Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa (Xanthium Strumarium l.)

phần chính của phosphatidylglycerol -Có trong thực vật, khuẩn que -Có trong dong tảo, thực vật bậc cao, vi khuẩn 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên cis-9- hexadecenoic Palmitoleic -Phổ biến trong động vật, thực vật, tổ chức vi sinh vật, là cấu phần chủ yếu của một vài loài hạt thực vật 18 cis-11- hexadecenoic cis-9-octadecenoic cis-11-ctadecenoic Palmivacceni c Oleic Vaccenic 10,5 13,0 -Có trong dầu các hạt thực vật. -Phổ biến hầu hết trong các động vật, thực vật và tổ chức vi sinh vật -Có trong E-coli và các vi khuẩn khác 16 18 Axít béo 2 nối đôi cis,cis-7,10- hexadecadienoic cis,cis-9,12- hexadecadienoic cis,cis-6-9- octadecenoic cis,cis-9-12- octadecenoic Linoleic -5,0 Phổ biến trong thực vật, rong, tảo… -Cấu tử thứ yếu Cấu phần thứ yếu ở động vật sống. -Cấu phần chủ yếu trong lipit thực vật, ở động vật và con người, nó chỉ bổ xung vào qua con đường thức ăn rau quả hoặc dầu mỡ thực vật và sinh vật biển Axít béo 3 nối đôi 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 18 16 16 20 (Phân cách đều đặn bởi một nhóm metylen) all-cis-7,10,13- hexadecatrienoic all-cis-6,9,12- octadecatrienoic all-cis-9,12,15- hexadecatrionic Axít béo 3 nối đôi (nối đôi liên hợp) Cis-9,trans- 11,trans-13- octadecatrienoic Axít béo 4 nối đôi all-cis-4,7,10,13- hexadecatrionic all-cis-5,8,11,14- eicosatetraenoic ó-Linoleic ỏ-Linolenic Elecostearic Arachidonic -11 44 -49,5 -Có ở thực vật bậc cao và rong tảo biển -Là cấu phần thứ yếu trong động vật và một vài loài rong biển.Là cấu thành rất quan trọng của một vài loài thực vật -Phổ biến ở thực vật bậc cao và rong tảo biển, là cấu phần đặc biệt của galatosyl diglycerit. -Có trong dầu hạt một số loài cây đặc biệt dầu trẩu -Là cấu phần quan trọng của lipit động vật và một vài rong tảo biển. Đặc biệt là thành phần chủ yếu của phospholipit Axit béo 5 nối đôi 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 22 All-cis- 7,10,13,16,19- Docosapentaenoic Axít béo 6 nối đôi All-cis- 4,7,10,13,16,19- docosahexanenoic clupanodonic DHA Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 CHƢƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là quả của cây Ké đầu ngựa được thu hái vào cuối tháng 8 đầu tháng 9 năm 2006 tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên. Quả Ké đầu ngựa còn được gọi là Thương nhĩ tử (Trung Quốc). Có tên khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae [5]. Mẫu quả tươi thu hái về (16kg), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 1100 C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-600 C cho tới khi độ ẩm nhỏ hơn 10% thu được 8.8kg mẫu khô. Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 900 ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ khoảng 500 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết hợp nhiều phương pháp khác nhau như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Riêng cặn thô n-Hexan được metyl hoá (este hoá) bằng MeOH xúc tác HCl. Đun hồi lưu khoảng 8 tiếng, sau đó trung hoà bằng NaHCO3 cho đến pH = 7, chiết 3 lần bằng n-Hexan. Dịch chiết tổng cô khô và được đưa đi phân tích bằng thiết bị GC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Hình 2.1. Cây Ké đầu ngựa Hình 2.2. Quả Ké đầu ngựa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của quả Ké đầu ngựa cần phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp : - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v...Sau đó sẽ tiến hành ghi các các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR) với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất. 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC- Plastikfolien Kieselgel 60F254 Art.5735 tráng sẵn, độ dày 0,2mm cũng đã được sử dụng để xác định số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM. 1. n-Hexan-etylaxetat (2:1) Hệ A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2. n-Hexan-etylaxetat (5:1) Hệ B 3. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ C 4. Cloroform-metanol (9:1) Hệ D 5. Cloroform-metanol (5:1) Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun bằng thuốc thử Vanilin 1% trong hỗn hợp metanol + H2SO4 đặc và sấy trên 100 0C hoặc đưa vào buồng I2 để xác định thành phần cấu tử. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B, C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 đến 0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm). Các dụng cụ khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là: - Cân phân tích. - Máy cất quay chân không. - Bộ chiết Shoxlet. - Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet - Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc ký Hoá chất:  Dung dịch axit sunfuric (H2SO4).  Dung dịch axit chlohiđric (HCl).  Dung dịch axit axetic (CH3COOH).  Tinh thể muối natrisunfat khan (Na2SO4).  Dung dịch Sodium metanolat, axetyl chlorit.  Dung dịch axit HCl 0,5N trong nước  Dung dịch KOH 0,5N trong cồn  Dung dịch KOH 0,1N trong nước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22  Hỗn hợp dung môi ete etylic - cồn 950 (2:1 theo thể tích) 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boátus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - TTKHTN & CNQG) dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L. Phổ FAB-MS(NaCH3COO) ghi trên máy LC- MS-Trap-00127. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá học –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) hoặc Bruker 200MHz, 400MHz AVANCE (Bruker) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3 , DMSO-d6 hoặc C5H5N-d5. - Phổ GC-MS ghi trên máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BFX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM). Carrier: N2, Pressure cant: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min, H2:35ml/min. Chương trình chạy nhiệt độ: 850(0/min.) -1500(10/min) -2000(10/min) - 230 0 (5/min). 2.3. CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) 2.3.1 Các dịch chiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ quả Ké đầu ngựa thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các ký hiệu tương ứng là: KĐN.H, KĐN.E và KĐN.M (xem trong sơ đồ 2.1). Kí hiệu: - KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan - KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc - KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu n-hexan EtOAc Mẫu khô nghiền nhỏ 1. n-hexan (KĐN.H) 2. Etylaxetat (KĐN.E) 3. Dịch cái 1.Etanol 2.Cặn + H2O 4. Metanol (KĐN.M) 1.Cô khô 2. Metanol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) Bộ phận Khối lượng mẫu (g) Cặn chiết n-hexan (g) EtOAc (g) MeOH (g) KĐN.H KĐN.E KĐN.M Quả 1600 62,7 14,8 93,2 2.3.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity). * Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định - Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa), E. coli (Ec) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (Bs), Staphylococcus aureus (Sa). - Nấm men : Candida albicans (Ca). Chất tham khảo: Amphotericin B Amoxicilin *Phương pháp thử : Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml; 8ỡg/ml; 2ỡg/ml; 0,5ỡg/ml đối với chất sạch, 256ỡg/ml; 64ỡg/ml; 16ỡg/ml; 4ỡg/ml; 1ỡg/ml đối với dịch chiết. Bước 2: Thử hoạt tính: Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hành thử. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Lấy 10ỡl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm 200ỡl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ 370 sau 24 giờ, đọc độ đục tế bào trên máy Tecan, xử lý số liệu và tính toán giá trị IC50. Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả Ké đầu ngựa STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định Ec. Escherichia coli IC50 g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50 g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50 g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50 g/ml Ca: Candida albicans IC50 g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 Nhận xét : Các mẫu thử không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định trên ở nồng độ < 256 g/ml. 2.3.3 Phát hiện định tính các nhóm chất 2.3.3.1. Các ancaloit Lấy 0,01g cặn chiết của các phân loại, thêm 5ml H2SO4 5%, khuấy đều lọc qua giấy lọc, sau đó lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit này. Ống 1: cho 1 – 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là dương tính. Ống 2: cho 1 – 2 giọt thuốc thử Dragendorff: nếu thấy xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống 3 : cho 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer: nếu xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.3.3.2. Các sterol Lấy 0,01gam cặn chiết của các phân đoạn cho thêm 2ml NaOH 10% đun trên bếp cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn vào 2ml Clorofoc, sau đó thêm một giọt thuốc thử Liebermann - Burchard (hỗn hợp 1ml anhyđric axetic+ 1ml cloroform để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Nếu thấy giữa hai lớp chất xuất hiện các màu xanh nhạt (có thể có màu lục, cam, hồng hoặc đỏ) bền vững trong một thời gian là dương tính. 2.3.3.3. Các flavonoit Lấy 0,01g cặn chiết của các phân đoạn, thêm 10ml Metanol , đun nóng cho tan hết rồi lọc qua giấy lọc . Lấy 2ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magiê kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc. Đun trong bình cách thuỷ vài phút, quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là dương tính với các flavonoit. 2.3.3.4. Các saponin. Chuẩn bị các dung dịch thử như 2.3.3.3. Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm cao 25cm, rồi thêm 25ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền của bọt (nếu bọt cao quá 3 - 4cm và bền trên 15 phút là có dấu hiệu dương tính). Dung dịch không tạo bọt là phản ứng âm tính. 2.3.3.5. Các Cumarin Dung dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.3.3. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml dung dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5ml NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội rồi mỗi ống lại cho thêm 5ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống nghiệm có kiềm trong hơn ống không có kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đặm đặc sẽ làm cho dung dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo kết tủa là dương tính. 2.3.3.6. Các tanin. Lấy 0,01gam chiết phẩm, thêm 10ml nước cất, khuấy đều, nhỏ 2 đến 3 giọt FeCl3 5%, nếu có màu xanh lục hoặc đen là dương tính. 2.3.3.7. Các glucozit trợ tim Cần thực hiện 02 phản ứng Phản ứng Kellere – Kaliani: Thuốc thử gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đậm đặc + 1mlFeCl3 5% Cách làm : Lấy 0,01 gam cặn chiết các phân đoạn cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ông nghiệm rồi cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu đỏ hay nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. Nếu không thấy xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim vì các glucozit tim luôn luôn có mặt các desoxysacarit. Phản ứng Legal : Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dịch thử , thêm vào 1 giọt dung dịch prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu thấy xuất hiện màu đỏ là dương tính với vòng butenolid. Bảng 2.3. Phát hiện định tính các nhóm chất STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + + 3 Flavonoit Xianidin - - - 4 Saponin Tạo bọt - + + 5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chiết n - hexan Chiết Etylaxetat Cất loại dung môi Cất loại dung môi GC - MS Sắc ký cột Silicagel Sắc ký cột Silicagel 6 Tanin FeCl3 5% - - + 7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - - 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L. Metyl hoá Dịch chiết n- hexan Dịch chiết Etylaxetat Dầu béo Cặn chiết Etylaxetat Xác định hàm lượng và TP axit béo Căn chiết n- hexan Chiết Shoxlet 1. n - hexan 2. Etylaxetat KĐN.H8 KĐN.E33 Quả Ké đầu ngựa sấy khô, nghiền nhỏ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.4.1. Phân tích thành phần các axít béo trong dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa trên GC. Hàm lượng lipit tổng: % (so với trọng lượng mẫu tươi) Thành phần axit béo được xác định dưới dạng metyl este trên sắc ký khí GC theo phương pháp tiêu chuẩn ISO/FDIS 5509:1998, LB Đức. Trong thực nhiệm 10mg dầu béo được hoà tan với 1ml n-Hexan lắc kĩ trong lọ nhỏ, nút kín. Bổ xung 25ml dung dịch CH3ONa trong metanol (2mol/l) và lắc kĩ trong 1 phút Bổ xung 1ml nước cất vào, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Hút lớp sáp không phản ứng ở dưới loại đi. Bổ xung 100 ml HCl, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Loại bỏ kiệt lớp bẩn dưới đáy, lớp dung môi trên được làm khan bằng Na2SO4 và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Chuyển mẫu đã metyl hoá sang ống mẫu đem phân tích thành phần axit béo bằng máy sắc kí khí . * Điều kiện phân tích GC mẫu methyl este axit béo: Máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BPX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM). Carrier: N2, Pressure const: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min, H2:35ml/min Chương trình nhiệt độ: 850 (0/min) -1500 (10/min) -2000(10/min) - 230 0 (5/min). Bảng 2.4. Kết quả thành phần axit béo 88 x100% = 4,4% 2000 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 (Phổ và điều kiện phân tích máy GC kèm theo) TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu(R1) Hàm lƣợng (%) 1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03 2 C15:0 Axit pentadecanoic - 13.00 0.35 3 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28 4 C18:1(n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 5 C18:2(n-6) Axit 9,12-Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 6 C18:3(n-6) Axit 6,9,12-Linolenic Linolenic 28.39 38.60 7 C19:1(n-9) Axit 10-nonadecaenoic - 28.44 5.24 8 C22:5(n-3) Axit 5,8,11,14,17- Docosapentaenoic DPA 53.60 0.24 9 others 0.84 Tổng các axit béo no 4.2 Tổng các axit béo không no 94.96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.4.2. Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-Hexan; Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa bằng phƣơng pháp sắc ký cột. 2.4.2.1.β – Sitosterol (KĐN.H8) Lấy 62,7g cặn chiết n- hexan đem tách trên cột có đường kính 1,5 cm dài 45 cm, với chất hấp phụ là silicagel khối lượng 100g, có kích thước hạt 60m – 100 m, dung môi rửa giải là n – hexan: etylaxetat với tỷ lệ etylaxetat tăng dần từ 0% - 100%. Các phân đoạn thu được từ cột được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi triển khai là n – hexan: etylaxetat (8: 1), hiện màu bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 10%. Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem cất loại dung môi thu được 8 phân đoạn với nhiều cấu tử khác nhau. Các phân đoạn từ 1 đến 6 và phân đoạn 7 đều là hỗn hợp, riêng phân đoạn 8 (rửa giải cột bằng hỗn hợp n – hexan: etylaxetat (20: 1)) có Rf C là 32, cất loại dung môi thu khối chất rắn vô định hình màu vàng nhạt, kết tinh lại trong axeton thu được 0,9870g những tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 138-1400C. KĐN.H 62,7g Silicagel n-Hexan:EtOAc (20:1) KĐN.H8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Phổ FT-IR (KBr): ớmax(cm -1): 3426 (rộng, mạnh); 2983; 2932; 2868; 1651 (yếu); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (200MHz, CDCl3,  (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13C -NMR (50MHz, CDCl3),  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33). Lấy 14,8g cặn chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa đem tách trên cột silicagel với khối lượng 70g. Cột có đường kính 2,5 cm, dài 45 cm. Rửa giải cột bằng hỗn hợp dung môi Cloroform: metanol với tỷ lệ metanol tăng dần từ 0 – 100%. hệ dung môi chạy bản mỏng là Cloroform: metanol (5:1). Hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4 10%, thu được tất cả 33 phân đoạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa Phân đoạn 33 (rửa giải cột bằng cloroform: metanol (95:5)), sau khi cất đuổi dung môi và kết tinh lại trong etylaxetat/metanol, rửa lại bằng axeton thu được 0,007 g khối chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 273 - 2750C, Rf E=35 Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz,): (ppm) 0,71 (3H, s, Me-18); 0,77 (3H, s, Me-19); 5,36 (1H, H-6); Phổ 13C – NMR (125 MHz, DMSO – d6); (ppm): 140,41 (s, C-5) ; 121,12 (d, C-6); 100,76 (d, C-1’); 76,89 (d, C-3’); 76,73(d, C - 5’); 76,69 (d - C3); 73,42 (d, C - 2’); 70,01 (d, C- 4’); 61,06 (t, C - 6’); 56,13 (d, C - 14); 55,39 (d, C-17); 50, 53 ( d, C-9); 49, 56 (d, C- 24); 45, 11 (s, C – 13); 40, 92 (t, C – 4); 39, 76 (t, C- 12); 36, 78 (t, C – 1); 35, 43 (s, C - 10); 33, 31 (d, C- 20); 31, 37 (t, C- 22); 31, 32 (d, C- 8); KĐN.E 14,8g KĐN.E33 Silicagel Clorofom:metanol (95:5) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 29, 22 (t,C – 16); 28, 68 (t, C- 23); 27, 73 (t, C- 2); 25, 43 (t, C-25); 23, 80 (t, C- 15); 22, 572 (t, C – 28); 21, 05 (t, C–11); 20,86 (d, C–27); 19, 64 (q, C- 19); 19, 04 (q, C–26); 12, 05 (q,C– 29); 11, 73 (q, C – 18). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 CHƢƠNG3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau [4]. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v.... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu quả Ké đầu ngựa được thực hiện theo phương án 2. (Sơ đồ 2.1). Các dịch chiết thô đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có phản ứng dương tính với các biotest. Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho biết một số dịch chiết có hoạt tính mạnh với vi sinh vật kiểm định. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 3.2. PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT N – HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) Việc phát hiện định tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan và dịch chiết etylaxetat của quả Ké đầu ngựa, được tiến hành thực nghiệm như ở mục 2.3.3. Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra ở bảng 2.3 như sau: Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + + 3 Flavonoit Xianidin - - - 4 Saponin Tạo bọt - + + 5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - + 6 Tanin FeCl3 5% - - + 7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - - 3.3 KẾT QUẢ THỬ HỌAT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) . Việc nghiên cứu hoá thực vật của bất kỳ 1 loài thực vật (hay những bài thuốc dân gian) nào thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học các loại dịch chiết cô của nó, nhằm định hướng cho việc phân lập các hoạt chất có trong cây. Các mẫu nghiên cứu được đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) và hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có những hoạt tính gì và lớp chất nào có trong thực vật. Kết quả thử hoạt tính sinh học giúp cho việc định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 hướng tìm kiếm hoạt chất, lựa chọn các phân đoạn ưu tiên để phân lập và nhận dạng cấu trúc hoá học của hoạt chất. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n-hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa được thực hiện tại phòng Thử nghiệm hoạt tính Sinh học-Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Qui trình thử chúng tôi đã trình bày cụ thể ở mục (2.3.2). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n – hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa. STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định Ec. Escherichia coli IC50 g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50 g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50 g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50 g/ml Ca: Candida albicans IC50 g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy : dịch chiết n - hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa đều cho phản ứng âm tính với các chủng vi khuẩn. Điều này chính tỏ rằng các dịch chiết trên của quả Ké đầu ngựa không có khả năng kháng khuẩn. Những công trình nghiên cứu trước đây về khả năng kháng khuẩn của dầu béo một số loài thực vật chi Xanthium strumarium L.cho thấy : trong dầu hạt thưc vật thuộc chi Xanthium strumarium L., có khả năng kháng khuẩn khá cao. Vậy sự khác nhau về kết quả nghiên cứu này, phải chăng nguyên nhân là sự khác nhau về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Trong tài liệu mà chúng tôi thu thập được không thấy tài liệu nào nói về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Theo chúng tôi, có thể các nhà nghiên cứu trước đã thu nhận dầu béo từ hạt thực vật bằng phương pháp ép trích li từ hạt, khi đó các hợp chất có chứa trong thành phần của hạt, kể cả những chất có hoạt tính và những chất không có hoạt tính, đều được ép ra cùng với dầu. Chính vì vậy hỗn hợp các chất này đã tạo cho dầu béo Quả Ké đầu ngựa thu được bằng phương pháp này có khả năng kháng khuẩn cao. Còn dầu Quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu được tách ra từ hạt theo phương pháp chiết shoxlet trong các dung môi khác nhau (n-hexan, etylaxetat và metanol) chính vì lẽ đó mà các chất chứa trong dầu béo của quả Ké đầu ngựa được chúng tôi tách chiết ra đã có sự chọn lọc theo độ phân cực tăng dần của dung môi. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy không có dịch chiết trong các dung môi n – hexan, etylaxetat, metanol của quả Ké đầu ngựa là có khả năng kháng khuẩn yếu, như vậy chứng tỏ những chất có khả năng kháng khuẩn trong quả Ké đầu ngựa là những chất phân cực. Nhưng trong quá trình chiết quả Ké đầu ngựa chúng tôi mới chỉ dừng lại ở dung môi metanol, nên có thể những chất có độ phân cực cao hơn và có khả năng kháng khuẩn cao chưa được tách ra . 3.4. XÁC ĐỊ NH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA. 3.4.1. Các axit béo. Sắc kí đồ của dầu quả Ké đầu ngựa xem ở phụ lục. Bằng phương pháp GC chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nghiên cứu có 9 cấu tử, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1%, 4 cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% và một số cấu tử khác chưa xác định cấu trúc cũng có hàm lượng axit béo dưới 1%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Bảng 3.1: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo trên 1% trong quả Ké đầu ngựa TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu Hàm lƣợng % 1 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28 2 C18:1 (n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 3 C18:2 (n-6) Axit 9,12- Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 4 C18:3 (n-6) Axit 6,9,12- Linolenic Linolenic 28.39 38.60 5 C19:1 (n-9) Axit 10- nonadecaenoic - 28.44 5.24 Bảng 3.2: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo dƣới 1% trong quả Ké đầu ngựa TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu Hàm lƣợng % 1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03 2 C15:0 Axit pentadecanoic - 13.00 0.35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 3 C22:5 (n-3) Axit 5,8,11,14,17- Docosapetaenoic DPA 53.60 0.24 4 Other 0.84 Trong các cấu tử của quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nhận được qua GC/MS, có 4.2 % cấu tử đã nhận dạng được là các axít béo no, 94.96 % các cấu tử là các axít béo không no. Các cấu tử chưa nhận dạng được đều là các chất có hàm lượng dưới 1%, chúng đều là những chất chưa có kết luận chắc chắn về cấu trúc phân tử. Nhìn chung các axit có số nguyên tử cacbon chẵn và nối đôi có cấu hình dạng cis hoặc Z, định vị bắt đầu từ nguyên tử cacbon số 9 kể từ nhóm cacboxyl hoặc kể từ nhóm metyl (n-9). Đồng phân 9Z được tìm thấy nhiều trong axit hexadecenoic. Nó là một hợp chất có nhiều trong dầu cá và là thành phần chính trong một vài loại dầu hạt. Axit oleic được phân bố rộng dãi nhất trong tất cả axit béo và đại diện cho axit ở dạng một nối đôi. Axit này có hàm lượng khá cao trong quả Ké đầu ngựa. Axit linolenic chiếm hàm lượng cao nhất trong quả Ké đầu ngựa, đây là một loại axit có nhiều trong hầu hết dầu hạt thực vật. Ngoài ra, nó có trong lipit động vật và dầu cá ở mức độ thấp. Axit ó – Linolenic (n-6) – 18:3, là bước chuyển hoá trung gian của axit linolenic tới axit archidonic. Các dầu chứa axit này trong Y học được dùng để chữa trị một số bệnh: Eczema, viêm khớp, xơ cứng động mạch, lão hoá. Dựa vào sắc kí đồ ta thấy: Thành phần chính của quả Ké đầu ngựa là 6,9,12 - Linolenic axit (chiếm 38.60 %); Cis-7-Octadecenoic axit (chiếm 27,67 %); 9,12- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Octadecadienoic axit (chiếm 23,21 %). Ngoài ra trong thành phần của quả Ké đầu ngựa còn chứa một số axit béo không no khác. Dưới đây là công thức cấu tạo của chất chính có hàm lượng tương đối cao trong quả Ké đầu ngựa. o o 9, 12 - octadecadienoic axit (23,21 %) COOH Oleic axit (27,67%) COOH 9,6,12 – Linolenic axit (38,60 %) 3.4.2. Các hợp chất sterol Những chất có khung steroit được tìm thấy trong các dịch chiết của quả Ké đầu ngựa thường là các sterol C29 với bộ khung 3-ol 5-pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây. 3.4.2.1. -sitosterol hay 24R-stigmast-5-en-3--ol (KĐN.H8) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n- hexan của quả Ké đầu ngựa, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH) : max = 3426 cm-1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm-1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm. Sơ đồ 3.1: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 H O m/z = 414 H O m/z = 329 m/z = 396 CH2 H O m/z = 273 m/z = 381 - H2O - 15 - C4 H8 - H2O - C6H13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol. Bảng 3.3: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol STT -sitosterol ppm 1 37.3 t 2 31.7 t 3 71.8 d 4 42.3 t 5 140.8 s 6 121.7 d 7 31.9 t 8 31.9 d 9 50.2 d 10 36.5 s 11 21.1 t 12 39.8 t 13 42.3 s 14 56.8 d 15 24.3 t m/z = 255 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 STT -sitosterol ppm 16 28.3 t 17 56.1 d 18 11.9 q 19 19.4 q 20 36.2 d 21 18.8 q 22 33.9 t 23 26.1 t 24 45.9 d 25 29.2 d 26 19.1 q 27 19.4 d 28 23.13 t 29 11.9 q 3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33) Chất rắn ở dạng vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hệ dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 273- 275 0 C. Phổ 13C-NMR quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có 7 nguyên tử cacbon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,1ppm đến 100,8ppm). Hai tín hiệu ở 140,41 và 121,12ppm thuộc về một liên kết olefin. Phổ 1H- NMR xác nhận sự có mặt của một liên kết đôi ở 5,36 ppm và của nhóm hydroxy ở vùng 3,5ppm đến 4,0 ppm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Số liệu từ các phổ 1H- NMR, phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến cấu trúc của hợp chất glucozit có công thức C35H60O6. Đem chất này thuỷ phân trong axit loãng đã thu được -sitosterol, đồng thời trong phổ cũng thấy mất đi tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng chứng tỏ rằng một phân tử đường đã bị loại ra khỏi phân tử -sitosterol glucozit. Các số liệu phổ thực nghiệm thu được so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định chất rắn vô định hình nóng chảy ở 273-2750C chính là -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 14 56,79 (d) 56,75 15 24,32 (t) 24,15 16 28,26 (t) 28,25 17 56,09 (d) 56,02 18 0,6 (3H, s) 11,89 (q) 11,84 19 1,01 (3H, s) 19,41 (q) 19,46 20 36,16 (c) 36,07 21 0,92 (3H, d) 18,80 (q) 18,68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 22 . 33,98 (t) 33,95 23 26,13 (t) 26,10 24 45,88 (d) 45,82 25 29,19 (d) 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) 19,21 28 23,13 ()t 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của (3, 24R)  - sitosterol thấy rằng kết quả tơng đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau. Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau. Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của KĐN.H8 có thể xảy ra như sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 H O m/z = 414 H O m/z = 329 m/z = 396 CH2 - H2O - 15 - C4 H8 - C6H13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 19 11 12 18 14 13 17 16 15 20 21 23 22 24 25 26 27 28 * Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng đị nh rằng chất KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R)  - sitosterol có công thức phân tử là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên. 3.4.2.2.  - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o -  - D - Glucopyranosyl). - Chất rắn vô định hình không màu (KĐN.E33) không tan trong cloroform, axeton dễ tan trong metanol. tonc = 282 – 283. Rf = 35. Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau m/z = 255 R O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 3390 cm -1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl (- OH) 2934, 2960 cm -1 (mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm – CH3 và > CH2 no. 1640 cm -1 (yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken 1461 cm -1 (trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm > CH2 và - CH3 1373 cm -1 (trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của nhóm – CH3 (xem phụ lục). - Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH – OH); 5,330 (1H, t, > CH -). - Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome” (H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz, và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm. - Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hai tín hiệu ở 140, 56 (s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin. - Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm) - Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60 O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được  - sitosterol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 - Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất (KĐN.E33) đã thu được từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa là  - sitosterol – 3 – O -  - D – glucopyranosyl. 31,69 (t) CH2 31,63 71,84 (d) CH 71,73 42,29 (t) CH2 42,20 140,78 (s) C 140,71 121,74 (d) CH 121,63 31,94 (t) CH2 31,90 31,95 (d) CH 31,81 50,17 (d) CH 51,13 36,53 (s) C 36,43 21,11 (t) CH2 21,09 39,81 (t) CH2 39,79 42,33 (s) C 42,37 56,79 (d) CH 56,75 24,32 (t) CH2 24,15 28,26 (t) CH2 28,25 56,09 (d) CH 56,02 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 11,89 (q) CH3 11,84 19,41 (q) CH3 19,46 36,16 (c) CH 36,07 18,80 (q) CH3 18,68 33,98 (t) CH2 33,95 26,13 (t) CH2 26,10 45,88 (d) CH 45,82 29,19 (d) CH 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) CH3 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) CH3 19,21 28 23,13 ()t CH2 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) CH3 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của BĐQ mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của (3, 24R)  - sitosterol thấy rằng kết quả tương đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau. Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đưa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau. Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của BĐQ có thể xảy ra như sau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất BĐQ H O m/z = 414 H O m/z = 329 m/z = 396 CH2 H O m/z = 273 m/z = 255 m/z = 381 - H2O - 15 - C4 H8 - H2O - C6H13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 19 11 12 18 14 13 17 16 15 20 21 23 22 24 25 26 27 28 * Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng đị nh rằng chất BĐQ mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R)  - sitosterol có công thức phân tử là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên 3.4.2.  - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o -  - D - Glucopyranosyl). - Chất rắn vô định hình không màu (HBĐ) không tan trong cloroform, axeton dễ tan trong metanol. tonc = 282 – 283. Rf = 32. Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau 3390 cm -1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl (- OH) 2934, 2960 cm -1 (mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm – CH3 và > CH2 no. 1640 cm -1 (yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken 1461 cm -1 (trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm > CH2 và - CH3 1373 cm -1 (trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của nhóm – CH3 (xem phụ lục ). - Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH – OH); 5,330 (1H, t, > CH -). R O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 - Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome” (H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz, và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm. - Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hái tín hiệu ở 140, 56 (s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin. - Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm) - Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60 O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được  - sitostrol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit. - Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất (HBĐ) đã thu được từ dịch chiết metanol của hạt Ba đậu là  - sitostrol – 3 – O -  - D – glucopyranosid. 3.4.3.  - amyrin axetat (urs – 12 – en - 3 - yl axetat) AcO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Trong phổ EI – MS quan sát thấy mảnh ion phân tử M+ ở 468 (1,7) m/z và có kiểu phân mảnh giống như urs – 12 – en – 3 – yl axetat [129 mh]. Phổ 13 C – NMR với các kỹ thuật khác nhau đã chỉ ra sự có mặt của 32 nguyên tử các bon (xem bảng ). Bảng : Độ chuyển dịch hoá học 1H – NMR và 13C – NMR của KSQ. STT của nguyên tử cacbon Chất KSQ C (độ bội) H (J, Hz) 1 38,493 (t) 2 23,265 (t) 3 80,975 (d) 4,507dd, J 6.0, 10.6 Hz 4 37,729 (s) 5 55,290 (d) 6 18,263 (t) 7 32,891 (t) 8 40,055 (d) 9 47,6,1 (d) 10 36,817 (d) 11 23,391 (t) 12 124, 344 (d) 5,126t, J 3.6 Hz 13 139,649 (s) 14 42,099 (s) 15 28,115 (t) 16 26,624 (t) 17 33,764 (s) 18 59,092 (d) 19 39,629 (d) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 20 39,673 (d) 21 31,266 (t) 22 41,553(t) 23 28,053 (q) 0,877s 24 16,885 (q) 0,865s 25 15,747 (q) 0,970s 26 16,748 (q) 1,012s 27 23,241 (q) 1,067s 28 28,759 (q) 0,800s 29 17,513 (q) 0,796d, J4.20 Hz 30 21,403 (q) 0,922d, J 5.13 Hz 31 170,996 - 32 121,312 2,046s (Ghi chú : Các dòng để trống trong phổ 1H là các tín hiệu không phân giải hoặc cacbon bậc 4 (không chứa H)). Phổ 1H – NMR chỉ ra sự có mặt của 6 nhóm metyl dạng singlet, 2 nhóm metyl ở dạng doublet trong vùng trường cao (0,79 đến 1,07 ppm) hoàn toàn chứng tỏ đó là một tritecpen kiểu khung ursan. Sự có mặt của nhóm axetyl trong (KSQ) được xác nhận bằng các tín hiệu cộng hưởng proton và cac bon – 13 (2,0460 s; 170,990 s; 21,312q). Các số liệu phổ 13C – NMR (bảng …..) hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của urs – 12 – en - 3 - yl axetat hay  - amyrin axetat [91 mH]. Có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN 1. Lần đầu tiên quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) mọc hoang tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật. Một số dịch chiết của quả Ké đầu ngựa được thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho thấy không có tác dụng với một số vi sinh vật kiểm định. 2. Từ quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) chúng tôi đã phân lập được 4 chất hữu cơ tinh khiết, trong đó có hai chất đã được nhận dạng là: KĐN.H8: β-sitosterol KĐN.E33: 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol Còn 2 chất rắn khác (do thời gian có hạn) đang được ghi các loại phổ để xác định cấu trúc hoá học của chúng. 3. Bằng phương pháp GC so với các chất chuẩn chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu ngựa có 9 cấu tử có hàm lượng axit béo cao, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% như: Axit 6,9,12 – linolenic (38,60%), Axit oleic (27,67%), đặc biệt một số axit béo có những hoạt tính sinh học tốt. II. KIẾN NGHỊ Cây Ké đầu ngựa là một loại thực vật mọc hoang dã ở Việt Nam, là một cây thuốc quý, rất phổ biến và có nhiều ứng dụng đối với Y học dân gian. Do điều kiện thời gian có hạn nên dịch metanol của quả Ké đầu ngựa chúng tôi chưa tiến hành phân lập thành phần hoá học được, đặc biệt là thành phần axit béo có trong quả Ké đầu ngựa. Chúng tôi mong muốn được tạo điều kiện tiếp tục nghiên cứu phân lập thành phần axit béo có trong quả Ké đầu ngựa, cũng như các thành phần khác trong dịch chiết MeOH của nó, nhằm làm sáng tỏ thành phần hoá học của quả Ké đầu ngựa, định hướng cho việc sử dụng hữu hiệu loài thực vật này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt 1. 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, (9/1993). 2. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, (1999). 3. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt - Đức về hoá học và các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội, (1998). 4. Nguyễn văn Đàn, Nguyễn Viêt tựu, Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, NXB Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, (1985). 5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, (1999). 6. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam, NXB Y học, (2001). 7. Phạm Quốc Long, Châu Văn Minh, Lipit và các axit béo hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiên nhiên, NXB khoa học và kỹ thuật, (2006) 8. Nguồn tài nguyên đa dạng sinh học rừng Việt Nam, Tạp chí Lâm nghiệp,(1997). 9. Sách đỏ Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội , (1996). 10. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Trường Đại học dược Hà Nội, (1998). 11. Nguyễn Quyết Tiến, Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Ráy, luận án tiến sĩ. Hà Nội, (2003). 12. Vnexpress.net, Ké đầu ngựa chữa bệnh hiệu quả cao, Sức khoẻ, (3B9E0855). (2005). B. Tiếng Anh 13. Ageta.I.Goto.S., Hatano, T., Nishibe.S. and Okuda, T., Phytochemistry, (33.508). (1993). 14. C. J. Kelley, R. C. Harruff, M Carmack, J Org.Chem., 41 (3), 449 (1976). 15. Chiu, N. Y. and Chang, K. H., in the Illustrated Medicinal Plants of Taiwan, Vol. l. Southern Materials Center, lnc., Taipei, p.233. (1987) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 16. Chang. H. M, and But, P. P.H., in Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica, Vol. l. World Scientific, Singapore, p. 589. (1986). 17. Editorial Board of China Herbal, State Administration of Traditional Chinese Medicine, China Herbal, 7. Shanghai Science and Technology Press, Shanghai, (1999). 18. Huang, K. C., in The Pharmacology of Chinese Herbs. CRC Press. Boca Raton, p. 160. (1993). 19. N. Isutomu, I. Akira, K. Kazuco, Phytochemistry, 24 (2), 339 (1985) Merfort. I., Phytochemistry. 31, 2111. (1992). 20. Morishita, H., Iwahashi, H, and Osaka, N., Kido, R., J. Chromatogr., 984, 315,325. (2000). 21. Pharmacopoeia of P. R. China (English Edition), Book 1. Chemical Industry Press, Beijing, (2000). 22. Pohl, P. and Wagner, Fette Seifen Anstrichm., 74, 541 (1972) 23. Ting Han, Huiliang Li, Qiaoyan Zhang, HanchenZheng, Luping Qin, “New Thiazinediones and other components from xanthium strumarium”, Xumuò npupoỏohx coeỏueầuŭ, ạ5. (2006). 24. TCVN, 3703-90: Phương pháp xác định hàm lượng mỡ. 25. Takagi T. ct.al., Lipids, 17, p.716, (1982). 26. Turner A., Sereening methods in pharmacology, Academic Press. P.60- 68. (1965). 27. Vickery J.R., J. Am. Oil chem Soc., Vol. 57, P.87-91 (1980). 28. Warnaar,F. Lipids, 12, 707 (1993). 29. WHO: Research guidelines for evaluating the safaty and efficacy of herbal medicines, Manila P. 35-42 (1993). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 30. William W.C., Topics in Lipid Chemitry. Vol. I, F.D (1969). 31. Ying Tsun Ma, Mu Chi Huang, Feng Lin Hsu, “Thiazinedione from Xanthium strumarium”, Phytochemistry, Vol. No. 6, pp. 1083-1085, (1998) Elsevler Science Ltd, All rights reserved Printed in Great Britain 32. Y., I., Chen, L., Xanthium, Flora Reipublicae Populariss Smicae. 75, S cience Press, Beijing, (1979). 33. Youngken H.W: Marine Technology Soc. (1970). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 PHỤ LỤC 1. Kết quả phân tích mẫu Trang 1.1 Hàm lượng lipit tổng ……………………………………….50 1.2 Thành phần axit béo ………………………………………...50 1.3 Bảng kết quả thành phần axit béo……………………………51 1.4 Sắc kí đồ …………………………………………………….53 2. Các sterol và glucozit 2.1 õ-sitosterol (KĐN.H8) 2.1.1 Phổ EI-MS của β-sitosterol…………………………….54 2.1.2 Phổ FT-IR của β-sitosterol…………………………….55 2.1.3 Phổ 1H-NMR của β-sitosterol………………………...56 2.1.4 Phổ 13C-NMR và của β-sitosterol…………………….57 2.2 õ-sitosterol glucozit 2.2.1 Phổ 1H-NMR β-sitosterol glucozit …………………..58 2.2.2 Phổ 13C-NMR của β-sitosterol glucozit ……………...59 KĐN.E33 - 13C-CPD…………………………..59 KĐN.E33 - 13C-DEPT…………………….62 2.2.3 Bảng số liệu phổ………………………………………..64 3. Phiếu trả kết quả thử hoạt tính kháng sinh……………………………...67