Nghiên cứu thiết lập quy trình xác định các amino acid trong một số loại mẫu thực phẩm và sinh học dựa trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

lu, Thr), diện tích mũi dansyl amino acid giảm mạnh khi tăng giá trị pH của môi trường phản ứng. Có thể lý giải hiện tượng này như sau: khi có các nhóm rút điện tử ở mạch nhánh, tính thân hạch của nhóm amino sẽ yếu đi, do đó chúng không thể cạnh tranh với ion OH- tại pH cao. Tuy nhiên, với các amino acid có phần kém phân cực lớn (không có các nhóm phân cực trên mạch nhánh như Leu, Val, Ala, Aba) diện tích mũi giảm mạnh khi giảm pH phản ứng. Điều này là do tính baz của nhóm amino trên các amino acid này khá mạnh nên bị proton hóa nhiều hơn khi pH giảm. Vì vậy, pH 9 phù hợp cho nhiều amino acid nhất (diện tích các mũi tương đối đồng đều) nên giá trị pH 9 được chọn cho các thí nghiệm sau. Hình 3.5: Độ chuyển hóa theo pH của hệ đệm dùng trong phản ứng 38 . 3.1.2.5. Nồng độ thuốc thử dansyl chloride Sau khi đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến cơ chế phản ứng, chúng tôi tiếp tục khảo sát lại các yếu tố khác của phản ứng dansyl hóa amino acid như nồng độ thuốc thử, nhiệt độ, và thời gian phản ứng. Thực hiện phản ứng dansyl hóa 11 amino acid trong hệ dung môi acetone-đệm 0.2 M borate pH 9 (1:1, v/v) với nồng độ thuốc thử thay đổi từ 0.25 % đến 1.0 % (w/v) pha trong acetone; còn các thông số khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng giống với mục 3.1.1. Kết quả khảo sát (xem hình 3.6) nồng độ 0.5 % (w/v) là thích hợp nhất vì diện tích các mũi dẫn xuất khá đồng đều và đường nền ít mũi tạp. Tại nồng độ 0.25 % (w/v), có tình trạng thiếu thuốc thử, dẫn đến độ nhạy của các mũi khác nhau. Tuy nhiên, tại nồng độ 1.0 % (w/v), có dấu hiệu dư thuốc thử vì đường nền có nhiều mũi tạp. Hình 3.6: Độ chuyển hóa theo nồng độ thuốc thử của phản ứng 3.1.2.6. Nhiệt độ tiến hành phản ứng dansyl hóa Khi tăng nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng giảm, nhưng có thể bị cạnh tranh bởi các phản ứng khác. Trong nhiều tài liệu như [11], [14], thường chọn nhiệt độ tối ưu cho phản ứng dansyl hóa các amino acid là 60 oC với thời gian phản ứng khoảng 30 phút. Tuy nhiên, hiện nay có nhiều công bố thực hiện phản ứng dansyl hóa trên các hệ thống online với thời gian tối ưu chỉ vài phút [5]. Vì vậy, khi áp dụng hệ đệm borate (hệ đệm có khả năng thủy giải thuốc thử) vào phản ứng dansyl hóa các amino acid, yếu tố nhiệt độ cần được khảo sát để tìm hiểu khả năng của hệ đệm này 39 có thể thực hiện trên các hệ thống online với thời gian vài phút hay không. Ở thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng ở hai điều kiện nhiệt độ: một là 60 oC với thời gian dừng phản ứng là 30 phút; và hai là 100 oC với thời gian dừng phản ứng là 2 phút. Các thông số khác như hệ đệm, pH, tỉ lệ dung môi, nồng độ thuốc thử được cố định tại các điểm tối ưu vừa kết luận. Kết quả cho thấy tại nhiệt độ 60 oC các mũi dẫn xuất thu được có độ nhạy tương đối đều nhau, và các mũi tạp ít xuất hiện. Ở 100 oC, độ nhạy các mũi dẫn xuất giảm, đặc biệt là Dns-Leu (xem hình 3.7). Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở nhiệt độ cao có sự cạnh tranh mạnh giữa ion OH- của môi trường đệm borate và nhóm amino của amino acid, làm cho phản ứng dansyl hóa bị dừng lại sớm. Qua đó, chúng tôi đi đến kết luận nhiệt độ phản ứng tối ưu vẫn nằm trong khoảng 60 oC, và nhiệt độ này được chọn cho các thí nghiệm phía sau. Tuy nhiên, phản ứng dansyl hóa có thể thực hiện online tại nhiệt độ cao, nhưng cần nghiên cứu thêm ví dụ như giảm nồng độ đệm hay tăng nồng độ thuốc thử dansyl chloride. Hình 3.7: Sắc ký đồ của 11 dẫn xuất được tạo thành tại 100 oC trong hệ đệm 0.2 M Na2B4O7, pH 9 3.1.2.7. Thời gian tiến hành phản ứng Theo các tài liệu tham khảo [9], [11], [14] , thời gian tối ưu cho phản ứng dansyl hóa các amino acid khoảng 30 phút. Vì vậy, trong phần này, chúng tôi thử tiến hành khảo sát các thời gian dài hơn 30 phút, nhằm khẳng định giả thiết tự dừng phản ứng, như đã nêu trên (xem mục 3.1.2.1). Các thông số khác như hệ dung môi (thành phần 40 đệm), pH, nồng độ thuốc thử, nhiệt độ được cố định tại các điểm tối ưu vừa kết luận. Kết quả thực nghiệm (xem hình 3.8) cho thấy khi tăng thời gian phản ứng, độ chuyển hóa không tăng nhiều. Điều này là do thuốc thử đã bị thủy phân gần như hoàn toàn trong vòng 30 phút; nên không cần tác nhân dừng phản ứng. Hình 3.8: Độ chuyển hóa theo thời gian tạo dẫn xuất  Kết luận điều kiện tối ưu cho phản ứng dansyl hóa amino acid với hệ đệm borate: • Nồng độ đệm borate: 0.2 M • pH hệ đệm: 9.0 • Nồng độ thuốc thử: 0.5 % (w/v) • Hệ dung môi: acetone-dung dịch 0.2 M borate (1:1, v/v) • Nhiệt độ phản ứng: 60 oC • Thời gian phản ứng: 30 phút • Nguyên nhân chính dẫn đến sự tăng đột biến về độ chuyển hóa của phản ứng dansyl hóa amino acid trong hệ đệm borate, có thể được quy cho khả năng tạo liên kết hydrogen của borate lên nhóm sulfonyl mạnh hơn lên các tâm nitrogen của amino acid. N S+ H3C H3C O- O Cl H O B O O O H H H H O B O O O H H H 41 3.2. NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH CÁC DẪN XUẤT DANSYL AMINO ACID TRÊN CỘT PHA ĐẢO Kỹ thuật triệt ion (hay điều chỉnh mức độ ion hóa) đã được vận dụng để phân tách vài chục amino acid từ những năm 1990. Nhưng, một số vấn đề vẫn tồn tại cho đến ngày nay như thời gian lưu của Asp và Glu còn quá thấp, các cặp Thr và Gly, Arg và Ala,… không phân tách hoàn toàn (xem hình 1.6, trang 23) [11]. Mặt khác, cho đến bây giờ, kỹ thuật ghép cặp ion (hay trao đổi ion động học) vẫn chưa đủ khả năng để phân tách đồng thời trên 20 amino acid. Đây là vấn đề làm cho các nhà sản xuất cột sắc ký hướng đến các cột đa cơ chế (vừa pha đảo, vừa trao đổi ion) để hỗ trợ cho kỹ thuật triệt ion trong phân tách các amino acid. Tuy nhiên, theo lý thuyết (xem mục 1.4), hai kỹ thuật triệt ion và ghép cặp ion có thể chuyển đổi qua lại tùy theo pH và hàm lượng dung môi hữu cơ của pha động. Năm 2008, Tomasz Baczek đã báo cáo các lợi thế của chế độ rửa giải theo chương trình biến đổi pH pha động trong phân tách các peptide nhỏ [2]. Vì vậy, chúng tôi định hướng kết hợp hai kỹ thuật ghép cặp ion và triệt ion thông qua một chương trình rửa giải có sự biến đổi pH pha động trên cột pha đảo (C18). Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất dansyl hóa cho các amino acid chuNn tại các điều kiện tối ưu như đã chọn ở mục 3.1. Do phải phân tách trên 20 amino acid có tính chất biến đổi rất phức tạp, nên chúng tôi chia làm hai phần để khảo sát. i. Khảo sát sơ bộ để tìm ra các thông số ảnh hưởng đến khả năng phân tách các amino acid (nghĩa là tìm ra mô hình kết hợp hai kỹ thuật triệt ion và ghép cặp ion) và các khoảng tối ưu cho các thông số đó. ii. Khảo sát để tìm ra điều kiện tốt ưu cho việc phân tách trên 20 amino acid. 3.2.1. KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HỆ DUNG MÔI RỬA GIẢI Do tính chất của các amino acid biến đổi quá phức tạp, nên chúng tôi phải dùng điều kiện rửa giải theo chương trình G1 (xem bảng 3.1, trang 34), với tốc độ dòng 1 mL/phút, nhiệt độ cột phân tích 50 oC, tại bước sóng 250 nm, để tiến hành khảo sát. 42 3.2.1.1. Giá trị pH của pha động A Phần này được chia làm hai hướng một theo kỹ thuật triệt ion dùng TFA làm chất định pH; hai theo kỹ thuật ghép cặp ion dùng hệ đệm TFA/TEA làm chất định pH cho pha động A. • Thay đổi pH của pha A theo TFA Để phân tách nhiều chất cùng một lúc, ta phải khảo sát theo chiến thuật lần lượt phân tách các mũi có hệ số lưu từ thấp đến cao. Từ tài liệu tham khảo và quá trình khảo sát thực nghiệm, nhận thấy cặp dẫn xuất của Glu và Asp có hệ số lưu và hệ số tách rất kém. Nguyên nhân có thể là do giá trị pH của pha động chưa đủ thấp để ngăn chăn sự anion hóa của chúng. Do đó, độ phân giải của cặp amino acid này được chọn làm cơ sở để khảo sát khả năng phân tách theo pH của pha A. Tuy nhiên, khi pH xuống thấp sẽ dẫn đến sự đồng rửa giải của các amino acid có cùng số carbon trên mạch nhánh, ví dụ như Met và Val cùng có bốn carbon Khảo sát được thực hiện như sau: dansyl hóa Glu, Asp, Met và Val. Pha động A có thành phần TFA thay đổi như bảng 3.2, và pha động B là ACN-IPA (80:20, v/v). Kết quả cho thấy cặp Asp và Glu chỉ tách tốt và cách xa mũi thuốc thử dư ở pH < 2 (xem hình 3.9a). Điều này là do chúng có hai nhóm carboxyl trên phân tử nên cần pH thấp để triệt anion. Tuy nhiên, cặp Met và Val chỉ tách tốt khi pH > 2 (xem hình 3.9b). Kết quả này có thể giải thích như sau, vì pKaval > pKaMet >2 (xem bảng 1.1, trang 15), nên khi pH > 2 phần trăm phân ly của Met cao hơn Val, nên Met được rửa giải ra trước Val; ngược lại khi pH < 2, chúng bị triệt anion hoàn toàn nên bị đồng rửa giải vì cùng số carbon. Vậy cơ chế kiểm soát sự ion hóa bằng acid trung bình theo một số tài liệu [11], [14] là không phù hợp để phân tách các amino acid một cách hoàn toàn. Bảng 3.2 Kết quả khảo sát pH pha động A theo TFA STN Pha động A Độ phân giải (RS) Glu và Asp Met và Val TN1 0.10 % TFA 1.20 0.23 TN2 0.05 % TFA 0.85 0.31 TN3 0.01 % TFA 0.53 2.10 43 Hình 3.9a: Sắc ký đồ phân tách 4 dansyl amino acid với pha A chứa 0.1 % (v/v) TFA Hình 3.9b: Sắc ký đồ phân tách 4 dansyl amino acid với pha A chứa 0.01 % (v/v) TFA • Thay đổi pH của pha động A theo hệ đệm TEA/TFA Đứng trước tình trạng trên, chúng tôi chuyển qua kỹ thuật ghép cặp ion với thuốc thử ghép cặp ion là một loại cation lưỡng cư (amphibian) để tương tác với các nhóm carboxyl của các dẫn xuất dansyl amino acid. Các cation lưỡng cư này có thể là muối ammonium bậc bốn hay amine bậc ba bị proton hóa. Mặt khác, các dẫn xuất dansyl amino acid có nhóm 5-dimethylamino là tâm baz, có thể tạo liên kết hydrogen với nhóm silanol trên pha tĩnh, gây ra những khó khăn cho quá trình phân tách các dẫn xuất này. Trong sắc ký pha đảo, để khắc phục khó khăn này, người ta thường thêm vào pha động các chất amine baz mạnh làm chất trợ tách. Trong nhiều trường hợp, hệ đệm của triethylamine (TEA) và acid acetic được chứng tỏ là thuận lợi hơn cả. Tuy nhiên, vì acid acetic có tính acid yếu hơn các dẫn xuất dansyl amino acid nên không thể điều chỉnh mức độ ion hóa của các dẫn xuất này. Vì vậy, chúng tôi chọn hệ đệm TFA/TEA vừa làm thuốc thử ghép cặp ion, vừa làm chất che tâm silanol của pha tĩnh và định pH. Để khảo sát khả năng phân tách của hệ đệm TFA/TEA, chúng tôi thực hiện phản ứng dansyl hóa 9 amino acid (Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Ala, Met, Val, Leu). Pha động B là ACN-IPA (80:20, v/v), pha động A thay đổi như bảng 3.3 44 Kết quả cho thấy khi sử dụng hệ đệm TFA/TEA, pH 3.45 (TN2), khả năng tách các amino acid tăng mạnh (xem hình 3.10). Điều này chứng tỏ TEA đã hỗ trợ tách các amino acid thông qua cơ chế trao đổi ion động học, do đó tăng cường sự phân tách giữa các dẫn xuất có giá trị pKa khác nhau. Tuy nhiên, cặp Dns-Thr và Dns- Gly vẫn bị đồng rửa giải. Điều này là do thành phần IPA trong pha B còn chưa hợp lý. Bảng 3.3 Kết quả khảo sát pH pha A theo hệ đệm TFA/TEA STN Thành phần pha A Khả năng tách TN1 10 mM TFA + 9.0 mM TEA (pH 3.27) Các cặp dẫn xuất Dns-Asp/Dns-OH & Dns-Thr/Dns-Gly bị đồng rửa giải TN2 10 mM TFA + 9.5 mM TEA (pH 3.45) Cặp dẫn xuất Dns-Thr/Dns-Gly bị đồng rửa giải (xem hình 3.10) Hình 3.10: Sắc ký đồ tách 9 amino acid, với pha động A gồm 10 mM TFA + 9.5 mM TEA, pH 3.45 3.2.1.2. Thành phần IPA trong pha B Trên mạch nhánh của Thr có nhóm hydroxyl, nên khi thay đổi tỉ lệ IPA/ACN trong pha B, Thr sẽ tách ra khỏi Gly. Do đó, chúng tôi khảo sát thêm thành phần pha B. Thực hiện phản ứng dansyl hóa Thr và Gly. Pha B có tỉ lệ IPA/ACN thay đổi như bảng 3.4, và pha A gồm 10 mM TFA + 9.50 mM TEA, pH 3.45 (pha động A1). Kết quả khảo sát (xem bảng 3.4 và hình 3.11) cho thấy hệ số tách của cặp dẫn xuất của Thr và Gly phụ thuộc vào thành phần trăm của IPA rất phức tạp (có sự thay đổi thứ tự rửa giải khi đi từ TN3 sang TN4). Kết quả thời gian lưu của Thr giảm ít hơn so với Gly theo tỉ lệ IPA có thể là do liên kết hydrogen nội phân tử của Thr (giữa nhóm 3-hydroxyl và nhóm carboxylate). Liên kết hydrogen này làm cho 45 mật độ điện tích âm trên nhóm carboxylate của Thr suy giảm, nghĩa là Thr ghép cặp ion yếu hơn so với Gly, do đó hệ số lưu của Thr sẽ giảm ít hơn khi điện thế bề mặt của pha tĩnh giảm (xem mục 1.4). Kết quả này khẳng định thêm cho giả thiết tồn tại của cơ chế ghép cặp ion trong hệ phân tách. Tại điều kiện TN2, cặp Thr và Gly có khả năng phân tách rõ nhất, nhưng các dẫn xuất, xuất hiện phía sau sắc ký đồ, không phân tách (xem hình 3.11a). Điều này là do khi tăng hàm lượng hữu cơ trong pha động, cơ chế ghép cặp ion không còn tác dụng mạnh, nên các dẫn xuất của Ile, Leu, và Nle có cùng số carbon, (thậm trí giữa Ile và Leu còn bằng nhau về cả số CH, CH2, và CH3) bị đồng rửa giải. Tuy nhiên, tại điều kiện TN5, Thr và Gly có khả năng phân tách tương đối tốt, nhưng các dẫn xuất, xuất hiện phía cuối sắc ký đồ, được phân tách khá hơn (xem hình 3.11b). Kết quả khi tăng phần trăm IPA làm tăng hệ số tách giữa các dẫn xuất dansyl hóa của Ileu, Leu, và Nle có thể là do tính baz của nhóm sulfonamide của các amino acid này khác nhau (xem bảng 1.1). Do đó, khi tăng thành phần trăm của IPA, dung môi có khả năng tạo liên kết hydrogen với nhóm sulfonamide (trong nhóm sulfonamide có sự chuyển điện tử tự do từ tâm nitrogen qua tâm oxygen tạo ra các dạng mang điện), làm cho lực solvate hóa các dẫn xuất này sẽ khác nhau nhiều hơn, dẫn đến sự phân tách giữa chúng tốt hơn. Tuy nhiên, khi tăng thành phần trăm của IPA lên hơn 50 % thì hệ số tách giữa các dẫn xuất của Ile, Leu, và Nle không tăng nữa và các dẫn xuất khác bị đồng rửa giải. Vậy thành phần trăm tối ưu của IPA là 50 %, được chọn cho các thí nghiệm sau. Với mục tiêu tăng cường sự khác biệt về tính baz, chúng tôi quyết định hạ pH của pha động ở các bước cuối trong chương trình rửa giải, nhằm sử dụng cơ chế điều chỉnh mức độ ion hóa cho việc phân tách các dẫn xuất của Ile, Leu và Nle. Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thành phần IPA của pha B STN Thành phần pha B Rs (Dns-Thr/Dns-Gly) TN1 90.0 % ACN: 10.0 % IPA 0.69 TN2 87.5 % ACN: 12.5 % IPA 1.82 TN3 85.0 % ACN: 15.0 % IPA 0.45 TN4 60.0 % ACN: 40.0 % IPA 0.32 TN5 50.0 % ACN: 50.0 % IPA 1.62 46 Hình 3.11a: Sắc ký đồ 22 amino acid rửa giải với hệ dung môi TN2 (xem bảng 3.4) Hình 3.11b: Sắc ký đồ 22 amino acid rửa giải với hệ dung môi TN5 (xem bảng 3.4) 3.2.1.3. Nồng độ TFA trong pha động B Vì tính baz của các nhóm sulfonamide của các dẫn xuất dansyl amino acid rất yếu, nên phải hạ pH xuống ≈ 2, để proton hóa chúng. Do đó, chúng tôi đã thêm TFA vào pha động B từ 0.025 % đến 0.05 %, để khảo sát kỹ thuật triệt ion cho các dẫn xuất, xuất hiện phía sau sắc ký đồ. Mặt khác, do chế độ rửa giải G1 có tốc độ biến đổi pha động quá chậm nên không cung cấp đủ điều kiện phân tách cho các dẫn xuất, xuất hiện ở phía sau sắc ký đồ (vì để các dẫn xuất này di chuyển trên cột trong điều kiện đồng rửa giải quá lâu). Vì vậy, phải rút ngắn thời gian của các bước trong chế độ G1, trước khi khảo sát sự phân tách của các dẫn xuất này. Bằng phương pháp thử và sai, chúng tôi đi đến chương trình rửa giải G2 (xem bảng 3.5). Dansyl hóa 10 amino acid (Trp, Phe, Cys, Ile, Leu, Nle, Orn, Lys, His, Tyr); pha A là pha động A1: 10 mM TFA + 9.5 mM TEA, có pH 3.45; pha B gồm: 50 % ACN + 50 % IPA, và có thêm TFA như bảng 3.6. 47 Kết quả (xem bảng 3.6 và hình 3.12) chỉ ra rằng khi giảm pH của pha động ở các bước rửa giải cuối và tăng tốc độ biến đổi của chương trình rửa giải khả năng tách các mũi phía sau sắc ký đồ tăng lên đáng kể, nhưng điều này có thể gây khó khăn cho việc phân tách các mũi xuất hiện phía đầu sắc ký đồ. Khi tăng hàm lượng acid trong pha B nhóm sulfonamide bị proton hóa, và giảm thiểu cơ chế ghép cặp ion, nên hệ số lưu của các dẫn xuất đều giảm; nhưng các dẫn xuất có nhiều nhân nitrogen như Trp, Cys (bị bidansyl hóa theo phản ứng 1.4, trang 17), Orn, Lys, và His sẽ giảm mạnh hơn. Vì vậy, điều kiện trong TN3 (bảng 3.6) trở nên tối ưu. Bảng 3.5 Chương trình rửa giải G2 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát nồng độ TFA trong pha B STN % TFA trong pha B Rs Phe/Cys Cys/Ile Ile/Leu Leu/Orn Orn/Nle TN1 0.000 0.85 0.88 0.00 1.50 2.05 TN2 0.025 2.32 0.00 0.97 2.75 0.00 TN3 0.035 2.62 1.16 1.34 1.51 1.21 TN4 0.050 2.32 1.70 1.58 0.00 1.89 Hình 3.12: Sắc ký đồ 10 amino acid rửa giải với hệ dung môi TN3 (xem bảng 3.6), theo chương trình G2 (xem bảng 3.5) T (phút) % A % B 0.00 95.0 5.0 1.00 90.0 10.0 20.00 75.0 25.0 25.00 49.0 51.0 30.00 40.0 60.0 35.00 20.00 80.0 48  Kết luận cho khảo sát sơ bộ thành phần pha động  Vì thao tác thêm TFA vào pha B ở nồng độ quá thấp rất kém chính xác, nên độ lặp lại không cao. Tại thời điểm khởi đầu của chương trình rửa giải G2 (xem bảng 3.5), pha động có 10.0 % B, 90.0 % A và pH 3.10. Mặt khác, tại thời điểm 80.0 % B (20,0 % A), các dẫn xuất đều bị rửa giải ra khỏi cột (xem hình 3.13), pha động có pH 2.10. Do đó, cần bố trí lại hệ dung môi rửa giải thành pha động A2 và pha động B2 có pH khác nhau, thành phần khác nhau. Pha động A2 gồm: 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm pH 3.0 của 0.1 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA; pha động B2 được pha gồm: 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm pH 2.0 của 0.14 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA  Khi sử dụng các hệ pha động A2 và B2, ta cần thay đổi chương trình rửa giải G2 thành chương trình G3 (xem bảng 3.7, trang 49).  Các thông số cần tối ưu hóa như sau: • Giá trị pH: biến đổi từ 1.80 đến 2.80 • Nồng độ đệm TFA/TEA: từ 0.8 % đến 1.6 % (v/v) TFA • Thành phần trăm IPA trong pha A2: từ 4 % đến 6 % • Thành phần trăm IPA trong pha B2: từ 35 % đến 45 %  Do thiết lập được mô hình kết hợp kỹ thuật trao đổi anion động học (ở các bước đầu của chương trình rửa giải) và kỹ thuật kiểm soát mức độ cation hóa (ở các bước sau) phù hợp với bản chất của các amino acid, nên khả năng tách của hệ tăng cao. Kết quả này mang tính mở nhiều hơn so với các loại cột phối hợp cơ chế cố định đang có trên thị trường. Hình 3.13: Sắc ký đồ 22 amino acid rửa giải theo điều kiện tổng kết từ phần khảo sát sơ bộ 49 3.2.2. KHẢO SÁT TỐI ƯU THÀNH PHẦN HỆ DUNG MÔI RỬA GIẢI Mục tiêu của phần khảo sát này không chỉ đi đến điểm dừng hợp lý nhất, mà còn cung cấp dữ liệu tham khảo để có thể chọn lựa điều kiện tối ưu cho các yêu cầu cụ thể. Vì trên thực tế, mẫu thật có thể không có quá nhiều amino acid, hay yêu cầu phân tích chỉ dừng lại ở một số loại amino acid nhất định…. Do đó, phương pháp tối ưu hóa cổ điển được trình bày, nghĩa là các thông số lần lượt được thay đổi trong vùng tối ưu đã chọn. Vì khoảng tối ưu của các thông số cần khảo sát khá hẹp nên thời gian lưu chết và bề rộng chân mũi ít thay đổi, do đó thời gian lưu có thể đại diện cho thông số lưu và có thể ước lượng độ phân giải qua hiệu số thời gian lưu. Mọi thí nghiệm đều được tiến hành rửa giải theo chương trình G3 (xem bảng 3.7) với tốc độ dòng là 1 mL/phút, nhiệt độ cột phân tích 50 oC, tại bước sóng 250 nm. Thực hiện phản ứng dansyl hóa 22 amino acid ở nồng độ 5 ppm theo điều kiện tối ưu trong mục 3.1 Bảng 3.7 Chương trình rửa giải G3 cho pha động A2 và B2 T (phút) % A % B 0.00 100.0 0.0 20.00 85.0 15.0 25.00 59.0 41.0 30.00 50.0 50.0 33.00 0.0 100.0 3.2.2.1 Giá trị pH của pha động A2 Các cặp Ser và Asp hay Gly và Thr chưa phân tách tốt trong chương trình rửa giải G3 (xem hình 3.13). Do đó, giá trị pH của pha động A2 cần tối ưu hóa lại để tách tốt hơn Pha B là pha động B2 có pH 2.0. Pha A là pha động A2 gồm: 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm của 0.1 % (v/v) TFA, điều chỉnh với TEA để có pH lần lượt là 2.80, 2.75, 2.70, 2.65, và lọc lại. Kết quả khảo sát (xem hình 3.14) cho thấy trong khoảng từ 2.65 đến 2.80 hệ số lưu tỉ lệ với giá trị pH gần như tuyến tính, nhưng bên ngoài vùng này sự biến đổi của hệ số lưu của các amino acid rất phức tạp có thể dẫn đến sự thay đổi thứ tự rửa giải ví dụ như cặp Gly và Thr, Arg và Ser hay Ser và Asp. Giá trị pH của pha động 50 A2 cần nằm trong khoảng từ 2.75 đến 2.80 để có sắc ký đồ cân đối. Sự giảm hệ số lưu khi giảm pH là do hai nguyên nhân: một là sự giảm khả năng ghép cặp ion (đối với các amino acid ở phía trước sắc ký đồ); hai là sự tăng phần trăm bị proton hóa (đối với các amino acid ở phía sau sắc ký đồ). Điều này cũng sẽ ghi nhận được trong khảo sát pH của pha B2 Hình 3.14: Thời gian lưu của các dẫn xuất theo pH pha A2 ( k’ ̴ tr & Rs ̴ tr2 - tr1) 3.2.2.2 Giá trị pH của pha động B2 Một số amino acid được rửa giải trong các bước cuối của chương trình pha động không phân tách tốt trong chương trình rửa giải G3 (xem hình 3.13). Do đó, giá trị pH của pha động B2 cần tối ưu hóa lại để tách tốt nhóm bốn chất Ile, leu, Orn, Nle. Pha A là pha động A2 có pH 2.77. Pha B là pha động B2 gồm: 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm của 0.14 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA để có pH lần lượt là 1.90, 1.85, 1.80, và lọc lại. Kết quả khảo sát (xem hình 3.15) chỉ ra rằng trong khoảng từ 1.80 đến 1.90 hệ số lưu tỉ lệ với giá trị pH gần như tuyến tính, nhưng bên ngoài vùng này sự biến đổi của hệ số lưu của các amino acid rất phức tạp có thể dẫn đến sự thay đổi thứ tự rửa 51 giải ví dụ như nhóm ba Met, Trp và Val hay Leu, Orn và Nle. Giá trị pH của pha B cần nằm trong khoảng từ 1.85 đến 1.90 để có sắc ký đồ cân đối. Hình 3.15: Thời gian lưu của các dẫn xuất theo pH pha B2 ( k’ ̴ tr & Rs ̴ tr2 - tr1) 3.2.2.3 Nồng độ chất trợ tách trong pha động A2 Trong khảo sát sơ bộ, nồng độ TFA và TEA được chọn khoảng 10 mM để đóng vai trò thuốc thử ghép cặp ion, chất che silanol, tác nhân triệt ion; làm khả năng phân tách của hệ pha động tăng mạnh. Vì vậy, cần khảo sát tối ưu lại nồng độ của chất trợ tách trong pha A và pha B. Pha B là pha động B2 có pH 1.85. Pha A là pha động A2 gồm: 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm lần lượt của: 0.08 %, 0.10 %, 0.12 % (v/v) TFA, điều chỉnh với TEA để có pH 2.75 và lọc lại. Kết quả khảo sát (xem hình 3.16) chỉ ra rằng trong khoảng từ 0.08 đến 0.12 % hệ số lưu của Arg (mạch nhánh mang điện tích dương) giảm mạnh hơn so với các amino acid còn lại cho phép ta kéo giãn các mũi gần nhau ở đầu sắc ký đồ. Giá trị nồng độ của TFA trong pha A2 cần nằm trong khoảng 0.10 % để có sắc ký đồ cân đối. Kết quả thời gian lưu giảm nhẹ khi giảm nồng độ đệm trong pha A2 là do ba yếu tố sau: một là pH của toàn bộ pha động giảm nhẹ; hai là thế tĩnh điện trên pha 52 tĩnh ghép cặp ion giảm; ba là lực ion giảm làm tăng khả năng hòa tan của các ion zwitter, yếu tố này giúp giải thích sự giảm nhanh thời gian lưu của Arg (xem hình 3.16). Hình 3.16: Thời gian lưu của các dẫn xuất theo nồng độ TFA trong pha A2 ( k’ ̴ tr & Rs ̴ tr2 - tr1) 3.2.2.4. Nồng độ chất trợ tách trong pha động B2 Tương tự như mục 3.2.2.3, Pha B là pha động B2 gồm: 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm lần lượt của 0.14 %, 0.16 %, 0.18 % (v/v) TFA, điều chỉnh với TEA để có pH 1.8, và lọc lại. Pha A là pha động A2 có pH 2.77. Kết quả khảo sát (xem hình 3.17) cho thấy trong khoảng từ 0.14 đến 0.18 % hệ số lưu của Orn giảm mạnh hơn so với các amino acid còn lại và cặp Met và Val tiến lại gần nhau hơn, điều này không có lợi. Giá trị nồng của TFA trong pha A cần nằm trong khoảng 0.14 % để có sắc ký đồ cân đối. Mặt khác, cho thấy thông số lưu của các dẫn xuất dường như không phụ thuộc vào nồng độ của chất trợ tách. Điều này là do khi tăng nồng độ của hệ đệm trong pha B2, thế tĩnh điện của pha tĩnh sẽ tăng nhẹ làm tăng hệ số lưu; nhưng pH của pha động sẽ giảm, dẫn đến sự giảm phần trăm anion hóa của chất phân tích. Hiệu ứng nồng độ của chất trợ tách trong hai pha lên hệ số lưu của các dẫn xuất là ngược nhau. Điều này là do pH của hệ dung môi bị giảm theo nồng độ đệm trong pha B2, nhưng tăng theo nồng độ đệm trong pha A2 53 Hình 3.17: Thời gian lưu của các dẫn xuất theo nồng độ TFA trong pha B2 ( k’ ̴ tr & Rs ̴ tr2 - tr1) 3.2.2.5. Tỉ lệ IPA/ACN trong pha A2 Do cơ chế lưu thay đổi theo chương trình rửa giải (thế tĩnh điện của pha tĩnh và điện tích của các dẫn xuất đều biến đổi), nên cần khảo sát lại tỷ lệ IPA/ACN trong cả pha A2 và pha B2. Pha B là pha động B2 có pH 1.8. Pha A là pha động A2 gồm: 10 % Dung môi hữu cơ, (có tỉ lệ IPA/ACN thay đổi lần lượt là: 4/6, 5/5, 6/4), 90 % hệ đệm của 0.10 % (v/v) TFA, điều chỉnh với TEA để có pH 2.8, và lọc lại. Hình 3.18: Thời gian lưu của các dẫn xuất theo tỉ lệ IPA/ACN trong pha A2 ( k’ ̴ tr & Rs ̴ tr2 - tr1) 54 Kết quả khảo sát (xem hình 3.18) cho thấy khi tăng tỉ lệ IPA/ACN trong pha A2, thời gian lưu của các mũi của các amino acid ở phía trước sắc ký đồ giảm nhiều hơn. Tỉ lệ IPA/ACN là 5/5 để có sắc ký đồ cân đối. 3.2.2.6. Tỉ lệ IPA/ACN trong pha B2 Tương tự như mục 3.2.2.5, pha B là pha động B2 gồm: 80 % dung môi hữu cơ, (có tỉ lệ IPA/ACN lần lượt thay đổi là: 36/44, 40/40, 44/36), 20 % hệ đệm của 0.14 % (v/v) TFA, điều chỉnh với TEA để có giá trị pH là 1.8, và lọc lại. Pha A là pha động A2 có pH 2.8. Kết quả khảo sát (xem hình 3.19) cho thấy khi tăng tỉ lệ IPA/ACN, thời gian lưu của các mũi của Cys và Orn giảm nhiều hơn. Tỉ lệ IPA/ACN là 40/40 để có sắc ký đồ cân đối. Đối chiếu với mục trước, ta thấy khi tăng tỉ lệ IPA/ACN trong cả hai pha đều dẫn đến hiệu ứng giảm hệ số lưu, đặc biệt là các dẫn xuất nhiều tâm nitrogen, hay mạch nhánh có nhóm chức phân cực. Điều này có thể là do bên cạnh tác dụng làm giảm năng lượng tạo lỗ trống vì hằng số điện môi và moment lưỡng cực của IPA lần lượt là 18.3 và 1.66 đều nhỏ hơn của ACN (38 và 3.92), IPA còn có khả năng solvate hóa chọn lọc thông qua việc tạo liên kết hydrogen. Hình 3.19: Thời gian lưu của các dẫn xuất theo tỉ lệ IPA/ACN trong pha B2 ( k’ ̴ tr & Rs ̴ tr2 - tr1) 55 Hình 3.20: Sắc ký đồ của 23 Dns-AA ở điểm dừng tối ưu của thành phần hệ dung môi rửa giải. 3.2.3. NHIỆT ĐỘ CỘT PHÂN TÍCH Khi tăng nhiệt độ cột phân tích, độ nhớt dung môi giảm, làm tăng vận tốc khuếch tán, giúp sự truyền khối nhanh dẫn đến hiệu năng tách của cột tăng, các mũi sắc ký hẹp và cân đối hơn. Kết quả khảo sát trên 15 dẫn xuất dansyl amino acid cho thấy khi nhiệt độ cột thấp hơn 40 oC, các mũi không thể tách nhau hoàn toàn. Ở nhiệt độ cột 50 oC, thời gian lưu của các mũi ngắn hơn, hình dạng mũi cân đối, bề rộng mũi hẹp nên được chọn làm nhiệt độ tối ưu để tiến hành phân tích.  Kết luận điểm dừng tối ưu, để phân tách các dẫn xuất dansyl-amino acid:  Tốc độ dòng 1 mL/phút.  Nhiệt độ cột là 50 oC.  Pha A là pha động A2: 5 % ACN, 5 % IPA, 90 % hệ đệm pH 2.8 của 0.1 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA.  Pha B là pha động B2: 40 % ACN, 40 % IPA, 20 % hệ đệm pH 1.8 của 0.14 % (v/v) TFA, điều chỉnh pH với TEA.  Chế độ rửa giải theo chương trình G3 (xem bảng 3.7, trang 49). 56 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN TÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP Tuy các amino acid đã phân tách tốt, nghĩa là có điều kiện định lượng đồng thời nhiều amino acid, nhưng khả năng phân tích của phương pháp còn phụ thuộc vào quá trình lấy tín hiệu. Trong đề tài này, tín hiệu được ghi nhận là độ hấp thu của các dẫn xuất dansyl-amino acid. Độ hấp thu của các dansyl amino acid tùy thuộc vào bước sóng theo phổ hấp thu (xem hình 3.21). Các dansyl amino acid có hai dải hấp thu cực đại tại 250 nm và 325 nm, nên tính năng phân tích của phương pháp cần được đánh giá tại hai dải hấp thu này. Hình 3.21: Phổ hấp thu của các dansyl amino acid. 3.3.1. BƯỚC SÓNG 250 nm 3.3.1.1. Khoảng tuyến tính Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp phân tích đồng thời nhiều amino acid. Do đó, ngoài yêu cầu phải phân tách tốt các amino acid, phương pháp còn phải đảm bảo khoảng tuyến tính cho mỗi amino acid đủ rộng nghĩa là phải trên 100 lần vì tỉ lệ giữa các amino acid trong mẫu thật có thể biến đổi khá rộng Thực hiện các phản ứng dansyl hóa hỗn hợp 23 amino acid (vì Cys và cystine được định lượng tổng số) theo điều kiện tối ưu (xem mục 3.1) tại 11 mức nồng độ trong khoảng từ 0.05 mg/L đến 50 mg/L đối với Tyr, His, Lys, Orn; và từ 0.1 mg/L đến 100 mg/L đối với các amino acid còn lại. Chương trình rửa giải G3, với tốc độ dòng là 1 mL/phút, nhiệt độ cột phân tích 50 oC. Pha A là pha động A2 và pha B là pha động B2. 57 Kết quả khảo sát cho thấy các amino acid bắt đầu tuyến tính từ 0.1 mg/L, hay 0.05 mg/L (đối với Tyr, His, Lys, Orn) cho đến 40,0 mg/L hay 20,0 mg/L (đối với Tyr, His, Lys, Orn). Khi nồng độ các amino acid lớn hơn ngưỡng trên của khoảng tuyến tính, có hiện tượng thiếu thuốc thử dansyl hóa, nên một số amino acid tăng chậm, một số khác lại có khuynh hướng giảm. Như vậy, khoảng tuyến tính của phương pháp là 400 lần (xem hình 3.22). Các điểm chuNn của từng amino acid được thể hiện trong bảng 3.8. Kết quả phương trình đường chuNn và hệ số tương quan của các amino acid được nêu trong bảng 3.9. Đường nền và hai điểm thấp nhất của các đường chuNn trên hình 3.23. Hình 3.22: Các sắc ký đồ của 23 amino acid từ 2mg/L đến 40mg/L. Hình 3.23: Sắc ký đồ đường nền và hai điểm đầu của các đường chu#n. 58 Bảng 3.8. Dữ liệu khoảng tuyến tính của 23 Dns-AA (số điểm chuNn N= 6) Stt AA N 1 2 3 4 5 6 1 Gln C mg/L 0.10 0.51 1.02 2.04 5.10 10.20 Dt 2.22 8.20 14.5 26.4 67.1 133.6 2 Arg C mg/L 0.10 0.51 1.01 2.02 5.05 10.10 Dt 2.98 16.7 30.5 60.4 157.7 316.9 3 Ser C mg/L 0.10 0.50 0.99 1.98 4.96 9.92 Dt 5.99 22.4 38.9 69.3 178.9 350.2 4 Asp C mg/L 0.10 0.50 1.00 2.01 5.02 10.04 Dt 3.07 14.5 26.3 50.7 133.6 261.3 5 Glu C mg/L 0.10 0.50 0.99 1.98 4.95 9.90 Dt 2.94 14.2 25.3 50.0 132.5 266.7 6 H-Pro C mg/L 0.10 0.50 0.99 1.98 4.95 9.90 Dt 3.95 16.2 33.6 68.5 182.0 371.1 7 Gly C mg/L 0.10 0.48 0.96 1.93 4.82 9.64 Dt 9.30 34.5 62.0 123.4 318.4 662.7 8 Thr C mg/L 0.11 0.52 1.05 2.09 5.24 10.47 Dt 2.69 13.8 24.4 47.0 120.4 239.9 9 Ala C mg/L 0.10 0.50 1.00 1.99 4.99 9.97 Dt 8.10 33.8 60.7 118.1 306.1 625.4 10 Aba C mg/L 0.09 0.47 0.94 1.89 4.72 9.43 Dt 6.75 32.9 63.3 124.9 327.6 671.4 11 Pro C mg/L 0.09 0.46 0.91 1.83 4.57 9.14 Dt 5.91 35.7 68.4 137.5 359.7 724.5 12 Met C mg/L 0.10 0.50 0.99 1.99 4.97 9.93 Dt 5.03 26.8 41.3 83.9 225.2 485.5 13 Trp C mg/L 0.10 0.51 1.01 2.02 5.06 10.12 Dt 2.94 20.3 37.4 77.4 204.1 429.1 14 Val C mg/L 0.10 0.48 0.97 1.94 4.84 9.69 Dt 6.35 33.1 60.6 124.9 324.1 677.1 15 Phe C mg/L 0.10 0.50 0.99 1.98 4.95 9.91 Dt 10.3 28.5 47.7 93.4 230.8 466.7 16 Cys C mg/L 0.08 0.38 0.76 1.52 3.81 7.62 Dt 7.11 34.0 62.3 118.7 315.3 642.8 17 Ile C mg/L 0.10 0.50 1.00 1.99 4.99 9.97 Dt 4.92 28.3 55.3 115.9 301.98 628.4 18 Leu C mg/L 0.10 0.48 0.97 1.94 4.85 9.70 Dt 5.20 28.0 55.7 115.3 306.9 635.1 19 Orn C mg/L 0.05 0.25 0.50 1.00 2.50 4.99 Dt 11.7 37.7 67.2 129.2 354.6 751.4 20 Nle C mg/L 0.10 0.49 0.98 1.96 4.90 9.80 Dt 9.94 39.6 65.0 132.7 341.9 694.3 21 Lys C mg/L 0.05 0.26 0.53 1.06 2.65 5.30 Dt 4.57 33.0 64.8 126.9 341.9 691.8 22 His C mg/L 0.05 0.25 0.49 0.99 2.46 4.93 Dt 6.89 29.8 60.9 102.5 287.4 536.7 23 Tyr C mg/L 0.05 0.24 0.47 0.94 2.36 4.72 Dt 5.56 27.9 53.5 82.9 270.7 569.3 59 Bảng 3.9. Phương trình đường chuNn của 23 Dns-AA Stt Tên dẫn xuất Thời gian lưu, tR (phút) Phương trình hồi qui: Speak=y; Cppm=x Hệ số tương quan ,R2 1 Dns-Gln 12.99 y = 12.98x + 0.944 (3.1) 0.999 2 Dns-Arg 14.67 y = 31.41x + 0.816 (3.2) 0.999 3 Dns-Ser 15.33 y = 35.02x + 3.274 (3.3) 0.999 4 Dns-Asp 15.78 y = 26.05x + 0.506 (3.4) 0.999 5 Dns-Glu 16.33 y = 26.97x - 0.809 (3.5) 0.999 6 Dns-Hpro 17.32 y = 37.66x - 2.970 (3.6) 0.999 7 Dns-Gly 19.53 y = 68.50x - 2.972 (3.7) 0.999 8 Dns-Thr 20.23 y = 22.85x + 0.521 (3.8) 0.999 9 Dns-Ala 24.37 y = 62.53x - 1.289 (3.9) 0.999 10 Dns-Aba 27.57 y = 71.25x - 3.861 (3.10) 0.999 11 Dns-Pro 28.14 y = 79.52x - 3.340 (3.11) 0.999 12 Dns-Met 29.09 y = 48.73x - 5.429 (3.12) 0.998 13 Dns-Trp 29.40 y = 42.52x – 4.781 (3.13) 0.999 14 Dns-Val 29.64 y = 69.91x – 5.622 (3.14) 0.999 15 Dns-Phe 31.46 y = 46.58x + 3.165 (3.15) 0.999 16 Dns-Cys/Cystine 32.04 y = 84.28x – 2.392 (3.16) 0.999 17 Dns-Ile 32.39 y = 69.91x – 5.622 (3.17) 0.999 18 Dns-Leu 32.77 y = 65.81x – 6.780 (3.18) 0.999 19 Dns-Orn 33.05 y = 150.0x – 7.069 (3.19) 0.998 20 Dns-Nle 33.38 y = 70.65x + 0.657 (3.20) 0.999 21 Dns-Lys 33.79 y = 131.3x – 5.052 (3.21) 0.999 22 Dns-His 34.48 y = 109.3x +3.728 (3.22) 0.998 23 Dns-Tyr 35.47 y = 121.2x – 8.871 (3.23) 0.996 3.3.1.2. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), và độ chính xác (% RSD) Để đánh giá độ nhạy của phương pháp tại bước sóng 250 nm, ta cần xác định LOD, LOQ. Tiến hành lấy nhiễu nền của 20 sắc ký đồ. Từ đó tính ra giá trị SBL trong từng bước của chương trình rửa giải. Kết quả nêu trong bảng 3.10. Tín hiệu giới hạn phát hiện: SLOD = 3 x SBL. Tín hiệu giới hạn định lượng: SLOQ = 10 x SBL. 60 Bảng 3.10. Giá trị SBL trong các bước rửa giải Thời gian (phút) 1223 2328 2832 3236 SBL 0.12 0.15 0.25 0.59 SLOD 0.36 0.45 0.75 1.8 SLOQ 1.2 1.5 2.5 6.9 Sau đó, chia cho hệ số góc của phương trình hồi qui ta được LOD = SLOD / b, và LOQ = SLOQ / b Kết quả LOD, LOQ được trình bày ở bảng 3.11. Bảng 3.11. LOD, LOQ của các dẫn xuất Dns-AA Stt Dẫn xuất LOD (mg/L) LOQ (mg/L) 1 Dns-Gln 0.028 0.092 2 Dns-Arg 0.011 0.038 3 Dns-Ser 0.011 0.034 4 Dns-Asp 0.014 0.046 5 Dns-Glu 0.013 0.044 6 Dns-HidroPro 0.010 0.032 7 Dns-Gly 0.010 0.030 8 Dns-Thr 0.020 0.066 9 Dns-Ala 0.010 0.030 10 Dns-Aba 0.011 0.035 11 Dns-Pro 0.010 0.031 12 Dns-Met 0.015 0.051 13 Dns-Trp 0.018 0.059 14 Dns-Val 0.011 0.036 15 Dns-Phe 0.038 0.13 16 Dns-Cys/Cystine 0.022 0.078 17 Dns-Ile 0.026 0.086 18 Dns-Leu 0.027 0.096 19 Dns-Orn 0.012 0.041 20 Dns-Nle 0.025 0.085 21 Dns-Lys 0.014 0.046 22 Dns-His 0.015 0.055 23 Dns-Tyr 0.016 0.050 61 Sự bất ổn của nền làm cho tín hiệu không chính xác, nhưng một số yếu tố khác cũng làm cho tín hiệu đo thiếu ổn định như tiêm mẫu, thực hiện phản ứng…. Do đó, cần đánh giá độ chính xác của phương pháp tại cận dưới của khoảng tuyến tính. Trong trường hợp này, điểm chuNn 1.0 mg/L được chọn để khảo sát sai số tiêm và sai số phản ứng. Kết quả khảo sát trong bảng 3.12 và hình 3.24. Bảng 3.12. % RSD của các dẫn xuất Dns-AA (số lần lặp lại n=6) Stt AA n 1 2 3 4 5 6 % RSD 1 Gln 28.22 28.39 28.15 28.10 28.50 27.77 0.91 2 Arg 25.01 25.23 25.85 25.80 26.01 25.38 1.6 3 Ser 42.42 44.51 44.03 45.68 43.69 42.10 3.0 4 Asp 33.06 34.78 32.25 34.19 34.55 33.43 2.9 5 Glu 24.29 24.89 24.18 24.55 25.42 24.15 2.0 6 H-Pro 53.64 53.44 57.51 47.12 52.18 52.97 6.3 7 Gly 64.35 65.49 65.43 67.26 64.67 63.47 1.9 8 Thr 43.86 44.21 44.54 45.31 44.40 43.46 1.4 9 Ala 58.95 60.10 58.72 59.95 58.64 57.87 1.4 10 Aba 55.09 56.16 55.92 54.43 56.42 55.12 1.4 11 Pro 55.02 56.56 55.65 55.97 56.12 54.94 1.1 12 Met 20.26 21.88 21.43 19.28 21.76 19.90 5.2 13 Trp 27.72 28.25 28.06 28.04 29.02 27.58 1.8 14 Val 45.03 46.38 45.21 46.36 45.80 44.92 1.4 15 Phe 44.71 44.74 43.36 45.10 45.53 44.01 1.7 16 Cys 43.28 43.99 44.21 44.69 44.72 42.40 2.0 17 Ile 32.27 32.16 32.17 31.29 32.36 30.57 2.2 18 Leu 43.17 42.55 42.17 42.63 43.71 42.71 1.2 19 Orn 36.99 37.09 37.71 38.02 38.93 36.47 2.3 20 Nle 55.28 58.70 56.01 56.26 57.99 54.47 2.8 21 Lys 40.64 41.26 40.96 39.87 42.79 41.08 2.3 22 His 29.17 32.85 31.06 32.09 35.77 31.46 6.8 23 Tyr 32.01 33.24 32.28 34.22 37.99 37.05 7.3 62 Kết quả thực nghiệm cho thấy tại bước sóng 250 nm, phương pháp này có thể ứng dụng để phân tích đồng thời các amino acid có hàm lượng lớn hơn 0.1 mg/L. Tính chính xác của phương pháp tương đối cao. Do đó, khi kết quả phân tích có độ lặp lại kém, thì nguyên nhân có thể là do nền mẫu quá phức tạp cần xử lý thêm. Đường nền của phương pháp có độ nhiễu cao. Nguyên nhân chính của hiện này là do các sự mất cân bằng trên cột tách. Vì vậy, các dung môi, và hóa chất dùng trong pha động phải đảm bảo đủ độ tinh khiết. Tại bước sóng 250 nm, độ truyền qua của IPA là 94 %. Đây là nguyên nhân không thể khắc phục của sự dâng cao đường nền trong các bước rửa giải cuối. Vì vậy, cần khảo sát khả năng phân tích của phương pháp tại 325 nm. Hình 3.24: Thể hiện 06 sắc ký đồ tại bước sóng 250 nm của 6 bình phản ứng 3.3.2. BƯỚC SÓNG 325 nm Tại bước 325 nm, độ truyền qua của IPA là 100 %. Do đó, hiện tượng dâng cao đường nền ở phía sau sắc ký đồ sẽ được giảm thiểu, nên nhiễu nền có thể giảm (SBL). Tuy nhiên, dải phổ 325 nm của các dẫn xuất dansyl amino acid có hệ số hấp thu nhỏ, nên hệ số khuếch đại không cao (hệ số góc, b, của phương trình đường chuNn). Vì vậy, cần so sánh tính năng phân tích tại bước sóng 325 nm với những kết quả thu được tại mục 3.3.1. Tiến hành dansyl hóa dung dịch đệm và dung dịch 1 mg/L của 23 amino acid theo điều kiện tối ưu trong mục 3.1. Sau đó, phân tách chúng trong cùng điều kiện tối ưu, nêu ở mục 3.2. 63 Kết quả khảo sát (xem hình 3.25) chỉ ra rằng nhiễu nền giảm, nhưng hệ số khuếch đại giảm mạnh hơn, do đó kém nhạy hơn tại 250 nm. Giảm thiểu sự dâng nền nhưng các mũi mất cân bằng vẫn còn. Do đó, tính năng phân tích tại 325 nm không tốt bằng tại 250 nm. Tuy nhiên, dải hấp thu này có thể hỗ trợ cho việc xác định amino acid trong các trường hợp nền mẫu có chứa các chất gây nhiễu, hấp thu mạnh tại dải phổ 250 nm, nhưng không hấp thu ở 325 nm Hình 3.25: Sắc ký đồ của nền phản ứng và dung dịch 1 mg/L dansyl amino acid tại bước sóng 325 nm 3.4. XỬ LÝ MẪU Với phương pháp dansyl hóa, tính phân cực của các amino acid giảm mạnh nên thường ít bị nhiễu bởi các tạp chất từ dung dịch chiết (HCl 0.1-1.0%) hay dung dịch thủy phân (HCl 6M) lên sắc ký đồ. Tuy nhiên, một số nhóm hợp chất như ammonia, amine, phenol có thể cạnh tranh gây ảnh hưởng lên phản ứng dansyl hóa các amino acid [11]. Đây là điểm yếu mang tính cố hữu của phương pháp tạo dẫn xuất dansyl hóa trước cột. Do đó, cần làm giảm thiểu hàm lượng của các nhóm chất này trước khi thực hiện phản ứng dansyl hóa amino acid. Nếu có thể xây dựng được quy trình xử lý mẫu có khả năng loại bỏ triệt để các loại tạp nhiễu này, thì tính ứng dụng của phương pháp dansyl hóa sẽ được nâng lên rất nhiều. Trong môi trường acid, các phenol thường ít mang điện tích, trái lại các amino acid, amine, ammonium lại mang điện tích dương. Trong môi trường kiềm, các phenol, và amino acid mang điện tích âm, nhưng các amine và ammonia không mang điện tích, dễ bay hơi; nhưng ammonia và các amine nhỏ như methylamine 64 vẫn tan tốt trong nước. Vì vậy, chiến thuật tối ưu để loại ảnh hưởng của các tạp nhiễu này được chúng tôi đề nghị như sau. Bước 1: loại các tạp nhiễu họ phenol khỏi nền trong môi trường acid. Bước 2: giảm thiểu hàm lượng các amine và ammonia trong môi trường kiềm. Bước 3: dansyl hóa mẫu gồm các amino acid và các amine, hay ammonia còn lại. Bước 4: khi tạo thành dẫn xuất dansyl hóa, điện tích âm của nhóm carboxylate của các amino acid dễ xuất hiện hơn [12]; tính phân cực của các dansyl của amine và ammonia giảm đi nhiều. Do đó, có thể loại bỏ các tạp họ amine và ammonia. 3.4.2. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT LỎNG-LỎNG Phương pháp chiết lỏng-lỏng có ưu điểm là dễ thực hiện, có thể phối trộn các dung môi để điều chỉnh được hệ số phân bố…. Tuy nhiên, sự tạo nhũ làm cho quá trình chiết rất khó kiểm soát. Vì vậy, hiện nay phương pháp chiết ly tâm thường được sử dụng nhiều hơn. 3.4.1.1. Loại các tạp nhiễu họ phenol Trong môi trường acid, các tạp chất họ phenol có độ tan trong dung môi hữu cơ lớn hơn trong dung dịch nước. Do đó, các phenol bị loại khỏi nền bằng phương pháp chiết nền với dung môi toluene hay chloroform. Hiệu quả của quá trình chiết rất cao, các phenol bị loại hoàn toàn và các amino acid đươc thu hồi trên 95 % (xem hình 2.26). Hình 3.26: Loại các tạp nhiễu họ phenol theo phương pháp chiết với toluene 65 3.4.1.2. Loại các tạp nhiễu họ amine và ammonia Trong môi trường kiềm, các amine và ammonia đều có thể bay hơi và các amine phân tử lớn ít tan trong nước. Do đó, chúng bị loại một phần khỏi nền bằng phương pháp lôi cuốn bay hơi trong môi trường pH 9 (pH > 12 Gln và Asn sẽ bị thủy giải tại nhiệt độ cao). Tuy vậy, hiệu suất loại tạp của phương pháp lôi cuốn là không triệt để, nhưng cũng đủ để các tạp chất amine và ammonia không cạnh tranh gây ảnh hưởng lên phản ứng dansyl hóa các amino acid (xem hình 3.27). Sau khi thổi khô, các amine nhỏ gần như bị loại hoàn toàn, nhưng ammonia còn một phần, urea hầu như không thay đổi. Sản phNm dansyl-ammonia có thể che lấp các mũi dansyl-amino acid (như arginine hay serine), do đó phải loại triệt để dansyl-ammonia khỏi dung dịch tiêm. Từ kết quả khảo sát, phương pháp chiết ly tâm với toluene là thích hợp nhất. Phương pháp này gồm hai bước: Bước 1: Chiết ly tâm 1 mL hỗn hợp sản phNm dansyl hóa (0.5 mL acetone và 0.5 mL đệm borate pH 9) với 1 mL toluene, hai lần. Pha nước được giữ trong ống nghiệm 1, pha toluene được chiết vào ống nghiệm 2. Bước 2: Chiết ly tâm dung dịch toluene (trong ống nghiệm 2) với 1 mL dung dịch HCl 2 %, hai lần. Pha nước bị loại bỏ, pha toluene cho vào ống nghiệm 1. Thổi khô ống nghiệm 1, thêm 0.5 mL pha động A2. Dung dịch trong ống nghiệm 1 là dung dịch tiêm vào máy HPLC. Phương pháp chiết toluene cho phép loại dansyl ammonia và các dansyl amine (phân tử nhỏ như methylamine) một cách triệt để (xem hình 3.28 và 3.29). Hình 3.27: Sắc ký đồ sau khi thổi khô trong môi trường kiềm (pH 9) của dung dich 20 ppm 23 amino acid chu#n, có chứa 0.5 % của ammonia, methylamine, dimethylamine và urea; X là mũi không cân bằng. 66 Hình 3.28: Sự phân bố của các dansyl-amino acid và dansyl ammonia trong 2 pha nước và toluene. Hình 3.29: Khả năng rửa tạp dansyl ammonia khỏi pha toluene theo nồng độ HCl trong pha nước (trong bước 2). Nhận xét và kết luận: • Thao tác và thiết bị khá đơn giản, giá thành thấp, kết quả có thể ứng dụng lên mẫu thật. • Độc hại vì phải dùng toluene, hơn nữa trong toluene thường có tạp chất. • Phương pháp chiết kết hợp với quá trình biến đổi pH mang lại sự chọn lọc cho các dẫn xuất dansyl amino acid, tuy nhiên hiệu suất thu hồi Tyr vẫn chưa ổn định trên các nền mẫu thật. Do đó, phần sau đề tài cố gắng vận dụng các hệ chiết pha rắn để thay thế cho kỹ thuật chiết lỏng-lỏng. 3.4.2. KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN TRAO ĐỔI ION Kỹ thuật chiết pha rắn, mặc dù cần các thiết bị chuyên dụng, giá thành cao hơn; nhưng lại có nhiều ưu điểm như: hệ số làm giàu cao đối với các nền mẫu nhiều 67 nước, có hệ số chọn lọc cao hơn kỹ thuật chiết lỏng-lỏng, hiệu suất thường ít thay đổi theo nền mẫu [8]. Theo phân tích về sự trên lệch điện tích giữa các amino acid và các tạp chất cố hữu của phương pháp dansyl hóa, chúng tôi cố gắng nghiên cứu các hệ chiết pha rắn trao đổi ion để thay thế cho phương pháp chiết lỏng-lỏng trong mục 3.4.1. Hình 3.30: Sơ đồ sử dụng SPE trao đổi ion [25] 3.4.2.1. Loại các tạp nhiễu phenols bằng SPE-SCX Theo tài liệu tham khảo [11], [25], chúng tôi chọn điều kiện ban đầu cho kỹ thuật SPE-SCX để loại các tạp nhiễu họ phenol như sau  Pha tĩnh: 500 mg của Dowex 50 được nhồi vào bộ vỏ SPE 3 mL (1x8 cm).  Các bước tiến hành: Trước đây, người ta thường dùng ammonia dư [11], để đưa pH của dung dịch rửa giải lên trên 10. Tuy nhiên, ammonia lại ảnh hưởng lên phản ứng dansyl hóa amino acid, do dó phải thay bằng tác nhân triệt ion khác. Trong đề tài này, chúng tôi chọn NaOH làm tác nhân triệt cation cho các amino acid, nhưng NaOH dư có thể đưa pH của dung dịch lên quá cao gây ra sự thủy giải một phần các amino acid ở dạng 68 amide. Vì vậy, dung lượng của cột cần đươc khảo sát để có thể sử dụng một lượng NaOH thích hợp cho sự triệt cation của các amino acid. Kết quả đường cong chuNn độ pha tĩnh (xem hình 3.31) chỉ ra rằng 2.4 mmol NaOH đủ để đưa pH dung dịch rửa giải lên hơn 9. Do đó, 1.2 mL NaOH 2 M được dùng để triệt cation cho amino acid. Vì vậy, các bước tiến hành được đề nghị như bảng 3.13. Hình 3.31: Đường cong chu#n độ 500 mg Dowex 50 với NaOH 0.2 M Hình 3.32: Khả năng loại tạp nhiễu họ phenol của SPE-SCX Bảng 3.13. Các bước tiến hành trên cột SPE-SCX Stt Công đoạn Hóa chất 1 Hoạt hóa 4 mL HCl 1 M, trung hòa bằng 150 mL H2O 2 Cân bằng 5 mL HCOOH 0.05 %, chỉnh pH đến 2 với HCl 1 M 3 Hấp phụ 1 mL mẫu có pH 2 4 Rửa tạp 1 5 mL HCOOH 0.05 %, chỉnh pH đến 2 với HCl 1 M 5 Rửa tạp 2 5 mL isopropanol 6 Rửa giải 1.2 mL NaOH 2 M và 2 mL borate 0.2 M, trung hòa bằng 1.3 mL HCl 1 M, định mức lên 5 mL với acetone 69  Khảo sát pH cho quá trình hấp phụ và rửa giải Kết quả thực nghiệm (xem hình 3.32) cho thấy khả năng loại các phenol của SPE-SCX là khá tốt, nhưng một số amino acid có hiệu suất thấp như Arg, Glu, Trp, và His. Điều này có thể là do tại pH 2, ion H+ cạnh tranh làm Glu (amino acid có nhóm bên mang điện tích âm) không thể lưu giữ tốt trên SPE-SCX, và pH rửa giải không đủ cao để triệt cation các amino acid có nhóm bên mang điện tích dương như Arg, Trp, và His. Vì vậy, pH của quá trình hấp phụ và rửa giải cần tối ưu lại. Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn các dung dịch cân bằng và pH hấp phụ mẫu lần lượt như sau: 0.01 % HCOOH (pH 3.17), 0.03 % HCOOH (pH 2.98), 0.05 % HCOOH (pH 2.87). Sau đó, dùng 1.3 mL NaOH để rửa giải. Kết quả thể hiện trong hình 3.33. Hình 3.33: Hiệu suất thu hồi các amino acid chu#n theo nồng độ HCOOH, cân bằng cột SPE-SCX  Khảo sát hệ số làm giàu trên cột SPE- SCX Kết quả thực nghiệm (xem hình 3.33) thể hiện hiệu suất thu hồi các amino acid chuNn tại 0.05 % HCOOH là trên 85 % và khá đồng đều. Tuy nhiên, hệ số làm giàu của kỹ thuật này chỉ là 20 % (1 mL mẫu giả/ 5 mL rửa giải và trung hòa). Vì vậy, chúng tôi khảo sát hệ số làm giàu lần lượt là 20 %, 100 %, 200 % tại điều kiện 0.05 % HCOOH (pH 2.80) cho cân bằng hấp phụ các amino acid và 1.3 mL NaOH 2 M cho rửa giải. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi ít thay đổi trong khoảng hệ số làm giàu đang khảo sát (xem hình 3.34). 70 Hình 3.34: Hiệu suất thu hồi theo hệ số làm giàu từ 20% đến 200% Nhận xét và kết luận:  Tuy thao tác phức tạp hơn, nhưng khả năng làm sạch của SPE- SCX cao hơn nhiều so với kỹ thuật chiết lỏng-lỏng.  Trong thí nghiệm khảo sát pH cho sự hấp phụ và rửa giải, các amino acid mang điện tích dương trên mạch nhánh có thiệu suất thu hồi trên 100% tại 0.01% HCOOH (thí nghiệm đầu tiên tăng pH rửa giải lên trên 12); điều này là do các amino acid này đã không được rửa giải từ các thí nghiệm trước. Vì vây, khi tiến hành trên mẫu thật, cần phải kiểm tra lại pH rửa giải để bảo đảm quá trình triệt cation cho các amino acid đa điện tích dương đến hoàn toàn.  Điều kiện tối ưu như sau Pha tĩnh: 500 mg của Dowex 50 được nhồi vào bộ vỏ SPE 3 mL (1x8 cm). Các bước tiến hành: theo bảng 3.14 Bảng 3.14. Các bước tiến hành trên cột SPE-SCX sau tối ưu Stt Công đoạn Hóa chất 1 Hoạt hóa 4 mL HCl 1 M, trung hòa bằng 150 mL H2O 2 Cân bằng 5 mL HCOOH 0.05 %, pH 2.8 3 Hấp phụ 1, 5 hay 10 mL mẫu có pH từ 2.8 đến 3.1 4 Rửa tạp 1 5 mL HCOOH 0.05 % 5 Rửa tạp 2 5 mL isopropanol 6 Rửa giải 1.3 mL NaOH 2 M và 2 mL borate 0.2 M, trung hòa bằng 1.3 mL HCl 1 M, định mức lên 5 mL với acetone 71 3.4.2.2. Loại các tạp nhiễu họ amine và ammonia bằng SPE-SAX Đây là định hướng mới (cho đến nay, vẫn chưa có công trình công bố) dựa trên công trình nghiên cứu chiết các dansyl-amino acid với thuốc thử dication (lưỡng nha) [12]. Theo tài liệu [12], các dansyl-amino acid sẽ ghép cặp ion với thuốc thử dication trong dung dịch nước có chứa 10 mM đệm borate pH 10. Điều này hoàn toàn phù hợp với điều kiện dansyl hóa của đề tài chúng tôi. Tuy nhiên, khi chúng tôi tiến hành khảo sát (tương tự như mục 3.4.2.1) trên hai loại pha tĩnh trao đổi anion là amberlite A 26 Cl- (type I) và amberlite XAD (type II), kết quả cho thầy khả năng loại dansyl ammonia kém, hiệu suất thu hồi các dansyl amino acid kém phân cực (như của Tyr, Hid, Lys,..) rất thấp (xem hình 3.35). Điều này có thể là do các pha tĩnh này chưa phù hợp. Vì vậy, phần nghiên cứu này cần được đầu tư nghiên cứu thêm trong các đề tài nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi. Hình 3.35: Kết quả loại ammonia trên SPE-SAX (amberlite A 26 Cl-) 3.4.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG XỬ LÝ MẪU TRÊN NỀN MẪU THẬT Từ khi khai triển đề tài cho đến này, phương pháp đã áp dụng thành công trên nhiều nền mẫu trong và ngoài trường ĐH KHTN, được gởi đến phòng TN PTTT. Sau đây, xin trình bày một số loại nền mẫu tiêu biểu, có chứa đồng thời nhiều loại amino acid. 72 Các nền mẫu được thủy phân trong môi trường acid (HCl 6 M có 0.1 % phenol) hoặc trong môi trường kiềm (NaOH 5 M có 0.1 % ascorbic acid). Sau đó, dịch thủy phân được pha loãng hoặc acid hóa đến pH < 1 (đối với thủy phân trong môi trường kiềm). Nội chuNn Nle hoặc hỗn hợp chuNn được thêm vào một phần của mẫu thật tạo thành mẫu kiểm tra. Mẫu thật và mẫu kiểm tra được loại các tạp chất họ phenol theo mục 3.4.1.1. Trung hòa và định mức pha nước. Lấy 1 mL pha nước của mẫu thật hoặc mẫu kiểm tra vào ống nghiệm 1 thêm 4 mL acetone để yên tại 15 oC khoảng 1 giờ, ly tâm (6000 rpm, 10 phút). Lấy 2 mL dịch nổi vào ống nghiệm 2, thổi khô. Tiếp theo, thêm 0.5 mL đệm 0.2 M borate pH 9 vào ống nghiệm 2 của mẫu thật hoặc mẫu kiểm tra, thổi khô. Loại tạp nhiễu họ amine và ammonia theo mục 3.4.1.2 (dansyl hóa theo mục 3.1). Phân tách các dẫn xuất theo mục 3.2. • Sắc ký đồ phân tích amino acid mẫu Trùn Quế đã thủy phân acid • Sắc ký đồ phân tích amino acid mẫu Trùn Quế đã thủy phân kiềm. 73 • Sắc ký đồ phân tích amino acid mẫu ruột non đã thủy phân acid. • Sắc ký đồ phân tích amino acid trong cao nước thủy phân acid. Kết quả hiệu suất thu hồi của các amino acid đều đạt trên 80 %. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi của tyrosine còn kém ổn định. Điều này có thể được khắc phục nếu quy trình loại ammonia trên SPE-SAX thành công. Kết quả hiệu suất thu hồi và các sắc ký đồ cho thấy tính khả dụng của phương pháp vừa xây dựng.