Nghiên cứu một số biến đổi hình thái của sự phát sinh cơ quan in vitro của cây cọc rào (Jatropha curcas L.) từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá

i (Nguyễn Công Tạn, 2008). 1.1.3. Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học a b c d Ảnh 1.1: Cây Cọc rào (a) và một số bộ phận chính của cây (b – hoa; c – quả; d – hạt) Tổng quan tài liệu  Trang 6 Hình 1.1: Hình thái cây Jatropha curcas L. a - cành đang ra hoa; b - vỏ cây; c - gân lá; d - hoa có nhuỵ; e - hoa có nhị; f - mặt cắt ngang của quả xanh; g - quả; h - mặt cắt dọc của quả (Hình a, c và f từ Aponte năm 1978; Hình d và e từ Dehgan năm 1984) (Nguyễn Công Tạn, 2008) JCL là cây gỗ nhỏ, có thể cao đến 5 m. Cành xòe, có nhựa mủ, trên cành có những vết sẹo. Thân, vỏ, lá có nhựa nhớt, không màu. Lá mọc so le, hình trái xoan, hơi tròn, chia 5-7 thùy nông với chiều dài và rộng khỏang 6-15cm. Phiến lá dạng giấy lụa (Nguyễn Công Tạn, 2008). Cụm hoa tận cùng có màu vàng. Hoa đơn tính, cùng gốc, đôi khi có hoa lưỡng tính. Bộ nhị 10, xếp thành hai vòng riêng biệt, mỗi vòng 5, tạo thành cột đơn gần nhau. Bộ nhụy có 3 vòi nhụy, dính với nhau ở khỏang 2/3 chiều dài, phần trên rời nhau và núm nhụy rẽ đôi (Dehgan và Webster, 1979). Quả non hình trứng, lúc chín màu vàng, sau nâu xám, chứa hạt màu đen. Thông thường, có 5 rễ được tạo ra khi hạt nảy mầm, một rễ chính và 4 rễ phụ. Nếu trồng bằng phương pháp thông thường thì cây không có rễ cái (Nguyễn Công Tạn, 2008). Cây JCL ưa ánh sáng, ưa khí hậu ấm áp, chịu khô hạn, có thể sống trong môi trường có lượng mưa trung bình năm 520-2000 mm, nhiệt độ bình quân năm 11-28oC. Cây chịu được đất xấu, đất sỏi, đất đá vôi bạc màu... Cây JCL nảy chồi rất dễ, có thể Tổng quan tài liệu  Trang 7 giâm hom, nếu trồng bằng hạt, cây có rễ chính và rễ ngang, nếu giâm hom thì không có rễ chính. Nói chung, sau khi trồng 3 năm, cây cao 3 m. Với cây thực sinh, sau trồng 3-4 năm thì kết trái. Thời gian ra quả bình thường là 6-20 năm, ít thấy hiện tượng ra quả cách năm. Ra hoa từ tháng 3 đến giữa tháng 4, thời gian ra hoa kéo dài 4-5 tháng, chín vào tháng 8-9, quả khó rụng. 1.1.4. Các ưu điểm sinh học và giá trị của cây Cọc rào JCL là lòai cây mà hiện nay được các nhà khoa học đánh giá rất cao vì các ưu điểm sinh học và giá trị của cây. Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội Phát hiện quan trọng nhất từ JCL là lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel). Cây JCL có chu kỳ sống lâu có thể lên đến 50 năm, cho quả, hạt sớm, hàng năm năng suất có thể đạt đến 10 – 12 tấn/ha nếu trồng trên đất tốt và đầu tư cao (chăm sóc, bón phân, tưới tiêu,...), hàm lượng dầu trong hạt cao trung bình 32 – 35%. Đây là nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học rất tiềm năng để dần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt. Từ hạt JCL ép ra dầu thô, từ dầu thô tinh luyện được diesel sinh học và glycerin. Mặc dù diesel sinh học được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: cải dầu, hướng dương, dầu cọ, mỡ động vật,… nhưng sản xuất từ JCL có giá thành rẻ nhất và chất lượng tốt tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống. Nếu 1 ha JCL đạt năng suất 8 – 10 tấn hạt/ha/năm có thể sản xuất được 3 tấn diesel sinh học. Loại dầu này sẽ thay thế được một phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu được lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính, là loại dầu cháy hết và có ít lưu huỳnh, là loại dầu sạch, thân thiện với môi trường. Thị trường tiêu thụ sản phẩm diesel sinh học từ JCL được coi là vô hạn. Nhà khoa học Đức Klause Becker còn cho rằng ”JCL là cây trồng đầu tiên mà người dân làm ra không sợ không có đầu ra”. Đó là ưu thế nổi trội hàng đầu của sản xuất JCL khi cây này có vị thế là cây sản xuất hàng hóa lớn. Là cây lâu năm nhưng ngay trong năm trồng đầu tiên đã thu hoạch được sản phẩm là hạt. Tổng quan tài liệu  Trang 8 Hạt JCL sau khi ép dầu, hơn 30% là sản phẩm dầu, gần 70% là khô dầu, có hàm lượng protein khoảng 30%, dùng làm phân hữu cơ rất tốt, nếu khử hết độc tố có thể làm thức ăn gia súc cao đạm. JCL còn tạo ra hiệu ứng xã hội rất lớn. Do trồng ở các vùng miền núi nghèo, cây JCL sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập khả quan cho đồng bào các dân tộc; trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chưa tìm kiếm được bất cứ cây gì khả dĩ trồng được trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trường ổn định (Nguyễn Công Tạn, 2007). Ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường JCL là cây lâu năm, phủ đất rất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển được ở hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, gia súc không ăn. Vì vậy, cây JCL trồng trên các vùng đất dốc sẽ được coi là cây “lấp đầy” lỗ hổng sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực bì dày đặc chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì của đất. Không những vậy, JCL còn có thể trồng ở những vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần phục hồi hệ sinh thái các vùng này. Vì vậy, cây JCL được đánh giá là “vệ sĩ sinh thái”, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trường. Cây JCL được coi là loài cây thân thiện với môi trường bởi các lý do sau đây: 1) Chu kỳ sống dài (30 – 50 năm), khả năng cộng sinh với nấm rễ micorrhiza cao nên thích nghi sinh trưởng tốt trên những lập địa suy thoái, khô cằn và hoang hóa, do vậy cây có tác dụng cải tạo đất, cải tạo môi trường rất tốt; 2) Có thể thu hái quả hạt hàng năm, không phải đốn hạ cây, tạo ra thảm thực vật có độ che phủ ổn định, có khả năng hấp thụ CO2 lớn, vì vậy cây JCL cũng rất có ý nghĩa về bảo vệ môi trường không khí. Được sử dụng làm phân bón và thức ăn cho gia súc Sau khi ép dầu, bã khô dầu có hàm lượng N 4,14 – 4,78%, P2O5 0,50 – 0,66%, CaO 0,60 – 0,65%, MgO 0,17 – 0,21% được sử dụng làm phân hữu cơ rất tốt để bón cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp sạch, vừa góp phần sản xuất sản phẩm sạch, vừa nâng cao độ phì của đất. Trong chữa trị bệnh Trong thành phần cây JCL, đã phân tích được những hợp chất chủ yếu như tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid. Nhiều bộ phận của cây này có thể Tổng quan tài liệu  Trang 9 chữa bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu của hạt có thể nhuận tràng; dịch nhựa trắng tiết ra từ vết thương của cành có thể trị viêm lợi, làm lành vết thương, chữa trị bệnh trĩ và mụn cơm; nước sắc từ lá dùng để chữa bệnh phong thấp, đau răng,… Trong cây JCL có một số độc tố, nhất là phytotoxin (curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể cung cấp cho chúng ta một loại dược liệu mới. 1.2. Tình hình nghiên cứu, sử dụng, phát triển NLSH và biodiesel từ cây Cọc rào trên thế giới và Việt Nam 1.2.1. Thế giới Tháng 6/2003, Hội nghị thượng đỉnh EU về năng lượng đã kêu gọi cộng đồng EU tăng cường sử dụng bio-fuels, đến năm 2005 chiếm 2-3%, năm 2010 tăng lên 5,75% và năm 2020 là 20%. Tháng 8/2004, Hội nghị các nước Châu Á mở rộng tổ chức tại Băng Cốc Thái Lan đã ra tuyên bố 8 điểm về sự hợp tác chia sẻ kinh nghiệm cùng nhau phát triển NLSH dùng cho giao thông vận tải. Tại Hội nghị quốc tế về năng lượng do APEC tổ chức từ ngày 27-29/4/2005 tại Vancouver, Canada, NLSH (Biofuel) đã được chọn để sử dụng trong ngành năng lượng cũng như ngành giao thông vận tải của các nước APEC trong lộ trình sản xuất nhiên liệu thay thế dần cho xăng dầu khoáng. Việc nghiên cứu sử dụng NLSH giờ đã trở thành xu thế phát triển tất yếu ở nhiều quốc gia trên toàn cầu để thay thế dần xăng dầu khoáng trong các thập kỷ tới. Dự báo ở cuối thế kỷ 21, năng lượng tái tạo (mặt trời, gió, địa nhiệt, thuỷ điện nhỏ, nhiên liệu sinh học) sẽ chiếm trên 50% của năng lượng thương mại (Đặng Tùng, 2007). Để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đảm bảo an ninh năng lượng lâu dài và phát triển bền vững, nhiều quốc gia trong vòng 2 - 3 thập kỷ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng NLSH (xăng/diesel pha ethanol và diesel sinh học), thay thế một phần xăng, dầu khoáng, tiến tới xây dựng ngành “xăng dầu sạch” ở quốc gia mình. Hiện có khoảng 50 nước trên thế giới khai thác và sử dụng NLSH ở các mức độ khác nhau. Nhìn chung, các nước trên thế giới đi theo hai hướng phát triển NLSH: ethanol nhiên liệu, được sản Tổng quan tài liệu  Trang 10 xuất chủ yếu từ ngô (Mỹ), mía đường (Brazil), sắn (Thái Lan),... còn diesel sinh học sản xuất từ cải dầu, hướng dương (châu Âu), cọ dầu (Đông Nam Á), dầu mỡ phế thải, JCL, tảo,... Năm 2003 toàn thế giới đã sản xuất khoảng 38 tỷ lít ethanol thì đến năm 2005 đã sản xuất được 50 tỷ lít ethanol (trong đó 75% dùng làm NLSH) và dự kiến đến 2012 là khoảng 80 tỷ lít ethanol. Diesel sinh học nguồn gốc động thực vật được sản xuất năm 2005 đạt 4 triệu tấn và dự kiến đến năm 2010 sẽ tăng lên đến 20 triệu tấn. Tại châu Âu , nhiều công ty đã nghiên cứu sản xuất diesel sinh học từ dầu đậu nành, dầu hạt cải, dầu hướng dương. Các nước như Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Áo, Đan Mạch đã đầu tư rất nhiều vào các chương trình NLSH. Giáo sư Klause Becker ở Đại học Stuttgart đã nhận đơn đặt hàng của Tập đoàn ôtô Daimler Chrysler của Đức nghiên cứu về cây JCL. Giáo sư cho biết, cách đây 15 năm, ông là một trong những người đầu tiên ở châu Âu cùng với một hãng tư vấn của Áo đã tiến hành nghiên cứu cây JCL ở Nicaragoa. Loài cây này đã có cách đây 70 triệu năm nhưng chẳng được ai quan tâm. Sau khi có dự án của Daimler Chrysler, đã dấy lên cơn sốt JCL trên toàn thế giới. Dầu diesel sinh học từ JCL đã được sử dụng vào các loại xe thông thường. Dự báo đến năm 2030, xe ôtô trên toàn thế giới từ 500 triệu chiếc hiện nay lên 900 triệu chiếc, trong đó Trung Quốc có tới 190 triệu chiếc. Diesel sinh học từ JCL là loại dầu cháy một cách sạch sẽ và sạch hơn bất kỳ một loại chất đốt diesel nào khác. Cây JCL trồng được trên đất bị thoái hóa, sau 10 – 15 năm, có thể tái sử dụng diện tích này để trồng các loại cây khác vì cây JCL đã chặn đứng được tình trạng rửa trôi. GS. Klause Becker còn cho rằng: “ Ai có thể nói lên được những cái xấu, cái bất lợi của cây JCL, tôi xin thưởng tiền cho người đó. Các vị có thể vặn vẹo đủ thứ, lật ngược, lật xuôi, nhưng quả thật các vị không thể bới móc được điều gì xấu liên quan đến loại cây này” (Nguyễn Công Tạn, 2007). Về hiệu quả giảm ô nhiễm môi trường, theo ông Boon thoong Ungtrakul, phụ trách dự án sản xuất dầu diesel sinh học tại Chieng Mai, Thái Lan cho biết, nếu sử dụng B100 (100% diesel sinh học), lượng khí thải giảm 50% so với diesel truyền thống, còn B20 (20% diesel sinh học + 80% diesel truyền thống), lượng khí thải giảm 20%. Tổng quan tài liệu  Trang 11 Dầu diesel sinh học nói chung và dầu diesel sinh học từ hạt cây JCL nói riêng đã bắt đầu được sử dụng khá phổ biến ở các dạng B5, B10, B20, B30 và thậm chí B100 tại các nước như Đức, Anh, Tây Ban Nha, Mỹ, Ấn Độ, Brazil,… Đặc biệt Đức là nước đi đầu, dẫn đầu về thị phần sản xuất và sử dụng dầu diesel sinh học trên thế giới, chiếm 50%. Gần đây nhất tại Anh, tàu hỏa cao tốc đầu tiên trên thế giới chạy bằng diesel sinh học (B20) có tên Virgin Voyager đã được đưa vào hoạt động (thisisdorset.net. 2007). Hiệu quả kinh tế của cây JCL được đánh giá là khả quan. Ở Ấn Độ, trồng JCL trên vùng đất khô cằn, 1 cây cho 5 – 6 kg hạt, 1 ha trồng 2500 cây có thể đạt năng suất trên 10 tấn hạt/ha/năm. Với hàm lượng dầu của hạt 38%, thì 1 ha JCL có thể sản xuất được 4,5 tấn dầu/năm. Với giá bán hạt tính ra 2000 VND/kg thì giá trị thu được trên 1 ha đạt 20 triệu VND/năm. Ở Trung Quốc, doanh nghiệp ký hợp đồng mua hạt JCL của nông dân với giá 1,6 NDT/kg, tức khoảng 3500 VND/kg. Như vậy, với năng suất 10 tấn hạt/ha/năm thì 1 ha JCL đạt doanh thu tới 35 triệu VND/năm. Cây JCL trồng được trên mọi loại đất, kể cả vùng sa mạc nóng bỏng ở Ai Cập, JCL vẫn phát triển tốt. Ở các vùng đất dốc, đất nghèo kiệt, không trồng được các loại cây nông nghiệp khác, cây JCL vẫn phát triển tốt. Chu kỳ kinh tế của cây này là 30 – 50 năm. Cây JCL còn cho sản phẩm phụ là phân hữu cơ, thức ăn chăn nuôi giàu đạm (sau khi khử độc), làm dược liệu, nuôi tằm lá sồi (Nguyễn Công Tạn, 2007). Các nước nhiệt đới, á nhiệt đới đang phát triển mạnh cây JCL. Thái Lan hiện có 1600 ha JCL, dự kiến sẽ tăng lên 320 nghìn ha trong vài năm tới. Indonesia đặt mục tiêu đến năm 2010, nhiên liệu sinh học đáp ứng 20% nhu cầu năng lượng trong ngành điện và giao thông vận tải. Ở nước này, các loại đất màu mỡ đều dành để trồng cây Cọ dầu, còn cây JCL sẽ trồng trên các loại đất khô cằn nhưng mức đầu tư chỉ bằng 10% so với cây Cọ dầu. Nhà khoa học Robert Manurung, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học thuộc Viện Công nghệ Bandung cho biết, một số công ty nước ngoài đang xúc tiến dự án bao tiêu 1 triệu ha JCL với nông dân của 3 tỉnh Papua, Kalimantan và Nusa Tenggara. Mới đây, một công ty Hà Lan đã đặt mua 1 triệu tấn dầu JCL nguyên chất. Manurung và nhiều nhà nghiên cứu khác ở Indonesia dự báo rằng, JCL sẽ sớm soán ngôi cây Cọ dầu, trở thành nguồn năng lượng có khả năng thay thế nhiên liệu hóa thạch và dầu cọ, đồng thời có thể giúp nông dân nghèo ở các tỉnh Tổng quan tài liệu  Trang 12 miền đông quanh năm khô hạn có cơ hội làm giàu. Theo Ủy ban quốc gia về nghiên cứu phát triển NLSH từ cây JCL của Indonesia, Chính phủ nước này có kế hoạch dành ít nhất 5 triệu ha đồi trọc lập các đồn điền trồng JCL, mía đường và sắn để sản xuất các loại NLSH. Ấn Độ đã xác định JCL là cây cho hạt có dầu thích hợp nhất để sản xuất diesel sinh học. Từ năm 2001, nhiều bang ở Ấn Độ đã có chương trình khuyến khích trồng JCL trên quy mô lớn ở các vùng đất hoang hóa, được nhà nước hỗ trợ giống và các nguồn vật tư đầu vào nhằm tạo việc làm, xóa đói giảm nghèo, phát triển bền vững xã hội nông thôn Ấn Độ. Cơ quan kế hoạch của Chính phủ Ấn Độ đặt chỉ tiêu trồng 11 triệu ha cây JCL vào năm 2012 để có đủ nguyên liệu sản xuất diesel sinh học phối trộn theo tỷ lệ 20%. Trong tương lai, Ấn Độ tiếp tục mở rộng trồng JCL trên phạm vi cả nước, đưa diện tích trồng trên 33 triệu ha, trong số hơn 133 triệu ha đất đang bị bỏ hoang. Myanma là nước phát triển trồng JCL với tốc độ nhanh. Đến 2006, diện tích trồng JCL ở Myanma đã đạt 800.000 ha. Trung Quốc là nước quan tâm phát triển mạnh JCL trong vài năm gần đây, chủ yếu là 7 tỉnh gồm Tứ Xuyên, Quý Châu, Vân Nam, Phúc Kiến, Quảng Tây, Quảng Đông và đảo Hải Nam; trong đó, ở khu tự trị Quảng Tây, đến cuối năm 2007 đã trồng được 15 nghìn ha, dự định đưa lên khoảng 10 vạn ha trong vài năm tới. Các tỉnh khác có điều kiện đã có kế hoạch trồng JCL trên quy mô lớn trong mấy năm tới. Theo ước tính của Giáo sư Klause Becker, cho đến nay, cả thế giới đã trồng được khoảng 5 triệu ha JCL. Hiện nay, có khoảng 1000 nhóm nghiên cứu về diesel sinh học và JCL. Cho đến thời điểm này, JCL vẫn là một cây dại, mới được đưa vào đối tượng cây trồng được khoảng trên 15 năm, cũng có thể coi JCL là cây nông nghiệp trẻ nhất trong lịch sử trồng cây nông nghiệp của loài người. 1.2.2. Việt Nam Nhu cầu sử dụng năng lượng của Việt Nam ngày càng gia tăng nhanh chóng, tương thích với tốc độ phát triển kinh tế và sự phát triển dân số. Sản lượng năng lượng nước ta tiếp tục tăng cao. Năm 2005 đã tiêu thụ gần 27 triệu tấn dầu qui đổi, dự đoán tăng lên đến gần 37 triệu tấn vào năm 2010 và 51 triệu tấn vào năm 2020. Trong đó, ngành công nghiệp có tỷ lệ sử dụng năng lượng cao nhất chiếm 46%, vận tải chiếm Tổng quan tài liệu  Trang 13 35%, thương mại dịch vụ chiếm 12%, nông nghiệp chiếm 1% và các ngành khác chiếm 6%. Việt Nam là một nước được thiên nhiên ưu đãi, hội đủ các nguồn tài nguyên năng lượng. Tuy nhiên, khả năng khai thác, chế biến và sử dụng nguồn tài nguyên năng lượng còn hạn chế. Theo phân tích tình hình phát triển kinh tế và các nguồn cung cấp năng lượng, dự kiến trong thời gian tới (tính đến năm 2020) nước ta tiếp tục phải nhập khẩu các sản phẩm dầu mỏ, trong khi giá dầu luôn có áp lực rất lớn đến phát triển kinh tế (Thái Xuân Du, 2007). Để giải quyết vấn đề này, nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất NLSH đã được tiến hành: sản xuất diesel từ đậu tương, vừng, dầu phế thải; sản xuất ethanol từ mía, ngô, lúa, sắn,...Việc nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu sạch sử dụng cho giao thông vận tải đã được giao cho một số cơ quan như Petrolimex, Petro Việt Nam, Đại học kỹ thuật Đà Nẵng,... và đã có kết quả ứng dụng bước đầu đáng khích lệ. Trong năm 2007, đề tài “Nghiên cứu gây trồng phát triển cây Cọc rào (Jatropha curcas)” do Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện (2007 – 2010) đã thu thập được 8 xuất xứ hạt JCL và tuyển chọn được 29 cây trội với các đặc tính vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt (2,8-5,0 kg/năm) và hàm lượng dầu trong hạt (25 – 39%). Các vùng đã tiến hành khảo sát đánh giá là Đồng Nai, ĐăkLăk, Ninh Thuận, Bình Thuận và Phú Thọ. Các định hướng cho tiêu chuẩn lập địa, chọn đất gây trồng trước hết tập trung cho các vùng đất cằn cỗi, suy thoái, các vùng hoang hóa, đất cát khô hạn và thậm chí cả các vùng bãi thải ô nhiễm. Điều này sẽ đảm bảo là không cạnh tranh lấy mất đất canh tác nông nghiệp của dân, không ảnh hưởng tới vấn đề an toàn lương thực tại các vùng triển khai dự án. Ngược lại sẽ có tác động cải tạo môi trường đất đai, và mang lại nguồn thu nhập ổn định cho cộng đồng người nông dân thông qua việc gây trồng JCL. Với tập hợp 8 xuất xứ thu thập được và 29 cây trội tuyển chọn được trong năm 2007, đề tài đã xây dựng thiết lập vườn tập hợp các giống, cây trội và tiến hành khảo nghiệm các xuất xứ tại Đại Lải, Ninh Thuận và Phú Thọ. Các cây trội tuyển chọn rất có tiềm năng về năng suất hạt (2,8-5,0 kg/năm) và hàm lượng dầu béo. Trung tâm đã ký văn bản thỏa thuận hợp tác với Công ty Green Tổng quan tài liệu  Trang 14 Energy Vietnam (GEV) nhằm khảo nghiệm và thử nghiệm cây trội và ứng dụng ngay các giống mới triển vọng nhất vào các dự án đầu tư sản xuất vùng nguyên liệu hàng nghìn ha tại Ninh Thuận, Bình Định, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế và Quảng Trị. 1.3. Sự phát sinh hình thái thực vật 1.3.1. Định nghĩa Phát sinh hình thái thực vật là những phát triển của cơ thể thực vật: tế bào, mô, cơ quan theo thời gian, từ lúc khởi đầu cho đến khi trưởng thành để hoàn tất chu trình phát triển (Bùi Trang Việt, 2003). Phát sinh hình thái thực vật bao gồm các quá trình: - Phát sinh mô (Histogenesis) - Phát sinh cơ quan (Organogenesis) - Phát sinh phôi (Embryogenesis) Sự phát sinh hình thái thực vật thực chất là sự cử động của thực vật. Theo Nozéran (1920 – 1989) thì sự cử động xảy ra ở mọi mức độ tổ chức của thực vật. Sự cử động của thực vật trong tự nhiên bao gồm: cử động phát sinh chủng loài, cử động trong sự tiến hóa và phân hóa tạo nên sự đa hình của thực vật và cử động phát sinh hình thái. Sự phát sinh hình thái thực vật được kiểm soát bởi hai quá trình căn bản: - Điều hòa kéo dài tế bào - Kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào Sự tăng trưởng của thực vật chính là sự gia tăng không hoàn nghịch về kích thước hay trọng lượng qua hai quá trình phân chia tế bào và kéo dài tế bào. Sự phân chia tế bào thường xảy ra ở các mô phân sinh, còn sự kéo dài tế bào thường xảy ra theo trục dọc của cơ thể thực vật ở vùng nằm dưới mô phân sinh ngọn (Bùi Trang Việt, 2003). 1.3.2. Sự phát sinh cơ quan chồi và rễ 1.3.2.1. Sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi Mọi cơ quan thực vật đều có khả năng tái sinh các mô phân sinh ngọn chồi bởi sự phát sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp. Ở các cây hạt kín, nguồn gốc ngọn chồi có thể là tế bào biểu bì, mô giậu, mô khuyết hay vùng mô bao quanh mạch của mô cấy (Bùi Trang Việt, 2003). Tổng quan tài liệu  Trang 15 Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh của chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động. Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hòa thích hợp. Theo Buvat (1965, 1989), có hai giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hóa và giai đoạn tái phân hóa. Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lạp thể phân chia thành các bóng nhỏ). Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trước khi bắt đầu giai đoạn khử phân hóa: mất dần tinh bột dự trữ trong các lạp (như trong trường hợp tế bào nhu mô libe Daucus carota). Ngoài ra, cũng có thể tích lũy tinh bột dự trữ và một số chất khác, nhưng sự tích lũy như vậy có thể làm chậm sự tạo mô phân sinh (Bùi Trang Việt, 2003). Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Có sự phân chia không bào thành những không bào nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to. Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại trạng thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng qua hai bước: bước một, tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần dần trở về hình dạng đặc trưng; bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất,... ), chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu,... ) được tổng hợp. Sau đó, các tế bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà không qua sự phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2003). Trong tự nhiên, sự tạo mới chồi trực tiếp có thể xảy ra ở các rãnh răng cưa trên lá một số loài sống đời (Bryophyllum, Kalanchoe), từ mô phân sinh trong gân lá dương xỉ. Trong nuôi cấy in vitro, sự tạo mới chồi từ các tế bào lá đã phân hóa được phân biệt thành hai dạng: trực tiếp không qua giai đoạn tạo mô sẹo và gián tiếp thông qua mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2003). 1.3.2.2. Sự phát sinh cơ quan rễ Tổng quan tài liệu  Trang 16 Sự phát sinh cơ quan rễ từ chồi in vitro hay từ cành giâm (còn gọi là sự tạo rễ bất định) trải qua bốn giai đoạn phát triển: (1) sự hoạt hóa tế bào ở phần gốc cành giâm; (2) sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia tế bào hình thành nên khối mô phân sinh nhỏ (hay còn gọi là vùng phát sinh hình thái); (3) sự tổ chức của vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ (sơ khởi rễ); (4) sự tăng trưởng (hay kéo dài) của sơ khởi rễ (Bùi Trang Việt, 2003). Ở giai đoạn một, các tế bào ở phần gốc cành giâm (hay chồi in vitro) được hoạt hóa để trở lại trạng thái mô phân sinh. Đây cũng chính là giai đoạn khử phân hóa tế bào (tương tự như trong sự phát sinh chồi): lúc ban đầu, không bào còn to, lạp và ti thể phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống như tế bào mô phân sinh cấp hai; sau đó tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch nhân to ra. Sau giai đoạn hoạt hóa này, tế bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân sinh cấp một có khả năng sinh cơ quan. Qua giai đoạn hai, có sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia tế bào để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ (vùng phát sinh hình thái). Sự phân chia tế bào tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một. Rễ có thể phát sinh từ các mô nội sinh hay từ các mô bề mặt. Trong sự phát sinh rễ từ các mô nội sinh, quá trình trở lại trạng thái mô phân sinh cấp một thường xảy ra ở mô mạch hay nhu mô vỏ gần trụ trung tâm (như trường hợp ở cây ca cao, cây nho,... ) từ các tế bào thuộc bó libe-mộc hay tầng phát sinh libe-mộc. Rễ ngoại sinh thường xuất phát từ các mô ở bề mặt cơ quan (như ở các rãnh răng cưa nơi bìa lá một số loại sống đời... ). Sự phân chia tế bào trong trường hợp này xảy ra ở tầng dưới biểu bì hoặc ở vùng biểu bì. Kết quả của giai đoạn hai là hình thành nên khối mô phân sinh rễ hình cầu do các tế bào mô phân sinh cấp một sinh sản mạnh tạo ra. Tiếp theo là giai đoạn tổ chức vùng phát sinh hình thái để hình thành sơ khởi rễ và cuối cùng là sự kéo dài (tăng trưởng) của sơ khởi rễ. 1.3.3. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái Mở đầu cho các nghiên cứu về hormon thực vật được đánh dấu bằng các thí nghiệm của Darwin (1980) về hiệu ứng của ánh sáng trên sự cong của diệp tiêu Avena, và sự phát hiện của Went (1928) về vai trò kích thích kéo dài tế bào của auxin. Cho Tổng quan tài liệu  Trang 17 đến nay, các nhà sinh lý thực vật nhận thấy có năm nhóm hormon thực vật chính: auxin, giberelin, cytokinin, acid abscisic và ethylene (Bùi Trang Việt, 2000). Hormon (kích thích tố), là thuật ngữ do các nhà sinh lý động vật Bayliss và Starling gọi vào năm 1904. Dựa vào định nghĩa hormon động vật, ta có định nghĩa: ”hormon thực vật là một chất hữu cơ do tế bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác, ở đó với nồng độ rất thấp, chất ấy gây ra một phản ứng sinh lý” (Bùi Trang Việt, 2000). Người ta thường phân biệt hormon tăng trưởng thực vật, tức các sản phẩm thiên nhiên của thực vật, với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, bao gồm các hormon thực vật và các chất hữu cơ nhân tạo có hoạt tính điều hòa. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật không phải là các chất dinh dưỡng, các vitamin hay những nguyên tố khoáng thiết yếu cho thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.3.1. Auxin Người ta gọi auxin là một nhóm của những chất điều hòa sinh trưởng thiên nhiên hay tổng hợp bao gồm bản chất hóa học là IAA (indol-3-acetic acid) và những phức hợp hóa học hiện diện trong cấu trúc nhân hay một nhánh bên (Bùi Trang Việt, 2000). Auxin từ lâu đã được biết đến như là một chất điều hòa thiết yếu trong hầu như tất cả các quá trình phát triển của thực vật. Auxin thiên nhiên thường được sản xuất trong ngọn thân, trong mô phân sinh ngọn, được vận chuyển đến rễ và tích tụ trong rễ. Chúng đóng một vai trò quan trọng trong các đáp ứng của thực vật đối với các tín hiệu từ môi trường như ánh sáng, trọng lực; trong việc kiểm soát các mối tương quan ưu tính ngọn; trong sự tạo sơ khởi rễ... Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của auxin có vai trò trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000; Berleth và cs, 2001). Các nhà khoa học đã chứng minh rằng auxin được vận chuyển theo hướng gốc, được tích lũy ở phần gốc của khúc cắt thân hay trụ dưới lá mầm của cây cà chua hay anh đào, có vai trò cảm ứng quá trình hình thành rễ bất định. Nồng độ auxin cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi (Bùi Trang Việt, 2000). Trong thực tiễn, việc sử dụng chất ĐHSTTV auxin và những kết hợp của nó rất phức tạp. Nó không nói lên một nồng độ đặc biệt nào được sử dụng ở bất kỳ một Tổng quan tài liệu  Trang 18 trường hợp nào. Có thể thấy rằng, trong một quá trình sinh lý, các chất auxin có thể có những hiệu ứng khác nhau, thậm chí đối nghịch tùy theo nồng độ và cơ quan liên hệ (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.3.2. Cytokinin Cytokinin được sinh tổng hợp chủ yếu ở mô phân sinh ngọn rễ và được vận chuyển trong xylem đến chồi (Bùi Trang Việt, 2000; Kieber, 2002). Cytokinin hoạt động trong hầu hết các quá trình tăng trưởng và phát triển. Chúng kích thích sự phân chia tế bào, nhất là trong điều kiện có mặt auxin, tác động theo hai bước: phân nhân và phân bào, giúp cho sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Tỷ lệ cytokinin với auxin quyết định kiểu tái sinh cơ quan từ mô sẹo chưa phân hóa in vitro: mô sẹo được đặt trong môi trường có tỷ lệ cytokinin / auxin cao thường tạo nhiều chồi và ít rễ, trong khi đó mô sẹo được đặt trong môi trường có tỷ lệ cytokinin / auxin thấp thường tạo ít chồi và nhiều rễ; một tỷ lệ cân bằng giữa hai chất điều hòa trên sẽ chỉ tạo nên khối mô sẹo không phân hóa (Mok và cs, 1994). Cytokinin cũng có tác dụng làm chậm quá trình lão suy. Cytokinin có thể cảm ứng sự biểu hiện các gen được điều hòa bởi ánh sáng (Chen và cs, 1993; Crowell và cs, 1994), và các cây mầm bị hoàng hóa nếu được tăng trưởng trong điều kiện có sự hiện diện của cytokinin sẽ có kiểu hình giống như cây mầm tăng trưởng dưới ánh sáng (Chory và cs, 1994). Một số nghiên cứu cho thấy cytokinin cũng có ảnh hưởng đến mối quan hệ ”sink / source”, sự nảy mầm, sự thành lập mô mạch và sự gia tăng kích thước lá mầm ở nhiều loài thực vật (Mok và cs, 1994). Vai trò của TDZ TDZ – thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5’-ylurea), được công bố lần đầu tiên như là một chất có khả năng làm rụng lá gòn, là một dẫn xuất của urea có hoạt tính tương tự như cytokinin (Eapen và cs, 1998; Mok và cs, 1982), cảm ứng sự tăng sinh chồi, tái sinh chồi bất định từ mô lá của một số loài cây thân gỗ và cảm ứng cho quá trình phát sinh phôi thể hệ. Các nhà khoa học cho rằng TDZ có thể kích thích quá trình chuyển đổi dạng nucleotide của cytokinin sang dạng nucleoside có hoạt tính sinh học hơn và kích thích sự tích lũy các cytokinin nội sinh dạng purin (Thomas và cs, 1986). Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), TDZ rất dễ kháng với các cytokinin adenin và vì vậy được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô. TDZ được sử dụng một mình hay kết Tổng quan tài liệu  Trang 19 hợp với NAA có thể cảm ứng sự phát sinh cơ quan hay sự phát sinh phôi thể hệ ở rất nhiều loài (Babaoglu và cs, 2000; Lu Chin-Yi, 1993; Hosokawa và cs, 1998; Magioli và cs, 1998). 1.3.3.3. Giberelin Giberelin là chất ĐHSTTV được tìm thấy lần đầu tiên trong nấm gây bệnh von lúa (nấm Gibberella fujikuroi). Sau đó được tìm thấy ở nhiều loài thực vật. Trong tế bào thực vật, giberelin có thể liên kết với các chất đường, nhất là trong các hạt (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Giberelin có vai trò điều hòa sự kéo dài tế bào và phân chia tế bào thân, dẫn đến kích thích sự kéo dài lóng. Tuy nhiên, giberelin không ảnh hưởng trên các khúc cắt thân cô lập (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Dẫn xuất được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy in vitro là GA3, nhằm giúp cho sự tăng trưởng của cây con trong ống nghiệm. Ngoài ra, GA3 còn có khả năng thúc đẩy sự phát triển của phôi soma. Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì. Ở nồng độ cao, nó kích thích mạnh sự tăng trưởng lá. Thông thường, giberelin làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích dù hai chất này hoạt động độc lập (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.3.4. Acid abcisic Acid abcisic (ABA) được xem là chất có hoạt tính đối kháng với giberelin. Chúng hiện diện nhiều trong diệp lạp, trong cytosol, không bào và apolast. ABA ức chế sự phân chia tế bào dẫn đến cản sự tăng trưởng, đóng khí khẩu, thúc đẩy sự rụng và lão suy (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). ABA kìm hãm sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hạt, làm chậm sự kéo dài lóng, cản sự tăng trưởng của diệp tiêu và các mô cấy. Tuy nhiên, ABA lại có hoạt tính (chưa rõ nét) trong sự sinh phôi và trưởng thành của hạt (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.3.5. Ethylene Ethylene thường được tổng hợp nhiều ở mô thực vật khi đáp ứng với các stress hay vết thương, cảm ứng sự thành lập và phát triển rễ bất định ở các khúc cắt thân, lá… Áp dụng các chất ức chế quá trình sinh tổng hợp ethylene và cản sự thu nhận ethylene sẽ làm giảm số rễ bất định trên khúc cắt thân cây hướng dương và đậu, các khúc cắt cây cà chua mang đột biến không nhạy cảm với ethylene tạo ít rễ bất định hơn Tổng quan tài liệu  Trang 20 so với loài hoang dại (Kuroha và cs, 2002). Ngoài ra, ethylene còn có vai trò trong việc kiểm soát sự chín trái có climac (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Một số mô cấy có thể sản sinh ra khí ethylene gây ức chế sự tăng trưởng và phát triển của mô cấy. 1.3.4. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái thực vật 1.3.4.1. Tuổi và kích thước mô cấy Tiềm năng phát sinh hình thái của mô cấy khác nhau phụ thuộc vào tuổi của lá. Các lá non Echeveria elegans (họ Crassulaceae) tăng trưởng rễ in vitro sớm hơn tạo chồi, trong khi đó hiện tượng ngược lại xảy ra ở các lá già hơn (Narayanaswamy, 1994). Các lá của cây in vitro Passiflora edulis hai tháng tuổi có khả năng tái sinh chồi cao hơn những lá từ các cây già hơn (Beccerra và cs, 2004). Khả năng tái sinh chồi cũng phụ thuộc vào kích thước mô cấy lá. Những mô cấy (thậm chí cả mô sẹo) quá nhỏ không thể đáp ứng với điều kiện nuôi cấy và thường bị hóa nâu. Các mảnh lá Solanum laciniatum có đường kính nhỏ hơn 2 mm không sống được, trong khi đó những mô cấy có đường kính 5 – 10 mm thì có khả năng phát triển như nhau (Narayanaswamy, 1994). Trong sự tái sinh chồi từ lá lan, các mô cấy là những mảnh lá dài 0,5 cm phát sinh chồi nhiều hơn so với những lá nguyên dài 1,5 cm (Chen và cs, 2004). 1.3.4.2. Ánh sáng Trong sự tái sinh chồi in vitro từ lá cây lê hoang dại, quá trình nuôi cấy được chia làm hai giai đoạn: giai đoạn một (30 ngày) trong tối và giai đoạn hai ngoài sáng đã làm gia tăng số chồi được tái sinh (Caboni và cs, 1999). Điều kiện tối cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào lá để tạo mô sẹo và giai đoạn sáng là giai đoạn biểu hiện (tái phân hóa) để tái sinh chồi. 1.3.4.3. Nguồn đạm trong môi trường nuôi cấy Người ta thấy rằng môi trường nuôi cấy có chứa một hàm lượng NH4+ và tỷ lệ NH4+ : NO3 thấp cho hiệu quả tốt trong sự tái sinh chồi. 1.3.4.4. Sự cấy chuyền Một số mô sẹo vẫn duy trì khả năng phát sinh cơ quan một thời gian dài sau vài lần cấy chuyền (Caboni và cs, 1999; Narayanaswamy, 1994). Số lượng cây con sẽ gia tăng sau nhiều lần cấy chuyền cơ quan hay mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2000). Tuy nhiên, Tổng quan tài liệu  Trang 21 sự cấy chuyền nhiều lần trong thời gian dài cũng làm giảm tiềm năng phát sinh hình thái, được cho là có liên quan đến tính đa dạng di truyền trong quần thể tế bào. Hay điều này còn có thể do sự tích lũy một vài chất có tác dụng ức chế khả năng phát sinh hình thái trong mô cấy. Sự mất đi tiềm năng phát sinh cơ quan cũng có thể là kết quả của sự biến dị biểu sinh trong tế bào được nuôi cấy. Khả năng cảm ứng chồi bị giảm ở một số loài, như trong mô sẹo cây thuốc lá, do sự cấy chuyền trên môi trường cảm ứng tạo chồi (Narayanaswamy, 1994). 1.4. Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu tái sinh, nhân giống thực vật 1.4.1. Khái niệm lớp mỏng tế bào Khi nghiên cứu về hệ thống ức chế, GS. K. Trần Thanh Vân nghĩ đến khái niệm về hệ thống lớp mỏng tế bào (Tran Thanh Van, 2003). Với hệ thống này, GS. K. Trần Thanh Vân cố gắng phân tách một hoặc một vài lớp trong những tế bào đã biệt hóa từ một hệ thống cơ quan, mô, hoặc tế bào; và cố gắng chương trình hóa lại chúng trong nuôi cấy in vitro; trong đó “biệt hóa” là một tiêu chí quan trọng. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu lần theo dấu vết trở lại những sự kiện tại mỗi thời điểm bắt đầu. Không phải như trường hợp chuyển nhân của một tế bào sinh dưỡng vào một tế bào trứng không nhân như trường hợp sinh sản vô tính của cừu Dolly, những tế bào trong hệ thống lớp mỏng tế bào vẫn giữ trạng thái nguyên nhân của nó trong tế bào chất và vẫn được chương trình hóa lại một cách đồng loạt để biểu hiện tất cả các trường hợp có thể có của quá trình biệt hóa, mà không chỉ có phôi mới làm được điều đó. Tất cả các quá trình biệt hóa đó được kiểm soát một cách riêng biệt hoặc tái chương trình hóa theo trình tự thời gian hoặc không gian tùy theo người nghiên cứu và không bị áp đặt bởi quá trình phát triển cá thể (Dương Tấn Nhựt, 2006). 1.4.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào Hệ thống lớp mỏng tế bào – TCL (Thin Cell Layer) chứa những mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt ra từ các cơ quan thực vật khác nhau (chồi, lá, rễ, cụm hoa, đế hoa, hoặc các cơ quan của hoa, lá mầm, trụ trên hay trụ dưới lá mầm, vùng chồi đỉnh hoặc phôi). Chúng được cắt theo chiều dọc – được gọi là lTCL hoặc ngược lại, theo chiều ngang – được gọi là tTCL. Dạng lTCL (kích thước 1mm x 5 - 10mm) chỉ bao gồm một loại tế bào, ví dụ một lớp các tế bào biểu mô có thể tách ra từ một số cơ quan Tổng quan tài liệu  Trang 22 hoặc vài lớp (3 – 6 lớp) từ các tế bào vỏ; trong khi đó, dạng tTCL (kích thước 0,2 - 0,5mm hay vài mm bề dày) bao gồm một số lượng nhỏ các dạng tế bào từ các mô khác nhau (biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mô mạch cũng như nhu mô). Một đặc tính phổ biến của lTCL và tTCL là tính mỏng, có nghĩa là mảnh cấy có số lượng tế bào càng ít càng tốt. Đặc tính “mỏng” đóng vai trò cực kỳ quan trọng bởi những phân tử marker chuẩn bị cho sự biệt hóa có thể được xác định in situ trong những tế bào đích (hay tế bào đáp ứng). Sự xác định vị trí như vậy cho phép giới hạn những tế bào đáp ứng (Tran Thanh Van, 2003; Dương Tấn Nhựt, 2006). Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ quan. Các chương trình biệt hóa có thể thay đổi từ việc thay đổi mối tương quan giữa cơ quan và mô cấy với kích thước của chúng khi nuôi trên môi trường có cùng tính chất. Phương pháp cắt dọc (lTCL) được dùng phổ biến hơn và các dạng phát sinh hình thái mong muốn có thể được tạo ra qua việc điều khiển mức độ của các nhân tố ngọai sinh (Dương Tấn Nhựt, 2006). 1.4.3. Những đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào Một phổ rộng các chương trình phát sinh hình thái có thể phát sinh từ những tế bào hợp tử biệt hóa. Đây là đặc tính chính của hệ thống TCL. Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp TCL là đồng nhất về sinh lý di truyền và có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật. Tuy nhiên, điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL phụ thuộc vào lòai và đòi hỏi chúng ta phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện nuôi cấy in vitro như: các chất ĐHSTTV, chất dinh dưỡng, ánh sáng, sự thẩm thấu, nhiệt độ,... (Tran Thanh Van, 1981). Những kỹ thuật sinh học phân tử, sinh hóa và sinh lý đã cho phép các nhà khoa học xác định và phân lập các gen mang đặc tính mới. Chúng ta cố gắng thiết lập mô hình hệ thống TCL trong đó tất cả những tế bào đích (tế bào đáp ứng) đều thích nghi và tiếp xúc tốt nhất với các nhân tố và thành phần môi trường xác định, ít nhất là trong môi trường nuôi cấy. Có hai vấn đề cần được giải quyết trong nuôi cấy mô thực vật. Đó là việc xác định vị trí của các tế bào đích và quan sát sự thay đổi của mảnh (mẫu) cấy. Đặc tính ”mỏng” giúp chúng ta giải quyết hai vấn đề đó. Tổng quan tài liệu  Trang 23 Bằng cách sử dụng các marker của quá trình biệt hóa, chúng ta có thể xác định vị trí của các tế bào đích/tế bào đáp ứng. Chúng ta cũng có thể quan sát sự thay đổi của mảnh cấy mà không cần phải phá vỡ mảnh cấy bằng cách sử dụng kính hiển vi xuyên thấu. Vì quá trình sinh tổng hợp, chuyển hóa, vận chuyển, điều hòa và vị trí của auxin, ABA, ethylene, cytokinin rất phức tạp nên những tế bào đáp ứng của hệ thống TCL có thể được sử dụng làm các marker để nghiên cứu các quá trình này (Dương Tấn Nhựt, 2006). Trong hệ thống TCL, các yếu tố nội sinh thường không lớn và quá trình vận chuyển ít phức tạp hơn so với khi sử dụng các mẫu cấy lớn. Tế bào đích/tế bào đáp ứng thường tiếp xúc với các tế bào bị thương do cắt ra khỏi cơ quan thông qua những mảnh thành tế bào hoặc oligosaccharide, một dạng của oligogalacturonide. Người ta thấy rằng dưới tác động của một số enzym thủy phân, các ảnh hưởng của oligosaccharide thường có hoặc không kết hợp với các nhân tố sinh trưởng trong quá trình biệt hóa, trong đó có sự hình thành rễ. Hệ thống TCL có khoảng thời gian cho sự phát sinh hình thái tương đối ngắn (khoảng 14 ngày từ khi bắt đầu nuôi cấy), tần số phát sinh cao (100% hoặc gần 100%), tỷ lệ giữa tế bào đáp ứng với tổng số tế bào hiện diện trong TCL cao. Ví dụ: trong một mẫu lTCL của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) được cắt ra khỏi cuống hoa có 3 – 6 lớp tế bào vỏ. Các cơ quan được biệt hóa mới mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo, trực tiếp nằm trên bề mặt của TCL gồm: 50 hoa trong môi trường tạo hoa; 500 – 700 chồi trong môi trường tạo chồi; 15 – 20 rễ trong môi trường tạo rễ. Lúc đầu, người ta giả thuyết rằng sự biệt hóa hoa có thể là do một giai đoạn sinh lý đặc biệt của cơ quan cho, là cuống hoa. Tuy nhiên, sự biệt hóa của chồi và rễ cũng hình thành những giai đoạn sinh lý tương tự. Như vậy, giả thuyết trên không còn đúng nữa. Người ta thấy rằng lượng RNA cần cho sự cảm ứng ra hoa trong lTCL không được biểu hiện ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy. Các quá trình hình thành cơ quan thường là do cảm ứng, trong đó có sự tạo hoa. Có nghĩa là nhân của những tế bào biệt hóa trong chính môi trường tế bào chất của nó được chương trình hóa trở lại. Tổng quan tài liệu  Trang 24 Sự hình thành phôi và cơ quan ở tần số cao, thời gian ngắn và trực tiếp cũng đã được chứng minh trên một số loài khác như: Populus (hiệu quả hơn 25 lần khi sử dụng mảnh cấy 0,4 – 0,5mm so với mảnh cấy 1mm); Garcinia mangostana (hiệu quả hơn 50 lần khi sử dụng phương pháp tTCL với mảnh cấy 3mm so với mảnh cấy là 1/2 lá); Aranda deborah; Heliconia; Rhynchostylis gigantean; Lilium longiflorum; Brassica napus; Panax ginseng;… (Dương Tấn Nhựt, 2006). 1.4.4. Nhân giống in vitro và phát sinh hình thái cây thân gỗ bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngành công nghiệp cây rừng cũng phát triển mạnh mẽ. Điều đó có được chính là nhờ những tiến bộ trong công nghệ gen, công nghệ tế bào đã được nhanh chóng áp dụng vào thực tiễn sản xuất. Hiện nay, hơn 116 cây biến đổi gen đang được thử nghiệm trên toàn thế giới là một sự gia tăng đáng kể từ năm 1995, do ban đầu chỉ được sự bảo trợ của chính quyền và giới khoa học ở Hoa Kỳ và châu Âu, nhưng sau đó được đảm nhận bởi các khu vực tư nhân ở châu Mỹ, châu Phi và Đông Nam Á. Các cây biến đổi gen đã được trồng ở Indonesia, Chile, Brazil và cả Trung Quốc. Cây gỗ và các loài thân gỗ khác là một nguồn cung cấp gỗ, nhựa, trái cây, các hợp chất thứ cấp, tinh dầu,…; quan trọng hơn, chúng còn có nhiều giá trị về trồng trọt và trang trí. Những loài khác như cây khoai mì cùng nằm trong nhóm các cây lương thực với lúa và khoai tây, đây là những cây lương thực chính trên khắp thế giới. Những cây này cũng đóng vai trò quan trọng trong chiến lược chống lại xói mòn, ô nhiễm và làm ấm toàn cầu (Dương Tấn Nhựt, 2006). Trước đây, việc nhân giống cây thân gỗ chủ yếu dựa vào kỹ thuật cắt cành, còn kỹ thuật nuôi cấy in vitro vẫn luôn gặp nhiều khó khăn. Khó khăn trong kiểm soát môi trường và các nhân tố dinh dưỡng in vitro được xem là do “tính ngoan cố” được điều khiển bởi kiểu di truyền, cộng với tốc độ tăng trưởng chậm đã làm cho các quá trình như chọn lọc cây chuyển gen làm nguyên liệu trở nên phức tạp. Tuy nhiên, kỹ thuật TCL ra đời đã chứng tỏ đây là một hệ thống ưu việt trong việc cảm ứng sự hình thành cơ quan in vitro của các loài cây thân gỗ như cây tre, cây khoai mì, cây thông, cây hông, cây dương, hoa hồng. Kỹ thuật TCL phá vỡ những khái niệm trước đây về sự hạn chế vi nhân giống hay “tính ngoan cố”. Bởi vì các cây rừng và cây thân gỗ có một chu trình sống dài nên việc cảm ứng phát sinh phôi sinh dưỡng có ý nghĩa to lớn trong Tổng quan tài liệu  Trang 25 việc áp dụng thương mại cho lĩnh vực lâm nghiệp, cung cấp các cây đồng nhất di truyền, loại trừ biến dị dòng sinh dưỡng, giảm được các rủi ro. Điều này có một tiềm năng to lớn, đặc biệt khi công nghệ di truyền hướng đến cải tiến chất lượng như bổ sung chất gỗ, làm tăng tốc độ tăng trưởng, tính kháng thuốc trừ cỏ, kháng côn trùng, tính đồng nhất của sản phẩm và sự cô lập carbon (Dương Tấn Nhựt, 2006). 1.5. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây Cọc rào Nhằm đáp ứng nhu cầu to lớn của thị trường, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro, tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh chồi của chúng. Để tái sinh chồi JCL, lá, các đốt thân và hạt thường được sử dụng để làm vật liệu ban đầu. Hầu hết các thí nghiệm đều sử dụng môi trường cơ bản MS (Murashige and Skoog 1962) có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin và cytokinin, riêng lẻ hoặc phối hợp. Nguồn auxin có thể là IBA, NAA hoặc IAA, và nguồn cytokinin chủ yếu gồm BA, TDZ và kinetin. Auxin và cytokinin rất cần cho sự tạo mới chồi in vitro từ lá JCL. Tuy nhiên, tùy theo bản chất, nồng độ và tỷ lệ kết hợp giữa chúng đã cho những kết quả khác nhau. Năm 1995, Sujatha và cs tiến hành nuôi cấy trụ thượng diệp, cuống lá và mảnh lá. Các cây con được trồng trong vermiculite vô trùng ở 26-28oC dưới ánh sáng (30 μmol/m2/s), sử dụng ánh sáng huỳnh quang trắng, mát. Các mẫu trụ thượng diệp được cắt từ các cây 2 tuần tuổi. Cuống lá được lấy từ các lá ở đốt 4 và 5 và các lá được cắt từ đốt 3 và 4 tính từ ngọn của những nhánh cây 2 năm tuổi. Kết quả cho thấy: (1) môi trường được bổ sung BA kết hợp IBA cho tần số tái sinh từ trụ thượng diệp và cuống lá cao hơn so với bổ sung zeatin hoặc kinetin; (2) lá thứ 3 có khả năng tái sinh cao hơn lá thứ 4; (3) tạo chồi bất định trực tiếp trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l IBA với cả ba loại mẫu; (4) tái sinh qua trung gian mô sẹo đối với trụ thượng diệp đạt hiệu quả trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA, đối với cuống lá là MS + 0,1 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA, và với mẫu lá là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA; (5) MS không có chất điều hòa sinh trưởng là môi trường thích hợp cho sự tạo rễ. Năm 2004, Sujatha và các cs đã tiến hành nuôi cấy các đốt thân và mảnh lá của lá 3-4 tính từ ngọn được cắt từ cây JCL 3 tháng tuổi. Sự thích hợp của môi trường BA- IBA cho sự tái sinh chồi bất định từ lá của JCL trước đây cũng đã được báo cáo Tổng quan tài liệu  Trang 26 (Sujatha và Mukta 1996; Prabakaran và Sujatha 1999; Sujatha và Prabakaran 2003) nhưng các nồng độ cho hiệu quả tối ưu trên sự tái sinh chồi là khác nhau, tùy theo kiểu gen. Môi trường chính cho sự tái sinh chồi bất định từ các mảnh lá của cây JCL là môi trường MS được bổ sung BA (1,0-10,0 mg/l) và 1,0 mg/l IBA, và môi trường nuôi cấy phụ được bổ sung chỉ 0,5 mg/l BA hoặc 1,0-2,0 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l IBA. Các chồi được tạo rễ trong môi trường MS1/2 bổ sung 5,4 μM NAA. pH của môi trường được điều chỉnh về 5,6 ± 0,1, hấp ở 104 kPa và 120oC trong 20 phút. Các mẫu cấy được đặt trong điều kiện 26 ± 2oC với 16h/8h sáng/tối, sử dụng ánh sáng huỳnh quang trắng, mát (30 μmol/m2/s). Kết quả nuôi cấy các mẫu đốt trên môi trường được bổ sung ba loại cytokinin ở các nồng độ khác nhau đã dẫn đến những đáp ứng khác nhau. Sau 1 tháng, ở môi trường chính, số cụm chồi nhú lên chỉ là 1-3 cụm. Các đốt được nuôi cấy trên môi trường với Kn cho thấy không có dấu hiệu đáng kể nào về sự biệt hóa mẫu ngoại trừ sự xuất hiện chồi với sự nhân rất ít và kéo dài chồi đã có sẵn thành một chồi đơn. Tuy nhiên, trong trường hợp môi trường được bổ sung 5,0 mg/l Kn, số chồi/mẫu đạt 2-4, với số chồi trung bình/mẫu đốt là 3,3. Chiều dài của chồi đã tăng lên cùng với sự gia tăng nồng độ Kn. Môi trường được bổ sung BA kích thích sự phát triển của các mô sẹo trắng hơi xanh lục tại phần chân với các chồi đã biệt hóa tốt từ chồi bên. Chiều dài chồi giảm khi tăng nồng độ BA. Những khác biệt đáng kể đã được thấy rất rõ ở các nuôi cấy phụ các mẫu đốt được nuôi cấy ở các nồng độ cytokinin khác nhau (BA 1,0-2,0 mg/l). Trên môi trường được bổ sung 1,0 mg/l BA, sự nhân chồi chỉ hiệu quả với những mẫu được chuyển từ môi trường có TDZ và BA, trong khi với môi trường có Kn lại không hiệu quả. Số chồi/mẫu đạt tối đa (4,0) ở các đốt được chuyển từ 1,0 mg/l BA. Các mẫu đốt cho thấy đáp ứng tích cực khi cấy chuyền sang môi trường có 2,0 mg/l BA và hệ số nhân đạt cao hơn so với 1,0 mg/l BA. Tần số tái sinh chồi đạt tối đa (10-12,3 chồi/đốt) ở các đốt được nuôi cấy ban đầu trên môi trường có bổ sung 0,5-1,0 mg/l TDZ. Các mẫu đốt được chuyển sang từ môi trường bổ sung BA và Kn tạo các chồi từ các nách, trong khi các mẫu đốt được chuyển sang từ môi trường có TDZ đã biệt hóa các chồi một cách trực tiếp mà không cần qua trung gian bất kỳ một mô sẹo nào. Những đốt được nuôi cấy phụ từ môi trường bổ sung TDZ tiếp tục được nuôi cấy Tổng quan tài liệu  Trang 27 phụ lên đến lần thứ ba và tiếp tục tạo ra những chồi mới. Việc nuôi cấy các chồi bên trong 12 tuần bao gồm 4 lần nuôi cấy phụ, đã tạo ra 4, 10 và 24 chồi trên mỗi đốt từ các mẫu được nuôi cấy ban đầu trên các môi trường có Kn, BA và TDZ, theo thứ tự. Trong trường hợp của JCL, TDZ tỏ ra hiệu quả hơn BA trong việc tái sinh chồi từ các nách. Đáp ứng mang tính biệt hóa của hai hệ thống cytokinin này có lẽ là kết quả của sự tương tác tương quan giữa kiểu mô và nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh (George 1993). Kết quả tái sinh chồi bất định ở các mẫu lá cho thấy các mô sẹo trắng hoặc trắng hơi xanh lục đã phát triển tại phần rìa cắt. Các chồi bất định phát sinh trực tiếp từ vùng bên cạnh mô sẹo được cảm ứng. Các chồi (3-11 chồi/mẫu) được quan sát trong 3 tuần đầu nuôi cấy. Đối với môi trường chính, tần số tái sinh chồi tối đa được ghi nhận ở môi trường được bổ sung 5,0 mg/l BA (+ 1,0 mg/l IBA). Nuôi cấy phụ các mẫu lá được thực hiện trên các môi trường được bổ sung 0,5 mg/l BA hoặc 1,0-2,0 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA đã dẫn đến sự biệt hóa của chồi. Trong các loại môi trường này, môi trường được bổ sung cả BA và IBA cho tần số tái sinh chồi cao hơn. Tần số tái sinh đạt tối đa (80-90%) với các mẫu lá được nuôi cấy ban đầu trên môi trường có 2,0 hoặc 10,0 mg/l BA kết hợp với 1,0 mg/l IBA và được chuyển sang môi trường có 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA. Nếu không kể đến môi trường chính thì các mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường có 2,0 mg/l BA và 1,0 mg/l IBA cho tần số tái sinh cao nhất trong tất cả môi trường nuôi cấy phụ.