Nghiên cứu điều chế và đánh giá nanolycopene

mặt làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai chất lỏng đó. Khi hòa chất hoạt hóa bề mặt vào trong một chất lỏng thì các phân tử của chất hoạt hóa bề mặt có xu hướng tạo đám (micelle, được dịch là mixen), nồng độ mà tại đó các phân tử bắt đầu tạo đám được gọi là nồng độ tạo đám tới hạn. Nếu chất lỏng là nước thì các phân tử sẽ chụm đuôi kị nước lại với nhau và quay đầu ưa nước ra tạo nên những hình dạng khác nhau như hình cầu (0 chiều), hình trụ (1 chiều), màng (2 chiều). Tính ưa, kị nước của một chất hoạt hóa bề mặt được đặc trưng bởi một thông số là độ cân bằng ưa kị nước (tiếng Anh: Hydrophilic Lipophilic Balance-HLB), giá trị này có thể từ 0 đến 40. HLB càng cao thì hóa chất càng dễ hòa tan trong nước, HLB càng thấp thì hóa chất càng dễ hòa tan trong các dung môi không phân cực như dầu [11]. Chất hoạt động bề mặt có thể được dùng như một chất nhũ hóa bề mặt, bảo vệ các hạt nano không kết đám, là một chất mang tốt, giúp các hạt nano thẩm thấu tốt, dễ hòa tan trong nước [11]. Hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) “Hình 1.6” là những chất làm đặc được dùng phổ biến không chỉ trong thực phẩm mà còn trong dược phẩm, trong công nghiệp, chúng được sản xuất đạt những tiêu chuẩn nghiêm ngặt cGMP và tuân theo tiêu chuẩn của Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) về thực phẩm. Những chất tạo keo thực phẩm linh hoạt và đa năng này là những hợp chất keo ưa nước độc đáo bởi vì chúng tạo ra nhiệt gel thuận nghịch [12]. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 17 HPMC phù hợp với thành phần của các loại thực phẩm, đảm nhiệm nhiều chức năng trong quá trình chế biến thực phẩm tùy thuộc vào loại sản phẩm, mức độ sử dụng và điều kiện sử dụng. Trong số các chức năng này bao gồm sự tạo gel do nhiệt, tạo màng bọc thực phẩm, làm quánh thực phẩm và giữ nước. Có tác dụng cải thiện liên kết trong thực phẩm, và cải thiện vị [12]. HPMC có màu trắng, dạng bột hoặc sợi nhỏ, không mùi, không vị. HPMC hầu như không tan trong ethanol khan, ether, acetone. Nó có thể hòa tan trong một số dung môi hữu cơ được sản xuất từ cellulose tự nhiên có trọng lượng phân tử cao qua một loạt những biến đổi hóa học. Là chất làm đặc, kết dính, có khả năng tạo màng, bôi trơn, kháng rêu mốc Nó có một số tính chất sau: – Khả năng hòa tan trong nước tốt. – Là loại non-ionic. – Ổn định pH – Hoạt tính bề mặt tốt Hình 1.6. Bột HPMC Hình 1.7. Tween 80 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 18 Polysorbate 80 (hay còn gọi là Tween 80) “Hình 1.7” là chất nhũ hóa cho các sản phảm sử dụng dầu nền với nước. Được tổng hợp từ sorbitol tự nhiên và acid oleic thực vật. Là một chất chuyển thể sữa (emulsifier - nhũ hóa) và khử bọt dùng trong thực phẩm, vitamin, thuốc và vắc-xin, tuy nhiên, polysorbate 80 cũng có thể được dùng như một chất hoạt động bề mặt (surfactant), chất hòa tan (solubilizer) trong xà phòng và mỹ phẩm giúp kết hợp và hòa tan các thành phần lại với nhau dễ dàng hơn. Sử dụng Polysorbate 80 trong các công thức sản phẩm oil in water (nước nhiều hơn dầu) như cream, lotion hoặc foaming soap. Sự khác biệt giữa các loại Polysorbate là: polysorbate 20 dùng để nhũ hóa hương liệu hoặc tinh dầu trong nước còn polysorbate 80 để nhũ hóa cho các công thức cần dùng nhiều loại dầu phức tạp hơn (dầu nền, bơ, mỡ...) trong môi trường nước. Hai chất hoạt động bề mặt này rất phù hợp để tổng hợp nano lycopene, vì an toàn về thực phẩm, cũng như cho hiệu suất cao về bảo vệ hạt nano, giúp hòa tan tốt trong nước, giúp cho hạt nano dễ thẩm thấu, tính ổn định bề mặt cao. *Phương pháp nghiền quay Trong phương pháp nghiền, lycopene ở dạng bột được trộn lẫn với những viên bi cỡ siêu nhỏ khoảng 0,5 mm, được làm từ các vật liệu rất cứng và được đặt trong một cái bình. Các viên bi cứng va chạm vào nhau phá vỡ bột đến kích thước nano. Nano lycopene được nghiền chung với chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là HPMC và Tween 80, CHHBM giúp cho quá trình nghiền được dễ dàng, ổn định bề mặt, đồng thời tránh cho các hạt kết tụ với nhau. Sau khi nghiền, sản phẩm phải trải qua quá trình phân tách hạt rất phức tạp để có được các hạt tương đối đồng nhất. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 19 Hình 1.8. Máy nghiền bi kiểu hành tinh Kết quả thu được là các hạt nano lycopene không chiều. (Hạt nano không chiều: cả ba chiều đều có kích thước nano, không còn chiều tự do nào cho điện tử, ví dụ: đám nano, hạt nano). 1.3.4. Các phương pháp, công cụ dùng để đánh giá hệ nano lycopene a) Kính hiển vi điện tử quét SEM – Scanning Eclectron Microscope [15]. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) là loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh có độ phân giải cao của bề mặt mẫu. Hình 1.9. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 20 Ưu điểm: không cần phá mẫu khi phân tích và có thể hoạt động trong môi trường chân không thấp Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong SEM Một chùm điện tử đi qua các thấu kính điện tử để hội tụ thành một điểm rất nhỏ chiếu lên bề mặt của mẫu nghiên cứu. Nhiều hiệu ứng xảy ra khi các hạt điện tử của chùm tia va chạm với bề mặt của vật rắn. Từ điểm chùm tia va chạm với bề mặt của mẫu có nhiều loại hạt, nhiều loại tia phát ra (tín hiệu). Mỗi loại tín hiệu phản ánh một đặc điểm của mẫu tại điểm được điện tử chiếu vào. Cho chùm điện tử quét trên mẫu, đồng thời quét một tia điện tử trên màn hình của đèn hình một cách đồng bộ, thu và khuếch đại một tín hiệu nào đó của mẫu phát ra để làm thay đổi cường độ sáng của tia điện tử quét trên màn hình và ta thu được ảnh.Cho tia điện tử quét trên ảnh với biên độ d nhỏ ( cỡ mm hay µm) còn tia điện tử quét trên màn hình với biên độ D (bằng kích thước trên màn hình) khi đó ảnh có độ phóng đại D/d. Độ phóng đại của kính hiển vi điện tử quét thông thường từ vài ngàn đến vài trăm ngàn lần. Năng suất phân giải phụ thuộc vào đường kính của chùm tia điện tử hội tụ chiếu lên mẫu. Với súng điện tử thông thường, năng suất phân giải là 5nm đối với kiểu ảnh điện tử thứ cấp. Như vậy chỉ thấy được những chi tiết thô trong công nghệ nano. Những kính hiển vi điện tử tốt có sung phát xạ trường, kích thước chùm điện tử chiếu vào mẫu nhỏ hơn 0,2 nm, có thể lắp thêm bộ nhiễu xạ điện tử tán xạ ngược để quan sát các hạt cỡ 1 nm và theo dõi được cách sắp xếp nguyên tử trong từng hạt nano đó. b) Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM -Transmission Electron Microscopy LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 21 Tem là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Hình 1.10. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) *Cấu tạo và nguyên lý làm việc của kính hiển vi điện tử truyền qua Đối tượng sử dụng của TEM là chùm điện tử có năng lượng cao, vì thế các cấu kiện chính của TEM được đặt trong cột chân không siêu cao được tạo ra nhờ các hệ bơm chân không (bơm turbo, bơm ion). * Súng phóng điện tử Trong TEM, điện tử được sử dụng thay cho ánh sáng (trong kính hiển vi quang học). Điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử. Có hai cách để tạo ra chùm điện tử:  Sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử: Điện tử được phát ra từ một catốt được đốt nóng (năng lượng nhiệt do đốt nóng sẽ cung cấp cho điện tử động năng để thoát ra khỏi liên kết với kim loại. Do bị đốt nóng nên súng phát xạ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 22 nhiệt thường có tuổi thọ không cao và độ đơn sắc của chùm điện tử thường kém. Nhưng ưu điểm của nó là rất rẻ tiền và không đòi hỏi chân không siêu cao. Các chất phổ biến dùng làm catốt là W, Pt, LaB6...  Sử dụng súng phát xạ trường (Field Emission Gun, các TEM sử dụng nguyên lý này thường được viết là FEG TEM): Điện tử phát ra từ catốt nhờ một điện thế lớn đặt vào vì thế nguồn phát điện tử có tuổi thọ rất cao, cường độ chùm điện tử lớn và độ đơn sắc rất cao, nhưng có nhược điểm là rất đắt tiền và đòi hỏi môi trường chân không siêu cao. Sau khi thoát ra khỏi catốt, điện tử di truyển đến anốt rỗng và được tăng tốc dưới thế tăng tốc V (một thông số quan trọng của TEM). Lúc đó, điện tử sẽ thu được một động năng. Hình 1.11. Cấu tạo của súng phóng điện tử * Các hệ thấu kính và lăng kính Vì trong TEM sử dụng chùm tia điện tử thay cho ánh sáng khả kiến nên việc điều khiển sự tạo ảnh không còn là thấu kính thủy tinhnữa mà thay vào đó LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 23 là các thấu kính từ. Thấu kính từ thực chất là một nam châm điện có cấu trúc là một cuộn dây cuốn trên lõi làm bằng vật liệu từ mềm. Từ trường sinh ra ở khe từ sẽ được tính toán để có sự phân bố sao cho chùm tia điện tử truyền qua sẽ có độ lệch thích hợp với từng loại thấu kính. Tiêu cự của thấu kính được điều chỉnh thông qua từ trường ở khe từ, có nghĩa là điều khiểncường độ dòng điện chạy qua cuộn dây. Vì có dòng điện chạy qua, cuộn dây sẽ bị nóng lên do đó cần được làm lạnh bằng nước hoặc nitơ lỏng. Trong TEM, có nhiều thấu kính có vai trò khác nhau: - Hệ kính hội tụ và tạo chùm tia song song (Condenser lens) - Vật kính (Objective lens) - Thấu kính nhiễu xạ (Diffraction lens) - Thấu kính Lorentz (Lorentz lens, twin lens) - Thấu kính phóng đại (Magnifying lens, intermediate lens) * Các khẩu độ Là hệ thống các màn chắn có lỗ với độ rộng có thể thay đổi nhằm thay đổi các tính chất của chùm điện tử như khả năng hội tụ, độ rộng, lựa chọn các vùng nhiễu xạ của điện tử... Sự tạo ảnh trong TEM Xét trên nguyên lý, ảnh của TEM vẫn được tạo theo các cơ chế quang học, nhưng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm khác cơ bản của ảnh TEM so với ảnh quang học là độ tương phản khác so với ảnh trong kính hiển vi quang học và các loại kính hiển vi khác. Nếu như ảnh trong kính hiển vi quang học có độ tương phản chủ yếu đem lại do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng thì độ tương phản của ảnh TEM lại chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử. Các chế độ tương phản trong TEM: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 24 - Tương phản biên độ: Đem lại do hiệu ứng hấp thụ điện tử (do độ dày, do thành phần hóa học) của mẫu vật. - Tương phản pha: Có nguồn gốc từ việc các điện tử bị tán xạ dưới các góc khác nhau. - Tương phản nhiễu xạ: Liên quan đến việc các điện tử bị tán xạ theo các hướng khác nhau do tính chất của vật rắn tinh thể. * Bộ phận ghi nhận và quan sát ảnh Khác với kính hiển vi quang học, TEM sử dụng chùm điện tử thay cho nguồn sáng khả kiến nên cách quan sát ghi nhận cũng khác. Để quan sát ảnh, các dụng cụ ghi nhận phải là các thiết bị chuyển đổi tín hiệu, hoạt động dựa trên nguyên lý ghi nhận sự tương tác của điện tử với chất rắn. Ví dụ như: Màn huỳnh quang và phim quang học hoặc CCd Camera. * Bộ khử loạn thị (astigmatism) Sự loạn thị ở TEM (astigmatism) có nguyên lý giống như điều kiện tương điểm trong quang học, tức là điều kiện để ảnh của một vật phẳng nằm trên một mặt phẳng. Trong TEM, khử loạn thị liên quan đến việc điều chỉnh cân bằng các chùm tia và các hệ thấu kính. - Khử loạn thị ở hệ hội tụ (Condenser Astigmatism) - Khử loạn thị ở vật kính (Objective Astigmatism) - Khử loạn thị ở kính nhiễu xạ (Diffraction Astigmatism) * Ảnh trường sáng, trường tối Là chế độ ghi ảnh phổ thông của các TEM dựa trên nguyên lý ghi nhận các chùm tia bị lệch đi với các góc (nhỏ) khác nhau sau khi truyền qua mẫu vật. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 25  Ảnh trường sáng (Bright-field imaging): Là chế độ ghi ảnh mà khẩu độ vật kính sẽ được đưa vào để hứng chùm tia truyền theo hướng thẳng góc. Như vậy, các vùng mẫu cho phép chùm tia truyền thẳng góc sẽ sáng và các vùng gây ra sự lệch tia sẽ bị tối. Ảnh trường sáng về mặt cơ bản có độ sáng lớn.  Ảnh trường tối (Dark-field imaging): Là chế độ ghi ảnh mà chùm tia sẽ bị chiếu lệch góc sao cho khẩu độ vật kính sẽ hứng chùm tia bị lệch một góc nhỏ (việc này được thực hiện nhờ việc tạo phổ nhiễu xạ trước đó, mỗi vạch nhiễu xạ sẽ tương ứng với một góc lệch). Ảnh thu được sẽ là các đốm sáng trắng trên nền tối. Nền sáng tương ứng với các vùng mẫu có góc lệch được chọn, nền tối là từ các vùng khác. Ảnh trường tối rất nhạy với cấu trúc tinh thể và cho độ sắc nét từ các hạt tinh thể cao. Hình 1.12. Ảnh trường sáng và ảnh trường tối c) Thiết bị đo zêta [16]. Thiết bị đo thế zêta dùng đo kích thước hạt có dải đo rộng nhất và độ chính xác cao nhất. Thế zeta của 1 mẫu là chỉ tiêu xác định độ ổn định của hệ. Thế zeta lớn tiên đoán về 1 hệ ổn định hơn, phép đo thế zêta nhanh và chính xác với thiết bị SZ-100 có thể giúp tăng hiểu biết về trạng thái của hệ huyền phù & nhũ tương. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 26 Hình 1.13. Thiết bị đo thế zêta SZ – 100 Thiết bị đo kích thước hạt nano SZ-100 là thiết bị phân tích linh hoạt để phân loại những đặc tính vật lý của những hạt nhỏ. Phụ thuộc vào cấu hình và ứng dụng, hệ có thể được sử dụng như thiết bị đo hạt, đo thế zeta, khối lượng phân tử MW hoặc tính hệ số virial thứ cấp A2. Ứng dụng tiêu biểu cho SZ-100 bao gồm hạt nano, keo, nhũ tương, huyền phù submicron. Phân tích kích thước hạt dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng động học (DLS). Dựa vào đặc tính vật lý của hệ mẫu, dải hạt đo được từ 0.3 nm – 8 µm. Giới hạn dưới bị ảnh hưởng bởi nồng độ, mẫu tán xạ mạnh hay yếu, và sự có mặt của một số hạt kích thước lớn không mong muốn. Giới hạn trên bị ảnh hưởng bởi mật độ của hạt vì DLS được tính toán dựa trên chuyển động Brownian, không phụ thuộc vào trọng lượng hạt. Điện tích trên bề mặt hạt được phân loại bởi SZ-100 bằng phương pháp đo thế zeta trong mẫu huyền phù. Mẫu được tiêm vào cell dùng một lần và kết quả đo thế zeta được tính từ thế điện di di động của hệ hạt. Thế zeta của mẫu được sử dụng nhiều nhất để xác định độ ổn định của hệ. Giá trị thế Zeta lớn chỉ ra rằng các hạt tích điện lớn và hệ có xu hướng bền vững. Thế Zeta cũng thường được đo để giúp các nhà chế tạo tạo ra những sản phẩm mới với tuổi thọ cao. Ngược lại khi xác định điều kiện tại 0, cho phép chọn điều kiện tốt nhất để làm tích tụ và tách các hạt trong mẫu. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 27 Một thiết bị tương tự có thể được sử dụng để đo khối lượng phân tử và hệ số virial thứ cấp của các protein, polymer, và các phân tử khác, người sử dụng chuẩn bị những dung dịch khác nhau có nồng độ biết trước và sử dụng những hệ thống trong chế độ tán xạ ánh sáng động học để tạo ra biểu đồ Debye, từ đó tính toán được cả khối lượng phân tử và hệ số virial thứ cấp A2. d) Máy quang phổ hấp thụ (UV – VIS) [17]. Phương pháp phổ hấp thụ phân tử là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200÷800nm. Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luật Bouger – Lam bert – Beer. Ứng dụng phương pháp phổ đo quang, người ta có thể xác định nhiều hợp chất trong phạm vi nồng độ khá rộng nhờ các cải tiến quan trọng trong thủ tục phân tích. Đây là phương pháp phân tích được phát triển mạnh vì nó đơn giản, đáng tin cậy và được sử dụng nhiều trong kiểm tra sản xuất hoá học, luyện kim và trong nghiên cứu hoá sinh, môi trường và nhièu lĩnh vực khác. Hình 1.14. Máy quang phổ hấp thụ (UV – VIS) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 28 Bản chất của phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: Khi chiếu một chùm sáng có bước sóng phù hợp đi qua một dung dịch chất màu, các phân tử hấp thụ sẽ hấp thụ một phần năng lượng chùm sáng, một phần ánh sáng truyền qua dung dịch. Xác định cường độ chùm ánh sáng truyền qua đó ta có thể xác định được nồng độ của dung dịch. Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch tuân theo định luật Bughe – Lambert – Beer: A = - lgT = lg (Io/It) = εbC với T = It/Io. Các bước tiến hành phép đo UV-VIS: Bước 1. Chọn bước sóng Nghiên cứu sự phụ thuộc mật độ quang của dung dịch A (hoặc hệ số tắt phân tử ε) theo bước sóng λ, tức là đo A (hoặc ε) của dung dịch nghiên cứu với các tia bức xạ điện từ có λ khác nhau, sau đó lập đồ thị hệ toạ độ A – λ (hoặc ε – χ). Đồ thị này có dạng đường cong Gauss. Cực đại Amax ứng với giá trị λmax gọi là cực đại hấp thụ. Khi tiến hành phân tích theo quang phổ đo quang chọn đo mật độ quang A của dung dịch nghiên cứu tại λmax. Bởi vì với việc đo A ở λmax cho kết quả phân tích có độ nhạy và độ chính xác tốt nhất. Bước 2. Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu phân tích có thể ở dạng rắn, lỏng nhưng thông thường người ta hay chuẩn bị mẫu phân tích là những chất lỏng, hoặc ở dạng dung dịch. Nếu chất nghiên cứu là những chất rắn không tan, người ta có thể tìm cách hoà tan chúng bằng các dung môi và các biện pháp thích hợp. Sau đó nếu chất nghiên cứu là hợp chất không có hiệu ứng phổ hấp thụ, thì phải chế hoá dung dịch bằng các biện pháp như phản ứng oxy hoá khử, phản ứng tạo phức chất... sau đó đem LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 29 nghiên cứu. Nếu chất nghiên cứu là những chất khí thì sẽ được nghiên cứu trong các cuvet đặc biệt. Bước 3. Ghi phổ Sau khi đã chế hoá mẫu, mẫu được chuyển vào cuvet ghi phổ hấp thụ, chọn λmax và đo mật độ quang dung dịch ở λmax Bước 4. Xử lý số liệu Các số liệu thu được có thể ở dạng các đường ghi phổ hệ toạ độ A – λ hoặc ε – λ, bảng số liệu về thành phần chất nghiên cứu, đồ thị cần thiết tuỳ thủ tục thực nghiệm đã chọn. Theo những nguyên lý cơ bản đã xét trên trong thực tế ta phải đo độ hấp thụ quang bằng cách đo cường độ bức xạ truyền đi từ nguồn sóng qua mẫu trắng tới detectơ và cường độ bức xạ từ nguồn qua chất nghiên cứu đến detectơ. Như vậy ta có thể hình dung một cách khái quát thiết bị đo độ hấp thụ quang như sau: - Nguồn phát tia bức xạ - Bộ lọc sóng - Ngăn đựng mẫu - Detector Phương pháp phân tích UV-VIS Phương pháp đường chuẩn Đồ thị theo hệ toạ độ A – C (mật độ quang - nồng độ) phải là đường thẳng đi qua gốc toạ độ. Để lập đồ thị A – C ta chọn hệ các dung dịch chất nghiên cứu có nồng độ chính xác C1, C2, C3,... Cn, xác lập các điều kiện để tạo LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 30 các hợp chất có hiệu ứng hấp thụ bức xạ điện từ ở λmaxchọn trước. Đo mật độ quang tương ứng A1, A2, A3, An: Nồng độ C1 C2 C3 ... Cn Mật độ quang A1 A2 A3 ... An Xây dựng đồ thị hệ toạ độ A – C. Vì đồ thị được thiết lập dựa trên các số liệu lặp đi lặp lại nhiều lần nên có thể sử dụng trong thời gian dài (đồ thị chuẩn có thể lưu dữ trong máy), khi làm việc có thể sử dụng và trong các máy thường có thủ tục của phương pháp đường chuẩn được thực hiện theo chương trình. Hoặc tính toán thông qua hằng số K (được xác định song song bằng một phép đo với dung dịch có nồng độ biết trước) Ứng dụng của phép đo phổ hấp thụ phân tử Phương pháp phân tích quang phổ đo quang là một phương pháp phân tích định lượng được sủ dụng rộng rãi vào nhiều mục đích thực tiẽn khác nhau. Phương pháp có thể áp dụng để xác định các chất có nồng độ lớn hoặc bé, đặc biệt có thể xác định nồng độ các tạp chất đến nồng độ giới hạn 10-5÷10-6%. Phương pháp phân tích đo quang thường có sai số tương đối 3 ÷ 5% được ứng dụng để xác định hơn 50 nguyên tố trong các đối tượng khác nhau trong các lĩnh vực thực phẩm, hoá học, luyện kim, địa chất, nông nghiệp... e) Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [18]. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 31 phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường Hình 1.15. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Sơ lược về hệ thống HPLC tại trung tâm RD gồm có - Bơm định lượng 1525 - Lò Cột sắc kí - Đầu dò khúc xạ 2414 - Dầu dò UV – VIS 2487 Bơm định lượng 2 kênh 1525: có thể sử dụng chế độ ISORACTIC và GRADIENT, hệ thống khử bọt khí nhưng không hoạt động. Lò Cột sắc kí: nơi chứa cột sắc kí và giữ ổn nhiệt cho cột Đầu dò UV – VIS: có thể đơn kênh hoặc kênh đôi Đầu dò khúc xạ: chạy với chương trình LC hoặc GPC. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 32 Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó: 1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống. 8: In dữ liệu  Bình chứa pha động: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ của 4 đường là 100%. Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng 1 lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải. Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 33 tinh khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.  Bộ khử khí Degases Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau: - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. - Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC  Bơm cao áp Mục đích là để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khoảng 250 – 600 bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút.  Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper).  Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh như là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5 – 25 cm, đường kính trong 1 – 10mm, hạt nhồi cỡ 0,3 – 5 µm, Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký.  Đầu dò LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 34 Là bộ phận phát hiện các chất và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp. Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất, Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngoại 190 – 360 nm để phát hiện UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – VIS) (190 – 900 nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dò thông dụng nhất. - Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn xuất có huỳnh quang. - Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất. - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường. - Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn. - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,  Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích.  In dữ liệu Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điểu khiển Phần mềm do hãng sản xuất cài đặt. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 35 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.1.1. Hóa chất Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu được trình bày bên dưới. Các chất này sử dụng làm thực nghiệm mà không qua giai đoạn tinh chế thêm. - Nước cất hai lần khử ion - KOH - Dầu gấc - Dung dịch NaCl - PG - Tween 80 - Ethanol - HPMC Dầu gấc – bột gấc nhão của công ty Gac Viet “Hình 2.1” được bảo quản kỹ ở ngăn mát tủ lạnh dưới 5oC, mỗi lần sử dụng lấy nhanh và đậy kín và dùng hết trong vòng một tháng sau khi đậy kín và dùng hết trong vòng 1 tháng sau khi mở nắp. Lycopene và β-carotene là các chuỗi hydrocacbon chưa no, có nhiều liên kết đôi nên rất dễ bị oxy hoá dưới các tác nhân nhiệt, các chất có khả năng oxy hoá cao và ánh sáng. Hình 2.1. Dầu gấc – Bột gấc nhão Các hoá chất dùng cho quá trình xà phòng hoá gồm KOH của Merck “Hình 2.2”, propylene glycol của Scharlau, ethanol thực phẩm 95%, nước đã LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 36 loại ion (DI) được sản xuất tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai thuộc khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh, và khí nitơ (công ty TNHH Air Liquide Việt Nam) đạt tiêu chuẩn phòng sạch. Hình 2.2. KOH của Meck Muối ăn được hoà tan trong nước DI rồi lọc. “Hình 2.3” Hình 2.3. Hòa tan muối ăn, sau đó lọc LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 37 Quá trình lọc rửa tinh thể carotenoid sử dụng màng lọc Whatman Nylon 0,2 μm, đường kính 47 mm. Hình 2.4. Màng lọc Whatman Nylon 0,2 μm 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Máy khuấy từ IKA RW 20 Digital với cánh khuấy dài 35 cm nhựa Teflon để chống bị ăn mòn bởi KOH. Hình 2.5. Máy khuấy từ IKA RW 20 Digital LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 38 - Máy hút chân không. “Hình 2.6” - Bể điều nhiệt “Hình 2.7” Hình 2.6. Máy hút chân không Hình 2.7. Bể ổn nhiệt - Máy sấy để làm khô mẫu . - Cánh khuấy - Bếp gia nhiệt “Hình 2.8” - Máy nghiền quay “Hình 2.9” Hình 2.8. Bếp gia nhiệt Hình 2.9. Máy nghiền quay LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 39 - Cân phân tích - Giá đỡ. - Beaker 250 ml. - Pipet 5, 10 ml. - Erlen 250 ml. - Bộ lọc thủy tinh, phuễ lọc - Giấy lọc 0,2µm - Nhiệt kê t́hủy ngân, hệ được ổn nhiệt cách thuỷ thông thường sử dụng nhiệt kế thuỷ ngân chính xác 1°C. - Ống nhỏ giọt . - Bóp cao su. - Giấy quỳ tím - Các chai nâu nhỏ tối màu để đựng mẫu và chai sáng màu để đo UV Vis. 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Tiến hành thực nghiệm Muốn điều chế ra nano lycopene, trước hết ta phải điều chế ra được bột lycopene. Và quá trình trích ly bột lycopene có thể được thực hiện bằng 2 cách: từ dầu gấc trích ly lycopene bằng phương pháp xà phòng hóa hoặc từ bột gấc nhão loại dầu và nước bằng xà phòng hóa cho trở thành bột ráo để trích ly bột lycopene và hai quá trình được mô tả như sau: Từ dầu gấc trích ly bột lycopene bằng phương pháp xà phòng hóa. Giai đoạn 1: Xà phòng hóa dầu gấc Dầu gấc được rót vào một beaker phù hợp khoảng 250 ml, bên ngoài beaker được bao giấy nhôm cẩn thận để có thể truyền nhiệt được nhưng hạn chế tối đa ánh sáng lọt vào. “Hình 2.10” LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 40 Hình 2.10. Rót dầu gấc vào beaker Beaker được đặt trong bể chưng cách thủy ở nhiệt độ 50°C sau đó thêm PG và khuấy đều với tốc độ 356 vòng/phút trong 60 phút. “Hình 2.11” Hình 2.11. Beaker đặt trong bể chưng cách thủy – khuấy – đo nhiệt độ Quá trình xà phòng hoá được tiến hành chậm ở nhiệt độ 55 °C bằng cách thêm từ từ dung dịch KOH 12M trong 30 phút trong khi vẫn tiếp tục khuấy với tốc độ như trên trong vòng 90 phút. Ở giai đoạn này có thể xà phòng được tạo LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 41 ra làm độ nhớt tăng nhiều, do đó thỉnh thoảng cần lưu ý để hỗn hợp luôn được khuấy đều. Hình 2.12. Quá trình khuấy từ xà phòng hóa dầu gấc Để giảm độ nhớt của hỗn hợp trước khi lọc, ethanol được thêm vào và khuấy đều trong vòng 15 phút cho đến khi hỗn hợp trong suốt. Beaker được lấy ra và bao kín bằng bao phim và giấy nhôm rồi để trong ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ 5-10°C trong 2-3 giờ để các chất rắn lycopene và β-carotene có thể lắng dần xuống đáy. Lúc này màu của dung dịch ở trên ít đỏ hơn, và ở gần đáy có thể quan sát thấy một lớp chất rắn lắng đọng màu đỏ hồng. Giai đoạn 2: Tiến hành lọc dầu thu lycopene Khuấy thật nhẹ hỗn hợp rồi lọc toàn bộ bằng màng lọc 0,2 μm, có hỗ trợ hút chân không. Chất rắn còn lại trên màng được rửa với hỗn hợp dung dịch ethanol:NaCl 0,9 % với tỉ lệ 1V:1V cho đến khi độ PH = 7 và nước rửa ko còn bọt, không có màu. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 42 Hình 2.13. Quá trình lọc lycopene Chất rắn carotenoid và giấy lọc được bảo quản bằng cách đặt trong chai nâu và sấy khô. Xác định khối lượng của tổng chất rắn thu được. Sau khi trích ly lycopene hoàn thành, ta thu được lycopene rắn dạng bột. Cân HPMC cho vào nước cất khuấy đều trong bình tam giác LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 43 Chuẩn bị một chai nâu, trong đó có sẵn bi nghiền, cho toàn bộ dung dịch HPMC đã khuấy đều vào, thêm vào 5ml Tween 80. Cho bột lycopene vừa trích ly vào, đóng nắp, đặt vào máy nghiền quay, tiến hành quay nano. Hình 2.14. Quay nano lycopene Sau khi tiến hành quay nano lycopene khoảng 1 tuần, ta thu được nano lycopene . Ngoài ra nếu không sử dụng phương pháp nghiền quay, chúng ta có thể sử dụng phương pháp hóa siêu âm, dùng sóng siêu âm để tạo hạt nano. Cách làm tương tự như phương pháp nghiền quay, nhưng sau khi thu được bột lycopene ta cũng cho chất hoạt động bề mặt vào và tiến hành siêu âm (hình 2.15) để thu được hạt có kích thước nano. Hình 2.15. Siêu âm LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 44 Từ bột gấc nhão loại dầu và nước bằng xà phòng hóa cho trở thành bột ráo, dùng dung môi hữu cơ (Aceton:Etyl acetat) để trích ly bột lycopene. Bột gấc của công ty Gac Viet được bảo quản kỹ ở ngăn mát tủ lạnh dưới 5°C, mỗi lần sử dụng lấy nhanh và đậy kín và dùng hết trong vòng 1 tháng sau khi mở nắp. Lycopene và β-carotene là các chuỗi hydrocacbon chưa no, có nhiều liên kết đôi nên rất dễ bị oxy hoá dưới các tác nhân nhiệt, các chất có khả năng oxy hoá cao và ánh sáng nên quá trình thí nghiệm cần phải thực hiện nhanh. Hình 2.16. Bột gấc nhão Cân m1 gam bột gấc nhão vào một beaker. Cho dung dịch ethanol vào beaker để rửa bột nhão (tỷ lệ bột nhão : ethanol = 2 : 1). Ngâm trong khoảng 10 phút. Vắt lấy rắn. Cân lấy khối lượng m2. Tiến hành pha dung dịch xút để xà phòng hóa bột nhão (tỷ lệ KOH : Ethanol = 1 : 10). LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 45 Cho m2 vào một beaker, tiếp tục cho tiếp dung dịch xút vào để xà phòng hóa (tỷ lệ m2 : KOH = 12,5 : 1). Đem beaker đặt vào bể siêu âm tiến hành đánh siêu âm trong khoảng 10 phút. Sau đó, lọc bằng màng lọc thường có hỗ trợ hút chân không. Kế tiếp, rửa chất rắn bằng dung dịch wash solution (NaCl: Ethanol = 1:1) “Hình 2.17”. Cân lấy khối lượng m3. Hình 2.17. Quá trình lọc rửa bột nhão Cho m3 vào bình có chứa dung môi hữu cơ Aceton : Etyl acetat (tỷ lệ 1:1), với tỷ lệ m3 : dung môi = 1 : 20. Tiến hành ngâm chất rắn trong khoảng 4h có thể hỗ trợ bằng máy quay kiểu hành tinh, để lycopene trong bột nhão tách ra. Sau khi ngâm xong, lọc lấy dung dịch (thấy chất rắn nhạt màu, có màu trắng) là quy trình đạt hiệu quả. Đem dung dịch thu được cho vào ngăn mát tủ lạnh, tiến hành trích ly bằng thiết bị cô quay khép kín “Xem hình 2.18” để cho bay dung môi để ngưng tụ lại. Sau đó tiến hành lọc lấy lycopene. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 46 Hình 2.18. Thiết bị cô quay khép kín Sau khi trích ly lycopene hoàn thành, ta thu được lycopene rắn dạng bột. Cân khối lượng. Và tiến hành nghiền quay tạo nano giống như trích ly lycopene từ dầu gấc. Hình 2.19. Bột lycopene trích ly từ bột gấc nhão Tóm lại, quy trình trích ly lycopene và điều chế hạt nano lycopene từ bột gấc nhão bằng dung môi hữu cơ được mô tả bằng sơ đồ khối được thể hiện ở phần Phụ lục. 2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều chế nano lycopene LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 47 a) Ảnh hưởng của thành phần trong công thức tới đặc tính lý hóa của tinh thể nano lycopene. * Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng đến sản phẩm nano lycopene. Nếu lượng chất hoạt động bề mặt quá nhiều sẽ làm ảnh hưởng đến một số tính chất, màu và mùi của sản phẩm, có thể làm hạn chế công dụng hoặc ảnh hưởng đến việc ứng dụng sản phẩm trong thực phẩm chức năng. Ngoài ra chất hoạt động bề mặt còn làm mẫu khó phân tích hoặc làm thay đổi khả năng hòa tan, thẩm thấu. Nếu chất hoạt động bề mặt quá ít cũng không tốt đối với sản phẩm, vì sẽ không bảo vệ hết sản phẩm làm cho sản phẩm bị phân hủy, hoặc làm kích thước của hạt lớn, hệ không trong suốt, độ phân tán kém. * Ảnh hưởng của nồng độ lycopene trong nguyên liệu Sau khi trích ly, chất rắn thu được có thể lẫn một số chất như các carotenoid khác, dầu còn lại, hoặc một số chất rắn không hoà tan trong nước là sản phẩm của quá trình xà phòng hoá. Những chất này có thể có ảnh hưởng nhất định đến kết quả thu được cho hệ nano. Đối với các carotenoid khác, như beta-carotene, thì vì cùng là carotenoid với các tính chất tương tự nhau nên sẽ không ảnh hưởng đến đặc tính lý hoá của sản phẩm. Tuy nhiên beta-carotene có màu vàng nên nếu tỉ lệ thành phần cao so với lycopene thì sản phẩm ngã sang màu cam. Dầu gây ảnh hưởng đến sự cân bằng và ổn định của hệ. Các tạp chất khác cũng vậy. Chính vì thế chúng ta cần loại bỏ những tạp chất này và sử dụng nguyên liệu lycopene càng tinh khiết thì hệ càng ổn định và bền vững, đạt yêu cầu về thành phần và chất lượng sản phẩm. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 48 * Ảnh hưởng của kích thước và cấu trúc của lycopene trong nguyên liệu Như chúng ta đã thấy, nếu để lycopene lắng đọng và kết tinh lâu trước khi lọc thì chúng ta có thể thu được những tinh thể có kích thước đáng kể, có độ óng ánh do cấu trúc tinh thể. Lúc này cấu trúc của lycopene bền vững và khó nghiền quay để đưa về dạng nano hơn. b) Ảnh hưởng của thông số kỹ thuật và quy trình bào chế ảnh hưởng tới đặc tính hóa lý của hệ nano lycopene * Ảnh hưởng của thao tác nghiền mịn bằng máy nghiền bi Khi bình quay, lực ly tâm được tạo ra, lycopene và bi trong bình được đưa lên độ nhất định, dưới tác động của trọng lực sẽ rơi xuống tự do, các bi rơi tự do va đập vào vật liệu nghiền là lycopene làm chúng bị vỡ vụn. Kết quả của quá trình xảy ra liên tục là lycopene được nghiền thành bột mịn có kích thước nano. Nếu thùng nghiền có tốc độ quay quá lớn, lực ly tâm lớn được tạo ra và các bi nghiền cùng lycopene bị văng cuốn theo thành bình mà không bị rơi xuống do đó không xảy ra quá trình va đập, tốc độ xảy ra quá trình như vậy gọi là “tốc độ tới hạn”. Vì vậy phải điều chỉnh tốc độ quay cho phù hợp để lycopene được nghiền với hiệu suất cao tạo thành nano lycopene. * Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ càng cao, độ hòa tan của các chất hoạt động bề mặt càng tốt. Tuy nhiên, nhiệt độ cao cũng làm giảm hoạt tính của một số chất hoạt động bề mặt dễ hòa tan, giảm độ bền của hệ nhũ. Và làm phân hủy sản phẩm, điển hình là nano lycopene rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Vì vậy, có thể bảo quản nano lycopene ở nhiệt độ phòng hoặc ngăn mát tủ lạnh. * Ảnh hưởng của ánh sáng Một điều cần phải chú ý là nano lycopene dễ bị phân hủy khi gặp ánh sáng, chính vì vậy ta cần bảo quản chúng trong chai lọ tối màu và bao bọc bởi giấy nhôm. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 49 * Ảnh hưởng của thời gian quay Nếu thời gian quay không đủ thì kích thước hạt sẽ không đồng đều, không được kích thước như mong đợi, đồng thời hạt nano sẽ phân bố không đều, kém chất lượng. * Ảnh hưởng của tốc độ quay Một thành phần cũng khá là quan trọng cần phải chú ý là tốc độ quay, các bi nghiền cần phải hoạt động tối đa để có thể nghiền mịn lycopene đến kích thước mong muốn. Chính vì vậy, tốc độ điều chỉnh phải phù hợp để có được kết quả tốt nhất. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá tính chất cảm quan của nano lycopene Sau khi tiến hành quy trình trích ly bột lycopene từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa và từ bột gấc nhão bằng dung môi hữu cơ, ta thu được bột lycopene có màu đỏ khá đậm (Hình 3.1, 3.2). Hình 3.1. Bột lycopene Hình 3.2. Bột lycopene dạng tinh thể LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 51 Đem bột lycopene nghiền chung với chất hoạt động bề mặt, ta thu được dung dịch nanolycopene (Hình 3.3) có màu đỏ đậm đạt chuẩn. Đem dung dịch nano lycopene đi đông cô ta thu được bột nano lycopene “Hình 3.4”. Hình 3.3. Dung dịch Nano lycopene Hình 3.4. Bột nano lycopene 5% LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 52 Quan sát sản phẩm tạo thành: Nano lycopene ta thấy: Bảng 3.1. Đánh giá nano lycopene bằng các chỉ tiêu cảm quan. Chỉ tiêu cảm quan Đánh giá Trạng thái Dạng lỏng, không có tạp chất lạ Dạng bột ( lỏng đem đông cô), đồng nhất, không có tạp chất lạ. Màu Đỏ hồng đậm Mùi Mùi thơm của gấc Thông qua các nhận xét – đánh giá về Nano lycopene ta thấy sản phẩm tạo thành đã đạt được các chỉ tiêu mong muốn. Chính vì vậy, quy trình đạt tính đặc hiệu. 3.2. Hình thái và kích thước hạt * Thông qua kính hiển vi điện tử quét SEM Kết quả đo SEM (ngày 03.04.2017 và ngày 02.05.2017) được đo tại Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ cao, ta thấy kích thước hạt vào khoảng 20 – 50 nm. Hạt có dạng hình cầu. Các hạt tương đối đồng đều. Phân bố đều. Hàm lượng nano lycopene cao. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 53 Hình 3.5. Kết quả đo SEM ngày 03.04.2017 Hình 3.6. Kết quả đo SEM ngày 02.05.2017 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 54 Ta nhận thấy rằng với kích thước và hình thái trên các hạt nano lycopene có thể dễ dàng phân tán và dễ hấp thụ tối ưu. Chính vì vậy, quy trình đạt chất lượng. * Thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua TEM Kết quả đo TEM (được đo tại phòng thí nghiệm Hóa học Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh). Hình 3.7. Kết quả đo TEM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 55 * Thông qua máy quang phổ hấp thu UV – Vis Kết quả đo UV – Vis: được đo tại Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ Cao Phổ UV-Vis của nano lycopene được đo tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai thuộc khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh bằng thiết bi ̣ máy đo UV-Vis Visco Spectrophotometer V670. Các carotenoid được hoà tan trong n-hexane và xác định thành phần dựa trên phương pháp của tính phổ hấp thụ đồng thời của Zechmeister [13], [14]. Phổ hấp thụ vùng khả kiến của hai thành phần carotenoid chính trong màng gấc là lycopene và β-carotene chồng lên nhau một phần nhưng thứ tự vị trí các đỉnh theo bước sóng có khác nhau. Vì tính cộng được của độ hấp thụ các chất khác nhau tại mỗi bước sóng, trong trường hợp này chúng ta thiết lập hệ phương trình liên hệ các độ hấp thụ ở hai bước sóng khác nhau để suy ra nồng độ của từng chất một cách đồng thời. Nano lycopene trong n-hexane có các đỉnh hấp thụ lần lượt tại 503 nm, 472 nm, và 445 nm. Còn β-carotene có hai đỉnh ở 478 nm và 452 nm. Vị trí các đỉnh phổ trong ether dầu hỏa, diethyl ether, methanol, ethanol và acetonitrile gần như trùng với các giá trị trên, trong khi đó các đỉnh dịch về phía bước sóng dài khoảng 2–6 nm trong acetone, từ 10-20 nm trong chloroform và dichloromethane, 18 – 24 nm trong toluene [14]. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 56 Hình 3.8. Phổ UV – VIS trong n- hexan của 3mẫu nano (đo lần 1) _______ Mẫu ngày 10+16/03/17 _______ Mẫu ngày 07+08/03/17 _______ Mẫu ngày 02/03/17 Hình 3.9. Phổ UV – VIS trong n- hexan của 3mẫu (đo lần 2) _______ Mẫu ngày 10+16/03/17 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0 100 200 300 400 500 600 700 PHỔ UV - VIS _ NANO LYCOPENE -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0 100 200 300 400 500 600 700 PHỔ UV - VIS _ NANO LYCOPENE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 57 _______ Mẫu ngày 07+08/03/17 _______ Mẫu ngày 02/03/17 * Thông qua máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Sử dụng đầu dò UV – VIS để xác định cường độ peak tương ứng của nano lycopene. Tốc độ dòng pha động: 1 ml/1 phút. Thời gian: 20 phút ( ở phút thứ 11 bắt đầu hiện peak nano lycopene). Bước sóng là: 450nm và 475nm Hệ dung môi sử dụng là: Dicromethan – methanol – acetonnitin – TEA Các peak đồ đo bằng máy HPLC được thể hiện ở phần phụ lục. Thông qua các sắc ký đồ, các đỉnh của hoạt chất không có sự trùng lắp với đỉnh của tá dược, dung môi và pha động. Đỉnh của Nano lycopene tách ra rất rõ ràng. Chính vì vậy, quy trình đạt tính đặc hiệu. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 58 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, tôi rút ra 1 số kết luận sau: 1. Trích ly được bột lycopene từ bột gấc nhão bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ là Aceton : Etyl axetat sau đó đem cô quay bay dung môi, thu sản phẩm. Từ sản phẩm là bột lycopene đem nghiền quay thu được nano lycopene. 2. Trích ly được bột lycopene từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa bằng kiềm, an toàn và ít tốn kém. Sau đó cũng tiến hành nghiền quay hoặc đồng hóa, hóa siêu âm thời gian ngắn thu được nano lycopene. Sản phẩm có thể sẵn sàng sử dụng ngay trong thực phẩm hoặc mỹ phẩm. Tuy nhiên khi áp dụng quy trình này vào sản xuất công nghiệp, các thiết bị và quá trình lọc cần điều chỉnh phù hợp để có thể đạt hiệu quả cao. 3. Nghiên cứu vận hành thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, nguyên lý hoạt động, cấu tạo, Tiềm hiểu thiết bị đo SEM, UV – VIS. 4. Từ sản phẩm thu được đem phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC, UV – VIS cho thấy các peak dễ tách rời , đo SEM cho thấy được hình dạng nano lycopene có dạng hình cầu, kích thước vào khoảng 50nm – 100nm, phân tán đồng đều, hàm lượng lycopene cao, độ hòa tan tốt, LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. A.V. Rao, L.G. Rao, (2007). Carotenoids and human health,Pharmacol. Res., 55, 3, 207–216. [2]. Bailey, (2015). Lycopene extraction properties and usage, Food science and technology, 4, 13-20. [3]. T.C. Kha et al., (2013). Effects of Gac aril microwave processing conditions on oil extraction efficiency, and β-carotene and lycopene contents, J. Food Eng., 117, 4, 486–491. [4]. F.A. De Sousaet al., (2014). Influence of ripening stages of tomatoes in the analysis of pesticides by gas chromatography,J. Braz. Chem. Soc.,25, 8,1431– 1438. [5]. P. Singhet al, (2012). Lycopene antioxidant activity in cosmetics meadow, Inter. Research J of Pha, 3, 1, 46–47. [6]. H.C. Mai, V. Truong, F. Debaste, (2016). Carotenoids purification from gac (Momordica cochinchinensis Spreng) fruit oil, J. Food Eng., 172, 2–8. [7]. L. Zechmeister, A. Polgár, (1943). Cis-trans Isomerization and Spectral Characteristics of Carotenoids and Some Related Compounds, J. Am. Chem. Soc, 65, 8, 1522–1528. [8]. L. Zechmeisteret al,(1943). Spectral Characteristics and Configuration of Some Stereoisomeric Carotenoids Including Prolycopene and Pro-γ- carotene, J. Am. Chem. Soc, 65, 10, 1940–1951. [9]. Trương Văn Tân (2013). Khoa học và công nghệ, NXB Tri Thức, Hà Nội [10]. https://vi.wikipedia.org/wiki/Nano. [11]. https://www.google.com.vn/chathoatdongbemat [12]. Lê Thị Tâm (2015). Tác động của nano sáp carnauba và nano bạc tới hiệu quả bảo quản của chế phẩm tạo màng hydroxypropyl methyl cellulose LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 60 (HPMC) dùng trong bảo quản quả xoài. Luận văn thạc sĩ – Học viện nông nghiệp Hà Nội. [13]. https://www.google.com.vn/cacphuongphapdieuchenano [14]. Trương Công Trị, Khưu Mỹ Lệ, Nguyễn Minh Đức (2015). Nghiên cứu điều chế hệ tiểu phân nano. Luận văn tiến sĩ dược học – Đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh. [15]. Nhóm nghiên cứu công nghệ nano. Tài liệu máy đo SEM của Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ cao, quận 9, thành phố Hồ Chí Minh. [16]. https://www.google.com.vn/thietbidothezeta [17]. Nhóm nghiên cứu công nghệ nano. Tài liệu máy đo UV – VIS của Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ cao, quận 9, thành phố Hồ Chí Minh. [18]. Nhóm nghiên cứu công nghệ nano. Tài liệu máy đo sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ cao, quận 9, thành phố Hồ Chí Minh. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG PHỤ LỤC Sơ đồ khối quy trình trích ly lycopene và điều chế hạt nano lycopene từ bột gấc nhão bằng dung môi hữu cơ (Aceton : Etyl axetat) Bột gấc nhão thương mại Loại nước Xà phòng hóa +KOH +H2O Siêu âm hh A Lọc A lấy bột ráo (B) (bằng chân không) Bột ráo B Rửa bằng NaCl + Ethanol Ngâm bột trong dung môi 4h + quay + DM: Aceton + Etyl axetat Lọc bỏ rắn thu dung dịch (C) Cô quay C Làm lạnh 2 ngày Lọc thu Lycopene Rửa bằng NaCl + Ethanol Nghiền quay Vật liệu nano Lycopene LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 1 Sắc ký đồ của mẫu nano lycopene đo bằng HPLC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIA NANOLYCOPENE GVHD: TS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY THS. VŨ THỊ HỒNG PHƯỢNG 2