Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải ssr60f và coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Cúc Hoà Sinh viên thực hiện: Phạm Quyết Thắng 3 LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Các Thầy cô trong và ngoài Trƣờng Đại Học Nông Lâm. Đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong thời gian em học tập tại trƣờng. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS. Trần Thị Cúc Hòa- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa luận. TS. Trần Ngọc Thạch đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận. Các anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Phạm Quyết Thắng 4 TÓM TẮT PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ CÚC HÒA Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây bông vải nhằm đƣa vào những đặc tính mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cƣờng chất lƣợng sợi… là điều rất cần thiết đối với ngành trồng bông của nƣớc ta hiện nay. Việc ứng dụng hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose và chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây bông hiện vẫn còn mới mẻ tại Việt nam. Việc sử dụng hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose có ƣu điểm vì không tạo ra sự lo ngại về an toàn sinh học nhƣ đối với hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh. Khóa luận “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vảI SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực hiện nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và Coker 312, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp. Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đã đƣợc thiết kế mang gen đánh dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus và đƣợc chuyển nạp các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi đƣợc chuyển nạp, mẫu cây đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa mannose qua 3 vòng thanh lọc. Kết quả đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai vòng thanh lọc trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở vòng thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công đƣợc chính xác. Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose ờ bông vải. Chú ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen ở Việt Nam. 5 ABSRACT PHAM QUYET THANG, Nong Lam University. August 2005. “STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ” Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the cotton industry of our country at present. The application of mannose selection and Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam. The application of mannose selection system has an advantage because it does not cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics. The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen calli of cotton after transformed. In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus. The hypocotyl segments of 5 - 7 old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using Agrobacterium tumefaciens. After transformed the explants were cultured on the medium containing mannose passing three cycles of selection. The results were recorded as follows. During the 1 st and 2 nd cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars grew normally. At the 3 rd cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously. It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the cultivar SSR60F. The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the 3 rd cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to make the selection of putative transformed calli more precise. Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each cycle of selection, the size of calli, etc. to improve the efficiency of mannose selection for cotton. Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam. 6 MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .......................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................... iv Mục lục .............................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................... viii Danh sách các hình ............................................................................................ ix Danh sách các bảng .............................................................................................x 1. LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1 1.2. Mục tiêu .....................................................................................................3 1.3. Hạn chế của khoá luận ...............................................................................3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4 2.1. Cây bông vải ..............................................................................................4 2.1.1. Vị trí và phân loại ..............................................................................4 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố ................................................4 2.1.2.1. Gossypium hirsutum ....................................................................4 2.1.2.2. Gossypium arboreum ..................................................................5 2.1.2.3. Gosypium barbadense .................................................................5 2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ...............................................6 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ...............................................7 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải .......................................10 2.2.1. Hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống..........................10 2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải ....................10 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ..................12 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............................13 2.3.2. Plamid Ti .........................................................................................14 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA ..............................................................15 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir .............................................................17 2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm .......................................................................19 7 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..............................................................22 3.1. Vật liệu ..................................................................................................22 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................22 3.3. Phƣơng Pháp .........................................................................................22 3.3.1. Quy trình chuyển nạp gen ...............................................................22 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy ........................................................22 3.3.1.2. Nguồn Plasmid ..........................................................................23 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn ......................................................................24 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy ...........................................................................24 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh cây ...........................................................25 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................26 3.3.2.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ............................................................26 3.3.2.2. Kết quả thanh lọc .......................................................................26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................28 4.1. Sự hình thành mô sẹo ............................................................................28 4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo ..............................................................28 4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ..................................................................31 4.2 Kết quả thanh lọc ..................................................................................34 4.2.1. Thanh lọc lần 1 ................................................................................34 4.2.2. Thanh lọc lần 2 ................................................................................36 4.2.3. Thanh lọc lần 3 ................................................................................38 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................43 5.1. Kết luận .................................................................................................43 5.2. Đề nghị ..................................................................................................43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................44 PHỤ LỤC 8 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP Adenosine 5’- monophosphate ATP Adenosine 5’- triphosphate AS Acetosyringone CaMV35S Vùng khởi động phiên mã ctv. cộng tác viên DNA Deoxyribonucleotic acid gus gen gus (gen chỉ thị) GUS enzyme β-glucuronidase lacZ gen β-galactosidase LB Bờ trái (Left border) MLN mẫu lây nhiễm MS Murashige and Skoog (1962) MSCo Môi trƣờng đồng nuôi cấy MSS1, MSS2, MSS3 Môi trƣờng thanh lọc lần 1, 2, 3 OD600 Độ hấp thụ tối đa ở bƣớc sóng 600 nm ori Vùng khởi động sự tự tái bản PEG polyethylene glycol PMI Enzyme Phosphomannose isomerase pmi gen pmi plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi) RB Bờ phải (Right border) rpm vòng/phút (round per minute) T-DNA DNA đƣợc chuyển (transferred DNA) YEP Yeast extract pepton Vir gen vir Vir virulence protein 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid v/v thể tích/thể tích (volume/volume) w/v trọng lƣợng/thể tích (weight/volume) 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra .........13 Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra ..............14 Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA............................................19 Hình 2.4. Quá trình hoà hợp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây ......................20 Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây .......21 Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm ..................................................23 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi .................................................24 Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp trên môi trƣờng đồng MSCo ...........................28 Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng MSRe ............29 Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng MSS1 ......................29 Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS2 .............30 Hình 4.5. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS3 .............31 Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng MSRe ..........................................................33 Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1 ..........36 Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc ..........38 Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng MSS3 ..............................39 Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng MSS3 ........40 Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) trên môi trƣờng MSS3 ...........41 10 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ..................................7 Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới .........................8 Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới ................................9 Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc ..........................25 Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải ........................27 Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 ................................32 Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F .....................................32 Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 .........................................35 Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F .............................................35 Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 .........................................36 Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F ..............37 Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 .........................................41 Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F .............................................41 11 CHƢƠNG 1 LỜI MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bông vải là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thỏa mãn nhu cầu bức thiết của con ngƣời sau ăn là mặc (Lê Quang Quyến, 2004). Cây bông cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai sau cây đậu tƣơng, hơn nữa hạt bông còn là nguồn cung cấp protein làm thức ăn cho gia súc (Jiang, 2004). Cây bông vải đƣợc trồng ở khắp nơi trên thế giới, nhƣng chủ yếu trồng ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong các nƣớc trồng bông vải, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất (9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế đến là Mỹ 24%, Trung Quốc 20% (Satyavathi và ctv., 2002). Ở Việt Nam, nghề trồng bông vải có từ lâu đời. Cây bông vải từng là cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ đặc biệt ở các tỉnh Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp (Lê Kim Hỷ, 2003). Sau ngày thống nhất đất nƣớc, chúng ta đã nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bông lại ở các địa phƣơng trên nhƣng các kế hoạch đó đều không thành công. Hai nguyên nhân chính làm thất bại các nỗ lực trên là: thị trƣờng giá cả bấp bênh, nông dân không trồng bông vì không trừ đƣợc sâu đục quả bông dẫn đến ngƣời trồng bông thua lỗ (Lê Quang Quyến, 2004). Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật và công nghệ nên đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu năng suất cao đƣa vào sản xuất. Tuy nhiên, sản lƣợng bông xơ chỉ mới đáp ứng một phần nhỏ (10-15%) nhu cầu vật liệu cho ngành dệt may. Trƣớc thực trạng đó, gia tăng sản lƣợng bông xơ là yêu cầu cấp thiết. Dự kiến đến năm 2010, sản lƣợng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nƣớc và diện tích bông đạt 1 triệu ha vào năm 2010, tập trung chủ yếu ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Đồng Bằng Sông Cửu Long (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003). Việc cải thiện di truyền của các loài bông vải nhằm tăng năng suất cũng nhƣ tăng tính kháng sâu bệnh đã đƣợc quan tâm nhiều. Kết quả là nhiều giống bông vải tốt đƣợc tạo ra theo các phƣơng pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống. Tuy nhiên, việc sử dụng các phƣơng pháp này khó có thể khai thác đƣợc các nguồn gen có lợi một cách 12 có hiệu quả do rào cản bất tƣơng hợp. Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ gen trên thực vật nói riêng có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống bông có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ: kháng sâu bệnh hại, kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng (rét, khô, hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng của bông và sợi (Perlak và ctv., 2001). Tuy nhiên, việc chuyển nạp gen vào cây bông vải đã gặp phải nhiều khó khăn. Cây bông vải đƣợc xem là cây rất khó chuyển nạp gen với hiệu quả cao. Hơn nữa, ở Việt Nam các phƣơng pháp nuôi cấy mô hiện tại dùng để tái sinh cây chuyển gen từ các mô sẹo hoặc từ tế bào có khả năng sinh phôi chƣa đƣợc xây dựng hoàn chỉnh. Ngoài giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô sẹo có khả năng sinh phôi sẽ có hình dạng dị thƣờng do biến dị soma phát triển trong quá trình nuôi cấy mô. Hiện nay, việc chuyển nạp gen mới chỉ thành công trên các giống nhóm Coker, hầu hết các gen mong muốn đều đƣợc chuyển vào các giống Coker và sau đó đem hồi giao với các giống khác (Nobre và ctv., 2001). Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chƣa thành công nhiều, việc chuyển nạp gen chỉ đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Tuy nhiên, các phƣơng pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhƣng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây chuyển gen giả định là không đƣợc hoàn toàn, tạo ra các cây thể khảm, gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này. Hơn nữa, ở Việt Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu nào xác định loài bông vải nào đang đƣợc trồng thích hợp việc chuyển nạp gen. Chính vì thế chúng tôi thực hiện khóa luận: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS. 13 1.2. Mục tiêu Khóa luận: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium Tumefaciens” nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và Coker 312 bằng phƣơng pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp. 1.3. Hạn chế của khoá luận Với quỹ thời gian ngắn (4 tháng) nên khóa luận chỉ có thể thực hiện phần chọn lọc bằng mannose (qua 3 lần chọn lọc), các bƣớc tiếp theo sau khi chọn lọc chƣa có điều kiện thực hiện. Khóa luận cũng chỉ giới hạn nghiên cứu ở hai giống bông vải, trong đó giống SSR60F là giống bông đang trồng ở Việt Nam. 14 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cây bông vải 2.1.1. Vị trí phân loại Cây bông vải thuộc: Ngành hiển hoa bí tử (Angospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Phạm Hoàng Hộ, 1997). 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố Trong chi Gossypium có khoảng 39 loài và rất đa dạng, trong đó có sáu loài bông đƣợc canh tác là: G. hirsutum, G. arboreum, G. barbadense, G. herbaceum, G. tricuspidatum và G. perriri (Bộ GD và ĐT,Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội,bộ môn Cây Công Nghiệp, 1996). Nhƣng theo Jiang (2004), Brubaker và ctv. (2002) chi Gossypium có khoảng 50 loài và có bốn loài đƣợc canh tác là: G. hirsutum L., G. barbadense L., G. arboretum L., G. herbaceum L., loài trồng phổ biến nhất thế giới là G. hirsutum. Cũng theo Brubaker và ctv. (2002) chi Gossypium phân bố ở phía Tây và Nam Mexico khoảng 18 loài, ở Đông Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 loài, và ở Australia khoảng 17 loài. Trong sáu loài trên, ở Việt Nam trồng phổ biến ba loài đầu. 2.1.2.1. Gossypium hirsutum Loài G. hirsutum thƣờng đƣợc gọi là bông Luồi hay bông Tàu, có bộ nhiễm sắc thể 2n = 52 (Jiang, 2004). Bông Luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay đƣợc trồng lan rộng ra khắp nơi trên thế giới, sản lƣợng xơ bông Luồi chiếm khoảng 70% sản lƣợng toàn thế giới (Bộ GD và ĐT,Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công Nghiệp, 1996). Bông Luồi đƣợc trồng nhiều nhất là ở Mỹ trên 95% (Jiang, 2004), Nga, Ấn Độ, Mehico, Trung Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc. Ở Việt Nam, bông Luồi du nhập vào nƣớc ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX. Phần lớn các giống thuộc loài này do ngƣời Pháp đƣa vào nhằm mục đích khai thác và sản xuất bông hàng hóa. Về sau, loài này đƣợc du nhập vào bằng nhiều con đƣờng khác nhau, chủ yếu thông qua các chƣơng trình viện trợ của các tổ chức quốc tế. Qua quá trình thực nghiệm cho thấy loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp 15 với điều kiện trồng bông nhờ nƣớc trời ở nƣớc ta. Với tiềm năng cho năng suất cao và có chất lƣợng xơ tốt, các giống bông này dần dần thay thế các giống bông Cỏ trƣớc đó (Lê Quang Quyến, 2004). Bông Luồi có nhiều loài phụ nhƣ: G. hirsutum ssp. Mexicanum, G. hirsutum ssp. Punctatum (Achum và Thonn), G. hirsutum ssp. Panicultum (Balanco)… 2.1.2.2. Gossypium arboreum Loài G. arboreum thƣờng đƣợc gọi là bông Cỏ. Loài này có lẽ đƣợc trồng lâu đời nhất, có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, lan truyền sang vùng Đông Nam Á, vùng có gió mùa khí hậu ẩm ƣớt. Bông Cỏ thƣờng đƣợc trồng ở vùng đồng bằng nhƣng cũng có trồng ở vùng núi cao 1500-2000 m. Vùng sản suất chính là Ấn Độ, Trung Quốc,Việt Nam, Myanmar, Lào. Hằng năm sản lƣợng bông Cỏ chiếm 20% tổng sản lƣợng bông thế giới. Hiện nay, diện tích trồng bông Cỏ ngày càng thu hẹp do chất lƣợng xơ ngắn. Ở Việt Nam khoảng thế kỷ XIII- XIV loài bông này đƣợc trồng phổ biến khắp mọi miền đất nƣớc, từ đồng bằng đến vùng Trung du và Miền núi. Đến năm 1955, loài bông Cỏ vẫn còn phổ biến trên các vùng trồng bông ở Bắc Bộ và một số vùng thuộc Bắc Trung Bộ, trong lúc đó ở các vùng bông ở Nam và Trung Bộ đang dần thay thế bằng các giống bông Luồi. Các giống bông Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc hai loài phụ: G. arboreum ssp. Neglectum và G. arboreum ssp. Nanking, kể cả hai dạng bông lâu năm và hằng năm (Lê Quang Quyến, 2004). 2.1.2.3. Gossypium barbadense Loài G. barbadense thƣờng đƣợc gọi là bông Hải đảo, bông Ấn Độ. Bông Hải đảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay đƣợc trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nƣớc khác. Bông hải đảo cung cấp khoảng 10% sản lƣợng bông sơ toàn thế giới và hiện nay diện tích trồng bông Hải đảo đang đƣợc mở rộng do phẩm chất xơ đặc biệt tốt. Ở Việt Nam, chƣa tìm thấy tài liệu nào nói về loài bông Hải đảo đƣợc trồng phổ biến trong sản xuất và bắt nguồn từ đâu. Loài này thƣờng gặp dƣới dạng cây lâu năm ở trong các vƣờn hoang và bờ giậu. Đến năm 1941- 1945 mới du nhập một số giống nhƣ 16 Ghiza, Pima vào miền Nam, các giống Trƣờng Nhung, Menufi, Tiến Vọt vào miền Bắc năm 1955-1956 qua chƣơng trình hợp tác và trao đổi giống. Qua quá trình nghiên cứu và thử nghiệm cho thấy loài bông Hải đảo thích hợp trong vụ khô có tƣới, không hợp với điều kiện mƣa nhiều độ ẩm cao. Bông Hải đảo có nhiều loài phụ nhƣ: G. barbadense ssp. Darwwinii (Watt) Mauner, G. barbadense ssp. redurale Mauner, G. barbadense ssp. Ventifolum (Lam) và G. barbadense ssp. Eubarbadense Mauner. 2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam Trƣớc thời Pháp thuộc, giống bông đƣợc sử dụng chủ yếu là các giống bông Cỏ địa phƣơng (Gossypium arboreum L.). Giống bông này cho năng suất thấp. Một số ít diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã đƣợc trồng các giống bông Luồi (Gossypium hirsutumL.) nhập nội, với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha. Đầu thế kỷ 20, nƣớc ta đã xuất khẩu bông sang Nhật, Hồng Kông. Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bông đã đƣợc phát triển mạnh trong đó liên khu V đạt khoảng 10.000 ha và liên khu IV đạt khoảng 13.000 ha. Sau năm 1954, các giống bông Luồi nhập nội đã thay thế một phần cho các giống bông Cỏ địa phƣơng. Sau năm 1975, năng suất bông hạt thấp chỉ đạt 3 – 4 tạ/ha. Nguyên nhân năng suất và diện tích bông giảm ở giai đoạn này là do sâu bệnh phá hoại nặng và chƣa có các giống bông thích hợp cho các vùng. Do chí phí sản xuất quá lớn vì đầu tƣ thuốc trừ sâu rất cao, ngƣời trồng bông luôn bị thua lỗ, thêm vào đó môi trƣờng bị ô nhiễm nặng, ngành bông Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn. Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bƣớc thay đổi mạnh mẽ, chúng ta đã tạo đƣợc các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất cao, chất lƣợng xơ tốt, chống chịu đƣợc sâu bệnh. Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật đƣợc áp dụng nhƣ: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác nhƣ hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE cho bông, phun các chất điều hòa tăng trƣởng…chính vì vậy mà năng suất và chất lƣợng bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, diện tích đã đạt hơn 35.000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trƣớc đây. 17 Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam (Lê Quang Quyến, 2004). Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (tấn) 1996/1997 1997/1998 1998/1999 1999/2000 2000/2001 2001/2002 2002/2003 10.676 11.716 19.963 17.705 13.250 29.573 35.200 6,0 9,0 8,0 10,0 9,0 11,0 10,5 6.866 10.986 16.245 17.578 20.340 32.530 36.960 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới Vụ bông 2001- 2002, tổng diện tích bông trên thế giới là 33,5 triệu ha, trong đó các nƣớc đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nƣớc phát triển chỉ chiếm có 30% diện tích. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 2.2, trong đó Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha. Điều đáng chú ý là 70% diện tích bông thế giới đƣợc trồng ở các nƣớc miền nam và diện tích trồng của ba nƣớc châu Á là Ấn Độ , Trung Quốc, Pakistan đã chiếm khoảng 50% diện tích trồng bông thế giới (ISAAA, 2002). 18 Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002 ( ISAAA, 2002) STT Nƣớc Diện tích (triệu ha) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ấn Đ ộ M ỹ Trung Quốc Pakistan Uzbekistan Brazil Thổ Nhĩ Kỳ Turkmenistan Mali Benin 8,730 5,596 4,824 3,125 1,453 0,75 0,654 0,550 0,516 0,415 Sản lƣợng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960-1961 lên 21,1 triệu tấn niên vụ 2001-2002, tức là tăng hơn 116% sau 40 năm. Danh sách mƣời nƣớc có sản lƣợng bông xơ lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 2.3, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn. Điều đặc biệt là trong mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới thì có sáu nƣớc là các nƣớc đang phát triển. Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1.658 kg bông xơ/ ha, tiếp theo là Syria 1.303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1.103 kg bông xơ/ha (ISAAA, 2002). 19 Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002 (ISAAA, 2002) STT Nƣớc Sản lƣợng (triệu tấn) Năng suất xơ (kg/ha) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Trung Quốc M ỹ Ấn Độ Pakistan Uzbekistan Thổ Nhĩ Kỳ Brazil Australia Syria Ai cập 5,320 4,420 2,508 1,853 1,055 0,880 0,750 0,670 0,335 0,314 1.103 790 287 593 726 1.345 999 1.658 1.303 994 Trong khi đó, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng. Diện tích trồng bông trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha (ISAAA, 2004), trong đó bông chuyển gen chiếm 28% (9 triệu ha). So với năm 2003 diện tích bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003). Trong số các nƣớc trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003). Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bông chuyển gen nhƣng năm 2004 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha. Trung Quốc cũng là nƣớc có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 có 2,8 triệu ha nhƣng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bông). Theo dự báo của các chuyên gia diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hƣớng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu nhƣng bên cạnh đó chất lƣợng sợi bông cũng đƣợc quan tâm nhiều (ISAAA, 2004). 20 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải 2.2.1. Những hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống Cây bông đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dệt may thế giới. Chính vì vậy mà việc cải thiện giống bông để nâng cao năng suất cũng nhƣ chất lƣợng sợi bông thì rất đƣợc chú ý. Các phƣơng pháp tạo giống truyền thống nhƣ: lai đơn, lai với loài hoang dại, hồi giao, đột biến... đã đƣợc sử dụng để đƣa các tính trạng nhƣ: năng suất cao, chất lƣợng sợi cao và kháng bệnh vào các giống bông. Kết quả là tạo ra những giống bông có năng suất cao và phẩm chất sợi tốt. Tuy nhiên, các phƣơng pháp tạo giống truyền thống đã không đáp ứng đƣợc yêu cầu ngày càng cao về chất lƣợng sợi bông, về sản lƣợng bông cũng nhƣ về khả năng kháng sâu bệnh. Thêm vào đó, hiện nay trong các giống bông chƣa tìm thấy các gen kháng sâu bệnh chính vì thế mà rất khó tạo ra một giống bông kháng sâu bệnh bằng phƣơng pháp lai tạo truyền thống. 2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải Hiện nay, trong nghiên cứu chuyển nạp gen với nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phƣơng pháp xung điện, phƣơng pháp vi tiêm, phƣơng pháp sử dụng PEG (polyethylene glycol), phƣơng pháp bắn gen và phƣơng pháp chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nhƣng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù đã đƣợc báo cáo (McCabe và Martinell, 1993, Rajasekaran và ctv., 2000), phƣơng pháp chuyển nạp gen bằng Agrobacterium tumefaciens (Rajasekaran, 1996, Satyawathi và ctv., 2002, Umbeck và ctv., 1987). Nghiên cứu chuyển nạp gen thành công bằng Agrobacterium tumefaciens trên cây bông vải đƣợc công bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv., 1987, Umbeck và ctv., 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Trong nghiên cứu của mình, Firoozabady đã sử dụng mẫu cấy tử diệp 12 ngày tuổi để đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid có chứa gen kháng kanamycin. Sau ba ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy sẽ đƣợc chuyển lên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa kanamycin. Kết quả là có hơn 80% các mô sẹo sống sót trên môi trƣờng có chứa yếu tố chọn lọc kanamycin. Từ đó nhiều gen đƣợc chuyển thành công vào cây bông nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng, gen 21 kháng thuốc diệt cỏ (Chen và ctv., 1994; Perlak và ctv., 1990). Các loại mẫu cấy nhƣ trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng nhƣ phôi non đã đƣợc dùng trong việc chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv., 1987, Perlak và ctv., 1990). Gould và Cedeno (1998) đã sử dụng đỉnh chồi làm mẫu cấy phục vụ cho việc chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã đƣợc sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv., 1995). Chuyển gen bằng súng bắn gen đã đƣợc Finer và McMullen (1990) thực hiện trên dịch huyền phù tế bào và kết quả là thu đƣợc cây chuyển gen. Trƣớc đó Finer và Smith (1984) đã thực hiện nghiên cứu tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy là thân và cuống lá. Súng bắn gen cũng đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các mô thu đƣợc từ việc tái sinh phôi soma (Rajasekaran, 1996, Reichert và ctv., 2002). Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thƣờng khá thấp, biến động 20 – 30% khi trụ hạ diệp đƣợc dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv., 1987, Rajasekaran, 1996). Một hiệu quả chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã đƣợc công bố khi trụ hạ diệp đƣợc dùng làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) đƣợc dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv., 1987). Chaudhary và ctv. (2003) cũng báo cáo với mẫu lây nhiễm là phôi soma sau khi thanh lọc tỉ lệ mẫu biểu hiện GUS là 75%. Nhƣng chỉ là kết quả của thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc và gen gus. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp ở song tử diệp chỉ khoảng 20-30%, hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp hơn khi sử dụng phƣơng pháp bắn gen. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy đƣợc dùng trong chuyển nạp gen có ảnh hƣởng đến hiệu quả của chuyển nạp gen và tái sinh cây. Ví dụ ngƣời ta cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp dƣơng tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv., 1987). Nghiên cứu về chuyển nạp gen trên cây bông vải, Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thƣớc mẫu cấy cũng ảnh hƣởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trƣờng chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Theo Chen và ctv. (2000) để chuyển nạp gen có hiệu quả nhiệt độ trong giai đoạn đồng nuôi cấy không lớn hơn 280C, thời gian chiếu 22 sáng 16h sáng/8h tối là thích hợp cho tất cả các giai đoạn chuyển nạp gen và tái sinh. Ngoài ra, pH môi trƣờng nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nạp gen. Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen nhƣ bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thƣờng khó có thể tái sinh và chuyển nạp đƣợc. Sự thiếu một phƣơng pháp tái sinh cây hiệu quả đã đƣợc xem nhƣ là một rào cản chính cho việc áp dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv., 1987). Để cải tiến phƣơng pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy phải đƣợc phát triển, cùng với môi trƣờng cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phƣơng pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhƣng phƣơng pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây đƣợc tạo thành nhƣng chỉ một số ít cây đƣợc chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000). 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra các cây trồng mang những tính trạng di truyền mong muốn. Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã đƣợc ghi nhận bằng cách sử dụng vectơ plasmid Ti, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đƣa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn đƣợc gọi là phƣơng pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 23 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chi Agrobacterium đƣợc chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium nhƣ: A. radiobacter (loài này không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A. rubi gây bệnh khối u trên cây mía. Gần đây nhất một loài mới vừa đƣợc đề nghị là A. vitis, loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990). Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv., 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. (Deacon và ctv., 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5-11 lông roi. Vi khuẩn này phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 290C trong môi trƣờng có bổ sung một chút mangan và succinate nhƣ là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000). Khi rễ cây xuất hiện vết thƣơng, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thƣơng và xâm nhập vào cây qua vết thƣơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen tạo khối u và đƣợc biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang pTi đƣợc xem nhƣ là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu đƣợc tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi (hình 2.1 và 2.2). Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn 24 khi chạm vào, nhƣng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các khối u có đƣờng kính đến 30 cm nhƣng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trƣờng. Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này nhƣ một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dƣỡng(Zhu và ctv., 2000). Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra (nguồn Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thƣớc là 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thƣớc 200-800 kbp (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti , hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv., 2005). 2.3.2. Plamid Ti Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định pTi nhƣ một nguyên lý tạo bƣớu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bƣớc khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 25 Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá đƣợc chuyển vào trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine (Zhu và ctv., 2000). Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen Vir (Gelvin, 2003). 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA T-DNA đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thƣớc 10-30 kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong pTi, vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tƣơng tự nhau và đều có kích thƣớc 25 bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể đƣợc bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và đƣợc đề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trƣớc rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngƣợc bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003). Các trình tự bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của protein VirD2. T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây đƣợc chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen đƣợc chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cƣờng sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trƣởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây đƣợc cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử 26 hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác đƣợc cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv., 1991). Trong khi đó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chƣa đƣợc giải thích (Tinland và ctv., 1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen đƣợc chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh dƣỡng cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc một đƣờng (Dessaux và ctv., 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lƣợng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thƣờng trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine đƣợc tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Dựa trên các kiểu opine đƣợc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng nhƣ là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt. Cho ví dụ, các plasmid Ti kiểu octopine điều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine. Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả những opine này đều đƣợc tìm thấy trong các khối u (Dessaux và ctv., 1998). Sản phẩm của gen mas2’ đƣợc cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic axit với glucose (mặc dù điều này chƣa đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic axit (Dessaux và ctv., 1998). Bởi vậy, các khối u đƣợc tạo ra bởi plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 27 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir Vùng Vir trên plasmid Ti có khoảng 25 gen đƣợc nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thƣớc khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv., 1998). Theo Stachel và ctv. (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này mã hoá cho các vai trò nhƣ: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, tạo đoạn T-DNA sợi đơn, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ (Gelvin, 2003). Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thƣơng của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thƣơng. Các tín hiệu hoá học từ vết thƣơng ở tế bào cây chủ tạo ra đƣợc nhận biết trƣớc tiên bởi protein VirA, rồi đến protein VirG để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir đƣợc kích hoạt tối đa ở pH axit với sự hiện diện của các hợp chất phenon nhƣ là acetosyringone (AS), chất mà đƣợc giải phóng khi tế bào cây bị tổn thƣơng (Stachel và ctv., 1987). Hệ thống điều hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào. Protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thƣơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trƣờng. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể đƣợc kích thích bởi đƣờng, các opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá. Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thƣớc khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001). Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3) và đƣa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein đƣợc mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T-DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T- DNA. Protein VirD2 đƣợc tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ ở vị trí tƣơng đồng (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn 28 DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là protein chiếm số lƣợng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy đƣa phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir cũng đƣợc cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã đƣợc thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cƣờng sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhƣng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv., 2000). Ngoài ra, protein VirD2 đƣợc cho là có chức năng trong sự kết nạp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đƣa T-DNA vào nhân tế bào và lƣu lại cùng với T-DNA trong các bƣớc kết nạp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đã đƣợc đề nghị: VirD2 hoạt động nhƣ một enzyme integrase và VirD2 hoạt động nhƣ một ligase (Ziemienowicz, 2001). Cùng với protein VirD4, mƣời một protein VirB, VirE2 và VirF tham gia đƣa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA đƣợc mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tƣơng tự nhƣ chiên mao tiếp hợp) và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và