Nghiên cứu khả năng sản xuất etanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp

ất. Ngoài thực vật, cellulose cũng là nguồn chủ yếu trong SK động vật, nhưng số lượng rấ ít hơn. Cellulose là polysacarit gồm có anhydro- D- ... liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit. Mức độ polyme hóa của cellulose rất cao tới 10000-14000 đơn vị glucoza/ phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và gian phân tử làm cho phân tử cellulose có độ cứng và vững chắc [36]. Liên kết glucozit không bền với axit, cellulose dễ bị phân hủy bởi acid và tạo thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro- cellulose có độ bền cơ học Hình 9: Cấu trúc cellulose Rơm rạ Thân cây ngô Gỗ cứng Bắp ngô Phần Trăm Khối Lượng Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 31 Cao học Môi trường K15 kém hơn cellulose nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là D-glucoza. Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo thành cellulose-ancolat. Nguyên tử hydro ở các ở các nhóm OH bậc một và hai trong phân tử Cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc – metyl, -etyl, … tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan trong nước khác nhau. Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy- Cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4), và muối của nó. Cellulose không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng mạch Cellulose và hòa tan một phần Cellulose phân tử nhỏ. Đặc biệt Cellulose dễ hòa tan trong dung dịch đồng amin hydrat (Cu(NH3)4(OH)2), và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm….[37] 1.4.1.2.Vi sinh vật phân giải cellulose Vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose là những vi sinh vật có khả năng tổng hợp được hệ enzym celluloza. Hệ enzym celluloza gồm bốn enzym khác nhau [32,34]. Cellobiohydrolaza có tác dụng cắt đứt liên kết hydro làm biến dạng celluloza tự nhiên, phân giải vùng kết tinh tạo dạng cấu trúc vô định hình. Endoglucanaza có khả năng cắt đứt các liên kết β 1-4 glucozit bên trong phân tử tạo thành những chuỗi dài. Exo- gluconaza có khả năng phân giải các chuỗi dài trên thành các disacarit gọi là xellobioza . β- gluconaza sẽ thuỷ phân xellobioza thành glucoza. Trong tự nhiên có rất nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ celluloseza nhờ hệ enzym xellulaza ngoại bào [30, 36, 37]: Nấm mốc (Aspergillus, Fusarium, Mucor, Tricoderma...) có cấu tạo dạng hệ sợi, sinh sản chủ yếu bằng bào tử. Chúng phát triển mạnh ở nhiệt độ 25-300C và pH= 6,5- Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 32 Cao học Môi trường K15 7,0, chúng có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất nhờ có khả năng sinh tổng hợp enzym rất cao. Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân giải cellulose tuy nhiên cường độ không mạnh bằng vi nấm. Nguyên nhân là do lượng enzym tiết ra môi trường ít hơn, thành phần lại không đầy đủ. Ở trong đất có rất ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đủ bốn loại enzym trong hệ enzym xelluloza mà thường mỗi nhóm vi sinh vật chỉ sản sinh ra một loại enzym tương ứng. Do vậy các nhóm vi sinh vật phải phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ tương hỗ, thông thường bao gồm các vi sinh vật sau: Pseudomonas, Xellulomonas, Achromonobacter, Clostridium, Ruminococus Xạ khuẩn cũng góp phần tích cực trong chuyển hoá cellulose. Các chủng xạ khuẩn được ứng dụng phổ biến hiện nay thuộc chi Streptomycin. Các chủng xạ khuẩn này thuộc nhóm ưa nóng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ 45-50 0C rất thích hợp cho các quá trình phân huỷ các hợp chất hữu cơ. Ngoài ra, một số nấm men cũng có khả năng sinh enzym phân huỷ celluloza như: Candida, Saccharomyces… 1.4.2. Hemicellulosese và vi sinh vật phân giải hemicellulosese 1.4.2.1. Hemicellulose Hemicellulose là một phần polysacarit thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose. Cellulose và hemicellulose được hình thành không chỉ từ một đường mà nhiều đường khác nhau, thậm chí cả từ axit urnoic của chúng. Người ta gọi tên cụ thể một loại hemicellulose là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên nó. Ví dụ: xylan là một hemicellulose mà thành phần chủ yếu của nó là xyloza, manan – manoza,... Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu hemicellulose được tạo thành từ loại đường 6 cacbon. Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều thông thường không quá 150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà còn bằng liên kết -1,3 và -1,6 glucozit tạo ra mạch ngắn và phân nhánh Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 33 Cao học Môi trường K15 Vì độ polyme thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lý cũng thấp hơn. Hemicellulose dễ tan trong dung dịch kiềm, trong nước nóng và dễ bị phân hủy bởi acid loãng. Xylan là một hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm 30% khối lượng rơm rạ, 20-25% trong gỗ cây lá rộng, 7-17% trong gỗ cây lá kim. 1.4.2.2.Vi sinh vật phân giải hemicellulose Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta thấy chúng giống với cellulose về cấu tạo, liên kết hoá học và cấu trúc đại phân tử. Nhiều tác giả cho rằng, hemixenlulose có tính chất tương đồng với cellulose về cơ chế tác động, tính chất cảm ứng tổng hợp. Tuy nhiên, giữa hemixenlulose và cellulose cũng có nhiền sự khác biệt. Hemicellulose có khối lượng phân tử nhỏ hơn, cấu trúc đơn giản và kém bền vững hơn [27,31]. Đa số vi sinh vật có khả năng tổng hợp celluloza cũng có khả năng tổng hợp xynalaza để phân huỷ xylan. Khả năng này thường thấy ở vi sinh vật sống trong dạ cỏ động vật nhai lại như: Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio, Ruminococus và các vi khuẩn chi Clostridium. Ngoài ra, một số loài nấm sợi như Mycotheciumverrucria, Chactomium, Stachybtrys… một số loài nấm xốp trắng cũng có khả năng phân giải hemicellulose như: Corrodusversicolor, Polyrus anceps, Phanerochaete, aspergillus fumigatus… và nhóm xạ khuẩn gồm Streptomyces, Pseudomonas, Bacillus… [31,36]. 1.5. Vai trò của vi sinh vật trong quá trình lên men rượu [12] 1.5.1. Quá trình lên men rượu Phương trình tổng quát về lên men rượu như sau: C6H12O6
2 C2H5OH + 2 CO2 + Q Theo Pasteur, sự lên men chỉ xảy ra khi có mặt của vi sinh vật. Nếu ngăn cản không cho vi sinh vật tiếp xúc với dịch đường thì hiện tượng lên men sẽ không xảy ra. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 34 Cao học Môi trường K15 Như vậy, sự lên men rượu là một quá trình sinh học có lên hệ mật thiết tới hoạt động của tế bào men”. Cơ chế lên men rượu xảy ra như sau: Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào bên trong. Ở đó các enzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và khí cacbonic. Hai chất này đều khuếch tán và tan vào môi trường xung quanh. Rượu do rất linh động nên hòa tan nhanh trong dịch lên men, còn khí cacbonic hòa tan kém và khuếch tán chậm. Lúc đầu CO2 hòa tan hoàn toàn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào men và lớn dần tới mức lực đẩy Archimedes lớn hơn khối lượng tế bào men cộng bọt khí. Lúc đó tế bào cùng bọt khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ tan vỡ và tạo thành tiếng rào rào (ta quen gọi là men ăn). Bọt khí tan, tế bào men lại chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp thụ và lên men rồi lại sản ra rượu và khí cacbonic. Như vậy tế bào nấm men từ chỗ là vi sinh vật không chuyển động đã biến thành tế bào luôn chuyển động trong quá trình lên men. Nhờ đó mà tăng nhanh tốc độ hấp thụ và chuyển hóa đường thành rượu. Khi đường và các chất dinh dưỡng trong môi trường còn ít, một lượng lớn tế bào men sẽ lắng xuống đáy thùng, dịch lên men sẽ trong dần. Nấm men có thể lên men trong dịch đường có nồng độ 25 đến 30%, nhưng chậm. Nồng độ thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15 đến 18%. Nồng độ cao thì áp suất thẩm thấu sẽ lớn, do đó ảnh hưởng xấu tới hiệu quả lên men, lên men sẽ kéo dài, đường sót lại trong giấm chín sẽ tăng. Nếu lên men ở nồng độ đường thấp cũng không có lợi vì tổn thất do tạo men sẽ tăng. Ví dụ khi lên men dịch đường có nồng độ 16,9% , tổn thất đường do tạo men chiếm 6% so với lượng đường có trong dung dịch; nếu nồng độ đường là 8,6% thì tổn thất do tạo men chiếm tới 9,84%. Mặt khác, lên men ở nồng độ thấp sẽ làm giảm năng suất của thiết bị, tốn nhiều hơi khi chưng cất và làm tăng tỉ lệ tổn thất rượu trong bã và nước thải. Khi lên men có khoảng 95% đường biến thành rượu và CO2, còn 5% là tạo các sản phẩm khác và đường sót. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 35 Cao học Môi trường K15 Lên men thường được tiến hành ở nhiệt độ 28-320C và pH = 4,5- 5,2. Ở nhiệt độ cao thì tổn thất đường trong quá trình lên men sẽ lớn do tạp khuẩn dễ phát triển, tạo nhiều este aldehyt. Khi lên men ở 29,50C, tổn thất do tạo men là 7,37%, ở 17,50C là 5,32% và nếu lên men dịch đường ở 100C thì tổn thất do tạo men chỉ chiếm 4,42% lượng đường có trong dung dịch. Xét về ảnh hưởng của pH thì tổn thất sẽ ít nhất khi lên men ở pH= 4,4. Nếu tăng pH thì tổn thất sẽ tăng nhanh và nhiều hơn so với giảm pH. Khi Giảm pH từ 5,6 xuống 4,42 hiệu suất lên men tăng 2,3%. Trên đây mới đề cập đến một vài yếu tố có ảnh hưởng nhiều tới kết quả lên men nhưng còn xét ở các trường hợp riêng rẽ. Trong thực tế sản xuất, các yếu tố ảnh hưởng có liên quan mật thiết và chi phối lẫn nhau. Vì vậy khi xem xét một trường hợp cụ thể ta cần đặt chúng trong một thể thống nhất, phải căn cứ vào điều kiện cụ thể, trang thiết bị ở từng cơ sở sản xuất để định ra chế độ kỹ thuật phù hợp nhằm đạt hiệu quả sản xuất cao nhât. 1.5.2. Nấm men dùng trong sản xuất rượu etylic Trong sản xuất cồn, rượu vang và bia người ta hay dùng loài Saccharomyces và chia thành: Nấm men nổi và nấm men chìm. Cách phân biệt này là do sự khác nhau trong giai đoạn lên men. Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzym α-galactozidaza có khả năng lên men hoàn toàn đường rafinoza, còn đối với nấm men nổi thì chỉ một số ít chủng có khả năng chuyển hóa đường rafinoza thành rượu và cacbonic và đường chỉ vào khoảng 1/3 tổng số đường. Đa số nấm men bia, rượu vang đều thuộc nấm men chìm. Còn men rượu, men bánh mì và số ít men bia thuộc nấm men nổi. Yêu cầu chung của nấm men dùng trong sản xuất cồn etylic là phải có năng lực lên men mạnh, biến đường thành rượu nhanh và hoàn toàn. Đồng thời phải ổn định và chịu được những biến đổi của môi trường. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 36 Cao học Môi trường K15 1.6. Chưng cất rượu etylic Giấm chín (là dịch nhận được sau lên men) bao gồm các chất dễ bay hơi như rượu, este, aldehyt và một số alcol có số cacbon lớn hơn hai, các rượu này ta quen gọi là rượu cao phân tử hay còn gọi là dầu fusel hay dầu khét. Ngoài các chất kể trên, trong giấm chín còn chứa tinh bột, dextrin, protit, axit hữu cơ và chất khoáng. Tuy là hỗn hợp nhiều cấu trúc nhưng trong thành phần của giấm chín chứa chủ yếu là rượu etylic và nước, vì thế khi nghiên cứu người ta xem giấm chín hỗn hợp hai cấu tử. Khi nghiên cứu hỗn hợp rượu – nước, Vrepski cho biết, thành phần hơi được thoát ra từ dung dịch nào đó đều phụ thuộc vào áp suất bên ngoài. Khi tăng áp suất của hệ thống hai cấu tử, cấu tử nào khi bay hơi đòi hỏi nhiều năng lượng thì hàm lượng tương đối của nó sẽ tăng trong hỗn hợp đẳng phí. Đối với hỗn hợp rượu- nước, nếu tiến hành chưng cất ở áp suất cao hơn áp suất khí quyển thì % nước trong hỗn hợp đẳng phí sẽ nhiều hơn, còn nồng độ rượu trong hỗn hợp sẽ thấp hơn 97,2% V. Ngược lại, nếu chưng cất trong điều kiện chân không thì nồng độ rượu trong hỗn hợp đẳng phí sẽ cao hơn 97,2% thể tích và phụ thuộc độ chân không. Sự phụ thuộc này có thể thấy ở bảng 9.[12] Bảng 9: Quan hệ áp suất, nhiệt độ và nồng độ rượu Áp suất, mmHg Nhiệt độ sôi, 0C Nồng độ rượu, % khối lượng 70 27,97 100 100 33,35 99,56 129,7 39,2 98,70 198,4 47,6 97,30 404,6 63,04 96,25 760,0 78,15 95,57 1175,4 87,12 95,35 1451,3 95,35 95,25 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 37 Cao học Môi trường K15 CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng nghiên cứu - Chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu do quỹ gen vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa và Bộ môn Sinh học Môi trường- Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp. - Thân cây ngô: thân cây ngô sau khi thu bắp được thu thập từ Trung tâm Giống, Phân bón và Cây trồng, Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp hoá lý 2.2.1.1. Phương pháp phơi, sấy nguyên liệu - Phơi khô tự nhiên dưới trời nắng. - Sử dụng tủ sấy: ở nhiệt độ tối đa 700C đến khối lượng không đổi. 2.2.1.2. Phương pháp phân tích đường khử - Xác định đường khử theo phương pháp Graxianop [10] * Nguyên tắc: Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thành axit đường. Dùng metyl xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc. Phản ứng chính như sau: 2 K3Fe(CN)6 + 2 KOH +CH2OH(CHOH)4CHO 2 K4Fe(CN)6+ 2 H2O + COOH(CHOH)4COOH 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 2.2.2.1. Phương pháp kiểm tra mật độ vi sinh vật [9] Cân 10g mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml có chứa 90ml nước cất đã khử trùng. Lắc trên máy lắc 150 vòng/phút trong 30 phút, thu được dịch pha loãng có nồng độ là 10-1. Sau đó, hút 1ml dịch trong bình pha loãng nồng độ 10-1 sang ống nước cất 9ml đã khử trùng, được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng như trên, được nồng độ pha loãng 10-3, 10-4…, đến nồng độ pha loãng cần thiết. Hút 0,05ml dịch đã pha loãng nhỏ vào các hộp petri chứa môi trường thạch phù hợp. Dùng que trang thuỷ t 0C Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 38 Cao học Môi trường K15 tinh (đã vô trùng), trang đều lên mặt môi trường trong hộp petri. Sau khi trang xong dùng giấy gói lại và chuyển các hộp petri chứa vi sinh vật vào tủ ấm và nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ thích hợp. Sau khoảng từ 2- 4 ngày nuôi cấy, lấy mẫu ra quan sát và đếm số khuẩn lạc mọc trên các hộp petri. Số lượng khuẩn lạc được tớnh bằng công thức: N = )1,0( 21 nnd C + ∑ Trong đó: N: là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (CFU/g (ml)); ∑C : là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại; n1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất; n2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai; d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. Kiểm tra mật độ xạ khuẩn: Kiểm tra trên môi trường Gause (A1), các bước tiến hành tương tự như trên Kiểm tra mật độ nấm men: Kiểm tra trên môi trường Hansen (A2), các bước tiến hành tương tự như trên 2.2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học vi sinh vật Phương pháp xác định hoạt tính phân giải cellulose [8] Xác định hoạt tính phân giải cellulose bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch đĩa. Nguyên tắc của phương pháp: enzym celluloseza thuỷ phân CMC trong môi trường sẽ tạo vòng thuỷ phân có màu vàng xung quanh lỗ đục đã được nhỏ dịch vi sinh vật và hiện màu bằng dung dịch lugol. Dựa vào hệ số giữa đường kính vòng thuỷ phân (D) và đường kính đục lỗ (d) người ta xác định được hoạt tính CMC- aza của vi sinh vật. Phương pháp được tiến hành cụ thể như sau: • Cân 1g CMC, 15g agar trong 1000ml nước cất và khử trùng. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 39 Cao học Môi trường K15 • Đổ dịch lỏng vào hộp petri có chiều dày là 1,5cm. • Dùng dụng cụ đục một lỗ tròn (đường kính 10mm) vào giữa hộp petri chứa môi trường CMC. • Nhỏ 0,1ml dịch enzym đã ly tâm vào lỗ được đục. Sau đó, chờ dịch khô, chuyển các hộp petri vào tủ lạnh (từ 6-8 giờ) để enzym khuyếch tán. Chuyển vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C để enzym tác dụng với cơ chất CMC. • Cho vào mỗi hộp petri 5ml dịch lugol (Cân 2g KI và 1g I2 vào 300ml nước cất), tráng đều lên mặt thạch và chờ khoảng 15 phút. Sau đó, gạt bỏ hết dịch lugol, quan sát vòng khuyếch tán. • Dùng thước kẻ, đo vòng CMC bị phân giải xung quang lỗ (vùng màu vàng trên nền đen tím). Hoạt tính CMC- aza được hiển thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải (D) và đường kính lỗ khoan ( d ), (D- d) đơn vị đo là mm. 2.2.3. Phương pháp xử lý sơ bộ Thân cây ngô sau khi phơi (sấy) khô, chặt nhỏ 2-3 cm, nghiền nhỏ bằng máy nghiền được bột nguyên liệu. Cân chính xác 50g nguyên liệu cho vào bình tam giác 1000ml. Bổ sung axit H2SO4 0,5% theo tỷ lệ 1: 10 (w/v) ở 1210C, theo rong 15, 30, 60 và 120 phút. Trung hòa dung dịch sau quá trình xử lý sơ bộ bằng dung dịch KOH sau đó lọc bằng giấy lọc hoặc bông thấm nước được dịch lọc và chất rắn. Sau khi sấy khô thu được chất rắn CR1. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử, thành phần của CR1. 2.2.4. Phương pháp thuỷ phân 2.2.4.1. Thủy phân bằng axít Cân 50 g chất rắn CR1 cho vào bình tam giác 1000ml, thủy phân bằng dung dịch H2SO4 1%, 2% và 4% theo tỷ lệ 1: 9; 1:10 và 1: 12 (w/v) ở 1210C, trong 60 phút. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 40 Cao học Môi trường K15 Trung hòa bằng dung dịch KOH sau đó lọc bằng giấy lọc thu được dịch thủy phân bằng axit và chất rắn sau khi sấy khô CR2. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử, thành phần của CR2 2.2.4.2. Thuỷ phân bằng vi sinh vật Sau quá trình xử lý sơ bộ và trung hòa, bố trí các công thức như sau: Cân 50g CR1 cho vào bình tam giác 1000ml thêm 500ml nước cất, sau đó bổ sung dịch lắc vi sinh vật theo các tỷ lệ 1%, 3% và 5% về thể tích. Trong quá trình thủy phân, theo dõi các chỉ tiêu: Mật độ vi sinh vật, hàm lượng đường khử sau 1, 2,3,5,7 ngày, Thành phần của chất rắn thu được sau khi lọc CR3 (sấy khô). 2.2.5. Phương pháp lên men Dịch nấm men Saccharomyces cerevisiae đã lựa chọn lắc trong 2 ngày được sử dụng để làm tác nhân cho quá trình lên men. Thể tích dịch lên men dùng cho mỗi công thức 1000ml. Lượng dịch nấm men bổ sung là 10% (v/v). Mỗi công thức nhắc lại 3 lần. Điều kiện lên men: Nhiệt độ = 300C; pH= 5,5; thời gian: 5 ngày Chỉ tiêu theo dõi: pH, hàm lượng đường khử, hàm lượng etanol 2.2.6. Phương pháp đo hàm lượng Etanol Mẫu được đo tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 41 Cao học Môi trường K15 CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn chủng VSV cho quá trình thủy phân và lên men 3.1.1. Lựa chọn chủngVSV phân giải hợp chất hydratcacbon Để phục vụ cho mục đích nghiên cứu, đề tài đã sử dụng vật liệu là các chủng xạ khuẩn có khả năng chuyển hóa hợp chất hydratcacbon do Bộ môn Vi sinh vật- Viện Thổ nhưỡng Nông hóa và Bộ môn Sinh học Môi trường- Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp, các chủng VSV sử dụng trong nghiên cứu đều có lý lịch rõ ràng và được định tên đến loài, đảm bảo an toàn sinh học khi ứng dụng trong thực tế sản xuất. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học CMC và khả năng sinh trưởng và phát triển các chủng VSV trong môi trường dịch thể từ 0 giờ đến 72 giờ nuôi cấy được trình bày trong Bảng 10. Bảng 10: Mật độ tế bào và hoạt tính sinh học CMC 4 chủng VSV nghiên cứu Mật độ tế bào (CFU/ml) Đường kính vòng phân giải CMC (D-d) Ký hiệu 24 giờ 48 giờ 72 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ ACT 01 5,77. 107 6,20.108 4,14.108 25 31 33 ACT 06 2,47.106 7,31. 108 6,12. 108 28 33 40 ACT 17 2,18. 108 8,34.108 5,22.108 26 30 35 ACT 18 1,87. 106 3,56.108 2,34.108 26 32 37 Số liệu bảng 10 cho thấy, cả 4 chủng VSV sử dụng trong nghiên cứu đều đạt mật độ cao tại thời điểm 48 giờ, tuy nhiên chủng ACT 06 có hoạt tính sinh học cao so với 3 chủng còn lại ACT 01, ACT 17 và ACT 18. Dựa vào kết quả này, đề tài đã lựa chọn chủng ACT 06 đề tiếp tục sử dụng với mục đich làm tác nhân sinh học chuyển hóa hợp chất hydratcacbon. Chủng ACT 06 (Streptomyces thermocoprophilus) khi được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa (A1) cho khuẩn lạc có màu trắng đục, bề mặt nhăn, mùi ngái, khuẩn lạc ăn sâu vào bề mặt thạch, sau 3 ngày nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,5- Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 42 Cao học Môi trường K15 2,3mm. Khi nuôi cấy trên máy lắc ở nhiệt độ 370C, tốc độ 150 vòng/phút) trong môi trường dịch thể tạo thành các hạt nhỏ. Khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên môi trường dịch thể. Với mục tiêu sử dụng có hiệu quả chủng xạ khuẩn ACT 06 cho quá trình thủy phân thân cây ngô, đề tài tiến hành nghiên cứu và kiểm tra hoạt tính sinh học và các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng ACT 06 như nhiệt độ, pH. Kiểm tra hoạt tính sinh học CMC của chủng xạ khuẩn ACT 06 theo phương pháp (2.2.2.2) cho thấy chủng ACT 06 có khả năng phân giải cellulose. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học CMC của chủng ACT 06 được trình bày ở Bảng 11. Bảng 11: Hoạt tính sinh học CMC của chủng xạ khuẩn ACT 06 Thời gian nuôi cấy (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (D-d)mm Mật độ tế bào (CFU/ml) 2 32 3,10. 108 3 40 6,33. 108 5 42 6,70. 108 7 45 6,80. 108 10 29 2,14. 108 15 30 8,07. 107 Kết quả kiểm tra cho thấy, sau 3 ngày mật độ tế bào đạt 6,33.108, đường kính vòng phân giải CMC đạt 40mm. Tại 7 ngày mật độ tế bào của xạ khuẩn đạt 6,80. 108, đường kính vòng phân giải CMC là 45 mm. Sau 10 đến 15 ngày mật độ tế bào của chủng ACT 06 tuy không giảm nhưng hoạt tính sinh học của chúng giảm xuống đáng kể, đường kính vòng phân giải CMC giám xuống còn 29-30mm. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 43 Cao học Môi trường K15 Hình 10: Đường kính vòng phân giải CMC của chủng ACT06 sau 3 ngày lắc Chủng ACT 06 sau khi đã nhân SK trên môi trường dịch được kiểm tra mật độ trên môi trường thạch agar (A1) ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của chủng ACT 06 được trình bày trong Bảng 12. Bảng 12: Ảnh hượng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng ACT 06 (sau 3 ngày nuôi cấy lắc) Nhiệt độ nuôi cấy (0C) Mật độ tế bào (CFU/ml) 25 2,67.105 30 8,15.106 35 5,20.108 40 9,40.108 45 7,23.108 50 5,34.108 55 4,56.105 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 44 Cao học Môi trường K15 Số liệu nghiên cứu ở Bảng 12 cho thấy chủng ACT06 có thể sinh trưởng và phát triển tốt và đạt mật độ cao khi được nuôi cấy trong khoảng nhiệt độ từ 35-500C. pH cũng là một yếu tố quan trọng đến sinh trưởng của vi sinh vật. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng ACT 06, đề tài sử dụng dung dịch đệm Mc Iivaine để điều chỉnh giá trị pH ban đầu của môi trường dịch thể. Kết quả Bảng 13 cho thấy: chủng xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong khoảng pH= 7,0-7,4. Bảng 13: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng và phát triển chủng ACT 06 (sau 3 ngày nuôi cấy lắc) pH Mật độ tế bào (CFU/ml) 4,4 8,35.103 5,0 2,57.105 5,4 7,22.105 6,0 3,31.106 6,4 4,20.106 7,0 8,71.108 7,4 6,45.108 8,0 8,89.107 Từ các kết quả nghiên cứu trình bày ở trên, chủng ACT 06 là chủng VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất hydratcacbon tốt nhất. ACT 06 là chủng VSV ưu nhiệt, có hoạt tính sinh học cao sau 3 ngày nuôi cấy lắc, sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 35- 500C, pH trung tính. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 45 Cao học Môi trường K15 3.1.2. Lựa chọn chủng vi sinh vật cho quá trình lên men Để phục vụ cho công tác nghiên cứu lên men sản xuất etanol, đề tài đã tiến hành lựa chọn chủng nấm men có khả năng lên men etanol cao dựa vào hồ sơ chủng giống vi sinh vật được lưu giữ tại Bộ môn Sinh học Môi trường – Viện Môi trường Nông nghiệp và chủng nấm men do Bộ môn Vi sinh vật- Viện Thổ nhưỡng Nông hóa cung cấp. Đề tài đã tiến hành đánh giá khả năng lên men rượu bằng cách đánh giá định tính thông qua việc hình thành CO2 hình thành: Ống Durham được cho ngược chiều vào ống môi trường lên men dịch thể (A2). Sau khi khử trùng khí trong ống bị loại hết, môi trường ngập kín ống. Sau khi cấy nấm men, khí CO2 sinh ra đẩy môi trường ra khỏi ống. Ống chứa khí CO2 sẽ nổi lên. Ống nổi lên càng nhiều thì lượng CO2 sinh ra càng nhiều. Kết quả đánh giá được thể hiện ở Hình 11. Hình 11: Sự hình thành khí CO2 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 46 Cao học Môi trường K15 Hình 11 cho thấy, ống Durham trong môi trường lên men sử dụng SA.03 bị đẩy lên nhiều nhất chứng tỏ trong ống sử dụng SA.03 khí CO2 sinh ra nhiều nhất so với 2 chủng SA.01 và SA.02. Như vậy, SA.03 là chủng nấm men có khả năng lên men cao và được đề tài lựa chọn sử dụng trong quá trình lên men. 3.2. Thành phần lý, hóa học của thân cây ngô sau thu hoạch Thân cây ngô được lấy từ Trung tâm Giống, Phân bón và Cây trồng. Sau khi thu bắp được 2 ngày, thân cây ngô được thu gom phơi khô tự nhiên. Hình 12: Thân cây ngô sau phơi khô tự nhiên Thân cây ngô sau khi phơi khô tự nhiện có màu nâu nhạt, mùi hơi hôi. Quá trình phơi khô tự nhiên làm hơi mất nước trong thân cây ngô sau thu hoạch: Khối lượng thân cây ngô sau thu hoạch: 10kg. Sau khi phơi khô tự nhiên còn: 3kg. Thân cây ngô được chặt nhỏ 2-3 cm, sấy khô ở 500C đến khối lượng không đổi để xác định độ ẩm và nghiền mịn làm nguyên liệu ban đầu để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Khối lượng thân cây ngô sau khi sấy khô giảm 10%. Như vậy, trong thân cây ngô sau thu hoạch nghiên cứu có chứa lượng nước: Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 47 Cao học Môi trường K15 Thân cây ngô sau khi sấy khô tuyệt đối được phân tích hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin. Kết quả phân tích các chất trên được trình bày ở Bảng 14. Bảng 14: Thành phần nguyên liệu thân cây ngô sấy khô TT Hợp chất Phần trăm theo khối lượng khô (%) 1 Cellulose 24, 07 2 Hemicellulose 37,19 3 Lignin 7,82 4 Khác 30,92 Tổng 100,00 Số liệu Bảng 14 cho thấy, thân cây ngô chứa chủ yếu là hemicellulose 37,19%, tiếp đến là cellulose 24,07 %. Đây là một nguyên liệu SK tiềm năng cho việc sản xuất etanol nếu các điều kiện thủy phân và lên men được nghiên cứu một cách hiệu quả. 3.2. Nghiên cứu quy trình sản xuất etanol từ thân cây ngô 3.2.1. Quá trình xử lý sơ bộ Để nghiên cứu một số điều kiện của quá trình xử lý sơ bộ, đề tài đã sử dụng axit H2SO4 0,5% và theo dõi phản ứng trong thời gian từ 0- 2 giờ ở 1210C. Ảnh hưởng của axit H2SO4 0,5% và thời gian phản ứng đến lượng đường khử được biểu diễn ở Hình 13. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 48 Cao học Môi trường K15 Hình 13: Tác động của thời gian phản ứng đến lượng đường khử ở điều kiện 1210C với H2SO4 0,5%. Hình 13 cho thấy, trong khoảng thời gian từ 0- 2giờ phản ứng hàm lượng đường khử tỉ lệ thuận với thời gian xử lý. Sau 1 giờ xử lý hàm lượng đường khử trong dịch sau phản ứng cao (đạt 2,0 g/l). Biểu đồ cũng cho thấy hàm lượng đường khử tạo thành sau 2 giờ phản ứng tăng không đáng kể so với thời điểm 1 giờ (2,3 g/l). Do vậy đề tài lựa chọn điều kiện cho quá trình xử lý sơ bộ với H2SO4 0,5% ở điều kiện ở 1210C trong 1 giờ. 3.2.2. Xác định các thông số kỹ thuật trong quá trình thuỷ phân bằng axít Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ axit H2SO4 loãng (1 %, 2% và 4%) trong thời gian 1 giờ ở 1210C. Kết quả về sự ảnh hưởng của nồng độ axit đến lượng đường khử tạo thành được biểu diễn ở Hình 14. Hàm lượng đường khử (g/l) Thời gian (giờ) 0,25 1,0 0,5 2,0 0 1,2 0,3 2,3 2,0 2,5 1,0 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 49 Cao học Môi trường K15 Hình 14: Tác động của nồng độ H2SO4 đến hàm lượng đường khử với thời gian phản ứng là 1 giờ, ở 1210C Hình 14 cho thấy, sau 1 giờ hàm lượng đường khử với nồng độ H2SO4 4% cao nhất (4,2 g/l) sau đó đến nồng độ H2SO4 2% (4,0g/l) và thấp nhất là với nồng độ H2SO4 1%. Từ các kết quả nghiên cứu thu được, đề tài lựa chọn điều kiện thủy phân bằng axit H2SO4 2% ở 1210C trong 1 giờ nhằm tiết kiệm thời gian và lượng axit H2SO4 sử dụng trong quá trình thủy phân. 3.2.3. Xác định điều kiện thủy phân bằng vi sinh vật Để xác định được một số điều kiện cho quá trình thủy phân bằng vi sinh vật, đề tài tiến hành theo dõi mật độ chủng VSV đã lựa chọn và hàm lượng đường khử sau 1,2,3,5 và 7 ngày với các công thức bổ sung 1%, 3% và 5% dịch SK chủng xạ khuẩn ACT 06 lắc trong 3 ngày. Kết quả được biểu diễn trong Bảng 15. Hàm lượng đường khử (g/l) Nồng độ H2SO4 (%) 1 2 4 0 4,0 2,4 5,0 4,0 2,0 4,2 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 50 Cao học Môi trường K15 Bảng 15: Mật độ xạ khuẩn và hàm lượng đường khử theo thời gian Mật độ tế bào (CFU/ml) Hàm lượng đường khử (g/l) Thời gian CT1 CT2 CT3 CT1 CT2 CT3 1 ngày 5,40.108 5,45.108 5,62.108 1,68 1,76 1,93 2 ngày 6,03.108 7,15.108 7,41.108 2,34 3,43 4,01 3 ngày 7,92.108 8,53.108 8,62.108 4,27 5,10 5,27 5 ngày 4,23.107 4,76.107 5,13.107 3,89 4,56 4,48 7 ngày 7,03.106 7,03.106 7,03.106 3,17 3,08 2,77 Trong đó: CT1: 50g CR1 + 500ml nước cất + 1% dịch lắc ACT 06 lắc trong 3 ngày (v/v) CT2: 50g CR1 + 500ml nước cất + 3% dịch lắc ACT 06 lắc trong 3 ngày (v/v) CT3: 50g CR1 + 500ml nước cất + 5% dịch lắc ACT 06 lắc trong 3 ngày (v/v) Bảng số liệu cho thấy mật độ tế bào của chủng ACT 06 tăng dần và đạt mật độ cao nhất sau 3 ngày bổ sung vào dịch thân cây ngô sau khi đã xử lý sơ bộ, sau 3 ngày mật độ tế bào chủng xạ khuẩn ACT 06 giảm dần. Nguyên nhân của sự giảm sút mật độ tế bào này có thể là vì vi sinh vật đã sử dụng hết thức ăn. Hàm lượng đường khử tạo ra là cao nhất ở cả 3 công thức sau 3 ngày lần lượt là 4,27; 5,10 và 5,27 g/l. Kết quả cũng cho thấy, tại ngày thứ 3 lượng đường khử sinh ra ở công thức 3 không cao hơn nhiều so với công thức 3. Từ kết quả thu được cho thấy, điều kiên thích hợp cho quá trình thủy phân bằng vi sinh vật là thời gian thủy phân là 3 ngày và luợng dịch SK chủng xạ khuẩn ACT 06 bổ sung 3% (v/v). Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 51 Cao học Môi trường K15 3.2.4. Đánh giá khả năng chuyển hóa hợp chất cacbonhyđrat trong thân cây ngô thành đường đơn Để đánh giá khả năng chuyển hóa hợp chất cacbonhydrat trong thân cây ngô, đề tài tiến hành phân tích thành phần các chất trong mẫu chất rắn thu đã được xử lý sơ bộ, thủy phân bằng axit và thủy phân bằng vi sinh vật. Kết quả phân tích hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin được trình bày trong Bảng 16. Bảng 16: Phần trăm theo khối lượng các hợp chất chính trong nguyên liệu sau các quá trình xử lý sơ bộ và thủy phân Phần trăm theo khối lượng (%) TT Hợp chất Nguyên liệu ban đầu Xử lý sơ bộ (H2SO4 0,5%, 1210C, 1giờ) Thủy phân bằng axit (H2SO4 2%, 1210C, 1giờ) Thủy phân vi sinh vật, 3% dịch lắc ACT06, sau 3 ngày 1 Cellulose 24, 07 37,67 39,83 18,80 2 Hemicellulose 37,19 22,90 9,52 24,01 3 Lignin 7,82 6,77 8,58 8,22 4 Khác 30,92 32,66 42,07 49,33 Tổng cộng 100,00 100,00 100,00 100,00 Số liệu bảng 16 cho thấy tỷ lệ % của cellulose, hemicellulose, lignin và các hợp chất khác trong nguyên liệu đã thay đổi so với ban đầu sau khi được xử lý sơ bộ. Kết quả phân tích cũng cho thấy sau quá trình thủy phân bằng axit H2SO4 2% và dịch SK chủng ACT 06, thành phần của nguyên liệu tiếp tục thay đổi. Tuy nhiên có sự khác biệt: Ở công thức thủy phân bằng axit H2SO4 2% tỷ lệ % hemicellulose giảm đi rõ rệt Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 52 Cao học Môi trường K15 trong khi đó công thức thủy phân bằng vi sinh vật tỷ lệ % cellulose giảm mạnh hơn với hemicellulose. Để thấy rõ sự chuyển hóa của các hợp chất cellulose, hemicellulose và lignin trong các quá trình xử lý, đề tài tiến hành so sánh hàm lượng các hợp chất này trong trong nguyên liệu ban đầu và trong chất rắn sau quá trình xử lý sơ bộ (Bảng 17); hàm lượng celluose, hemicellulose và các chất khác trong chất rắn sau quá trình xử lý sơ bộ với các hợp chất đó trong các chất rắn thu được của quá trình thủy phân (Bảng 18 và Bảng 19). Từ tỉ lệ phần trăm về khối lượng của các hợp chất cellulose, hemicellulose và lignin đề tài đã tính toán ra khối lượng các chất đó trong khối lượng nguyên liệu ban đầu cho mỗi công thức là 50g và khối lượng chất rắn thu được sau mỗi quá trình xử lý. Sau quá trình xử lý, chất rắn thu được sau khi lọc, được phơi/sấy khô và cân khối lượng. Bảng 17: Khả năng chuyển hóa chất trong quá trình xử lý sơ bộ Chuyển hóa Hợp chất Nguyên liệu ban đầu (g) Sau xử lý sơ bộ (H2SO4 0,5%, 1210C, 1giờ) (g) g % Cellulose 12,04 11,50 0,54 4,5 Hemicellulose 18,60 6,99 11,61 62,4 Lignin 3,54 2,17 1,37 38,7 Khác 16,36 9,96 6,40 39,1 Tổng 50,00 30,52 19,48 39,0 Số liệu Bảng 17 cho thấy, trong quá trình xử lý sơ bộ một lượng lớn hemicellulose đã bị thủy phân, làm giảm lượng hemicellulose trong nguyên liệu ban đầu đến 62,4%. Tiếp đến lignin là 38,7%. Tuy nhiên quá trình này có tác động không Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 53 Cao học Môi trường K15 lớn đến hàm lượng cellulose trong cây ngô, chỉ chuyển hóa được 4,5% lượng cellulose ban đầu. Kết quả tác động của axit sunfuric 2% đến sự chuyển hóa các hợp chất được trình bày trong Bảng 18. Bảng 18: Khả năng chuyển hydratcacbon trong quá trình thủy phân bằng axit Chuyển hóa Hợp chất Nguyên liệu đầu vào (g) Sau quá trình thủy phân bằng axit (H2SO4 2%, 1210C, 1giờ)(g) g % Cellulose 18,84 14,26 4,58 24,3 Hemicellulose 11,45 3,41 8,04 70,2 Lignin 3,39 3,07 0.32 9,4 Khác 16,32 15,06 1,26 7,7 Tổng 50,00 35,80 14,20 28,4 Số liệu trên cho thấy, ở điều kiện 1210C trong vòng 1 giờ, axit sunfuric 2% có khả năng chuyển hóa tới 70,2% hàm lượng hemicellulose, 24,3% cellulose và 9,45 lignin trong nguyên liệu đầu vào. Như vậy sự chuyển hóa cho phép dự đoán rằng đường khử tạo thành trong dịch thủy phân bằng axit chủ yếu là đường 5- cacbon. So sánh tương tự với chất rắn thu được từ quá trình thủy phân bằng vi sinh vật ta được kết quả trong Bảng 19. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 54 Cao học Môi trường K15 Bảng 19: Khả năng chuyển hoá hydratcacbon trong quá trình thủy phân bằng ACT 06 Chuyển hóa Hợp chất Nguyên liệu đầu vào (g) Sau quá trình thủy phân bằng vi sinh vật (g) g % Cellulose 18,84 6,98 11,86 63,0 Hemicellulose 11,45 8,91 2,54 22,2 Lignin 3,39 3,05 0,34 10,0 Khác 16,32 14,60 1,72 10,5 Tổng 50,00 37,12 12,88 25,76 Số liệu cho thây, cellulose chuyển hóa khá lớn nhờ tác nhân vi sinh vật là chủng ACT 06. Vi sinh vật đã sử dụng hợp chất cellulose trong nguyên liệu làm thức ăn đồng thời chuyển hóa thành đường. Từ các kết quả nghiên cứu trình bày ở trên cho thấy, hiệu suất chuyển hóa của cellulose và hemicellulose thành đường và các hợp chất khác như sau: Quá trình xử lý chỉ dùng axit: - Đối với cellulose: 4,5+ (100- 4,5)/100 x 24,3 = 27,7 % - Đối với hemicellulose: 62,4 + (100-62,4)/100 x 70,2 = 88,8 % Quá trình xử lý có sử dụng chủng vi sinh vật ACT 06: - Đối với cellulose: 4,5 + (100- 4,5)/100 x 63,0 = 64,7 % - Đối với hemicellulose: 62,4 + (100-62,4)/100 x 22,2 = 70,7 % Kết quả này cho thấy, quá trình xử lý chỉ sử dụng axit vô cơ loãng có khả năng thủy phân đến 88,8% hợp chất hemicellulose, trong khi đó chỉ thủy phân được 27,7% hàm lượng cellulose trong thân cây ngô. Còn quá trình xử lý kết hợp axit vô cơ loãng và chủng vi sinh vật ACT 06 có khả năng chuyển hóa 70,7% lượng celluose và 64,7% lượng hemicellulose trong thân cây ngô khô. Như vậy phương pháp xử lý kép bao gồm Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 55 Cao học Môi trường K15 quá trình xử lý sơ bộ bằng axit loãng và quá trình thủy phân bằng vi sinh vật cho hiệu quả chuyển hóa hợp chất hydratcacbon cao hơn. 3.2.5. Hiệu suất của quá trình lên men Để nghiên cứu đánh giá khả năng lên men của chủng SA.03 đối với các dịch lên men, đề tài đã bố trí thí nghiệm với 5 công thức dưới đây ở 300C, pH= 5,5 trong thời gian 5 ngày, thể tích dịch lên men là 1 lít có bổ sung 10% dịch lắc SA.03 trong 2 ngày về thể tích: LM1: Dịch lên men là dịch lọc thu được của quá trình Xử lý sơ bộ bằng H2SO4 0,5% ở 1210C trong 1 giờ; LM2: Dịch lên men là dịch thủy phân bằng axit với axit H2SO4 2%, ở 1210C trong 1 giờ; LM3: Dịch lên men là hỗn hợp gồm dịch lọc thu được của quá trình Xử lý sơ bộ bằng H2SO4 0,5% ở 1210C trong 1 giờ và dịch thủy phân bằng axit với axit H2SO4 2%, ở 1210C trong 1 giờ; LM4: Dịch lên men là hỗn hợp gồm dịch lọc thu được của quá trình Xử lý sơ bộ bằng H2SO4 0,5% ở 1210C trong 1 giờ và dịch thủy phân bằng vi sinh vật thu được sau quá trình thủy phân bằng cách bổ sung 3% dịch lắc ACT 06 trong 3 ngày. LM5: Dịch lên men là dịch thủy phân bằng vi sinh vật thu được sau quá trình thủy phân bằng cách bổ sung 3% dịch lắc ACT 06, trong 3 ngày. Trong quá trình lên men, đề tài tiến hành theo dõi sự thay đổi pH của dịch lên men và hàm lượng đường khử . Kết quả sự thay đổi pH của dịch len men được biểu diễn trong bảng 20. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 56 Cao học Môi trường K15 Bảng 20: Kết quả theo dõi sự thay đổi pH của dịch lên men Tên công thức Thời gian lên men LM1 LM2 LM3 LM4 LM5 1 ngày 5,4 5,1 5,2 5,3 5,0 2 ngày 5,0 4,9 5,1 5,0 4,8 3 ngày 4,7 4,4 4,8 4,6 4,1 4 ngày 4,4 4,0 4,3 4,2 3,9 5 ngày 3,8 3,9 3,7 3,8 3,7 Số liệu bảng 20 cho thấy trong 4 ngày kể từ khi bổ sung chủng nấm men vào dịch lên men, pH giảm dần. Điều đó SA.03 phát triển tốt. Đến ngày thứ 5, pH của các dịch lên men đều nhỏ hơn ≤ 4, hạn chế sự phát triển của nấm men. Như vậy, thời gian lên men thích hợp được lựa chọn là 4 ngày. Đề tài mới chỉ xác dịnh được tổng lượng đường khử mà chưa xác định được chính xác hàm lượng đường 5C và đường 6C trong dịch lên men cũng như các chất trung gian hình thành trong quá trình lên men. Do đó, đề tài chưa tính toán được lượng etanol sinh ra theo lý thuyết nên chưa đánh giá được hiệu suất của quá trình lên men. Đề tài chỉ tiển hành đánh giá hiệu suất chuyển hóa của đường khử dựa trên hàm lượng đường khử trong dịch lên men và đường khử sót lại sau quá trình lên men. Hiệu suất chuyển hóa đường khử trong quá trình lên men được biểu diễn trong Bảng 21. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 57 Cao học Môi trường K15 Bảng 21: Hiệu suất chuyển hóa đường khử trong quá trình lên men (4 ngày) Hàm lượng đường khử (g/l) Tên công thức lên men Trong dịch trước khi lên men (a) Trong dịch sau khi lên men Chuyển Hóa (b) Hiệu suất chuyển hóa đường khử (%) (b/a)*100 LM1 2,0 1,03 0,97 48,5 LM2 4,2 1,16 3,04 72,4 LM3 3,1 0,86 2,24 72,3 LM4 3,55 0,87 2,68 72,7 LM5 5,1 1,23 3,75 75,9 Dịch lên men LM5 chuyển hóa cao nhất đạt 75,9%, tiếp đến là dịch lên men LM4, LM2, LM3 có hiệu suất chuyển hóa tương tự nhau và cuối cùng là LM1 có hiệu suất chuyển hóa thấp nhất.Dịch LM5, LM4 có hiệu suất chuyển hóa cao có thể lý giải là do: chủng vi sinh vật ACT 06 đã chuyển hóa một lượng khá lớn cellulose trong nguyên liệu thành đường đơn, chủ yếu là đường glucose là đường chuyển hóa thành rượu. 3.2.6. Hàm lượng etanol trong dịch sau lên men Hàm lượng etanol trong dịch sau lên men được xác định bằng phương pháp điểm sôi và phương pháp tỷ trọng kế. Kết quả được trình bày ở Bảng 22: Bảng 22: Hàm lượng etanol trong dịch sau lên men Hàm lượng etanol (%V) TT Tên công thức Phương pháp điểm sôi Phương pháp tỷ trọng kế Trung bình 1 LM1 2,1 1,7 1,9 2 LM2 2,8 2,4 2,6 3 LM3 2,7 2,2 2,45 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 58 Cao học Môi trường K15 4 LM4 3,3 2,9 3,1 5 LM5 4,3 3,9 4,2 Số liệu bảng 22 cho thấy, etanol trong dịch sau lên men trong đạt 1,9- 4,2 % về thể tích. Trên thực tế sản xuất từ nguyên liệu tinh bột thì hàm lượng cồn trong dịch giấm chín đạt từ 6 đến 9,5% về thể tích. Kết quả hàm lượng etanol trong nghiên cứu này tuy không cao nhưng cũng cho thấy rằng, thân cây ngô là nguyên liệu rất có triển vọng cho việc sản xuất etanol. 3.3. Đề xuất quy trình sản xuất etanol từ thân cây ngô Từ các kết quả nghiên cứu trên, đề tài đề xuất 2 quy trình sản xuất etanol từ thân cây ngô với quá trình thủy phân và lên men tách rời như sau: Quy trình 1: Thân cây ngô
Xử lý mẫu (phơi khô, chặt nhỏ, nghiền nhỏ)
Xử lý sơ bộ bằng H2SO4 0,5%, ở 1210C trong 1 giờ
Thủy phân bằng vi sinh vật (3% dịch lắc ACT06 trong 3 ngày)
Lên men (Dịch lên men là dịch lọc thu được sau quá trình thủy phân bằng vi sinh vật có bổ sung 10% dịch lắc nấm men, ở 300C trong 4 ngày)
Chưng cất
Etanol. Quy trình 2: Thân cây ngô
Xử lý mẫu (phơi khô, chặt nhỏ, nghiền nhỏ)
Xử lý sơ bộ băng H2SO4 0,5%, ở 1210C trong 1 giờ
Thủy phân bằng axit (H2SO4 2%, ở 1210C trong 1 giờ)
Lên men (Dịch lên men là dịch lọc thu được sau quá trình thủy phân bằng axit có bổ sung 10% dịch lắc nấm men, ở 300C trong 4 ngày)
Chưng cất
Etanol. Giả thiết hiệu suất chưng cất đạt 90% thì theo các kết quả trong nghiên cứu này có thể tính suất sản xuất ethnaol sinh học từ thân cây ngô sau thu hoạch như sau: Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 59 Cao học Môi trường K15 Sản xuất theo quy trình 1: 1 lít dịch sau lên men có 42 ml etanol (Nồng độ etanol 4,2 %V) 37,12g chất rắn sau quá trình thủy phân bằng vi sinh vật 50 g chất rắn sau quá tình xử lý sơ bộ 82,0g nguyên liệu thân cây ngô khô 303,7g thân cây ngô sau thu hoạch Như vậy, để sản xuất dịch có chứa 1 lít (103 ml) etanol cần dùng khối lượng thân cây ngô sau thu hoạch là Tính toán tương tự theo quy trình 2 ta có kết quả như sau: để sản xuất lượng dịch có chứa 1 lít etanol từ thân cây ngô theo quy trình 2 ta cần dùng khối lượng thân cây ngô sau thu hoạch là: Chuyển hóa 25,76% Chuyển hóa 39% Chiếm 27% Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 60 Cao học Môi trường K15 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Thân cây ngô sau thu hoạch có độ ẩm 73% được phơi khô tự nhiên có mầu nâu nhạt, mùi hơi hôi, độ ẩm 10%, có thành phần chính gồm cellulose 24,07%; hemicellulose 37,19%; lignin 7,82% và 30,92% các chất khác. 2. Quá trình xử lý sơ bộ bột thân cây ngô khô bằng axit H2SO4 0,5% ở 1210C trong 1 giờ với tỉ lệ nguyên liệu: axit là 1:10 (w/v) có hàm lượng đường khử cao. Đề tài đã xác định được điều kiện cho quá trình thủy phân bằng axit: H2SO4 2 % ở 1210C trong 1 giờ, tỷ lệ nguyên liệu: axit là 1: 10 (w/v) thu được dịch sau thủy phân có hàm lượng đường khử là 4g/l. 3. Đề tài đã lựa chọn chủng ACT 06 làm tác nhân cho quá trình thủy phân bằng vi sinh vật và chủng SA.03 là chủng nấm men có khả năng lên men cao làm tác nhân cho quá trình lên men từ các chủng vi sinh vật lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh vật- Viện Thổ nhưỡng Nông hóa và Bộ môn Sinh học Môi trường- Viện Môi trường Nông nghiệp. 4. Chủng xạ khuẩn ACT 06 thuộc nhóm vi sinh vật ưa nhiệt, phát triển tốt ở nhiệt độ 35- 500C và pH trung tính. Chủng ATC 06 có khả năng phân giải CMC, đường kính vòng phân giải đạt 40 mm sau 3 ngày nuôi cấy. Đề tài đã xác định được điều kiện cho quá trình thủy phân bằng visinh vật: bổ sung 3% dịch ACT 06 cấy lắc trong 3 ngày vào dịch sau quá trình xử lý sơ bộ, mật độ tế bào và hàm lượng đường cao tương ứng là 8,53 .108 CFU/ml và 5,10 g/l. 5. Hiệu suất của quá trình chuyển hóa đường khử từ 70-75 % đối với dịch lên men có hàm lượng đường khử từ 3,0- 5,0 g/l. Hàm lượng etanol không cao từ 1,9- 4,2%V nhưng cũng chứng tỏ thân cây ngô là nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất etanol sinh học. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 61 Cao học Môi trường K15 6. Đề tài đã đề xuất 02 quy trình sản xuất etanol từ thân cây ngô. Theo quy trình 1 (có sử dụng chủng ACT06 làm tác nhân thủy phân) thì cứ 7.787 kg thân cây ngô sau thu hoạch sản xuất được dịch giấm chín chứa1 lít etanol, trong khi đó theo quy trình 2 để sản xuất 1 lít etanol cần 12,654 kg nguyên liệu thân cây ngô sau thu hoạch . KHUYẾN NGHỊ 1. Đề tài mới chỉ nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm và trên 1 đối tượng nghiên cứu là thân cây ngô, cần tiếp tục nghiên cứu trên các đối tượng PPNN khác với quy mô lớn hơn. 2. Trong điều kiện thời gian hạn hẹp, đề tài chưa nghiên cứu được quy trình sản xuất etanol trong đó quá trình thủy phân và quá trình lên men diễn ra đồng thời, cần tiếp tục nghiên cứu vấn đề này. 3. Trong quá trình nghiên cứu đề tài mới chỉ xác định được tổng hàm lượng đường khử dựa tính theo glucoza làm cơ sở đánh giá mà chưa xác định rõ được hàm lượng đường 5 cacbon và 6 cacbon, cần nghiên cứu thêm và đưa phương pháp antron vào sử dụng. 4. Đề tài mới chỉ quan tâm đến sự chuyển hóa của hợp chất cellulose và hemicellulose trong nguyên liệu mà chưa chú ý đến các hợp chất khác cũng như ảnh hưởng của các sản phẩm trung gian đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật nghiên cứu. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 62 Cao học Môi trường K15 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Nông nghiệp và PTNT, Báo cáo tình hình sản xuất nông lâm nghiệp và thủy sản tháng 9 và 9 tháng năm 2008, Hà Nội. 2. Nguyễn Lân Dũng (1982), Thực hành Vi sinh vật học (Dịch từ Nxb Moscow), Nxb Đại học và Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội. 3. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập Vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.82-90. 4. Nguyễn Thị Huê (2008), “Đánh giá tiềm năng năng lượng SK các PPNN (lúa, ngô, lạc) ở tỉnh Nam Định”, Luận văn thạc sỹ, Hà Nội. 5. Nguyễn Quang Khải, Hội thảo Phát triển năng lượng bền vững ở Việt Nam, Những vấn đề phát triển năng lượng SK của Việt Nam. 6. Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp xenluloza cao, Luận án PTSKHKT, Hà Nội. 7. Lê Đình Quang (2008), “Nhiên liệu sinh học – Lợi ích khổng lồ nhưng còn đó những nguy cơ”, Tạp chí Tài nguyên môi trường, Số 21, tr.24-25. 8. TCVN 6168:2002. 9. TCVN 6268:2002. 10. Lê Thanh (2004), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 11. Thủ tướng chính phủ (2007), Đề án phát triển nhiên-liệu-sinh-học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025”, Hà Nội. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 63 Cao học Môi trường K15 12. Nguyễn Đình Thưởng (2000), Công nghệ sản xuất & kiểm tra cồn etylic, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr.107-173. 13. Tổng cục Thống kê, Niên giám thống kê 2008. 14. Trung tâm khuyến nông Hà Tây, Chế biến dự trữ thức ăn thô xanh. 15. Trần Cẩm Vân (2004), Giáo trình vi sinh vật môi trường, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, tr.79-82. 16. Viện Năng lượng nguyên tử Việt Nam(2004), Hỏi và Đáp về Năng lượng nguyên tử, Viện , Hà Nội, tr.14. 17. Nhiên liệu sinh học - nguồn năng lượng tái tạo quan trọng trong tương lai. 18. nuoc-ta.14940.html?lang=en, 2007, Vì sao nhiên liệu sinh học chưa được quan tâm ở nước ta, Sinh học Việt Nam. 19. Nhiên liệu sinh học Etanol: hy vọng hay ảo vọng. 20. 5090.html, Sản xuất điện từ PPNN 21. pham-nong-nghiep.html (2009), Sản xuất nhiên liệu sạch từ PPNN 22. tận dụng phế phụ phẩm làm phân hữu cơ sinh học 23. xăng sinh học. 24. Không nên đốt rơm rạ trên ruộng lúa. Tiếng Anh 25. Cheng- shung gong, li-fu chen, Michael C. Flickinger, Ling- Chang Chiang, and George T. Tsao (1981), Applied and environmental microbiology: Production of Etanol from D-Xylose by Using D-Xylose Isomerase and Yeasts, p. 430-436 Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 64 Cao học Môi trường K15 26. Badger, P.C (2002), Trends in new crops and new uses, Etanol from cellulose: A general review, p. 17–21. 27. Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; and Stryer, Lubert (2002), Biochemistry, Spinger. 28. Biotechnology for Fuels and Chemicals- Applied Biochemistry and Biotechnology. 29. James D. Kerstetter, Ph.D.John Kim Lyons(2001), Wheat straw for etanol, Production in Washington: A Resource, Technical, and Economic Assessment, p.18. 30. Jeris J. S and A. W. Regan (1973), “The effect of pH, nutrient, storage and paper content”, Controllong environmental for oplimal composting, p 16- 22 31. Gaur A.C (1980), Microbial decomposition of organic matterial and humus in soil and compost, .FAO/UNDP,p.59. 32. Mandels Andreotii R. and Rochee (1996), “Enzymatic conversion of cellulose matterials”, New York, p.79-85. 33. Ralph Sims, Ali Savigh (2004), Bioenergy Options for a Cleaner Environment, Elsevier Science & Technology Books, p.131-132. 34. Resse E.T and Levison H.S (1952), A comparative study of the break down of cellulose by microorganism. 35. Se Hoon Kim (2004) , Lime pretreatment and enzymatic hydrolysis of corn stover, p.6. 36. . Sheela Srivastava, P S Srivastava (2003), Understanding Bacteria, Springer 37. Sin R.G.H (1951), Microbial decomposition of cellulose, Rainhold, New York. 38. tml 39. 40. Luận văn Thạc sỹ 07- 09 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Nguyễn Thị Hằng Nga 65 Cao học Môi trường K15 41. _biomass.html 42. www.wisbiorefine.org, Fermentation of Lignocellulosic Biomass. 43. www.wisbiorefine.org, Etanol fuel.