Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

o ở Việt Nam, chúng tôi được giao thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS ” Mục đích và yêu cầu ®Æt ra a. Mục đích. 1. Nghiên cứu môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris ®Ó xác định môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phát triển tốt. 2. Xác định được một số đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường thích hơp. 3. Bước đầu xác định giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris. b. Yêu cầu. 1. Xác định được thành phần môi trường nuôi cấy cho nấm Cordyceps militaris ph¸t triÓn tèt. 2. Xác định được ¶nh h­ëng cña yÕu tè nhiÖt ®é và Èm ®é ®Õn sự sinh trưởng và phát triển của nÊm Cordyceps militaris. 3. Xác định được giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris. PHẦN II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Tình hình nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo trªn thÕ giíi 1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo được các nhà khoa học Trung Quốc xác đinh mới đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu này thực chất là hiện tượng ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. ký sinh. Năm 1878 các nhà khoa học đã phát hiện ra nấm này ký sinh trên sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường dễ gặp nhất ở sâu non loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Vào cuối mùa thu các chất trên da của sâu non họ ngài đêm (Noctuidae) tương tác với các bào tử nấm và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng là chất dinh dưỡng để phát triển. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu. Do đó nhiều người gọi là nấm Đông trùng hạ thảo bởi vì mùa đông nấm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè thì nấm phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ (hình 1) [8, 9]. Đầu thế kỷ XVIII, những người truyền giáo Châu Âu đã đưa Đông trùng hạ thảo đến với nước Pháp để nghiên cứu, và họ coi nước Pháp là nước có nền y học hiện đại. Đến nay rất nhiều nước đã nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ngoài tự nhiên để làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho người [10]. Hình 1: Nhộng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ( nguồn ) 1.2. Sù ph©n bố của nấm Đông trùng hạ thảo Theo tài liệu của báo điện tử [8, 9] nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy được vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000 m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam,... Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người. Vị thuốc này thực chất là hiện tượng ký sinh trên cơ thể ấu trùng của loài bướm có tên khoa học là Thitarodes thuộc chi Cordyceps, chñ yÕu lµ Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus. Loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và Châu Úc. 1.3. Cơ chế lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng Theo Bách khoa toàn thư [8] thì loài nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể s©u hại đến nay vẫn chưa rõ nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mặc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu. Đến một giai đọan nhất định, nấm phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng xẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [11, 12]. II. Giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps: Năm 1993, Đông trùng hạ thảo đã làm cả thế giới kinh ngạc qua sự kiện thể thao quốc tế. Một nữ vận động viên người Trung Quốc đã liên tục phá kỷ lục thế giới nội dung chạy cự ly 1000 m, 3000 m và 10000 m. Thành công của người nữ vận động viên này một phần nhờ vào dùng Đông trùng hạ thảo trong bữa ăn hàng ngày. Tập đoàn Dược phẩm Tasly đã nhân giống Đông trùng hạ thảo đầu tiên ở vùng đầm lầy cao nguyên có độ cao trên 4000 m. Nhờ đó, Tasly đã phân lập và chiết xuất được hết hoạt động sinh học có giá trị dược liệu của Đông trùng hạ thảo, tạo nên viên nang Tasly Hoàng trùng thảo với hàm lượng Polissaccharid cao. Hướng đi này đã cho Trung Quốc có thương hiệu Đông trùng hạ thảo đã xuất khẩu vi toàn cầu. Nấm §THT có các chất dược liệu quý chủ yÕu là Cordycepin vµ Adenosine, ngoµi ra cßn nhiÒu chÊt kh¸c còng cã t¸c dông tèt cho con ng­êi nh­: Protein, Acid amin, Vitamin, Lipit, Polysaccharide,và các khoáng chất, … Phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của ĐTHT có 17 acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na...). Quan trọng hơn là trong sinh khối ĐTHT có nhiều chất hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang phát hiện dần dần ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự nhiên. Trong đó phải kể đến  chất Cordiceptic acid, Cordycepin, Adenosine, Hydroxyethyl-adenosine. Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl-Adenosine- Analogs). Ngoµi ra còn có chứa nhiều loại Vitamin (trong 100g ĐTHT có 0,12 g, vitamin B12; 29,19 mg vitamin A;  116,03 mg, vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K.. ) [11]. Sau đây là giá trị dược liệu quan trọng của một số chất:   2.1. Chất Cordycepin ( 3- deoxyadenosine ) có trong nấm ĐTHT với hàm lượng là 0.006 mg/g, đây lµ một dạng analoge của Adenosine, chất này có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn chặn ung thư, ung thư vòm họng, bệnh lao (tuberculosis bird-type) ở người ….   2.2. Chất acid Cordycepic ( một dạng D-mannitol ) cña §THT ở thiên nhiên có hàm lượng là 30.05 mg/g. Chất Acid Cordycepic có tác dụng giảm ho và hen suyễn, giảm đường huyết và kháng vi khuẩn.   2.3. Chất SOD, một chất chống oxi hóa ( Superoxide  Dismutase ) ở nấm ĐTHT có hàm lượng là 149.4 U/ml, cã t¸c dông chống lại thấp khớp, phát ban đỏ lupus, viêm tấy da hay cơ, ung thư và phóng xạ, nó cũng có khả năng chống lại lão hóa và làm đẹp làn da [10, 11]. 2.4. Chất Polysaccharide có hàm lượng là 94,6 mg/g, có tác dụng gia tăng hệ miễn dịch, chống ung thư, điều trị các bệnh về tim phổi, viêm phế quản mãn tính ở tuổi già cũng như cải thiện khả năng giải độc của gan. Hàm lượng Polysaccharide ở thiên nhiên là 94,6 mg/g, có tác dụng gia tăng hệ miễn dịch, chống ung thư, điều trị các bệnh về tim phổi, viêm phế quản mãn tính ở tuổi già cũng như cải thiện khả năng giải độc của gan [9, 10]. 2.5. Chất Manitol có thể tìm thấy ở nhiều thực vật, nhưng ở nấm Đông trùng hạ thảo có hàm lượng diosmol là cao nhất, ngoài công dụng làm giảm mỡ máu, đường máu và cholesterol. Chất Manitol còn giúp cho mạch máu giãn mỡ, phòng chống bệnh tim mạch rất hữu hiệu. 2.6. Chất Adenosin có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể. Chất này giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của các tế bào thoái hóa, tăng lượng oxy trong máu…Vì vậy việc bổ sung hàm lượng Adenosin cao cho cơ thể là vô cúng cần thiết, giúp cho con người luôn dồi dào năng lượng để lao động hiệu quả. III. Công dụng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh được nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps có những tác dụng sau: 1- Chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ đối với độc tính của Cephalosporin A. 2 - Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thưng  do thiếu máu. 3 - Chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu quản ở thận. 4 - Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp. 5 - Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim. 6 - Giữ ổn định nhịp đập của tim. 7 - Tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu. 8 - Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu. 9 - Tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch. 10 - Tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản. 12 - Làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể. 13 - Hạn chế bệnh tật của tuổi già. 14 - Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể. 15 - Chống lại tình trạng thiếu oxygen của cơ thể. 16 - Tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể. 17 - Hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể. 18 - Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh. 19 - Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu. 20 - Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch. 21- Xúc tiến  tác dụng của các nội tiết tố (hoocmon). 22 - Tăng cường chức năng tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dưỡng. 23 - Ức chế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao. 24 - Kháng viêm và tiêu viêm. 25 - Có tác dụng cường dương và chống liệt dương. Với những tác dụng trên thì nấm Đông trùng hạ thảo còn trực tiếp ảnh hưởng đến một số hệ thống quan trọng trong cơ thể . 3.1. Đối với hệ thống miễn dịch: Những nghiên cứu thực nghiệm ở Trung Quốc đã chứng minh ĐTHT có khả năng làm tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể. Cụ thể là nấm có tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và các tế bào nhiễm khuẩn. Chúng điều tiết các phản ứng đáp của tế bào lympho B, tăng cường một cách có chọn lọc hoạt tính của các tế bào ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh. Mặt khác, nấm ĐTHT còn là một vị thuốc ức chế miễn dịch có tác dụng chống lại sự lão hóa của các tế bào. 3.2. Đối với hệ thống tuần hoàn tim, não: Nấm ĐTHT có tác dụng làm giãn mạch máu, làm tăng lưu lượng tuần hoàn não và tim, thông qua cơ chế hưng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch. Mặt khác, nấm ĐTHT còn có khả năng điều chỉnh lipit máu, làm giảm lượng cholesterol và lipoprotein, hạn chế quá trình tiến triển của tình trạng xơ vữa động mạch. 3.3. Đối với hệ hô hấp: Nấm ĐTHT có tác dụng bình xuyễn, trừ đờm và phòng chống khí phế thũng. Điều này làm sáng tỏ quan điểm của cổ nhân xa xưa cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có khả năng “bảo phế, ích thận” và “dĩ lao khái” [11]. 3.4. Đối với hệ thống nội tiết: Các tác giả Chen L.T, Cao H.F & Huang W.F năm 2009 cho biết nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng trọng lượng tuyến vỏ thượng thận và tăng tổng hợp các hoocmon tuyến này, đồng thời nấm có tác dụng tương tự như hormon nam tính và làm tăng trọng lượng tinh hoàn cũng như các cơ quan sinh dục phụ trên động vật thực nghiệm. Ngoài ra, ĐTHT còn có tác dụng chống ung thư, chông viêm nhiễm, chống quá trình lão hoá và trấn tĩnh chống co giật [12]. IV. Nghiên cứu lâm sàng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sp Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sử dụng nấm ĐTHT để điều trị thành công khá chứng bệnh như rối loạn máu, viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục. Viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc) cũng đã dùng nấm ĐTHT để điều trị cho các bệnh nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt. Như vậy, có thể thấy rằng nấm ĐTHT là một trong những vị thuốc đông y có khả năng cải thiện đời sống tình dục trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tác dụng nâng đỡ bồi bổ cơ thể. Điều này đã được các nhà y học cổ truyền biết đến từ rất sớm. Theo các cuốn sách cổ xưa, nấm ĐTHT có vị ngọt, tính ấm vào hai kinh thận và phế, có công năng dưỡng phế, bổ thận, ích tinh được dùng để trị phế hư khái xuyễn, thận suy dương nuy (liệt dương), di tinh, lưng đau gối mỏi. Khó có thể kể hết các phương thuốc đông y có sử dụng ĐTHT, nhưng để cải thiện và phòng chống các bệnh rối loạn tình dục. Các nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc, đã nghiên cứu dùng nấm ĐTHT điều trị thành công khá nhiều bệnh như: Rối loạn lipid máu (hiệu quả đạt 76,2%), viêm phế quản mạn tính và hen phế quản, viêm thận mạn tính và suy thận (đạt hiệu quả từ 44,7-70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57-64,15%) [11,12,13]. 4.1. Cải thiện chức năng gan: Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân viêm gan B mãn tính và  xơ gan,  khi sử dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảo dược với thành phần chính là nấm linh chi,  kết quả cho thấy có 68 % người bệnh có phản ứng lâm sàng tốt (với nhóm sử dụng ĐTHT) và chỉ có 57 % phản ứng tốt (với nhóm hổn hợp thảo dược chứa  nấm Linh chi). Điều này cho thấy nấm Đông trùng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc điều trị bệnh gan hay xơ gan cho người [14]. Thí nghiệm khác cũng được thực hiện trên 22 bệnh nhân xơ gan ở liều lượng 6 g/ngày cũng cho kết quả rất khả quan khi thử nghiệm các chức năng gan sau thời gian điều trị bằng Đông trùng hạ thảo [10]. 4.2. Giải độc cho thận: Bác sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT có tác dụng làm tăng chức năng thận. Rất nhiều công trình y học hiện đại xác nhân là nhờ nấm có khả năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết. Thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị từ 3-5 g  ĐTHT/ ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đáng kể. Mặt khác chức năng của hệ miễn dịch cũng được nâng cao hơn so với nhóm đối chứng. Một nghiên cứu khác trên 57 bệnh nhân bị hỏng thận do sử dụng gentamixin , người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm ĐTHT với lượng 4.5 g/ ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn, 89 % chức năng thận được hồi phục, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chứng khi dùng giả dược hay sử dụng liệu pháp khác chỉ cho kết quả 45 %. Nghiên cứu ở 51 bệnh nhân bị suy thận có dùng nấm đông trùng hạ thảo với lượng 3-5 g/ngày thì nhận thấy chức năng thận và hệ miễn dịch được cải thiện. Thử nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps đã làm giảm độc tính của Cyclosporine trên thận [9,10]. 4.3. Hiệu quả giảm đường huyết:   Nấm ĐTHT có hiệu quả với hệ thống chuyển hóa glucose máu. Các nhà khoa học nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95 % bệnh nhân được cải thiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3 g nấm/ ngày. Hiệu quả này đạt được là do tác dụng của nấm ĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và các emzyme chuyển hóa glucose gan, glucokinase và hexokinasse. Kết quả này khẳng định rằng việc sử dụng nấm ĐTHT trong việc kiểm soát chỉ số đường huyết mà không gây ra các phản ứng phụ [11] 4.4. Bệnh phổi: Tác dụng điều trị bệnh về đường hô hấp của nấm ĐTHT đã được Y văn cổ ghi nhận từ hàng nghìn năm nay bao gồm các bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính ( COPD ) và bệnh viêm phế quản. Nghiên cứu về lâm sàng tại trường Đại học Y Bắc Kinh trên 50 bệnh nhân hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHT nhận thấy tình trạng bệnh nhân đã được cải thiện có khoảng 81,3 % số bệnh nhân sau khi sử dụng nấm 5 ngày so với nhóm điều trị bằng các thuốc kháng histamine thông thường [13]. 4.5. Bệnh tim mạch: Nấm ĐTHT thường dùng để điều trị rối loạn nhịp tim, ngoài ra nấm còn được sử dụng để điều trị bệnh tim, hay hồi phục sau khi đột quỵ. Với các bệnh nhân suy tim mãn tính thì việc sử dụng nấm ĐTHT  dài ngày và điều trị thông thường với các loại thuốc như Dioxin, hydrochlorothiazide, Dopamine, và Dobutamine sẽ thúc đẩy việc cải thiện  chất lượng cuộc sống nói chung, bao gồm cả thể chất lẫn tinh thần, sinh lý và chức năng tim mạch. Nấm ĐTHT còn là loại nấm có khả năng làm giảm cholesterol, gia tăng tỷ số HDL / LDL Cholesterol và giảm Triglyceride. 4.6. Nâng cao khả năng miễn dịch: Thí nghiệm ở 61 bệnh nhân bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy việc dùng nấm §ông trùng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisinine với lượng 0,6 g/ngày đã làm giảm căn bệnh trên [9]. 4.7. Hỗ trợ điều trị ung thư: Nhiều nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quèc và Nhật Bản trên những bệnh nhân bị ung thư cho kết quả khả quan. Nghiên cứu trên 50 bệnh nhân ung thư phổi đã được uống 6 g nấm ĐTHT/ ngày, cùng với liệu pháp vật lý trị liệu thì khối u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46 %. Nghiên cứu trên một số các bệnh nhân bị các dạng ung thư khác nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong 2 tháng với liều lượng là 6 g/ ngày, kết quả cho thấy có cải thiện về triệu chứng trên đa số bệnh nhân. Số lượng tế bào máu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm3; ngay cả khi sử dụng liệu pháp chiếu xạ hay hóa chất thì các tham số miễn dịch cơ thể đã không bị thay đổi đáng kể trong khi kích thước khối u giảm đi nhiều trên một nửa bệnh nhân. Như vậy việc kết hợp sử dụng nấm ĐTHT với  các liệu pháp hóa trị cho kết quả khả quan giảm tác dụng phụ của các liệu pháp trên [11,12]. 4.8. Chống rối loạn tình dục: Nấm ĐTHT  dùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới bao gồm giảm ham muốn, lãnh cảm hoặc liệt dương. Nghiên cứu được tiến hành tại Trung Quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn, sau 40 ngày sử dụng 3 g ĐTHT/ ngày, thì có 64.8 % bệnh nhân đã cải thiện được tình trạng tình dục. Công trình nghiên cứu khác trên các đối tượng người cao tuổi, cả nam và nữ đều có triệu chứng giảm ham muốn, liệt dương và các bệnh suy giảm sinh l‎ý khác, sử dụng 3 g/ngày trong vòng 40 ngày, các chỉ số đo được như thời gian sống của tinh trùng, số lượng tinh trùng đã tăng lên, còn tỷ lệ khiếm khuyết của tinh trùng giảm xuống đối với đa số các đói tượng, hơn gấp đôi số người bị liệt dương cũng được ghi nhận có cải thiện về tình trạng tình dục. Đối với nữ giới, chứng đa khí hư, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, ham muốn tình dục cũng được cải thiện. 4.9. Tăng sức bền, chống mệt mỏi: Theo báo điện tử thì khi sử dụng mỗi ngày liều 3 g nấm Đông trùng hạ thảo thì kết quả làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính. Năm 2004, tại Mỹ các nhà khoa học đã thí nghiệm cho người 40 - 70 tuổi, nếu dùng nấm Đông trùng hạ thảo trong 12 tuần thì có sự gia tăng sức bền thể lực. Sự gia tăng sức mạnh được thể hiện ở cả  hai yếu tố đó là gia tăng  Adenosine Triphophate ( ATP ) và giải phóng năng lượng trong ty lạp thể của tế bào cũng như hệ số sử dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quá trình giải phóng năng lượng [9]. 4.10. Chống lão hóa: Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide  Dismutase ) là chất chống oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể. V. Công nghệ sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo và sản phẩm sử dụng: HiÖn nay nấm §THT đã ®­îc rÊt nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi s¶n xuÊt thành viên dược liệu thực phẩm chức năng cho người trªn quy m« c«ng nghiÖp nh­ Trung Quèc, Hµn Quèc, NhËt Bản, Mü vµ Malaysia. NÊm §THT được s¶n xuất trªn m«i tr­êng nh©n t¹o tèt h¬n nhiÒu so víi §THT thu ®­îc ë ngoµi tù nhiªn. Cã rÊt nhiÒu s¶n phÈm ®­îc s¶n xuÊt tõ nấm §THT vµ ®­îc b¸n kh¾p mäi n¬i trªn thÕ giíi. 5.1. Sản phẩm CORDY-CGB: Dạng đóng gói: 90 viên nang/ hộp gồm 500 mg Đông trùng hạ thảo. Tổng cộng có 45 gam Đông trùng hạ thảo / hộp. Bột §ông trùng hạ thảo có chất lượng cao với hàm lượng Adenosine > 0.25 %, Mannitol > 7 % và Polysacchyride > 10 %. Mỗi ngày sử dụng khoảng 4-6 viên, trường hợp hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, suy gan hay ung thư thì dùng liều lượng gấp 2 lần [11]. 5.2. S¶n phÈm CODYCAP – Đông trùng Hạ thảo Tenamyd: CODYCAP được sản xuất hoàn toàn từ Cordyceps Cephalosporium Mycelia nguyên chất, nguồn nguyên liệu tốt nhất từ nhà cung cấp nguyên liệu Đông trùng hạ thảo. Đặc điểm vượt trội của CODYCAP là hàm lượng rất cao Adenosine trong thành phần (5,088.90 mcg/g) (Tài liệu nghiên cứu thực tế bởi BIOFACT LIFE; Analytica Chimica Acta 567 (2006) 218-228) giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả và nhanh chóng xoá đi các triệu chứng mệt mỏi. Sản phẩm CODYCAP được chỉ định trong mọi trường hợp, dùng 2 viên/ngày/2 lần [10, 11]. VI. Nghiên cứu nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam Hiện nay ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt được một số kết quả. Việc nghiên cứu mới chỉ mang tính chất điều tra, phát hiện và thu thập chúng trong điều kiện Việt Nam. Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện được loài nấm Đông trùng hạ thảo và được giám định là loài Cordyceps nutans. Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam [1]. Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát hiện nấm ĐTHT Cordyceps Gunnii [2]. Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm ĐTHT Cordyceps militari (NÊm nhéng trïng th¶o) [3]. Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập ở vườn Quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình nguồn nấm Cordyceps [6]. Về nấm Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam [1,2]. Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900 m đến 2.100 m so với mực nước biển. Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 – 6,5 cm, hình chuỳ, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu( phần sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6 cm. Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300 – 510 µ x 3,5 – 5µ, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 – 5 µ [3]. Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên cøu nấm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu rừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m. Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militarris PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người. Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là: Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh. Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang. Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số vitamin và một số nguyên tố vi lượng. Trên đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam. Vì vậy việc nghiên cứu nấm này cần thiết được tiếp tục để đi sâu và phát triển những nấm Cordyceps để làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người [5]. Như vây nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam là hoàn toàn cần thiết, đáp ứng nhu cầu đòi hỏi là bảo vệ sức khoẻ con người ở Việt Nam. PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Viện Bảo vệ thực vật - Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội 2. Thời gian nghiên cứu. Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến hết tháng 5/2010 II. Vật liệu nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu. Chủng nấm Cordyceps militaris do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ - Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. 2. Vật liệu nghiên cứu. a. Một số hoá chất: + Agar + Pepton + Maltoza + Cao nấm men b. Muối khoáng: + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + Chất bám dính, Tween 80 (Mỹ), Agral (Nhật) c. Dụng cụ và thiết bị cơ bản: Kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, nồi khử trùng, tủ sấy, tủ định ôn, tủ lạnh, buồng cấy, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, lọ thuỷ tinh, ống đong, phễu đong,… III. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1. Nội dung: 1.1 Nghiên cứu một số môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác định môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phát triển. 1.2 Nghiên cứu ¶nh h­ëng của thời gian đến sự phát triển của nÊm Cordyceps militaris. 1.3 Xác định giá trị dược liệu, thµnh phÇn hoá học của nấm Cordyceps militaris 2. Phương pháp nghiên cứu. 2.1. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác đinh môi trường tối ưu a. Một số môi trường sử dụng: + Môi trường Czapek – Dox: - Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - NaNO3: 2 g - K2HPO4: 1 g - MgSO4.7H2O: 0.5 g - KCl: 0.5 g - H2O: 1000 ml + Môi trường PDA: - Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - Khoai Tây: 300 g - H2O: 1000 ml + Môi trường MYPS: - Agar: 20 g - Đường kính: 10 g - Maltoza: 4 g - Pepton: 6 g - Cao nấm men: 4 g - H2O: 1000 ml b. Phương pháp tiÕn hµnh: Thí nghiệm 1: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 3 môi trường Czapek-Dox, PDA, MYPS trong tháng 2 để xác định môi trường tối ưu Bước 1: Cân số lượng từng thành phần của 3 môi trường. B­íc 2: Nấu từng loại m«i tr­êng cho tan các thành phần nguyên liệu, đo độ pH = 6 B­íc 3: §æ 1/2 phần m«i tr­êng vµo èng nghiÖm( 1/4 ®Õn 1/3 èng ) và để nguội, rồi gói lại. Phần môi trường còn lại đổ vào bình tam giác, mang tất cả đi khử trùng trong thời gian 60 phút, 1210C (với áp suất 1at) Bước 4: - Cho ra và nghiªng m«i tr­êng ở ống nghiÖm trong buồng cấy - Rót môi trưòng trong bình tam giác ra đĩa petri trong buồng cấy, để nguội. - Sau đó để nguội và khử trùng buồng cấy bằng tia UV ( 30 phút đến 60 phút ). B­íc 5: TiÕn hµnh cÊy chÊm ®iÓm trên đĩa petri và cấy rÝch r¾c trên từng ống nghiệm. B­íc 6: Gói ống nghiệm và đĩa petri cấy nấm, nu«i trong tñ định ôn, theo dâi hµng ngµy sự phát triển của nấm. Thí nghiệm 2: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 2 môi trường PDA và MYPS trong tháng 3 Phương pháp như thí nghiệm 1 Thí nghiệm 3: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 2 môi trường PDA và MYPS trong tháng 4 – 5 Phương pháp như thí nghiệm 1 c. Theo dõi sự phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris về hình thái, sinh trưởng và phát triển + Chỉ tiêu theo dõi hàng ngày: - Quan sát hình thái nấm bằng mắt thường: Quan sát màu sắc sự phát triển của sợi nấm cả mặt trước và mặt sau của khuẩn lạc để xác định sắc tố. Mô tả quá trình phát triển nấm. - Theo dõi và ghi chép nhiệt độ và ẩm độ trong phòng nuôi cấy. - Đo đưòng kính khuẩn lạc: Kể từ khi nấm hình thành khuẩn lạc sau 5,10,15,,20,25 ngày (dùng thước đo cm kẻ rõ) để đo đường kính, đo cả mặt trước và mặt sau của đĩa theo hai đường vuông góc, sau đó tính trị số trung bình theo công thức: D1 + D2 D = ------------- 2 Trong đó: D: đường kính trung bình của khuẩn lạc D1, D2: đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc - Chụp ảnh sự phát triển của nấm theo thời gian phát triển 2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường tối ưu nhất - Nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi trường tối ưu nhất trong ba khoảng thời gian khác nhau (tháng 2, 3, 4). - Theo dõi hàng ngày và đo đường kính khuẩn trung bình của khuẩn lạc nấm ở các khoảng thời gian trên, nhận xét và mô tả sự phát triển. - Sau ba đợt thí nghiệm so sánh đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm và rút ra kết luận trong khoảng thời gian, nhiệt độ, ẩm độ nào nấm phát triển mạnh nhất. - Chụp ảnh sự phát triển của nấm (thông qua mô tả sự phát triển). 2.3. Xác định giá trị dược liệu và thành phần hoá học của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris a. Phương pháp tiến hành: - Nguồn nấm Cordyceps militaris làm khô trong không khí ở 400C và dùng máy nghiền thành bột - Lấy 0,1 g bột trên chiết 3 lần với nước sôi (3 x 10 ml). Lọc qua phễu và làm khô lạnh để thu chất chiết suất - Sau khi làm khô lạnh, phần còn lại được hoàn nguyên trong 10 ml methanol và lọc qua màng 0,22 µm. Trước khi phân tích tiếp HPLC, các mẫu được hoà tan trong 10 ml các dung dịch thích hợp - HPLC: Thể tích mẫu 5 µl; dung dịch rửa giải methanol: 20 mM phosphoric acid = tỷ lệ 15 : 85 trong 20 phút, phát hiện tại bước sóng 260 nm b. Định lượng chuẩn: Xác định Cordycepin hoặc Cordycepic Acid hoặc đường cụ thể bằng hợp chất N6 -(2- hydroxyethyl) – Adenosine, đây là chất chỉ thị để phát hiện trong các mẫu Cordyceps và không được tìm thấy trong các sinh vật. Hợp chất này và chất Adenosine và 3’ deoxyadenosine ( Cordycepin ) được sử dụng làm chất chỉ thị chất lượng để so sánh các chủng khác nhau của nấm Cordyceps c. Xác định một số vitamin và nguyên tố vi lượng theo phương pháp chung của phân tích hóa học Phần xác định giá trị dược liệu do Công ty cổ phần dược liệu Trung ương II thực hiện PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Như chúng ta biết, để nghiên cứu được môi trường nuôi cấy tối ưu nhất cho các loài nấm phát triển thì yếu tố quan trọng nhất quyết định là chủng giống. Trên cơ sở có chủng giống do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ cung cấp, chúng tôi đã nuôi cấy và đánh giá được khả năng phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên ba môi trường Czapek-Dox, PDA, MYPS. Từ đó xác định được môi trường tối ưu nhất cho nấm Cordyceps militaris phát triển. I. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác định môi trường tối ưu Môi trường nuôi cấy là yếu tố có tính chất quyết định đến sự phát triển và hình thành bào tử nấm. Môi trường thích hợp nhất là môi trường ở đó nấm phát triển mạnh, thể hiện ở đường kính khuẩn lạc lớn nhất và tạo ra số lượng bào tử nhiều nhất. Để xác định môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm Cordyceps militais, như phần vật liệu và phương pháp đã trình bày, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm trên ba loại môi trường: Czapek-Dox, PDA và MYPS. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi được trình bày ở bảng 1 Bảng 1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris Môi trường Khả năng phát triển Nhiệt độ trung bình ( 0C) Ẩm độ trung bình (% ) Czapek-Dox + 23,1 85 PDA ++ MYPS +++ Ghi chú: + yếu ++ bình +++ tốt Qua kết quả ở bảng 1 cho thấy: trong ba môi trường nghiên cứu trên thì nấm Cordyceps militaris phát triển có khác nhau trên từng môi trường. So sánh sự phát triển của nấm trên các môi trường nuôi cấy chúng tôi nhận thấy: - Trên môi trường Czapek-Dox, nấm Cordyceps militaris phát triển yếu, gần như là không phát triển. Sau 5 ngày nuôi cấy 10 đĩa thạch của môi trường này thì nấm mới bắt đầu mọc ở 1 đĩa và chỉ có 1 chấm trắng nhỏ. Theo thời gian nuôi cấy, sau 10 ngày nấm không phát triển, đến ngày 25 nấm cũng không phát triển. Như vậy môi trường Czapek-Dox là không thích hợp để nuôi cấy nấm Cordyceps militaris. - Trên môi trường PDA, chỉ sau 3 ngày nuôi cấy, nấm Cordyceps militaris đã bắt đầu hình thành khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc tăng dần theo thời gian. Quan sát thấy bề mặt khuẩn lạc phồng xốp, nấm chưa ăn sâu vào môi trường, mặt sau khuẩn lạc phẳng, có màu trắng. Sau 10 ngày nuôi cấy thì đường kính khuẩn lạc phát triển nhanh đến ngày thứ 25, bề mặt khuẩn lạc lõm xuống, mặt sau khuẩn lạc môi trường có sắc tố màu vàng trắng ngà với nhiều múi khía. - Trên môi trường MYPS thì nấm Cordyceps militaris phát triển mạnh nhất, theo chúng tôi môi trường này có đủ thành phần dinh dưỡng giống như trong nhộng và sâu sống trong đất. Qua quan sát thấy bề mặt thạch ở mặt trước của đĩa petri, chúng tôi thấy sợi nấm ban đầu màu trắng xám, sau đó chuyển sang màu trắng xám vàng, sợi bông xốp, hơi ngắn, mọc chằng chịt và bám chặt vào mặt thạch. Quan sát mặt sau thấy sắc tố của nấm có màu vàng sáng, có múi khía màu vàng đậm. Để dễ dàng quan sát, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi đã chụp được hình ảnh về sự phát triển trên ba môi trường của nấm Cordyceps militaris, kết quả thể hiện ở hình 2a va hình 2b Hình 2a: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên ba loại môi trường sau 20 ngày nuôi cấy Hình 2b: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên ba loại môi trường sau 20 ngày nuôi cấy Qua bảng 1 và hình 2a, 2b chúng tôi khẳng định môi trường MYPS là môi trường cho nấm Cordyceps militaris phát triển tốt nhất, thứ 2 là môi trường PDA, nấm không phát triển trên môi trường Czapek-Dox. II. So sánh khả năng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS Qua thí nghiệm 1, chúng tôi rút ra được kết luận môi trường MYPS là môi trường tốt nhất cho nấm Cordyceps militaris phát triển. Nhưng vì chưa có số liệu cụ thể, nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 là so sánh khả năng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS để đưa ra kết quả chính xác về môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phát triển. Kết quả nghiên cứu thu được trình bày ở bảng 2 Bảng 2: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycep militaris nuôi cấy trên hai môi trường PDA, MYPS Môi trường nuôi cấy Đường kính KL nấm (mm) qua các ngày nuôi cấy Nhiệt độ trung bình (0C) Ẩm độ trung bình (%) 5 10 15 20 25 PDA 10,5 17,0 23,0 28,5 33,5 24,7 84,2 MYPS 13,5 22,0 30,5 36,0 42,0 Kết quả ở bảng 2 chúng tôi nhận thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bình là 24,70C và độ ẩm trung bình là 84,2% thì nấm Cordyceps militaris phát triển như sau: - Trên môi trường PDA: + Sau 5 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính trung bình là 10,5 mm. + Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 17 mm + Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 23 mm + Sau 20 ngày nuôi cấy, đưòng kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 28,5 mm + Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc đạt 33,5 mm. + Ngày thứ 26 khuẩn lạc nấm bắt đầu phát triển chậm và gần như không phát triển nữa. - Trên môi trường MYPS nấm Cordyceps militaris phát triển nhanh hơn hẳn so trên môi trường PDA. Khuẩn lạc nấm phát triển mạnh trong 25 ngày đầu tiên. Cứ sau 5 ngày nuôi cấy đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm ở môi trường MYPS tăng lên trung bình từ 3-5 mm so với môi trường PDA, cụ thể: + Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 13,5 mm. + Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kình trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 22 mm. + Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 30,5 mm + Sau 20 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 36 mm. + Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 42 mm. + Sau 26 ngày thì khuẩn lạc nấm phát triển chậm dần. Như vậy qua số liệu cụ thể cho thấy nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS là mạnh nhất. Vì thế chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu môi trường này. Để dễ theo dõi, chúng tôi minh hoạ kết quả bảng 2 qua hình 3 và hình 4 Hình 2: Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS sau 20 ngày nuôi cấy Đường kính trung bình của khuẩn lạc (mm) Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 3: Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS III. Mô tả một số đặc điểm của nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS Sau khi đã lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cho sự phát triển và hình thành bào tử nấm Cordycpes militaris đó là môi trường MYPS. Dựa trên chủng nấm do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ cung cấp, chúng tôi đã sử dụng môi trường này để nuôi cấy nấm Cordyceps militaris. Bằng phương pháp quan sát bằng mắt thường về sự phát triển của nấm, chúng tôi nhận thấy lúc đầu sợi nấm có màu trắng, xốp, sau chuyển sang màu trắng ngà, rồi vàng, nấm ăn sâu vào môi trường, mặt sau khuẩn lạc nấm có những khía màu vàng tạo thành nhiều múi. Kết quả quan sát về hình thái nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris chúng tôi trình bày lên bảng 3. Bảng 3: Mô tả một số đặc điểm hình thái của nấm Cordycpes militaris phát triển trên môi trường MYPS đến 25 ngày nuôi cấy Tốc độ phát triển của khuẩn lạc Quan sát màu sắc bề mặt khuẩn lạc Quan sát sắc tố của khuẩn lạc Sau 2 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24,50C, độ ẩm 82% thấy khuẩn lạc bắt đầu hình thành và chúng phát triển mạnh từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 25. - Khuẩn lạc có hình tròn. - Lúc đầu khuẩn lạc có màu trắng xám, đến ngày thứ 7 khuẩn lạc chuyến sang màu trắng ngà và sau 10 ngày thì khuẩn lạc có màu trắng hồng. - Sợi nấm bông xốp, hơi ngắn, tỏa tròn, phát triển chằng chịt trên đĩa thạch và mọc nhô lên, bám chặt vào mặt thạch (hình 5a). Do sợi nấm ăn sâu vào môi trường nên mặt sau tạo thành các khía, chia ra thành nhiều múi. Lúc đầu có sắc tố màu vàng, sau biến thành màu vàng đậm và cuối cùng chuyển thành màu vàng nâu, lõm ở tâm đĩa (hình 5b). Chúng tôi cũng chụp hình ảnh nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS (hình 5a, 5b) Hình 5a: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trên môi trường MYPS (mặt trước) trên môi trường MYPS (mặt trước) Hình 5b: Sắc tố của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris IV. Nghiên cứu sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trên môi trường MYPS theo thời gian Qua hai thí nghiệm trên đã xác định được môi trường MYPS là tối ưu nhất cho nấm Cordycep militaris phát triển. Chúng tôi tiến hành đi sâu vào nghiên cứu nuôi cấy nấm trên môi trường này. Kết quả thí nghiệm về sự phát triển của nấm trong tháng 2 được trình bày ở bảng 3. Bảng 4: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên môi trường MYPS ( Thí nghiệm tháng 2) Lần nhắc lại Sự phát triển của KL nấm (mm) sau thời gian nuôi cấy Nhiệt độ trung bình (0C) Ẩm độ trung bình (%) 5 10 15 20 25 1 11,0 20,0 29,0 33,5 37,0 23,1 85 2 10,5 19,5 27,5 31,0 33,5 3 11,0 15,0 30,5 34,5 37,5 TB 10,8 18,2 29,0 33,0 36,0 Kết quả ở bảng 4 cho thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bình 23,10C và độ ẩm trung bình 85% trên môi trường MYPS nấm Cordyceps militaris phát triển cho kết quả cụ thể như sau: - Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 10,8 mm. - Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 18,2 mm. - Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 29 mm. - Sau 20 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 33 mm. - Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 36 mm. - Từ ngày thứ 26 khuẩn lạc nấm phát triển chậm và gần như không phát triển. Duới đây là hình ảnh nấm Cordyceps militaris đang phát triển trên môi trường MYPS trong tháng 2 (hình 6) Hình6: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trên môi trường MYPS sau 8 ngày nuôi cấy trong điều kiện T0= 23,10C, H%=85% Thí nghiệm nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trong điều kiện tháng 3, kết quả thu được ở bảng 5 Bảng 5: Sự phát triển của khuản lạc nấm Cordyceps militaris trên môi trường MYPS ( Thí nghiệm tháng 3) Lần nhắc lại Sự phát triển của KL nấm (mm) sau thời gian nuôi cấy Nhiệt độ trung bình (0C) Ẩm độ trung bình (%) 5 10 15 20 25 1 12,0 21,0 30,5 35,5 40,0 24,1 84,5 2 11,5 20,0 27,0 39,0 43,0 3 9,0 20,0 26,0 40,0 45,0 TB 11,0 20,3 29,0 38,0 43,0 Thí nghiêm nuôi cấy nấm tiến hành trong tháng 3 với điều kiện nhiệt độ trung bình 24,10C và độ ẩm trung bình 84,5 %cho thấy nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS mạnh hơn. Cụ th ể: - Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 11 mm - Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 20,3 mm - Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 29 mm - Sau 20 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 38 mm - Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 43 mm Dưới đây là hình ảnh chúng tôi chụp được khi nấm phát triển trên môi trường MYPS trong điều kiện tháng 3 (hình 7) Hình 7 b: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên môi trường MYPS sau 10 ngày nuôi cấy Qua hình ảnh chúng tôi thấy nấm Cordyceps militaris đã phát triển tốt trong điều kiên nhiệt độ 24,10C , ảm độ 84,5% Thí nghiệm nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trong điều kiện tháng 4, kết quả trình bài ở bảng 6 Bảng 6: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên môi trường MYPS ( Thí nghiệm tháng 4) Lần nhắc lại Sự phát triển của KL nấm (mm) sau thời gian nuôi cấy Nhiệt độ trung bình (0C) Âm độ trung bình (%) 5 10 15 20 25 1 15,0 26,0 36,0 46,0 46,0 26,2 83 2 12,0 23,0 33,0 41,0 42,0 3 10,5 25,0 34,0 43,0 45,0 TB 12,5 24,7 34,3 43,3 45,0 Bảng số liệu trên cho thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bình 26,20C và độ ẩm trung bình là 83% thì nấm Cordyceps militaris phát triển tốt nhất. Kết quả cụ thể đạt cao nhất: - Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 12,5 mm - Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 24,7 mm - Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 34,3 mm - Sau 20 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 43,3 mm - Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 45 mm Kết quả dừng lại sau 25 ngày nuôi cấy nấm, vì ngày thứ 26 khóm nấm phát triển rất chậm. Để quan sát khuẩn lạc phát triển, chúng tôi đã chụp lại hình ảnh ( hình 8a, 8b) Hình 8a: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trên môi trường MYPS sau 10 ngày trong tháng 4 Hình 8b: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trên môi trường MYPS sau 10 ngày trong tháng 4 Rõ ràng là yếu tố nhiệt độ và ẩm độ có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris V. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ đến sự phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Như trên đã trình bày, nhiệt độ và ẩm độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của đường kính khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris. Vì thế qua các thí nghiệm trên, chúng tôi tổng hợp kết quả ghi được ở bảng 7 Bảng 7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris nuôi cấy trên môi trường MYPS Đợt TN Đường kính KL nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy Nhiệt độ trung bình (0C) Ẩm độ trung bình ( % ) 5 10 15 20 25 1 10,8 18,2 29,0 33,0 36,0 23,1 85,0 2 11,0 20,0 29,0 38,0 43,0 24,1 84,5 3 12,5 24,7 34,3 43,3 45,0 26,2 83,0 Kết quả ở bảng 7, chúng tôi rút ra được một số nhận xét sau: - Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris phát triển tốt trên môi trường MYPS, trong điều kiện nhiệt độ trung bình 26,2 0C và độ ẩm trung bình 83 %, kết quả đạt được sau 25 ngày nuôi cấy đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được là 45 mm. - Nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ trung bình 24,1 0C và độ ẩm trung bình 84,5 % nhanh thứ 2, kết quả sau 25 ngày nuôi cấy đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt được 43 mm - Nấm phát triển chậm nhất ở tháng 2 trong điều kiện thời tiết mát mẻ hơn, nhiệt độ trung bình 23,1 0C và độ ẩm trung bình 85 % thì sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm chỉ đạt được 36 mm. Kết quả trên đã khẳng định nhiệt độ thích hợp cho nấm Cordyceps militaris phát triển tốt là trong điều kiện nhiệt độ 26,20C và ẩm độ 83%. Để minh hoạ kết quả thu được ở bảng 7 chúng tôi trình bày lên hình 9 và hình ảnh ống giống ở hình 10. Đường kính trung bình của khuẩn lạc (mm) Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 9: Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Ghi chú: - Đợt 1: T0 = 23,10C; H% = 85% - Đợt 2: T0 = 24,10C; H% = 84,5% - Đợt 3: T0C = 26,20C; H% = 83% Hình 10: Nấm Cordyceps militaris phát triển sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường MYPS VI. Xác định giá trị dược liệu và thành phần hoá học của nấm Cordyceps militaris Trên cơ sỏ nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi trường MYPS trong điều kiện nhiệt độ 26,20C và ẩm độ, việc 83% xác định giá trị dược liệu và thành phần hóa học có trong nấm Cordyceps militaris do Công ty cổ phần dược liệu Trung ương II thực hiện. Qua phân tích về thành phần hoá học của nấm Cordyceps militaris được trình bày ở bảng 8 Bảng 8: Xác định thành phần hoá học của nấm Cordyceps militaris STT Gía trị dược liệu Thành phần hoá học 1 Cordycepin 3’- deoxyadenosine 2 HEAA Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs 3 VTM VTMA, VTMB12, VTMC, VTMB2, VTME,… 4 Nguyên tố vi lượng Na, K, Al, Si Qua phân tích hoá học về các hợp chất tự nhiên, Công ty dược liệu Trung ương II cho biết sinh khối nấm Cordyceps militaris có chứa nhiều chất sinh hoc, trong số đó phải kể đến chất Cordycepin, đó là 3’- deoxyadenosine, thưa 2 là nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs). Ngoài ra nấm Cordyceps militaris còn chứa nhiều loại vitamin như vitamin A, vitamin B12, vitamin C, vitamin B2-riboflavin, vitamin E, vitamin K…và các nguyên tố vi lượng như Na, K, Al, Si.. Như vậy nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris có nhiều giá trị. Kết quả trên cho thấy việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam là hết sức cần thiết, mang tính thực tiễn. PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A. KẾT LUẬN Qua bốn tháng thực tập tại Viện BVTV, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris. Trong ba môi trường Czapek-Dox, PDA và MYPS thì môi trường MYPS gồm có các thành phầnâgar, sacharoza, maltoza, pepton và cao nấm men là tối ưu nhất cho nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris phát triển ở mức +++. Thứ 2 là ở môi trường PDA gồm các thành phần khoai tây, sacharoza và agar thì nấm Cordyceps militaris phát triển ở mức ++. Còn trên môi trường Czapek-Dox gồm có agar, sacharoza, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, thì nấm gần như không phát triển. 2. So sánh khả năng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS ở nhiệt độ trung bình 24,70C và độ ẩm trung bình 84,% 2.1. Nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS sau 25 ngày nuôi cấy đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 42 mm. 2.2. Nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường PDA sau 25 ngày nuôi cấy đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 33,5 mm. 3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trên môi trường MYPS đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris 3.1. Ở nhiệt độ trung bình 23,10C và ẩm độ trung bình 85% thì đường kính của khuẩn lạc nấm sau 25 ngày nuôi cấy đạt trung bình là 36 mm. 3.2. Ở nhiệt độ trung bình 24,10C và ẩm độ trung bình 84,5% thì đường kính của khuẩn lạc nấm sau 25 ngày nuôi cấy đạt trung bình là 43 mm. 3.3. Ở nhiệt độ trung bình 26,20C và ẩm độ trung bình 83% thì đường kính của khuẩn lạc nấm sau 25 ngày nuôi cấy đạt trung bình là 45 mm. 4. Gía trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris bao gồm : 4.1. Cordycepin với thành phần hoá học là 3’- deoxyadenosine. 4.2. HEAA với thành phần hoá học là Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs. 4.3. Một số loại vitamin như vitamin A, vitamin B12, vitamin C, vitamin B2, vitamin E, vitamin K, … 4.4. Một số nguyên tố vi lượng như Na, K, Al, Si… B. ĐỀ NGHỊ Nấm Cordyceps militaris là một loài nấm mới có rất nhiều công dụng, đây là loại thực phẩm chức năng rất tốt với con người, vì vậy chúng tôi đề nghi: cần tiếp tục nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để nhân nhanh nguồn nấm này làm nguyên liệu thực phẩm chức năng phục vụ cho con người. PHẦN V TÀI LIỆU THAM KH ẢO A. Tài liệu trong nước 1. Phạm Quang Thu (2009). Điều tra phát hiện nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat. phân bố ở khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tạp trí nông nghiệp và phát triển nông thôn. số 4 - tháng 4/2009. 2. Phạm Quang Thu (2009). Phát hiện nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni (Berk.)Berk. tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn. số 6 - tháng 6/2009. 3. Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà. Phát hiện nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:FR.)LINK. tại vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn. số 9 - tháng 9/2009. 4. Phạm Thị Thuỳ (2004). Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội. 5. Phạm Thị Thuỳ (2010). Nghiên cứu phát triển các nguồn nấm Beauveria và Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng, cây rừng và phát hiện nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức năng cho người. B¸o c¸o tại Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam. 24/4 – 25/4/2010. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Trang 224 – 231. 6. Báo điện tử. Hội tiêu chuẩn và bảo vệ người tiêu dùng Việt Nam-Timo Cordyceps king. Đông trùng hạ thảo cho mọi người (thứ 3, ngày 1, tháng 4, năm 2008 ). 7. Báo điện tử. Bách Khoa Toàn Thư mở wikipedia. Đông trùng hạ thảo. Ngày 12, tháng 1, năm 2010. 8. Báo điện tử. Thầy thuốc Của Bạn. Vị thuốc đông y. Đông trùng hạ thảo, ngày 25, tháng 1, năm 2010. 9. B¸o ®iÖn tö. Greenbiotech – Thực phẩm dinh dưỡng – Giải pháp sức khỏe cho mọi người. Ngµy 25/07/2009. 10. Báo điện tử. Thần dược Đông trùng hạ thảo – Câu lạc bộ nấm trồng Việt Nam – Mush clubVN. com. Ngµy 3/5/2009 B. Tµi liệu nước ngoài 1. Chen L.T.,Cao H.F. & Huang W.F, 2005. Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, Modern Food Science. 21(3), 192-195. 2. Feng-Lin Hu, Zeng-Zhi Li, Ya-Qiong He, Chu-Ru Li, Bo Huang, Mei- Zhen Fan, 2009. Secondary metabolistes in a soybean fermentation both of Paecilomyces militaris. Journal of Food Chemistry 116, pp.198-201. 3. Ohta Y. Lee, J. B. Hayashi, K F ujita A., Park D. K, 2007. Invivo anti-influenza virus activity of animmun omodulatory acidicpolysaccharide isolated from Cordyceps militaris grow on germinated soybeans. Journal of Agricutural and Food Chemistry, 55 (25), 10194-10199.