuần 3 1/32 1/67,2 1/58,6 Tuần 4 1/57,6 1/208 1/121,2 Tuần 5 1/121,6 1/236,8 1/224 Tuần 10 1/120,4 1/244,2 1/211,2 Tuần 12 1/116,2 1/251,4 1/121 Tuần 15 1/56,8 1/121 1/62,4 Sau tiêm nhắc lại 1/57,2 1/265,6 1/112,2 Mức độ phản ứng đối với gà 4-5 giờ sau mỗi lần tiêm miễn dịch cơ sở Gà bắt đầu mệt, giảm ăn trong vòng 05 ngày Gà bắt đầu mệt, giảm ăn trong vòng 02 ngày Gà bắt đầu mệt, giảm ăn trong vòng 04 ngày Sau khi tiêm miễn dịch cao độ 3% gà bị chết, cả đàn mệt mỏi, giảm ăn Gà mệt mỏi, giảm ăn, sau 3 ngày khoẻ lại bình thường Gà mệt mỏi, giảm ăn, sau 3 ngày khoẻ lại bình thường Sau tiêm nhắc lại Gà mệt mỏi, giảm đẻ đến 90% trong 02 ngày, giảm ăn Gà mệt mỏi, giảm đẻ đến 30% trong 01 ngày. Gà mệt mỏi, giảm đẻ đến 50% trong 02 ngày. Qua kết quả thử 3 qui trình ở trên chúng tôi thấy qui trình 2 cho kết quả miễn dịch cao nhất và ổn định nhất nên qui trình này được chọn làm qui trình miễn dịch chính thức. Qui trình miễn dịch kèm theo phụ lục (phụ lục 01) 3.9. xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh và lòng đỏ trứng gà Sau khi chọn được qui trình miễn dịch thích hợp, tiến hành tiêm miễn dịch cho đàn gà đẻ trứng dùng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm kháng thể lòng đỏ trứng. Chúng tôi chọn ra 5 lô kháng nguyên đã chế tạo là: lô 4, lô 6, lô 8, lô 11 và lô 14 để miễn dịch cho 5 đàn gà mái đẻ. Theo dõi hàm lượng kháng thể trong huyết thanh và lòng đỏ trứng gà. Sử dụng hai phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính và ADP để xác định hàm lượng kháng thể (phản ứng ngưng kết nhanh xác định hàm lượng kháng thể kháng với kháng nguyên thân E. coli, phản ứng ADP xác định hàm lượng kháng thể kháng độc tố E. coli). Kết quả định lượng hàm lượng kháng thể trong huyết thanh và trong lòng đỏ trứng gà tương ứng với các lô kháng nguyên miễn dịch được trình bày trong bảng 26. Như vậy, với các lô kháng nguyên khác nhau, sau khi miễn dịch cho gà trong giai đoạn thu hoạch trứng làm nguyên liệu, hiệu giá kháng thể ngưng kết trong huyết thanh gà có hàm lượng luôn ổn định ở 1/128 đến 1/281,6; hiệu giá ADP dao động từ 1/8 đến 1/16. Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh và lòng đỏ trứng gà không chênh lệch nhiều (hiệu giá kháng thể ngưng kết trung bình trong lòng đỏ trứng dao động từ 1/118,2 đến 1/243,2; hiệu giá ADP dao động từ 1/8 đến 1/16 ).. Điều đó chứng tỏ kháng thể của gà sau khi đáp ứng miễn dịch được truyền nhiều vào trong lòng đỏ trứng. Đó chính là điều kỳ diệu và ưu việt của lòng đỏ trứng gà. Bảng 26: Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh và lòng đỏ trứng gà Lô kháng nguyên HGKT trung bình trong huyết thanh HGKT trung bình trong lòng đỏ trứng Ngưng kết nhanh ADP Ngưng kết nhanh ADP Lô 4 1/ 281,6 1/16 1/243,2 1/8 Lô 6 1/128 1/8 1/118,4 1/8 Lô 8 1/230,4 1/16 1/192 1/16 Lô 11 1/256 1/8 1/217,6 1/16 Lô 14 1/268,8 1/8 1/243,2 1/8 3.10. nghiên cứu qui trình sản xuất Trứng thu hoạch từ gà miễn dịch được chúng tôi chế thử sản phẩm theo 5 quy trình sản xuất khác nhau, chọn được QTSX4 là tối ưu, đạt yêu cầu về các tiêu chuẩn: vật lý, vô trùng, HGKT xác định bằng phản ứng ngưng kết đạt từ 1/80-1/100, HGKT xác định bằng phản ứng ADP đạt từ 1/8 - 1/16. Quy trình sản xuất kèm theo phụ lục (phụ lục 02) 3.11. Nghiên cứu qui trình kiểm nghiệm và bảo quản chế phẩm 3.11.1. Khảo sát chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm Theo dõi các chỉ tiêu cảm quan 03 lô sản phẩm; mỗi lô 20 mẫu trong vòng 06 tháng, chúng tôi thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu sản phẩm ở điều kiện bảo quản khác nhau. ở điều kiện nhiệt độ phòng khoảng 25oC, tất cả các mẫu sản phẩm sau 01tháng đã chuyển màu từ vàng sang trắng ngà, có hiện tượng phân lớp, sau 02 tháng có lắng cặn. ở nhiệt độ bảo quản 2-8oC trong 06 tháng tất cả các mẫu sản phẩm đều đạt yêu cầu cảm quan, không thay đổi về màu sắc sản phẩm, độ đồng nhất, không váng, không cặn. Vậy, sản phẩm bảo quản ở 2-8oC là đạt yêu cầu. 3.11.2. Khảo sát độ vô trùng của sản phẩm Dùng 3 lô sản phẩm, mỗi lô 20 mẫu để kiểm tra vô trùng theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCN) (Dược điển Việt Nam II, Tập 3, NXB Y học, trang 498) Sản phẩm được kiểm tra trên các môi trường sau: NA (nutrient agar), NB (nutrient broth), BA (blood agar), SA (sabouraud agar), Thioglycolat Các môi trường kiểm tra sản phẩm được để trong tủ ấm 370C, theo dõi ít nhất 4 ngày, riêng thạch nấm SA để ở nhiệt độ phòng với thời gian theo dõi ít nhất 7 ngày. Sản phẩm được bảo quản ở 2-80C và cứ sau 1 tháng thì kiểm tra vô trùng 01 lần, khảo sát trong 06 tháng. Kết quả trình bày trong bảng 27. 3.11.3. Khảo sát hiệu giá kháng thể trong sản phẩm Xác định bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính và phản ứng ADP giữa sản phẩm được bảo quản ở 2-80C với kháng nguyên và độc tố E. coli tại các thời điểm khác nhau, khảo sát trong 6 tháng. Kết quả khảo sát độ vô trùng và hiệu giá kháng thể trên bảng 27. Từ bảng 27 ta thấy trong điều kiện bảo quản 2-80C, độ vô trùng của sản phẩm được bảo đảm trong 05 tháng. Sau 05 tháng có 04 mẫu trong tổng số 60 mẫu của cả hai lô có tạp trùng nhưng không phát hiện có nấm trong sản phẩm. Hiệu giá kháng thể trong sản phẩm không thay đổi trong suốt thời gian bảo quản. Bảng 27: Kết quả khảo sát chỉ tiêu vô trùng và hgkt trong thời gian bảo quản Lô SX Thời gian theo dõi HGKT Kết quả kiểm tra vô trùng Ngưng kết ADP NA NB BA SA Thio - + - + - + - + - + Lô 02/09/08 (n = 20) T0 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T1 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T2 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T3 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T4 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T5 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T6 1/100 1/16 20 0 18 2 20 0 20 0 20 0 Lô 15/11/08 (n = 20) T0 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T1 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T2 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T3 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T4 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T5 1/80 1/8 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T6 1/80 1/8 20 0 19 1 20 0 20 0 20 0 Lô 28/01/09 (n = 20) T0 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T1 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T2 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T3 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T4 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T5 1/100 1/16 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 T6 1/100 1/16 20 0 19 1 20 0 20 0 20 0 3.11.4. Khảo sát độ an toàn của sản phẩm Bảng 28: Độ an toàn của sản phẩm trên chuột bạch và thỏ Động vật thí nghiệm Đường tiêm Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Kết quả Chuột bạch 5 con Tiêm dưới da Liều 0,4 ml/con Liều 0,4 ml/con Liều 0,4 ml/con Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% chuột sống khoẻ mạnh bình thường 5 con Tiêm phúc xoang Liều 0,4 ml/con Liều0,4 ml/con Liều 0,4 ml/con Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% chuột sống khoẻ mạnh bình thường Thỏ 3 con Tiêm dưới da Liều 3 ml/con Liều 3 ml/con Liều3 ml/con Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% thỏ sống khoẻ mạnh bình thường 3 con Tiêm phúc xoang Liều 5 ml/con Liều 5 ml/con Liều 5 ml/con Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% thỏ sống khoẻ mạnh bình thường Bảng 29: Độ an toàn của sản phẩm trên lợn Động vật thí nghiệm Đường tiêm Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Kết quả Lợn <5 kg ( 20- 30 ngày tuổi) 10con Tiêm bắp thịt Liều 2 ml/kgTT Liều2 ml/kgTT Liều2 ml/kgTT Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% lợn sống khoẻ mạnh bình thường 10 con Tiêm phúc xoang Liều 4 ml/kgTT Liều 4 ml/kgTT Liều4 ml/kgTT Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% lợn sống khoẻ mạnh bình thường Lợn >5 kg (>30 ngày tuổi) 10 con Tiêm bắp thịt Liều 1,5ml/kgTT Liều 1,5ml/kgTT Liều 1,5ml/kgTT Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% lợn sống khoẻ mạnh bình thường 10 con Tiêm phúc xoang Liều 3 ml/kgTT Liều 3 ml/kgTT Liều 3 ml/kgTT Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 100% lợn sống khoẻ mạnh bình thường Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của sản phẩm + Phương pháp đánh giá bằng phản ứng ngưng kết trực tiếp giữa sản phẩm với kháng nguyên E. coli và bằng phản ứng ADP giữa sản phẩm và độc tố E. coli. Pha loãng kháng thể trong sản phẩm bằng nước muối sinh lý theo độ pha loãng khác nhau. Với phản ứng ngưng kết nhanh, lấy một lượng kháng thể đã pha ở mỗi hiệu giá và một lượng kháng nguyên E. coli bằng nhau, trộn đều, để ở nhiệt độ khoảng 250C. Đọc kết quả sau 3 - 5 phút bằng mắt thường. Với phản ứng ADP cũng lấy một lượng kháng thể đã pha ở mỗi hiệu giá và một lượng độc tố E. coli nhỏ vào các giếng, trong đó độc tố E. coli nhỏ vào giếng trung tâm, kháng thể nhỏ vào các giếng xung quanh. Kết quả đọc sau 72 giờ. Đối chứng âm làm tương tự bước trên nhưng thay thế kháng thể của sản phẩm bằng nước sinh lý. Đối chứng dương làm tương tự bước trên nhưng thay thế kháng thể của sản phẩm bằng kháng thể E. coli đã biết. Kết quả: chế phẩm kháng thể đạt hiệu giá ngưng kết ở độ pha loãng ≥1/50, hiệu giá ADP ở độ pha loãng ³ 1/4. + Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của sản phẩm trên chuột: Dùng 20 con chuột bạch trọng lượng trung bình mỗi con 18 - 20g, khoẻ mạnh, chia làm 2 nhóm: Nhóm 1: 10 con, mỗi con tiêm 0,4 ml kháng thể vào phúc xoang. Sau 24 giờ tiêm lần hai cùng liều. Nhóm 2: 10 con không tiêm làm đối chứng. Sau 48 giờ kể từ khi tiêm kháng thể lần hai, công cường độc cho cả hai nhóm chuột với liều tiêm dưới da mỗi chuột 0,2 ml dịch nuôi cấy E. coli đa giá nuôi cấy 24 giờ (10 chủng E. coli giống sau khi nuôi cấy 24h, đem trộn đều với tỷ lệ bằng nhau). Theo dõi chuột trong 7 ngày, đánh giá kết quả. Tính hiệu số của số lượng chuột sống sót của nhóm 1 (nhóm được tiêm miễn dịch bằng kháng thể lòng đỏ trứng) và số lượng chuột sống sót của nhóm 2 (nhóm đối chứng). Kết quả ở bảng 30. Bảng 30: Hiệu lực của sản phẩm trên chuột Nhóm thí nghiệm Số lượng chuột chết/số chuột tiêm Khả năng bảo hộ (% số chuột sống) Nhóm 1 0/10 100% Nhóm 2 8/10 20% Qua kết quả trên ta thấy, sản phẩm có khả năng bảo hộ tốt đối với chuột thí nghiệm (100%), trong khi nhóm đối chứng tỷ lệ chuột sống sót sau khi công cường độc chỉ đạt 20%. Kết luận và kiến nghị Kết luận Đã thu thập được 340 mẫu bệnh phẩm lợn ốm do tiêu chảy và sưng phù đầu ở 5 tỉnh đại diện cho 3 miền Bắc - Trung - Nam. Từ 340 mẫu bệnh phẩm này đã sàng lọc và tuyển chọn được 10 chủng E. coli điển hình có độc lực mạnh, tính kháng nguyên tốt để làm giống. Đã xác định được động thái sinh trưởng của 10 chủng E. coli phân lập được. Các chủng E. coli này tăng trưởng cực đại sau 24 giờ nuôi cấy sau đó giảm dần, trong khi pH của môi trường nuôi cấy giảm cực tiểu sau 24 giờ nuôi cấy sau đó tăng dần. Việc làm bất hoạt và giải độc kháng nguyên bằng formol 30/00 ở 37oC trong 24h cho hiệu quả tốt. Sau khi bị bất hoạt và giải độc, độc lực bịgiảm đi nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Alum 20/00 là chất bổ trợ kháng nguyên an toàn và làm tăng miễn dịch. Đã nghiên cứu được qui trình miễn dịch tối ưu cho gà để thu được hàm lượng kháng thể cao nhất trong lòng đỏ trứng. Hàm lượng kháng thể trong lòng đỏ trứng kháng với kháng nguyên thân E. coli luôn ổn định ở 1/118,2 đến 1/243,2 và hàm lượng kháng thể kháng với độc tố E. coli dao động từ 1/8 đến 1/16. Đã nghiên cứu được qui trình sản xuất kháng thể, qui trình kiểm nghiệm và bảo quản chế phẩm. Chế phẩm kháng thể sản xuất ra có hiệu giá kháng thể ngưng kết đạt từ 1/80 đến 1/100, hiệu giá ADP đạt ³ 1/4. Sản phẩm đạt các tiêu chuẩn về vật lý, vô trùng, an toàn và hiệu lực. Nhiệt độ bảo quản chế phẩm tốt nhất là từ 20C - 80C, thời gian bảo quản là 5 tháng. Kiến nghị Tiếp tục khảo sát chế phẩm kháng thể được tạo ra trên lợn để xác định khả năng bảo vệ của chế phẩm đối với lợn mắc bệnh và đưa ra liều phòng và điều trị bệnh. Cần sản xuất thử nghiệm một số lô chế phẩm để đưa ra khảo nghiệm trên thực địa trước khi sản xuất đại trà và đưa chế phẩm kháng thể này vào phòng và trị bệnh bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli gây ra. Tài liêu tham khảo Tiếng việt Đặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh (2003), "Khảo sát sự biến động hàm lượng Globulin miễn dịch trong sữa đầu của lợn nái khi sử dụng chế phẩm sinh học phòng bệnh tiêu chảy lợn con", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập X, (1), tr.42-49. Đặng Xuân Bình (2004), Vai trò của vi khuẩn Escherichia coli và Clostridium Perfringens trong bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ, các biện pháp phòng trị, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. Tô Minh Châu, Nguyễn Ngọc Hải (1999), "Bước đầu phân lập và định danh E.coli gây bệnh phù đầu ở lợn con sau cai sữa", Khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp, (3), tr.60-63. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2000), "Sử dụng chế phẩm sinh học Biosubtyl để phòng trị bệnh tiêu chảy ở lợn con trước và sau cai sữa", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập VII, (2), tr.58-62. Đoàn Thị Kim Dung (2003), Sự biến đổi một số vi khuẩn hiếu khí đường ruột, vai trò của E.coli trong hội chứng tiêu chảy của lợn con theo mẹ, các phác đồ điều trị, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa ở lợn, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.43-86. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, M.Carles, A.Tripodi và G.Bodin (2000), "Tìm hiểu nguyên nhân của hội chứng thần kinh - phù mắt ở heo cai sữa", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập VII, (2), tr.27-35. Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996), "Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của E.coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng tại các tỉnh phía Bắc trong 20 năm qua (1975 - 1995)", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, (4), tr.63-66. Lý Liên Khai (2001), "Phân lập xác định độc tố ruột của các chủng E.coli gây bệnh tiêu chảy cho heo con", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập VIII, (2), tr.13-18. Nguyễn Thị Nội, Vũ Ngọc Lâm, Phạm Khắc Vượng (1978), "Nghiên cứu Escherichia coli trong phòng thí nghiệm. Vi trùng Escherichia coli độc trong bệnh lợn con ỉa phân trắng và độ nhiễm khuẩn của bệnh. Hiệu lực của vacxin E.coli đối với lợn con ỉa phân trắng trong sản xuất", Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú y 1968-1978, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.207-225. Sử An Ninh (1995), Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu, nước tiểu và hình thái đại thể một số tuyến nội tiết ở lợn con mắc bệnh phân trắng, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Ngọc Nhiên (1999), "Xác định độc lực và chọn chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ lợn con mắc bệnh phù đầu, chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh", Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y 1998 - 1999, Huế, tr.440-453. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, Đỗ Ngọc Thúy (1999), Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella spp ở lợn mắc tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị, Báo cáo khoa học chăn nuôi thú y 1998-1999, tr.189-196. Nguyễn Ngọc Phục (2005), Công tác thú y trong chăn nuôi lợn, Nxb Lao động - xã hội, tr.60-67. Lê Văn Tạo và cs (1995), "Hiệu quả sử dụng vacxin E.coli cho uống phòng bệnh phân trắng lợn con", Nông nghiệp Công nghiệp Thực phẩm, (11), tr.432-433. Lê Văn Tạo, Nguyễn Khả Ngự (1996a), "Xác định khả năng dung huyết và kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ lợn con trước và sau cai sữa bị bệnh Colibacillosis ở đồng bằng sông Cửu Long", Nông nghiệp, Công nghiệp, Thực phẩm, (2), tr.493-494. Lê Văn Tạo (1996b), "Cấu trúc Fimbriae, serotype bám dính K88 của vi khuẩn E.coli và vai trò của nó trong quá trình gây bệnh phân trắng lợn con", Nông nghiệp, Công nghiệp, Thực phẩm, (2), tr.62-63. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), Vi sinh vật thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.72-101. Đỗ Ngọc Thúy, Darren Trott, Alan Frost, Kirsty Town Send, Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Xuân Huyên, Văn Thị Hường, Vũ Ngọc Quý (2002), "Tính kháng kháng sinh của các chủng Escherichia coli phân lập từ lợn con tiêu chảy ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IX, (2), tr.21-31. Tổng cục Thống kê (2008), Niên giám thống kê năm 2008, Nxb Thống kê, Hà Nội, tr.107-110. Đoàn Xuân Trúc (2003), Sổ tay kỹ thuật chăn nuôi lợn trang trại, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.3-4. Tạ Thị Vịnh, Đặng Thị Hòe (2002), "Một số kết quả sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng trị bệnh tiêu chảy ở lợn con", Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IX, (4), tr.54-56. Tiếng anh Aarestrup, M.F., Jorsal, S.E., Ahrens, P., Jensen, N.E., and Meyling, A. (1997), "Molecular characterization of Escherichia coli strains isolated from pigs with edema diseas", J. Clin. Microbiol., (35), pp.20-24. Akita, E.M., and S.Nakai, S. (1993), "Comparison of four purification methols for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain", Journal of Immunological methols, (160), pp.207-214. Bakker, D., Willemsen, P.T.J., Simons, L.H., van Zijderveld, F.G., de Graaf, F.K. (1992), "Characterization of the antigenic and adhesive properties of FaeG, the major subunit of K88 fimbriae", Mol. Microbiol, (6), pp.247-255. Bertschinger, H.U., and Pohlenz, J., (1983), "Bacterial colonization and morphology of the intestine in porcine Escherichia coli enterotoxemia (edema disease)", Vet. Pathol., ( 20), pp.99-110. Biehl, L.G., and Hoefling, D.C. (1986), "Diagnosis and treatment of diarrhea in 7-to 14 day old pigs", J. Am. Vet. Assoc., (188), pp.1144-1146. Blanco, J., Gonzalez, E.A., Bernardez, I., Rigueiro, B. (1983), "Differential biological activity of Vero cytotoxins (VT) released by human and porcine Escherichia coli strains". FEMS. Microbiol. Lett., ( 20), pp.167-170. Bosworth, B.T., Samuel, J.E., Moon, H.W., O’ Brien, V.M., and Whipp, S.C. (1996), "Vaccination with Genetically Modified Shiga - Like toxin IIe prevents Edema Disease in Swine", Infection and Immunity, pp.55-60. Butler, J.E. (1973), "Synthesis and distribution of immunoglobulins", J.Am.Vet. Med. Assoc., (163), pp.795-800. Cavalieri, S.J, Snynder, I.S. (1982), "Cytotoxin activity of a partially purifield Escherichia coli alpha - haemolysin", J. Med. Microbiology, (15), pp.11-21. Choi, B.K., and Schifferli, D.M. (2001), "Characterization of FasG segments required for 987P fimbria-mediated binding to piglets glycoprotein receptors", Infect. Immun., (69), pp. 6625-6632. Cox, E., Houvenagel, A. (1993), "Comparison of the invitro adhesion of K88, K99, F41 and 987P positive Escherichia coli to intestinal villi of 4 to 5 week old pigs", Vet. Microbiol., (34), pp.7-18. Dean, E.A. (1990), "Comparison of receptors for 987P pili of enterotoxigenic Escherichia coli in the small intestines of neonatal and older pigs", Infect. Immun., (58), pp.4030-4035. Dean, E.A., Samuel, J.E. (1994), "Age-related resistance to 987P fimbria-mediated colonization correlates with specific glucolipid receptors in intestinal mucus in swine" Infect. Immun., (62), pp.4789-4794. Deprez, P., De Cupere, F., Muylle, E., and Zobisch, H. (1992), "The use of egg powder antibodies in the prevention of post weaning colibacillosis", Proc. Int. Congr. Pig. Vet.Soc., (12), pp.251. Fairbrother, J.M., Bestchinger, H.U., Nielsen, O.N., Pohlenz, J.F. (1992), Escherichia coli infections, diseases of swine. Seventh Edition. Wolfe publishing Ltd - Australian 1992, pp.489-497. Fekete, P.Z., Gerardin, J., Jaccquemin, E., Mainil, J.G., Nagy, B. (2002), "Replicon typing of F18 fimbriae encoding plasmids of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli strains from porcine post-weaning diarrhoea and oedema disease", Vet. Microbiol., (85), pp.275-284. Francke, S., Harmsen, D., Caprioli, A., Pierrard, D., L.H., Karch, H. (1995), "Clonal relatedness off Shiga-like toxin producing Escherichia coli O101 strains of human and porcine origin". J. Clin. Microbiol., (33), pp.3174–3178. Frydendahl, F., (2002), "Prevalence of serogroups and virulence genes in E. coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches", Vet. Microbiol., (85), pp.169-182. Gannon, V.P.J., Gyless, C.L., (1990), "Characteristics of the Shiga-like toxin produced by Escherichia coli associated with porcine oedema disease". Vet. Microbiol., (24), pp.97-100. H. Imberechts, P. Deprez, E. Van Driessche and P. Pohl. (1997), "Chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae of Escherichia coli inhibit shedding of F18 positive E. coli by experimentally infected pigs", Veterinary Microbiology., (54), pp.329-341. Holm, A., and Poulsen, H.D. (1996), "Swine nutrition management update: ZinC oxide in treating E.coli diarrhea in pigs after weaning", Compend. Cont. Educ. Pract. Vet., (18), pp.8. Hung, Vu Khac (2004), Escherichia coli - Prevalence and comparison of virulece factors in strains isolated from pigs with diarrhoea in Slovak Republic, Ph.D. Thesis, University of Veterinary medicine, Kosice Slovak Republic. H Yokoyama, R C Peralta, R Diaz, S Sendo, Y Ikemori, Y. (1992), "Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets", Infect Immun., (3), pp.998-1007. Isaacson, R.E., and Start, G.L. (1992), "Analysis of K99 plasmids from enterotoxigenic Escherichia coli", FEMS. Microbiol, Lett., (90), pp.141-146. Jacobs, A.A.C. and de Graaf, F.K. (1985), "Production of K88, K99 and F41 fimbriae in relation to growth phage and rapid procedure for adhesion purification", FEMS. Micribiol, Lett., (26), pp.15-19. Johansen, M., Andresen, L.O., Jorsal, S.E., Thomsen, L.K., Waddell, T., and Gyles, C.L. (1996), "Vaccination against oedema diseas", Proc. Int. Congr. Pig. Vet. Soc., (14), pp.378. Khan, A.S., Johnston, N.H., Goldfine, H. and Schifferli. (1996), "Porcine 987P glucolipid receptors on intestinal brush borders and their cognate bacterial ligands", Infect. Immun., (64), pp.3688-3693. Konowalchuk, J., Speirs, J.I., Stavric, S. (1977), "Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli". Infect. Immun., (18), pp.775-779. Kwon, D., Choi, C., Jung, T., Chung, H.K., Kim, J.P., Bae, S.S. (2002), "Genotypic prevalence of the fimbrial adhesins (F4, F5, F6, F41 and F18) and toxin (LT, STa, STb, and Stx 2e) in Escherichia coli isolated from postweaning pigs with diarrhoea or oedema disease in Korea", Vet. Red., (12), pp.35-37. Mainil, J. (1999), "Shiga/Verocytotoxin and Shiga/Verotoxigenic Escherichia coli in animal". Vet. Res., (30), pp.235-257. Marquers, L.R.M., Peiris, J.S.M., Cryz, S.J., O’Bien, A.D. (1987), "Escherichia coli strains isolated from pigs with oedema disease produce a variant of Shiga-like toxin II". FEMS. Microbiol. Lett., (44), pp.33-38. Mooi, F.R., Wouters, C., Wijfjes, A., de Graaf, F.K. (1982), "Construction and characterization of mutants impaired in the biosynthesis of the K88ab antigen", J. Bacteriol., (150), pp.512-521. Nagy, B. (1986), Vaccines against toxigenic Escherichia coli disease in animals, In Development of Drugs and Vaccines against Diarrhea,11th Nobel Conf Stockholm, 1985. Lund: Stdentlitteratur, pp.53. Nagy, B., Fekete, P.Z. (1999), "Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals", Vet. Res., (30), pp. 259 - 284. Pohl, P., Mainil, J. (1995), "F17 positive Escherichia coli", Vet. Rec., (137), pp.623-624. Ronald R Marquardta, L.Z Jina , Jung-Woo Kima , Lin Fanga, Andrew A Frohlicha, Samuel K. (1998)," Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli K88+ infection in neonatal and early-weaned piglets", FEMS Immunology & Medical Microbiology., pp.11-13. Sandefur, P.D., Peterson, J.W. (1976), "Isolation of skin permeability factors culture filtrates of Salmonella typhimurium". Infection and Immunity, (14), pp.671-679. Sarmiento, J.I. (1983), Environmental temperature: A predisposing factor in the enterotoxigenic Escherichia coli induced diarrhea of the newborn pig, M.S. Thesis, Univ. Guel.Ph, Ont. Sarrazin, E., and Bertschinger, H.U. (1997), "Role of fimbriae F18 for actively acquired immunity against porcine enterotoxigenic Escherichia coli. Escherichia coli", Vet. Microbiol., (54), pp.133-144. Simons, B.L., Mol, O., van Breemen, J.F.L., Oudega, B. (1994), "Morphological appearance of K88ab fimbriae and optical diffraction analysis of K88 paracrystalline structures", FEMS. Microbiol. Lett., (118), pp.83-88. Smith, H.W. (1963), "The haemolysisns of Escherichia coli", J. Pathol. Bacterial., pp.197-212. Soderlind, O., Thafvelin, B., and Mollby, R. (1998), "Virulence factors in Escherichia coli strains isolated from Swedish pigs with diarrhea", J. Clin. Microbiol., (26), pp.879-884. Sydler, T., Buergi, E., Bertschinger, H. U., and Pospischil, A. (1996), "Edema disease in adult swine", Proc. Int. Congr. Pig.Vet. Soc., (14), pp.272. Thomlinson, J.R., and Lawrence, T.J.L. (1981), "Dietary manipulation of gastric pH in the prophylaxis of enteric disease in weaned pigs: Some field observations", Vet. Rec., (109), pp.120-122. Wittig, W., Klie, H., Gallien, P., Lehmann, S., Timm, M., and Tschape, H. (1995), "Prevalence of the fimbrial antigens F18 and K88 and of enterotoxins and verotoxins among Escherichia coli isolated from weaned pigs", Zbl. Bakt., (283), pp. 95-104.