Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ

ằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu. Dịch nổ hơi có màu vàng, đó là do xylan. Xylan là các olygomer của xylose, tạo thành từ quá trình thủy phân hemicellulose. Trong dịch nổ hơi có chứa các acid: acid oxalic, acid acetic, acid citric. Cụ thể là pH của dịch nổ hơi cho thấy môi trường acid yếu, pH=4,9. Trong thiết bị nổ hơi, nhiệt độ và áp suất cao, nước sẽ thủy phân các nhóm acetyl trong hemicellulose để tạo các acid gây ra môi trường acid trong toàn khối nguyên liệu. Môi trường acid lại thúc đẩy việc thủy phân của hemicellulose vì polysaccharide này không bền trong môi trường acid ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao. Ngoài ra dịch nổ hơi còn có các đường: cellobiose, mannose, arabinose, xylose. Các đường này tạo thành là do hemicellulose và cellulose bị thủy phân trong quá trình nổ hơi. Sự giảm khối lượng của cellulose, hemicellulose và sự tạo thành của các đường 5, đường 6 trong dịch nổ hơi chứng minh cho những điều trình bày trên. Ngoài ra, quá trình nổ hơi còn tạo thành fufural và hydoxymethyl fufural tương ứng từ xylose và glucose. Đây là một nhược điểm của quá trình nổ hơi vì fufural và hydroxymethyl fufural gây ức chế hoạt động của nấm men. Khi nhiệt độ và áp suất tăng, khả năng tạo thành fufural và hydroxylmethyl fufural cũng tăng. Các peak hydroxymethyl fufura và fufural lần lượt xuất hiện tại 20,422 và 30,412 (Theo giáo sư Mochidzuki – Đại học Tokyo). TÓM LẠI: trong quá trình tiền xử lý nổ hơi - Hemicellulose bị phân hủy mạnh, tạo cấu trúc xốp cho xơ sợi. Đồng thời tạo các acid, đường, fufural và các dẫn xuất của fufural. 75 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN - Cellulose cũng bị phân hủy nhưng với một lượng ít, cấu trúc cellulose trở nên xốp hơn và dễ bị tấn công bởi enzyme hơn. - Lignin bị phá vỡ cấu trúc, cắt nhỏ mạch, đồng thời một phần bị kết tụ lại, làm giảm bớt tác dụng bao bọc cellulose, thuận lợi hơn co sự tấn công của enzyme. 4.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN Rơm sau nổ hơi được xác định hàm ẩm và tiến hành thủy phân. Đối với quá trình thủy phân, 3 yếu tố xác định hiệu quả của quá trình là: nồng độ glucose, hiệu suất tạo thành glucose và tốc độ phản ứng ban đầu. Nồng độ glucose tạo thành và hiệu suất lớn nhất là 2 yếu tố chính để so sánh hiệu quả thủy phân của các điều kiện khác nhau, tốc độ phản ứng ban đầu là yếu tố phụ. 4.2.1 Thành phần dịch thủy phân Dịch thủy phân được lọc qua phễu lọc và đem đi phân tích HPLC. Kết quả được trình bày ở bảng sau Bảng 4-6 Thành phần dịch thủy phân STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NHẬN XÉT  Thời gian lưu (phút) 5,394 5,919 6,316 7,526 8,043 8,678 10,964  Chất acid oxalic Cellobiose Glucose Xylose Arabinose Acid acetic  Thời gian lưu chất chuẩn (phút) 5,984 6,506 7,558 7,993 8,525 11,108 Kết quả HPLC cho thấy, dịch thủy phân gồm 9 thành phần (với nồng độ đủ lớn để có thể nhận ra nhờ máy HPLC). Trong đó có 6 chất là có thể giải đoán được. Quá trình thủy phân cellulose sẽ tạo ra cellobiose và glucose. Phản ứng thủy phân hemicellulose sẽ tạo ra xylose và arabinose. Vì acid acetic được sử dụng làm chất đệm cho dịch thủy phân 76 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN nên trong kết quả phân tích có xuất hiện acid acetic. Điều này cho thấy enzyme cellulase thủy phân được cả cellulose và hemicellulose. 4.2.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của lượng bã rắn cho vào lên quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 50oC; pH: 4,8; % enzyme: 5%. Lượng bã rắn cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Kết quả trình bày trong bảng sau Bảng 4-7 Kết quả ảnh hưởng của phần trăm bã rắn STT  % bã rắn Nồng độ đường(g/l) Nồng độ cellobiose (g/l) Hiệu suất (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 30,38 33,40 36,09 39,49 42,84 46,62 52,28 48,81 48,81 50,47 77 1,26 2,38 1,72 - - 2,14 5,42 - - 5,4 97,05 88,50 82,46 79,02 75,64 74,78 75,89 71,41 60,15 53,89 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 60 50 97.05  46.62  52.28  48.81 48.81  50.47  120 100 40 30  30.38 88.50 33.40 82.46 36.09 42.84 39.49 79.02 75.64 74.78  75.89  71.41  60.15  53.89  80 60 20 10 0  1.26 2.38 1.72  2.14 Noàng ñoä glucose Cellobiose Hieäu suaát 6.36 5.42  5.40  40 20 0 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 % baõ raén 14 15 16 Hình 4-6 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thu được theo % bã rắn cho vào NHẬN XÉT Đối với cellobiose, khi % bã rắn thấp (từ 5% đến 10%), lượng cellobiose tích tụ trong dung dịch sau 72 giờ nhỏ (<2,14 g/l). Khi % bã rắn tăng cao (từ 11% đến 15%) lượng cellobiose tích tụ trong dung dịch nhiều và với giá trị hầu như không đổi theo % bã rắn. Khi nồng độ chất rắn tăng, lượng cơ chất tăng nên cellobiose được tạo thành nhiều hơn. Tuy nhiên, cellobiose là sản phẩm trung gian, bị tiêu thụ bởi enzyme β-glucosidase, sự tích tụ cellobiose trong dung dịch sau thời gian dài cho thấy hoạt tính enzyme này bị giảm đối với các % bã rắn cao. Vì glucose tạo thành nhiều ở các % bã rắn cao, gây tác dụng ức chế đối với enzyme β-glucosidase. Trong khoảng 5 -11% bã rắn, nồng độ glucose thu được trong dung dịch tăng từ 30g/l đến 52,28g/l. Sau đó khi % bã rắn tăng từ 12% đến 15%, nồng độ glucose thu được giảm và giá trị thay đổi không đáng kể. Nồng độ glucose lớn nhất thu được tại 11% bã rắn. Thật vậy, khi nồng độ bã rắn tăng cao, lượng cellulose cũng tăng. Như vậy, lượng cellulose có thể bị tấn công bởi enzyme sẽ tăng lên và kết quả là lượng glucose, cellobiose trong dung dịch cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi nồng độ chất rắn tăng quá cao, enzyme sẽ bị bão hòa cơ chất, khả năng tác động của enzyme sẽ giảm và ảnh hưởng tới lượng glucose tạo thành. Ngoài ra, cellobiose có tác dụng ức chế enzyme đặc biệt là 78 No àng ñ oä ( g/ l) H ieä u s ua át ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN cellobiohydrolase, khi nồng độ cơ chất tăng cao đến một ngưỡng nhất định, lượng cellobiose sinh ra sẽ có tác dụng ức chế enzyme cellulase, vì vậy hoạt tính enzyme này bị giảm và lượng glucose sinh ra cũng bị giảm. Mặt khác, khi nồng độ chất rắn cao, dung dịch đậm đặc, quá trình khuếch tán của enzyme trong toàn khối nguyên liệu sẽ rất khó khăn dẫn đến phản ứng thủy phân diễn ra khó khăn, nồng độ glucose thu đuợc nhỏ. Đối với hiệu suất, tương ứng % bã rắn tăng dần, hiệu suất giảm dần. Với cùng một lượng enzyme, khi nồng độ chất rắn càng nhỏ, enzyme sẽ càng dễ tấn công do dung dịch loãng, khả năng khuếch tán enzyme cao; cơ chất ít, enzyme có thể tác động triệt để hơn. Ngoài ra, khi nồng độ bã rắn tăng, sản phẩm trung gian như cellobiose và sản phẩm cuối cùng như glucose tạo thành nhiều, sẽ gây ra tác dụng ức chế lên enzyme cellulase (cellobiosehydrolase) và β-glucosidase. Chính những lý do trên làm cho hiệu suất của quá trình thủy phân giảm dần khi nồng độ cơ chất tăng. Như vậy, đối với yếu tố này, hiệu suất và nồng độ glucose thu được là hai hàm nghịch nhau, hiệu suất cao sẽ càng thu được ít glucose. Để đưa ra được kết luận về điểm tốt nhất đối với yếu tố này cầng phải xem xét hai vấn đề. Thứ nhất, hiệu suất liên quan đến việc sử dụng nguyên liệu hiệu quả. Thứ hai, nồng độ glucose liên quan đến quá trình sau, nồng độ glucose càng lớn, quá trình lên men càng thu được nhiều ethanol và như vậy quá trình chưng cất thu ethanol sẽ tiết kiệm hơn về mặt chi phí. Nguyên liệu – rơm rạ là một phế phẩm nông nghiệp, giá thành thấp, trong lúc đó vấn đề năng lượng tiêu tốn cho quá trình chưng cất lại đóng một vai trò quan trọng trong giá thành của bioethanol. Chính vì vậy, vấn đề thứ hai cần được xem xét kĩ. Dựa trên sự thay đổi của nồng độ glucose theo nồng độ chất rắn ban đầu, chọn 11% là nồng độ bã rắn thích hợp cho quá trình thủy phân. 4.2.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào lên quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 50oC; pH: 4,8; % bã rắn: 11%. Lượng enzyme cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau. Bảng 4-8 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau Nồng độ glucose (g/l) Thời gian 1% enzyme 3% enzyme 5% enzyme 7% enzyme 9% enzyme 0 0,5 1 0,00 3,56 6,01 0,00 5,47 7,97  79 0,00 7,62 7,23 0,00 9,29 12,90 0,00 13,35 14,65 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 2 5,06 9,01  15,07  16,36  21,28 24 26,5 48 72 14,03 14,41 - 22,79 34,38 34,15 - 47,43 45,83 44,88 - 55,80 47,84 48,57 48,67 54,01 50,03 55,71 58,14 60,95 (*) Mẫu được lấy tại 26 giờ 60 50 40 30 20 10 0  1% 3% 5% 7% 9% 0 10 20 30 40 Thôøi gian (giôø) 50 60 70 Hình 4-7 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian tương ứng với các % enzyme khác nhau Bảng 4-9 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với % enzyme khác nhau Thời gian (giờ)  Nồng độ cellobiose (g/l) 1% enzyme 3% enzyme 5% enzyme 7% enzyme 9% enzyme 0 0,5 1 2 0,00 0,37 9,91 8,33 0,00 8,64 11,73 10,67  80 0,00 8,91 9,25 13,95 0,00 8,89 10,75 11,64 0,00 7,01 8,94 9,79 N oàng ñ oä ( g/ l) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 9,45 10,92  9,36  6,33  7,21 26,5 48 72 16 14 12 10 8 6 4 2 0 9,43 - 8,33 10,24 - 6,25 9,22 - 5,63 5,87 4,03 3,69 1% 3% 5% 7% 9% 7,61 4,77 4,22 0 10 20 30 40 Thời gian (giờ) 50 60 70 80 Hình 4-8 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với các % enzyme Bảng 4-10 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau Hiệu suất Thời gian 1% enzyme 3% enzyme 5% enzyme 7% enzyme 9% enzyme 0 0,5 1 2 24 0,00 5,18 8,74 7,36 20,42 0,00 7,96 11,59 13,10 50,01  81 0,00 11,09 10,52 21,93 66,69 0,00 13,52 18,77 23,81 69,62 0,00 19,42 21,30 30,95 72,66 N ồ ng độ cel lo b ios e ( g/ l) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26,5 20,97 49,67  65,30  70,67*  80,90 48 72 - 33,17 - 69,00 - 81,23 70,82 78,59 84,42 88,51 Từ các đồ thị và bảng trên, rút ra được các bảng số liệu và đồ thị sau: Bảng 4-11 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu theo lượng enzyme cho vào STT 1 2 3 4 5 60 50  % enzyme 1 3 5 7 9  Nồng độ glucose (g/l) 23 47 56 54 61  Nồng độ cellobiose(g/l) 8,33 6,25 5,63 3,69 4,22 56 54 81  Hiệu suất (%) 33 69 81 79 89  61 89  Tốc độ ban đầu (g/l.h) 2,33 4,15 6,86 7,56 9,49 100 90 80 40 30 20 10 0  0  23 33 8.33  2 47 69 6.25  4  5.63 % enzyme  6 79 3.69  8  Glucose Cellobiose Hiệu suất 4.22  10  70 60 50 40 30 20 10 0 Hình 4-9 Nồng độ glucose, cellobiose thu được và hiệu suất theo % enzyme Đồng thời vẽ đồ thị của tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào. 82 Noà ng ñoä( g/ l) Hi ệ u s u ấ t ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 10 9 8 7 6 5  6.86  7.56  9.49 4 3 2 1 0  0  1  2.33  2  3 4.15  4  5 % enzyme  6  7  8  9  10 NHẬN XÉT  Hình 4-10 Tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào Khi lượng enzyme cho vào tăng, tốc độ phản ứng ban đầu tăng (hình 4-10). Khi % enzyme tăng từ 1% đến 5% thì tốc độ phản ứng ban đầu tăng nhanh. Khi % enzyme tăng từ 5% đến 9% thì tốc độ phản ứng ban đầu tăng chậm. Thật vậy, khi lượng enzyme cho vào tăng lên, tốc độ phản ứng tăng[4], tuy nhiên khi lượng enzyme tăng đến một giới hạn nhất định, nồng độ cơ chất sẽ là yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng, ở giá trị đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa. Trong giới hạn enzyme khảo sát ở nghiên cứu này, chưa thể hiện được giá trị enzyme mà tại đó, tốc độ phản ứng không tăng nữa. Tuy nhiên cũng thể hiện được đoạn tăng chậm trên đồ thị % enzyme – tốc độ phản ứng. Đối với cellobiose, khi % enzyme tăng, lượng cellobiose tích tụ trong dung dịch tại thời điểm cuối giảm (hình 4-9). Khi lượng enzyme cellulase tăng, lượng β-glucosidase cũng tăng, tương ứng, cellobiose được tiêu thụ mạnh và nồng độ cellobiose còn trong dung dịch ít. Đối với nồng độ glucose và hiệu suất (hình 4-9), ảnh hưởng của enzyme tương tự như đối với tốc độ ban đầu. Khi lượng enzyme cho vào tăng lên, nồng độ glucose thu được tại 72 giờ tăng, % enzyme tăng 1% - 5%, nồng độ glucose tăng nhanh 23g/l – 56g/l. Nhưng sau đó, từ 5% đến 9% enzyme, nồng độ glucose tăng rất chậm từ 56g/l đến 61g/l, Điều này có thể được giải thích: khi lượng enzyme tăng, sẽ có nhiều enzyme tấn công vào cơ chất hơn nên lượng glucose tạo thành tăng. Tuy nhiên, với một lượng cơ chất nhất định (% bã rắn được giữ không đổi), lượng cellulose cũng nhất định và không phải tất cả 83 T ố c độ ph ả n ứ ng đầ u (g /l. gi ờ Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN cellulose đều có thể bị tấn công bởi enzyme. Khi enzyme tấn công, những phần cellulose dễ bị tấn công như cấu trúc cellulose xốp, vô định hình… sẽ bị thủy phân trước. Khi những phần cellulose này bị mất đi thì tốc độ phản ứng cũng giảm dần [10], khả năng tấn công của enzyme sẽ trở nên rất khó khăn. Vì vậy, ở giai đoạn này, nếu lượng enzyme có được tăng lên thì cũng không cải thiện tốc độ phản ứng cũng như không thể tạo thành nhiều glucose hơn. Việc này cho thấy ứng với mỗi nồng độ bã rắn nhất định, chỉ cần một lượng enzyme nhất định, nhiều hơn cũng không tăng được hiệu suất đáng kể. Enzyme cellulase lại rất mắc, chi phí cho enzyme là chi phí lớn nhất cho quá trình thủy phân, vì vậy cần chọn một giá trị enzyme thích hợp. Đối với yếu tố này, 5% enzyme là giá trị thích hợp, cho hiệu suất cao, nồng độ glucose cao và tiêu tốn một lượng enzyme thích hợp. 4.2.4 Ảnh hưởng của pH Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 50oC; % bã rắn: 11%; % enzyme: 5%, pH ban đầu của môi trường và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Bảng 4-12 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau. Thời gian (giờ)  Nồng độ glucose (g/l) pH=3 pH=4 pH=4,2 pH=4,4 pH=4,6 pH=4,8 pH=5 pH=6 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,5 7,87 6,49 5,79 6,63 5,57 7,62 8,20 6,03 1 2 3 24 26,5 72 9,53 12,33 14,49 30,30 30,69 22,83 12,84 13,05 16,70 40,34 - 45,55 9,65 12,62 14,86 40,16 - 47,97 9,61 12,62 16,99 43,66 - 48,70 9,31 12,58 17,58 43,62 - 52,78 7,23 15,07 - 45,83 44,88 55,80 10,48 15,90 17,76 43,30 46,01 53,95 6,94 9,34 10,19 25,80 26,90 34,34 (-) mẫu không được chạy.  84 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 60 pH 4 50 40 30 20 10 0  0 pH 4,2 pH 4,4 pH 4,6 pH 4,8 pH 3 pH 5 pH 6 10  20  30  40 Thôøi gian (giôø)  50  60  70 Hình 4-11 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH khác nhau Bảng 4-13 Hiệu suất thủy phân theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau Thời gian (giờ)  Hiệu suất (%) pH=3 pH=4 pH=4,2 pH=4,4 pH=4,6 pH=4,8 pH=5 pH=6 0 0,5 1 2 3 24 26,5 72 0,00 11,40 13,82 17,87 21,01 43,93 44,49 33,09 0,00 9,44 18,69 18,99 24,30 58,70 - 66,27 0,00 8,37 13,96 18,25 21,48 58,08 - 69,37 0,00 9,63 13,95 18,32 24,66 63,38 - 70,70 0,00 8,09 13,53 18,28 25,54 63,38 - 76,69 0,00 11,09 10,52 21,93 - 66,69 65,30 81,23 0,00 11,90 15,20 23,08 25,77 63,02 66,97 78,52 0,00 8,75 10,07 13,54 14,77 37,40 39,00 49,78 Với các giá trị đo được tại 72 giờ, ta rút ra bảng sau 85 N oàn g ñ oä g luc os e ( g/ l) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 4-14 Hiệu suất và nồng độ glucose, cellobiose theo pH dung dịch STT 1 2 3 4 5 6 7 8  pH 3 4 4,2 4,4 4,6 4,8 5 6  Hiệu suất (%) 44 66 69 71 77 81 79 50  Nồng độ glucose (g/l) 30,69 45,55 47,97 48,70 52,78 55,80 53,95 34,34 52.78 55.80  Nồng độ cellobiose (g/l) 5,79 4,78 7,09 6,66 3,99 5,63 5,65 7,89 100 50 40 47.97 45.55  48.70  77 53.95 8179 90 80 70 30 20 10  30.69 44 5.79 66 69 71 7.09 6.66 4.78  5.63  5.65 34.34 50 Glucose Cellobiose Hiệu suất 7.89  60 50 40 30 20 10 0 3.99 0 2 2.5 3 3.5 4 pH 4.5 5 5.5 6 6.5 Hình 4-12 Hiệu suất, nồng độ glucose và nồng độ cellobiose theo pH dung dịch NHẬN XÉT Khi pH tăng từ 3 đến 4,8 thì nồng độ glucose thu đựơc (30,6 g/l đến 55,8 g/l) và hiệu suất tăng (từ 44% đến 81%) (hình 4-12), nhưng khi pH tăng từ 4,8 đến 5 thì nồng độ glucose thu được giảm ( từ 55,80 còn 34,34g/l) và hiệu suất cũng giảm (từ 81% còn 50%). Như đã trình bày ở mục 2.2.3.3 c, ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân, mỗi enzyme 86 N oàng ño ä ( g/ l) Hi eäu s ua át ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN sẽ hoạt động tốt nhất ở một khoảng giá trị pH nhất định. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH này là từ 4 đến 5. Điều này được phản ánh ở đồ thị 4-12, nồng độ glucose và hiệu suất đạt được tốt nhất trong khoảng pH từ 4 đến 5, trong đó pH 4,8 cho giá trị cao nhất. Khoảng pH hoạt động của enzyme rất có ý nghĩa với sản xuất công nghiệp vì trong quy mô công nghiệp, việc giữ pH ở một giá trị không đổi là rất khó khăn, vì vậy, việc đưa ra kết luận về một khoảng pH hoạt động sẽ giúp quá trình vận hành đơn giản hơn mà vẫn đạt được hiệu quả quá trình cao. Đồ thị cho thấy rằng, pH không cho ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và tiêu thụ của cellobiose, nồng độ cellobiose trong dung dịch tại thời điểm kết thúc theo pH không có một quan hệ rõ rệt (hình 4-12). Đối với yếu tố này, pH 4,8 là giá trị pH cho hiệu quả quá trình thủy phân tốt nhất. 4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân, Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : pH 4,8; % bã rắn: 11%; % enzyme: 5%, Các nhiệt độ khảo sát và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau. Bảng 4-15 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ khác nhau. Nồng độ glucose (g/l) Thời gian (giờ) 0 0,5 1 2 3 24 26,5 48 Nhiệt độ thường (28oC) 0,00 - 3,29 6,28 6,87 26,55 26,77 28,38 37 oC 0,00 - 8,42 8,60 9,05 29,85 - 33,75 40 oC 0,00 - 3,71 7,10 10,00 43,56 - 46,28 87 50 oC 0,00 7,62 7,23 15,07 - 49,69 - 54,35 55 oC 0,00 - 9,00 13,49 17,11 44,99 - - 60 oC 0,00 - 11,70 14,08 17,17 36,92 - 40,30 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 40 30 20 10 0 0 10 20  30  Nhieät ñoä phoøng 40 50 37 55 60 40  50 Thôøi gian (giôø) Hình 4-13 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ: nhiệt độ phòng khác nhau. Bảng 4-16 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian tương ứng các chế độ nhiệt độ khác nhau. Nồng độ cellobiose(g/l) Thời gian (giờ) 0 0,5 1 2 3 24 26,5 48 Nhiệt độ thường (28oC) 0,00 - 5,34 9,57 8,80 13,36 13,97 9,41 37 oC 0,00 - 8,52 11,01 11,95 14,74 - 12,21 40 oC 0,00 - 5,80 11,83 14,56 15,24 - 11,04 88 50 oC 0,00 8,91 9,25 13,95 - 9,36 - 7,51 55 oC 0,00 - 10,13 11,89 13,50 7,62 - 5,29 60 oC 0,00 - 9,18 9,58 9,87 3,63 - 2,34 N oàng ñoä gl uc os e ( g/ l) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00  Nhiệt độ thường 37 40 50 55 60 0 10 20 30 40 50 Thời gian (giờ) Hình 4-14 Nồng độ cellobiose theo thời gian ứng với các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Bảng 4-17 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian tương ứng các nhiệt độ khác nhau Hiệu suất (%) Thời gian (giờ) 0 0,5 1 2 3 24 26,5 48 Nhiệt độ thường (28oC) 0,00 - 4,79 9,14 10,01 38,66 38,98 41,32 37 oC 0,00 8,79 11,90 15,73 47,26 - 49,05 40 oC 0,00 5,39 10,31 14,52 63,24 - 67,19 50 oC 0,00 11,09 10,52 21,93 - 72,30 - 79,13 55 oC 0,00 - 13,01 19,49 24,73 65,02 - 71,64 60 oC 0,00 - 16,87 20,29 24,75 53,22 - 58,10 Từ đồ thị trên, ghi nhận được bảng số liệu sau. 89 N ồ ng độ c ello bi os e (g /l) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 4-18 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu đạt được theo nhiệt độ STT 1 2 3 4 5 6 50 45 40  Nhiệt độ (oC) Nhiệt độ thường 37oC 40 oC 50 oC 55 oC 60 oC Glucose Cellobiose Hiệu suất  Nồng độ glucose (g/l) 28,38 32,52 43,56 49,69 44,99 36,92 43.56  Nồng độ cellobiose (g/l) 9,41 12,21 9,50 7,51 7,62 3,63 49.69  Hiệu suất (%) 41,32 47,26 63,24 49,69 44,99 36,92 44.99  Tốc độ phản ứng ban đầu(g/l,h) 2,36 3,46 3,34 6,86 5,58 5,39 100 90 80 35 30 25 20 15  41.32  28.38 32.52  47.26  63.24 72.30  65.02 36.92 53.22  70 60 50 40 30 10 5 0 9.41 12.21 9.50  7.51  7.62  3.63  20 10 0 25 30 35 40 45 Nhieät ñoä (ñoä C) 50 55 60 65 Hình 4-15 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ 90 Noàn g ñoä (g /l) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.46 3.00 2.36 2.00 1.00 0.00 25 30 35 40  45  50  6.86  55  5.58 5.39 60  65 NHẬN XÉT Nhiệt độ (độ C) Hình 4-16 Tốc độ phản ứng ban đầu theo nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng ban đầu tăng (hình 4-16), quan hệ này rõ rệt trong khoảng nhiệt độ từ nhiệt độ thường (28oC) đến 50oC. Thủy phân ở 50oC sẽ cho tốc độ phản ứng ban đầu lớn nhất. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng (từ 50oC đến 60oC), tốc độ phản ứng ban đầu giảm. Như đã trình bày trong mục 2.2.3.3 b, ảnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ phản ứng thuỷ phân, tốc độ phản ứng thuỷ phân bằng enzyme tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định tốc độ phản ứng sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu. Vì enzyme là protein, đến một nhiệt độ nhất định, enzyme sẽ bị bất hoạt và không còn tác dụng nữa. Đối với hệ enzyme cellulase, nhiệt độ này là 50oC. Đối với glucose và hiệu suất phản ứng (hình 4-15), khi nhiệt độ tăng từ 28oC đến 50oC, lượng glucose tạo thành tăng và do đó hiệu suất cũng tăng. Theo [4] nhiệt độ tăng sẽ làm tăng hoạt tính enzyme, từ đó tốc độ phản ứng enzyme cũng tăng theo và sản phẩm tạo thành nhiều hơn. Tuy nhiên, sau nhiệt độ bất hoạt enzyme, hoạt tính enzyme giảm dần, vì thế sau 50oC, nồng độ glucose và hiệu suất cũng giảm dần. Đối với cellobiose (hình 4-14 và 4-15), trong giai đoạn đầu của phản ứng (hình 4-14, 3 giờ đầu) lượng cellobiose tạo thành tăng theo nhiệt độ tương ứng đến 50oC, và giảm khi nhiệt độ tăng quá 50oC. Điều này phù hợp với những giải thích nêu trên. Trong giai đoạn 91 T ố c độ đầ u ( g/ l.g i ờ ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN phản ứng kết thúc (hình 4-14) nhiệt độ tăng, nồng độ cellobiose tạo thành giảm. Giải thích như sau: đối với khoảng 28 - 50oC, hoạt tính enzyme tăng dần, cellobiose được tiêu thụ mạnh nên lượng tích tụ trong dung dịch tại thời điểm cuối là giảm dần. Tuy nhiên đối với khoảng 50-60oC hoạt tính enzyme bị giảm theo nhiệt độ nên lượng cellobiose tạo thành ít và tương ứng lượng tích tụ ít. Hình 4-15 cho thấy, khoảng nhiệt độ 40oC - 50oC cho nồng độ glucose chênh lệch không nhiều. Vì vậy nếu quá trình thủy phân được tiến hành trên quy mô lớn thì có thể giữ nhiệt độ cho quá trình ở khoảng nhiệt độ này mà không ảnh hưởng nhiều tới lượng glucose sinh ra. Trong khoảng nhiệt độ này, 50oC là nhiệt độ cho hoạt tính enzyme tốt nhất. 4.2.6 Hiệu suất thủy phân , nồng độ đường tạo thành theo thời gian Sau các thí nghiệm với các yếu tố trên, tìm được giá trị thích hợp cho các yếu tố lần lượt là: % bã rắn: 11%; % enzyme: 5%; pH 4,8; nhiệt độ 50oC. Tiến hành khảo sát nồng độ đường tạo thành, giúp có một cái nhìn tổng quát về toàn bộ quá trình thủy phân. Thí nghiệm được thực hiện với các giá trị kể trên của các yếu tố và lấy mẫu theo thời gian. Bảng 4-19 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian STT  Thời gian (h) Nồng độ glucose (g/l)  Nồng độ cellobiose (g/l)  Hiệu suất (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 15,75 19 23 24 26,5 48 72 0,00 8,18 38,31 41,79 43,86 43,65 47,26 54,35 55,80 92 0,00 10,52 11,62 11,09 10,19 9,92 9,72 7,51 3,79 0,00 11,92 55,77 60,84 63,85 63,55 68,80 79,13 81,23 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 40 30 20 10 0  Glucose Cellobiose Hiệu suất  100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 Thôøi gian (giôø) 50 60 70 80 NHẬN XÉT  Hình 4-17 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian. Trong 1 đến 3 giờ đầu tiên (hình 4-17 và 4-14), lượng cellobiose tạo thành nhiều, glucose tạo thành ít. Nồng độ cellobiose trong dung dịch phụ thuộc vào tốc độ sinh ra cellobiose bởi enzyme endo, exo và tốc độ tiêu thụ bởi enzyme β-glucosidase. Ở giai đoạn này, cơ chất mới, tác động của enzyme endo và exo vào cơ chất là tác động chủ yếu. Tốc độ tiêu thụ celllobiose của enzyme β-glucosidase nhỏ hơn tốc độ tạo thành celllobiose, vì vậy lượng celllobiose là chủ yếu trong dung dịch. Trong 24 giờ tiếp theo, cellobiose giảm và glucose tăng nhanh (43,65 g/l) tương ứng hiệu suất đạt được khá cao (63,85%). Do trong giai đoạn này cellulose và enzyme vẫn còn mới, các cấu trúc dễ bị tấn công của cellulose còn nhiều và không có chất ức chế hoạt tính của enzyme. Enzyme β-glucosidase bắt đầu tiêu thụ cellobiose mạnh, glucose tạo thành nhiều. Đây là giai đoạn glucose được sinh ra nhanh và nhiều nhất trong suốt quá trình phản ứng. Từ 24 đến 48 giờ, tốc độ phản ứng giảm dần, nồng độ glucose và hiệu suất tăng chậm. Trong giai đoạn này, cellobiose và glucose tích tụ trong dung dịch gây ức chế enzyme, những phần cellulose dễ thủy phân đã hết. Mặt khác, hoạt tính enzyme đã bị 93 Noàn g ñoä g luc os e ( g/ l) Hi eäu s ua át ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN giảm nhiều sau một thời gian tác động, một số enzyme bị nhốt trong cấu trúc xốp của cellulose. Từ 48 giờ đến 72 giờ, nồng độ glucose tăng rất chậm từ 54,35 g/l đến 55,80 g/l, Kết thúc phản ứng ở 72 giờ, nồng độ glucose đạt được là 55,80 g/l tương ứng hiệu suất đạt được là 81,23%. Không thể đạt hiệu suất 100% hay nói cách khác không thể thủy phân tất cả cellulose có trong rơm rạ. Phản ứng thủy phân cellulose là một phản ứng dị thể, vấn đền tiếp xúc pha đóng một vai trò quan trọng [10]. Ngoài ra, cấu trúc cellulose có những phần rất khó bị tấn công bởi enzyme, enzyme không thể tấn công vào để thủy phân phần cơ chất này. 4.3 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI Quá trình thủy phân và lên men đồng thời có nhiều ưu điểm so với quá trình thông thường như đỡ hao tốn thiết bị, thời gian, năng lượng, hiệu suất toàn quá trình cao hơn. Làm ra bioethanol từ quá trình thủy phân và lên men đồng thời là một hướng nghiên cứu mới, chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ ở Việt Nam. Trên thế giới đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu và đã triển khai sản xuất thử mô hình này. Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát các chất có trong dịch thủy phân và lên men đồng thời, ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào và ảnh hưởng của mật độ nấm men lên hiệu suất quá trình. 4.3.1 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời Dịch thủy phân và lên men đồng thời được lọc qua phễu lọc và đo bằng máy HPLC, Kết quả được trình bày trong bảng sau. Bảng 4-20 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời Thời gian lưu chất STT 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian lưu (phút) 5,507 5,163 5,974 6,332 7,079 7,425 8,203 Chất Acid oxalic Cellobiose Glucose Xylose 94 chuẩn (phút) 5,985 6,506 7,558 7,993 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 8 8,403 9 8,639  Arabinose  8,525 10 11 12 13 14 15 16 17 9,518 9,867 10,979 12,354 12,735 13,213 13,888 15,502 Acid lactic Acid acetic Ethanol 9,579 11,108 15,565 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời gồm có 17 chất. Trong đó, có thể giải đoán được 8 chất, riêng xylose được giải đoán bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu. Có thể lý giải như sau: cellobiose và glucose là do enzyme tạo thành và nấm men chưa chuyển hóa hết thành ethanol. Xylose và arabinose là những đường pentose có từ quá trình thủy phân của hemicellulose, chủng nấm men sử dụng là saccharomyces cerevisiae chỉ có khả năng lên men đường hexose, vì vậy, các đường này vẫn còn lại trong dịch. Ngoài ra, quá trình lên men còn tạo thành các acid hữu cơ và các aldehyde, một số acid hữu cơ có thể giải đoán được như acid acetic và acid lactic. Các acid khác và các aldehyde do không chạy được chuẩn nên không thể giải đoán được. Ethanol là sản phẩm được tạo thành trong quá trình. 4.3.2 Ảnh hưởng của lượng emzyme cho vào Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 37oC; % bã rắn: 11%; pH: 4,8; mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml. Lượng enzyme cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.4. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau. 95 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất toàn quá trình theo % enzyme cho vào tại 24 giờ và 48 giờ. STT 1 2 3 4 5 6 7 8  % enzyme 3% 5% 7% 9%  Thời gian (giờ) 24 48 24 48 24 48 24 48  Nồng độ ethanol (g/l) 15,70 17,09 18,31 27,61 24,77 24,49 24,31 21,34  Nồng độ glucose còn(g/l) 1,87 3,32 0 0 2,24 3,65 1,84 1,81  Nồng độ cellobiose (g/l) 9,08 4,75 11,03 2,47 4,73 1,76 1,98 0,55  Hiệu suất (%) 47,12 53,17 51,76 78,05 73,26 74,52 71,26 62,83 Đồ thị thu được tại 24 giờ 30  100 25 20 15 10 5 0  15.70 47.12 1.87  18.31 51.76 0.00  24.77 73.26 2.24  24.31 71.26 Ethanol Glucose Hiệu suất 1.84 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 3 4 5 6 % enzyme 7 8 9 10 Hình 4-18 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo % enzyme, tại 24 giờ 96 N oàn g ñ oä ( g/ l) Hi ệ u s u ấ t ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Vẽ đồ thị, nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất tại 48 giờ theo lượng enzyme cho vào để thấy được ảnh hưởng của lượng enzyme lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời. 25 20 15 10 5 0  Ethanol Glucose Cellobiose Hiệu suất  17.09 53.17 4.75 3.32  27.61 78.05 2.47 0.00  24.49 74.52 3.65 1.76  21.34 62.83 1.81 0.55  100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 % enzyme 6 7 8 9 10 Hình 4-19 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo % enzyme cho vào tại 48 giờ NHẬN XÉT Khi lượng enzyme tăng từ 3% đến 5% cả nồng độ ethanol và hiệu suất tổng cộng của quá trình đều tăng. Tuy nhiên khi lượng enzyme cho vào tăng từ 5% đến 9%, lượng ethanol và hiệu suất toàn quá trình giảm (chênh lệch nồng độ là 6,27g/l; chênh lệch hiệu suất là 15%).(Hình 4-19) Thủy phân và lên men đồng thời bao gồm hai quá trình diễn ra song song, thủy phân cellulose thành glucose và lên men glucose thành ethanol. Phản ứng thủy phân là phản ứng dị thể rắn/lỏng, trong khi đó phản ứng lên men là phản ứng đồng thể. Quá trình lên men diễn ra dễ dàng hơn quá trình thủy phân do quá trình khuếch tán glucose từ dung dịch đến tế bào nấm men dễ dàng hơn quá trình hấp phụ và khuếch tán enzyme đến sợi cellulose, chính vì vậy mà enzyme có ảnh hưởng mạnh lên quá trình. Tương tự như đối với quá trình thủy phân, với một lượng cơ chất nhất định, chỉ cần một lượng xác định enzyme là có thể thủy phân hiệu quả. Vì vấn đề hạn chế chính là lượng cellulose có thể bị thủy phân đã hết. Việc dùng lượng enzyme nhiều hơn sẽ không cho hiệu quả đáng kể. Ngoài ra, trong khảo sát này, khi lượng enzyme tăng cao (7% và 9%) lượng ethanol tạo thành và hiệu suất chuyển hóa lại giảm đi. Đồ thị biểu diễn theo 24 giờ cho thấy trong 97 N oàn g ñ oä (g /l) Hi ệ u s u ấ t ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 giờ đầu, lượng ethanol và glucose tương ứng với 7% và 9% đều lớn hơn 5%. Sau đó ethanol lại bị giảm đi tại 48 giờ. Có thể giải thích rằng, do sự tích tụ lớn của các sản phẩm này sau 24 giờ đã ức chế hoạt động của nấm men (ethanol) và enzyme (glucose) chính vì thế mà trong khoảng thời gian tiếp theo, hoạt động của enzyme và nấm men trong hai thí nghiệm này không tốt bằng 5%, tạo ra sự giảm quan sát thấy trên đồ thị. Ngoài ra, ethanol có thể bị chuyển hoá thành các acid do sự hiện diện của các vi sinh vật khác trong dung dịch, làm cho nồng độ ethanol bị giảm sau 24 giờ đối với 7% và 9% enzyme. Đồng thời tại các % enzyme 3%, 7% và 9%, vẫn còn tồn tại một lượng glucose đáng kể tại 48 giờ, điều này cho thấy hoạt tính của nấm men sử dụng không cao. Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến toàn quá trình. Vì nấm men tiêu thụ glucose làm chuyển dịch cân bằng tạo glucose của enzyme cellulase, hoạt tính nấm men không cao ảnh hưởng tới việc tạo ra ethanol đồng thời lượng glucose tích tụ trong dung dịch sẽ ảnh hưởng đến tác dụng làm chuyển dịch cân bằng enzyme. Từ loạt thí nghiệm này, có thể kết luận % enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời rơm rạ tạo ethanol là 5%. 4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ban đầu Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của mật độ nấm men cho vào lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện: nhiệt độ 37oC; % bã rắn: 11%; pH: 4,8; % enzyme 5%. Mật độ nấm men cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.4. Để tiện việc trình bày kết quả cũng như theo dõi kết quả, mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml được chọn làm gốc, các mật độ khác được biểu diễn dưới dạng tỉ lệ với mật độ này. Tỉ lệ mật độ nấm men = mật độ nấm men sử dụng (triệu tế bào /ml)/ 23,6 98 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 4-22 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo mật độ nấm men cho vào STT 1 2 3 4 5 6 7 8  Mật độ nấm men (triệu tế bào/ml) 11,8 23,6 35,4 47,2  Tỉ lệ mật độ nấm men 0,5 1 1,5 2  Thời gian (giờ) 24 48 24 48 24 48 24 48  Nồng độ ethanol (g/l) 19,11 25,60 18,31 27,61 18,42 26,06 23,04 28,80  Nồng độ glucose còn(g/l) 1,79 0 0 0 1,79 0 1,72 0  Nồng độ cellobiose (g/l) 5,97 1,96 11,03 2,47 8,51 2,27 4,62 0,27  Hiệu suất (%) 57,94 72,60 51,76 78,05 54,91 74,01 67,72 81,52 Vẽ đồ thị các mối quan hệ tại 24 giờ 25  23.04  100 90 20 15 10 5 0  0  19.11 57.94 2.59 0.5  18.31 51.76 0.00 1  18.42 54.91 1.79 1.5  2  67.72 Ethanol Glucose Hiệu suất 1.72  2.5  80 70 60 50 40 30 20 10 0 Tỉ lệ mật độ nấm men Hình 4-20 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 24 giờ 99 N oàn g ñ oä (g /l) Hi ệ u s u ấ t ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27.61 25.60  26.06  28.80  100.00 90.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00  0  72.60 1.96 0.5  78.05 2.47 1  74.01 2.27 1.5 81.52 Ethanol Glucose Cellobiose Hiệu suất 0.27 2 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 2.5 Tæ leä maät ñoä naám men Hình 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 48 giờ NHẬN XÉT Nhìn chung, khi mật độ nấm men cho vào tăng lên, lượng ethanol tạo thành tăng và do đó hiệu suất của toàn quá trình cũng tăng. Tuy nhiên, mức độ chênh lệch không nhiều, chỉ trong khoảng 3,2 g/l đối với nồng độ ethanol và 8,92% đối với hiệu suất (hình 4-21). Lượng cellobiose tích tụ tại thời điểm cuối có giá trị gần như nhau đối với các tỉ lệ nấm men 0,5; 1; 1,5 và không có cellobiose tích tụ đối với tỉ lệ nấm men 2 (hình 4-21). Như vậy, khi mật độ nấm men tăng lên, hiệu suất tạo ethanol cũng tăng, Tuy nhiên điều này chỉ đúng với một khoảng nhất định, khi vượt quá một ngưỡng giá trị, tăng mật độ nấm men không làm tăng hiệu suất chuyển hóa ethanol. Lý do là với mật độ nấm men lớn, nấm men sẽ sử dụng đường tạo thành trong quá trình thủy phân để tăng sinh khối, và như thế lượng ethanol sinh ra sẽ giảm theo [1]. Nấm men sử dụng nhiều sẽ tạo chuyển dịch cân bằng, làm cho cellobiose và glucose bị tiêu thụ mạnh và tương ứng lượng tích tụ của hai chất này ít khi dùng tỉ lệ nấm men cao. Như quan sát trên hình 4-21, tỉ lệ nấm men 2 không còn cellobiose. Thí nghiệm này cũng cho thấy, quá trình lên men không đóng vai trò lớn trong thủy phân và lên men đồng thời như quá trình thủy phân. Khi mật độ nấm men thay đổi, hiệu suất chuyển hóa của quá trình không thay đổi mạnh như khi % enzyme thay đổi. 100 N oàng ñ oä ( g/ l) Hi ệ u s u ấ t (% ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đối với thí nghiệm này, chọn mật độ nấm men thích hợp là 23,6 triệu tế bào/ml. Mật độ gấp 2 lần (47,2 triệu tế bào/ml) cho hiệu suất ethanol lớn hơn không nhiều mặt khác sử dụng một lượng nấm men gấp đôi nên hiệu qủa không cao. 4.3.4 Hiệu suất toàn quá trình theo thời gian Sau các thí nghiệm khảo sát các yếu tố trên, tìm ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời là: mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml; % enzyme 5%; pH 4,8; nhiệt độ 37oC; % bã rắn 11%. Tiến hành thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol tạo thành, nồng độ glucose và cellobiose trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời tại các giá trị kể trên. Bảng 4-23 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời STT 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (giờ) 0 2 21 24 26 51 74 Nồng độ cellobiose(g/l) 0,00 9,96 4,59 4,21 3,13 0,72 0,88 Nồng độ glucose (g/l) 0,00 6,73 1,87 1,79 1,89 0 0 101 Nồng độ ethanol (g/l) 0,00 1,73 22,10 24,73 25,49 29,23 30,68 Hiệu suất (%) 0,00 14,58 65,10 72,40 74,68 82,53 86,61 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Từ số liệu trên vẽ được đồ thị sau 35 30 25.49  29.23  30.68  90 80 70 25 20 15 10 5 0  1.73 0.00 24.73 22.10  Ethanol Glucose Cel obiose Hiệu suất 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Thời gian (giờ) Hình 4-22 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời. NHẬN XÉT Trong thời gian đầu (2 giờ), glucose và cellobiose được tạo thành nhanh, ethanol tạo thành không nhiều (hình 4-22). Nồng độ clellobiose trong dung dịch được quyết định bởi tốc độ thuỷ phân của enzyme endo, exo và tốc độ tiêu thụ cellobiose của enzyme β- glucosidase . Nồng độ glucose được quyết định bởi tốc độ tạo phản ứng thuỷ phân bằng enzyme cellulase và tốc độ lên men của nấm men. Tuỳ thuộc vào mối quan hệ của các tốc độ này, cellobiose và glucose trong dung dịch sẽ có các giá trị nồng độ khác nhau. Như được đề cập trong [9] giai đoạn đầu, nấm men không lên men kịp tốc độ tạo thành glucose từ phản ứng thủy phân cellulose của enzyme. Ngoài ra, cơ chất trong giai đoạn này là mới, các bề mặt dễ tấn công còn nhiều, enzyme chưa bị ức chế. Vì vậy tồn tại glucose và cellobiose tích tụ trong dung dịch ở giai đoạn này. Hoạt động của nấm men trong giai đoạn này còn yếu, glucose không bị tiêu thụ mạnh, lượng glucose tích tụ trong thời điểm này sẽ làm hạn chế tốc độ thủy phân của enzyme β-glucosidase. Sau đó, trong 24 giờ tiếp theo, khi nấm men đã thích nghi được với môi trường và tăng sinh khối đáng kể. phản ứng lên men tạo ethanol diễn ra nhanh và quá trình thủy phân tạo glucose trở thành giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng. Lúc này, lượng glucose 102 N ồ ng độ ( g/l) Hi ệ u s u ấ t ( % ) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN không còn đủ để ức chế enzyme β-glucosidase nữa, phản ứng thủy phân diễn ra nhanh hơn, tác dụng chuyển dịch cân bằng của quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời được thể hiện trong giai đoạn này. Từ 24 đến 51 giờ, nồng độ ethanol vẫn tiếp tục tăng nhưng chậm, nồng độ cellobiose và glucose dần giảm tới 0. Từ 51 đến 74 giờ, ethanol vẫn được tạo thành nhưng với tốc độ chậm, lượng glucose và cellobiose không còn đáng kể. Tuy nhiên, như đã trình bày ở mục 2.2.5.2, hiệu suất quá trình chỉ đạt được đến 86,61%. Lý do là vẫn có những phần cellulose không thể bị tấn công bởi enzyme. 103 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Chương 5  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN Từ các thí nghiệm khảo sát các yếu tố, rút ra được điểm tốt nhất cho quá trình thủy phân rơm rạ bằng enzyme % bã rắn % enzyme Nhiệt độ pH Nồng độ glucose đạt được Hiệu suất 11% 5% 50oC 4,8 55,08 g/l 81,23% Như vậy, khi tiến hành thủy phân ở điều kiện này, 1 kg rơm thô sẽ thu được 204,16g glucose. 5.2 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI Từ các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các yếu tố, kết luận được điểm tốt nhất cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời Mật độ nấm men % enzyme % bã rắn Nhiệt độ pH Nồng độ ethanol đạt được Nồng độ glucose tích tụ Hiệu suất 23,2 triệu tế bào/ml 5% 11% 37oC 4,8 30,68 g/l 0 g/l 86,61% Nếu tiến hành quá trình thủy phân và lên men đồng thời ở điều kiện này, 1 kg rơm thô sẽ thu được 113,72 g ethanol tương đương 144 ml ethanol. Trong thí nghiệm tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid yếu, Keikhosro Karimi và cộng sự [13], 1 kg rơm sẽ cho 172g ethanol tương ứng 218ml ethanol đối với quy trình sử dụng nấm men S.cerevisiae. 104 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.3 SO SÁNH HIỆU SUẤT TOÀN QUÁ TRÌNH CỦA THỦY PHÂN VỚI THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI Như đã trình bày ở trên, hiệu suất quá trình thủy phân thường là yếu tố quyết định lên hiệu suất toàn quá trình. Vì quá trình lên men thường đạt hiệu suất rất cao (99%) do phản ứng lên men là đồng thể nên dễ xảy ra. Trong khi đó enzyme thường không thủy phân hết được lượng cellulose có trong rơm rạ. Hiệu suất toàn quá trình thường bằng hoặc nhỏ hơn hiệu suất quá trình thủy phân. Hiệu suất quá trình thủy phân và lên men đồng thời đạt được 86,62% ( tại 74 giờ), lớn hơn so với hiệu suất quá trình thủy phân 81%. Như vậy, có thể chỉ ra rằng quá trình thủy phân và lên men đồng thời cho hiệu suất cao hơn quá trình thủy phân thông thường, hay nói cách khác cao hơn quá trình thủy phân và lên men tách biệt. Bên cạnh đó, quá trình tiến hành trong thời gian ngắn hơn (48 – 72 giờ, so với 6 ngày (144 giờ) như các quá trình thông thường). Các thiết bị cũng được giảm từ hai còn một thiết bị nếu sử dụng thủy phân và lên men đồng thời. 5.4 ĐỀ NGHỊ Để quá trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ và từ nguồn nguyên liệu lignocellulose có hiệu quả hơn, tác giả đưa ra một số đề nghị như sau: Quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất có ý nghĩa đối với công nghiệp sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu lignocellulose chung và từ rơm rạ nói riêng. Những kết quả từ nghiên cứu này cũng đã phần nào chứng minh tính khả thi của quá trình này. Tuy nhiên, nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế. Việc nghiên cứu kỹ hơn quá trình thủy phân và lên men đồng thời là rất có ý nghĩa đối với việc sản xuất bioethanol. Hiệu suất quá trình thủy phân cũng như thủy phân và lên men đồng thời chỉ đạt đến ngưỡng 80%. Cellulose cũng đóng một vai trò rất lớn vào sự hạn chế này. Có những phần cellulose không thể bị tấn công bởi enzyme, làm ảnh hưởng tới hiệu suất toàn quá trình. Nghiên cứu để nâng cao hiệu quả của quá trình tiền xử lý là cần thiết. Kết quả phân tích dịch thủy phân cũng như thủy phân và lên men đồng thời chỉ ra rằng, trong dịch có tồn tại các đường pentose gồm xylose và arabinose, nấm men saccharomyces cerevisiae không thể lên men các đường này. Một quy trình được đề ra là dịch sau lên men đường hexose được loại ethanol (chưng cất…) sau đó sẽ tiếp tục lên men đường 5. Quá trình lên men lần hai này có thể tiến hành bằng chủng nấm men Pichia Stipitis. Như vậy sẽ tận dụng hết lượng cơ chất. 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]  Cao Đình Khánh Thảo, Nghiên cứu thử nghiệm khả năng xử lý rơm rạ để lên men ethanol, Luận văn Đại học, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Khoa Công Nghệ Hóa Học, 01/2007 [2] TS. Nguyễn Thị Ngọc Bích, Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2003. [3] Hồ Sĩ Tráng, Cơ sở hoá học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang 30-81. [4] TS. Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001. [5] TS. Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001. [6] Th.S Trịnh Hoài Thanh, Nghiên cứu quá trình xử lý rơm rạ để chế biến cồn nhiên liệu, Luận văn Thạc sĩ, Bộ môn Máy Thiết bị - Khoa Công nghệ Hóa học. [7] Nguyễn Ngọc Quế, Trần Đình Thao, Báo cáo tổng quan ngành hàng lúa gạo Việt Nam, Viện Chính sách và Chiến lược Phát triển Nông Nghiệp Nông Thôn, 2005. [8] TS. Nguyễn Thế Bảo, TS.Bùi Tuyên, Điều tra quy hoạch các dạng năng lượng mới trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh, Sở Khoa học và Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, 2001. [9] Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor&Francis, 1996. p 119-285 [10] Hetti Palonen, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT Biotechnology, 2004, p 11-39. [11] M.Roehr, The Biotechnology of ethanol classical and future application, Weinheim, WILEY-VCH Verlag GmbH, 2001. [12] Ilona Sárvári Horváth, Carl Johan Franzén, Mohammad J. Taherzadeh, Claes Niklasson, Gunna Lidén, Effect of Fufural on the Respiratory Metabolism of Saccharomyces Cerevisiae in Glucose-Limited Chemostats, American Scociety for Microbiology vol.69, 07/2004, p.4076-4086. [13] Keikhosro Karimi, Giti Emtiazi, Mohammad J. Taharzadeh, Ethanol production from dilute-acid pretreated rice straw by simultaneous saccharification 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO and fermentation with Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Science Direct, Enzyme and microbial Technology 40, 2006, p 138-144. [14] Lonnie O. Ingram, Joy B.Doran, Conversion of cellulosic materials to ethanol, FEMS Microbiology Reviews, 1995. [15] Carlo N Hamelinck, Greertje van Hooijdonk, André PC Faaij, Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term, Science Direct, Biomass and bioenergy 28, 2005, p.384-410 . [16] M. Clark Dale và Mark Moelhman, Enzymatic Simultaneous saccharification and fermentation of biomass to ethanol in a pilot 130 liter multistage continuous reaction separator. [17] Haagensen F., Ahring B.K., Enzymatic hydrolysis and glucose fermentation of wet oxidized sugarcane bagasse and rice straw for bioethanol production, Environment Microbiology & Biotechnology Research Group, Technical University of Denmark. [18] Seungdo Kim, Bruce E. Dale, Global potential bioethanol production from wasted crops, Science Direct, Biomass and Bioenergy 26, 2004, p.361-375. [19] Jeibing li, Gunnar Henriksson, Goran Gellerstedt, Lignin depolymerization/ repolymerization and its critical role for deligninfication of aspen wood by steam exposion, Science Direct, Bioresource Technology 98, 2007, p. 3061-3068 . [20] Muhammad Ibrahim Rajoka, The enzymatic hydrolysis and fermentation of pretreated wheat straw and bagasse to ethanol, ATDF Journal Volume 2, Issue 2, p.29-35 [21] Ghasem Najafpour, Habibollah Younesi, Ku Syahidah Ku Ismail, Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor, Science Direct, Bioresource Technology 92, 2004, p.251-260. [22] Luiz Pereira Ramous, The chemistry involved in the steam treatment of lignocellulosic materials, Quin. Nova, 2003. [23] Karin Ohgren, Oskar Bengtsson, Marie F.Gorwa-Grauslund, Simultaneous saccharification and co-fermentation of glucose and xylose in steam-pretreated corn stover at high fiber content with Saccharomyces cerevisiae TMB3400, Science Direct. [24] Jesper Norgard, Ethanol production from biomass – optimization of simultaneous saccharification and fermentation with respect to stirring and heating, Department of Chemical engineering, Lund Institute of Technology. 107 PHỤ LỤC PHỤ LỤC TÍNH HIỆU SUẤT Một số kí hiệu sử dụng: Khối lượng bã sử dụng Hàm ẩm Phần trăm cellulose trong bã  mrom (g) a % b % Khối lượng cellulose có trong bã mcellulose-1 (g) Thể tích dung dịch V (ml) Nồng độ glucose trong dung dịch Cglucose (g/l) Khối lượng mol cellulose Khối lượng mol glucose Khối lượng cellulose phản ứng 162×n (g) 180 (g) mcellulose-2(g) Nồng độ ethanol trong dung dịch Cethanol (g/l) Khối lượng cellulose bị lên men mcellulose-3 (g) HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH THUỶ PHÂN Khối lượng cellulose có trong bã ban đầu m  −= m rom × − × (100 a) b  (g) (4) cellulose 1 10.000 Khối lượng cellulose thủy phân × cosVM Cglue  cos Cglue  ×V×162 m −2= ×× cellulose = (g) (5) cellulose 1000 n Mglucose 1000 180 Hiệu suất phản ứng thuỷ phân m H = cellulose−2 ×100% (6) mcellulose−1 HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH THUỶ PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI Tính khối lượng cellulose có trong bã ban đầu theo (4) Tính khối lượng cellulose bị thuỷ phân ứng với nồng độ glucose còn trong dung dịch 108 PHỤ LỤC Khối lượng cellulose tham gia phản ứng lên men m  −3= C ethanol × V M ××× cellulose  = C  ethanol × V 162 ××  (g) (7) cellulose 1000 2 n M ethanol 1000 2 46 Hiệu suất quá trình thủy phân và lên men đồng thời H = m cellulose−2 + m cellulose−3 ×100% (8) mcellulose−1 TÍNH TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG BAN ĐẦU Từ các giá trị nồng độ glucose đo được ứng với các thời điểm ban đầu: 0; 0,5; 1; 2; 3 giờ. Tiến hành vẽ đồ thị nồng độ glucose – thời gian. Từ đồ thị, dùng phương pháp bình phương cực tiểu nội suy ra dạng đường thẳng đi qua các điểm. Giá trị hệ số góc của đường thẳng nội suy được chính là tốc độ phản ứng ban đầu. 109