Nghiên cứu thu nhận Proteaza từ Bacillus subtilis và ứng dụng vào sản xuất dịch đạm thuỷ phân

LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học đang được xem là một ngành mũi nhọn của tương lai, thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Trong đó một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzym (men), nó đặc trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục năm vừa qua. Một thành tựu vô cùng to lớn của enzym là đã khám phá được cấu trúc hoá học và cơ chế xúc tác diệu kỳ của nó. Đặc biệt là đã tổng hợp được enzym nhân tạo, cho phép chúng ta trong tương lai không xa có thể tổng hợp được nhiều chất xúc tác mới theo kiểu xúc tác enzym để sử dụng trong thực tế. Từ khi enzym được phát hiện thì chúng ta không ngừng đưa nó vào trong thực tiễn của cuộc sống, phục vụ cho nhiều ngành như công nghiệp, nông nghiệp, y học, thực phẩm …Enzym được xem là thành phần quan trọng và tất yếu trong thực phẩm. Bằng cách bổ sung có định hướng và chọn lọc thì có thể tạo cho sản phẩm có được kết cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù khác. Chính tầm quan trọng đó mà mấy chục năm gần đây hình thành và phát triển mạnh kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 20 hãng sản xuất ra hơn 100.000 tấn chế phẩm enzym. Tuy nhiên, nó tập trung chủ yếu ở các nước phương Tây, còn ở phương Đông thì còn rất non kém. Ở Việt Nam, nó được xem là một ngành còn mới lạ, mới ở bước đầu phát triển. Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất enzym đang là một thách thức, đồng thời cũng là triển vọng cho ngành công nghệ sinh học của nước ta . Trong lượng enzym được sử dụng trên thế giới thì proteaza chiếm đến 60% hàm lượng enzym. Trước đây, phần lớn các proteaza đều được thu từ nội tạng động vật, nhưng ngày nay nó đang được thay thế dần bằng proteaza của thực vật và vi sinh vật rẻ tiền. Để sản xuất proteaza, người ta thường tận dụng các nguồn nguyên liệu từ những sản phẩm phế thải của các ngành chế biến khác như sản phẩm cặn bã của nhà máy sản xuất tinh bột, của nhà máy giấy, nhà máy đường …Xuất phát từ tầm quan trọng đó của các enzym và được sự hướng dẫn của cô giáo T.S Trần Thị Xô tôi chọn đề tài "Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bacillus subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm ". Sở dĩ tôi chọn nguyên liệu để thu nhận enzym là Bacillus subtillis là do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzym ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp, có thể chủ động về nguồn nguyên liệu, chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, vào khoảng từ 16 đến 100 giờ, do đó ta có thể thu hoạch hàng trăm lần một năm, có thể điều khiển sự sinh tổng hợp enzym dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzym được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzym, giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền . Nội dung được trình bày trong đề tài gồm 4 phần chính : Chương I : Tổng quan nguyên liệu . Chương II : Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu . Chương III : Kết quả và thảo luận . Chương IV : Kết luận . Do thời gian làm đề tài có hạn và những hiểu biết về enzym nói chung và proteaza nói riêng còn hạn chế. Cho nên phần trình bày không thể tránh khỏi những vướng mắc và sai sót. Em rất mong được sự góp ý nhiệt tình của các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn. CHƯƠNG I TỔNG QUAN NGUYÊN LIỆU 1.1. Enzym và các ứng dụng của chúng 1.1.1. Giới thiệu về enzym Enzym là những hợp chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000÷1.000.000 danton, được cấu tạo từ các L-
- axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Đó chính là các protein có hoạt tính xúc tác. Các enzym xúc tác cho hầu hết các phản ứng đã xảy ra trong cơ thể sống. Đảm bảo cho quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định để đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.[2,Tr9] Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm, hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Đặc biệt là nó thực hiện xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở nhiệt độ và áp suất bình thường, pH gần như pH sinh lý, hơn nữa enzym lại có khả năng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng. Nên việc sử dụng enzym làm xúc tác đem lại hiệu quả rất lớn . Enzym được phân làm hai nhóm chính: Enzym một cấu tử (enzym đơn giản) là các protein đơn giản làm nhiệm vụ xúc tác. Enzym hai cấu tử (enzym phức tạp) là các protein phức tạp làm nhiệm vụ xúc tác. Trong enzym hai cấu tử gồm có hai phần: Phần mang bản chất protein gọi là “Apoenzym“ hay “feron“ đảm bảo tính đặc hiệu cho phản ứng. Phần phi protein có tên gọi là “Coenzym“ hay gọi là “Agon” có khả năng tách ra và tồn tại một cách độc lập bên ngoài protein, tham gia vào quá trình xúc tác. Enzym mang bản chất là protein, có thể hoà tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong dung môi hữu cơ có cực, nhưng không hoà tan trong dung môi không phân cực. Enzym có tính lưỡng tính, dựa vào tính chất này ta có thể tiến hành phân tách và làm sạch bằng phương pháp điện di. Các enzym cũng là các protein nên nó chịu tác động của các yếu tố vật lý như nhiệt độ, các yếu tố hoá học như pH, dung môi, các kim loại... Do đó ta cần phải có sự lựa chọn các yếu tố để đảm bảo cho cường lực xúc tác của enzym là lớn nhất.[14,Tr5] 1.1.2. Các ứng dụng của enzym Việc nghiên cứu và ứng dụng các enzym đem lại ý nghĩa to lớn. Về mặt lý thuyết, trong 20 năm gần đây người ta đạt được những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu cấu trúc phân tử enzym và giải thích cơ chế phân tử quá trình sinh tổng hợp enzym trong tế bào, điều đó cho phép chúng ta trong tương lai không xa sẽ tổng hợp được nhiều chất xúc tác mới theo kiểu enzym để sử dụng trong thực tế, đem lại hiệu quả kinh tế với các enzym khó tách từ các nguyên liệu tự nhiên. Bên cạnh những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lý thuyết về enzym. Các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả cao. Để sử dụng enzym trong thực tế có thể tiến hành theo hai cách sau: Điều hoà định hướng tác dụng của enzym trong các nguyên liệu chứa nó. Tách enzym ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các quá trình sản xuất. Khi sử dụng enzym theo hướng thứ nhất trong nhiều trường hợp có thể đơn giản hơn. Tuy nhiên cách sử dụng này hạn chế phạm vi ứng dụng của enzym vì chỉ có thể dùng enzym đối với quy trình chế biến chính nguyên liệu của nó. Sử dụng enzym theo cách thứ hai có hiệu quả hơn vì chế phẩm enzym nhận được có thể sử dụng rộng rãi tuỳ theo yêu cầu. Hơn nữa còn có thể dễ dàng điều khiển hoạt động của enzym theo ý muốn và cho phép đề ra quy trình sản xuất. Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong hoá phân tích để định tính và định lượng các chất, trong nông nghiệp, trong y học, trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp hoá học và nhiều ngành công nghiệp khác như công nghiệp dệt, công nghiệp da v.v ... 1.1.2.1. Ứng dụng trong hoá phân tích để định tính và định lượng Khi sử dụng enzym để định lượng các chất có thể tiến hành theo hai cách: Để định lượng một chất nào đó ta dùng enzym có tác dụng phân giải riêng chất ấy. Sau đó dùng một trong các phương pháp phân tích thông thường để định lượng các chất sau phản ứng, từ đó suy ra lượng chất cần phân tích. Phương pháp này để đạt được kết quả tốt nhất cần sử dụng enzym có tính đặc hiệu cao và chế phẩm enzym thật tinh khiết. Nếu chất cần phân tích có tác dụng kìm hãm hoặc kích thích đặc hiệu một enzym nào đó, ta có thể định lượng bằng cách xác định mức độ ảnh hưởng của chúng đến hoạt độ enzym, đối chiếu với bảng hoặc đồ thị chuẩn để suy ra lượng chất cần phân tích . 1.1.2.2. Ứng dụng trong y học Trong y học có thể sử dụng enzym để chữa bệnh, để sản xuất các sinh tố và các chất kháng sinh. Nhiều enzym hiện nay được dùng để điều chế thuốc như papain, pepxin, bromelain… Có thể dùng enzym, coenzym để tăng thêm lượng enzym cho cơ thể, loại bỏ các phần mô bị hỏng, bị thối ở các ổ viêm, các vết thương, chữa các bệnh thiếu enzym bẩm sinh, chẩn đoán nhanh một số bệnh, làm các nội quan nhân tạo hoặc có thể dùng enzym để chữa các bệnh tiêu hoá kém, hoà tan các cục máu đông làm nghẽn mạch máu. Ngoài ra có thể dùng enzym để phân giải các thuốc khi cơ thể bị phản ứng mạnh với các thuốc này hoặc dùng các chất kìm hãm đặc biệt để kìm hãm các quá trình tăng quá mức gây tác hại cho cơ thể. 1.1.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp Enzym được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp. - Trong công nghiệp xà phòng dùng để làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp. - Sử dụng enzym amylaza để khử hồ trên vải trong công nghiệp dệt. - Sử dụng proteaza của Asp-oryzae 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp thuộc da. - Sử dụng xenlulaza, thuỷ phân bào mòn màng xenluloza để trích ly các chất keo trong rong biển. - Trong công nghiệp giấy sử dụng enzym để sản xuất bột giấy và giấy. 1.1.2.4. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Bằng cách sử dụng enzym đã hỗ trợ một cách tích cực cho lĩnh vực thực phẩm như để tăng độ tơi xốp, độ ngọt, màu sắc cho bánh mì, người ta đưa vào trong bột nhào 0,002-0,003% (-amylaza, cũng có thể sử dụng amylaza thay cho HCl, thủy phân tinh bột để sản xuất glucoza. Còn dựa vào khả năng thủy phân protein của proteaza người ta bổ sung nó vào trong chế biến thịt, cá, sữa, đồ hộp, cá rán, chế biến nước mắm ngắn ngày. Hay dùng pectinaza để tăng hiệu suất ép nước làm dịch quả.... Khi sử dụng chế phẩm enzym để chế biến các sản phẩm nông nghiệp như chè, thuốc lá…thì thường tăng nhanh quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử dụng enzym còn có thể cải tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến, trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác. 1.1.2.5. Ứng dụng trong nông nghiệp Sử dụng các chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm nông nghiệp như: Sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt trước khi gieo. Dùng enzym để sản xuất thức ăn cho động vật nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng cho thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn. Sử dụng enzym để chuẩn bị thức ăn cho gia súc có thể tiến hành theo hai cách: Thêm trực tiếp enzym vào trước khi dùng. Thêm enzym để xử lý sơ bộ thức ăn. Cách thứ nhất đơn giản hơn nhưng cách thứ hai lợi hơn vì khi xử lý ngoài cơ thể ta có thể dễ dàng tạo điều kiện thích hợp về pH, nhiệt độ cho enzym hoạt động mạnh, do đó hiệu quả phân giải thức ăn lớn hơn so với cách thứ nhất. Để sử dụng enzym trong chăn nuôi, tốt nhất là dùng các chế phẩm enzym từ vi sinh vật và chưa tinh chế, vì thành phần enzym, đặc biệt là các enzym thuỷ phân trong các chế phẩm này thường phong phú hơn nhiều so với chế phẩm enzym từ động vật. Do vậy khi thêm chế phẩm enzym vi sinh vật vào thức ăn của động vật trưởng thành, khoẻ mạnh vẫn có ảnh hưởng rõ rệt. Trong khi đó nếu thêm chế phẩm enzym động vật lại không có hiệu quả gì. Khi sử dụng dụng chế phẩm enzym để bổ sung vào thức ăn cần lựa chọn chế phẩm phù hợp cho từng loại động vật. Vấn đề quan trọng hơn nữa là phải xác định lượng enzym thích hợp cần thêm vào thức ăn để đạt kết quả tốt nhất. Ngoài ra trong nông nghiệp có thể sử dụng enzym để xử lý hạt trước khi gieo nhằm rút ngắn thời gian nảy mầm và tăng sản lượng thu hoạch.[16,Tr13][2,Tr12] 1.2. Enzym proteaza 1.2.1. Giới thiệu về enzym proteaza Proteaza là enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự [2,Tr127 ]. Dưới tác dụng của enzym proteaza, protein bị thuỷ phân theo sơ đồ sau : Protein pepton polypeptit peptit axit amin. Đây là quá trình thuỷ phân tương đối phức tạp và có sự tham gia của nhiều loại proteaza khác nhau. Nhiều proteaza cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin (CO-OH). Từ thế kỷ XVIII, nhà bác học Pháp Roemur đã phát hiện dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hoá thịt. Tuy nhiên đến năm 1875 Convisart mới tách được từ dịch tụy, đó là proteaza đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Từ đó nhiều nhà bác học nghiên cứu và tách được nhiều enzym khác nhau ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzym hệ tiêu hoá, người ta cũng có những quan sát về những proteaza trong máu. Schmidt (1869-1872) đã nêu giả thiết trong máu có enzym trombin tham gia trong quá trình làm đông máu và tác giả thu được enzym này và kết tủa bằng cồn. Các proteaza thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1874 Group-Besanez công bố đã nhận được proteaza từ hạt một loại đậu. Tác giả cũng nhận thấy rằng dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động phân giải protein nhưng bằng chứng này không vững chắc. Vì vậy Wurtz được xem là người đầu tiên tách được proteaza thực vật (1879). Ông nêu rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa proteaza, khi dùng cồn để kết tủa thu được chế phẩm không tinh khiết (100g/1cây) gọi là papain. Đến đầu nữa thế kỷ XX người ta mới phát hiện thêm các peptithydrolaza khác như: bromelain-proteaza từ cây dứa, captesin-proteaza của mô cơ động vật. Nhờ kết tinh được enzym có độ tinh khiết cao nên người ta nghiên cứu được cấu trúc phân tử, cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hoá lý và tính đặc hiệu của các proteaza. Từ năm 1950 trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về proteaza cho thấy các proteaza khác nhau về cơ chế phản ứng, phân hủy các cơ chất có cấu trúc khác nhau, điều kiện môi trường hoạt động khác nhau. 1.2.2. Nguồn thu proteaza Các proteaza khá phổ biến trong động vật, thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên sự phân bố của chúng không đồng đều trong các mô của các loài và các cơ quan. Có thể thu nhận proteaza theo 3 nguồn chính sau : Từ thực vật : Thu nhận protein từ thực vật cũng chiếm một tỉ lệ quan trọng trong công nghệ enzym. Một số enzym thực vật được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công nghiệp. Trong số đó phải kể đến bromelain có trong dứa, papain có trong đu đủ và ureaza có trong các cây họ đậu v.v… Việc nghiên cứu proteaza thực vật được bắt đầu vào thế kỷ XIX gắn liền với công trình nhà bác học người Nga Kieegov, ông đã chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch có tác dụng chuyển hoá tinh bột thành đường. Và đến năm 1962 lần đầu tiên Sumner đã tách proteaza thực vật ở dạng tinh thể (ureaza). Năm 1995, Võ Sỹ Hùng nghiên cứu thu nhận proteaza từ ruột bí đao, đến năm 1997 các tác giả đã nghiên cứu tìm cách ứng dụng proteaza thu được vào quy trình sản xuất phomat phù hợp với điều kiện Việt Nam.Trong những năm gần đây, nhiều tác giả trong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số proteaza từ thực vật ở mức độ tinh khiết khác nhau tuỳ theo mục đích sử dụng như papain từ nhựa đu đủ xanh, bromelain từ võ, lõi, và lõi đầu dứa với hiệu suất thu hồi chế phẩm thô tương đối cao. Bromelain được điều chế từ vỏ, lõi, chồi dứa, nguồn cung cấp chính của enzym này là hãng Biochem, Bangkok Thái Lan. Từ động vật : Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhầy dạ dày, tim,…những phế liệu của công nghiệp thịt -dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch tuỵ có chứa amylaza, lipaza, proteaza, ribonucleaza và một số enzym khác. Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê nghé, người ta thu chế phẩm Renin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepxin từ dạ dày động vật. Từ mô cơ (gan, thận, phổi, tim, dạ con) tách được captexin A, B, C, D, từ huyết tương tách được enzym trombin. Tuy nhiên với nguồn nguyên liệu để sản xuất enzym là động vật thì nguyên liệu đó phải tươi tốt, lấy ngay sau khi giết mổ, bảo quản ở -200C. Đây là vấn đề khó khăn cho nên thu enzym proteaza từ động vật ít được quan tâm hơn so với thực vật và vi sinh vật. Từ vi sinh vật: Với lí do về kinh tế, công nghệ mà hai nguồn nguyên liệu động vật, thực vật không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với qui mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzym nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa hẹn. Phần lớn enzym được sản xuất từ vi sinh vật. Các vi sinh vật chủ yếu được sử dụng thuộc loài Bacillus hoặc loài Aspergillus. Năm 1950, hãng Novo của Đan Mạch chào hàng chế phẩm enzym lên men đầu tiên, là
-amylase lấy từ vi khuẩn . Trong những năm gần đây, với số lượng enzym proteaza bán ra chiếm 60% tổng lượng enzym thì việc thu nhận proteaza từ vi sinh vật là điều tất yếu. + Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh proteaza như: Vi khuẩn: Giống Bacillus như: Bac.subtillis, Bac.thermophilus, Bac.brevis... ; giống Clostridium như Cl.perfrigens, Cl.sporogens ... Xạ khuẩn: Từ giống Streptococus như: Str.griseus, Str.rimosus... Nấm mốc: Giống Asp như: Asp.oryzae, Asp.Niger, Asp.awamori, Asp.candidus, Asp.flavus... So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.Trước hết hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym giống nhau nên proteaza vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Nếu khi dùng enzym vào mục đích sử dụng thì rất hiệu quả, tuy nhiên nó gây khó khăn cho việc tách và tinh chế một enzym. 1.2.3. Phân loại proteaza : 1.2.3.1. Dựa vào cơ chế thuỷ phân : Phân làm hai nhóm : Exoproteaza : là những enzym thuỷ phân các liên kết đầu mút của chuỗi mạch polypeptid. Các enzym có khả năng thuỷ phân liên kết _NH_ của liên kết peptid gọi là aminopeptidaza, còn enzym xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu mạch cacbon -CO- của mạch polypeptid được gọi là cacboxypeptidaza. Endoproteaza : là những enzym xúc tác sự phân giải các liên kết peptid ở giữa mạch polypeptid như dipeptithydrolaza. 1.2.3.2. Dựa vào trung tâm hoạt động : Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,v.v… Hartley đã phân loại proteaza vi sinh vật thành 4 nhóm chính : Các proteaza sinh kiềm: có pH tối thích trong vùng kiềm và thường chứa một nhóm Serine quan trọng. Nhóm này có thể được phát hiện bằng các chất ức chế nhất định như dizo-propylfluophotphat. Nó bị vô hoạt nhanh chóng ở nhiệt độ lớn hơn 600C, điểm đẳng điện trong khoảng cao 9,5÷10,5, có khả năng phân giải este và liên kết amit của các dẫn xuất axit và axit amin. Các proteaza-kim loại: pH tối thích trong vùng trung tính, trung tâm hoạt động có chứa nguyên tử kim loại và bị ức chế bởi EDTA, nó sẽ bị mất hoạt tính hoàn toàn ở nhiệt độ 700C sau 30 phút. Các proteaza axit: trung tâm hoạt động có chứa nhóm -COOH có pH tối thích trong vùng 2÷5 và nó thuộc loại khá bền với nhiệt. Các proteaza cystein: có pH tối thích trong vùng trung tính đến kiềm yếu và bị ức chế bởi thuốc thử SH như P-clomecuribenzoat, trung tâm hoạt động là nhóm -SH của cystein. Sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thực sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố khác.[17,Tr177] 1.2.4. Ứng dụng của proteaza : Các enzym proteaza nói chung được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học... 1.2.4.1. Trong quá trình chế biến cá Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá... proteaza vốn có trong cá sẽ thủy phân một phần protein của cá. Tuy nhiên quá trình này thường xảy ra chậm và yếu, người ta đưa thêm proteaza từ ngoài vào sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân, rút ngắn thời gian chế biến. Protein của cá bị thủy phân mạnh nên quá trình loại mỡ, loại xương khỏi phần thịt cá bị thủy phân (trong sản xuất bột cá) được dễ dàng hơn, lượng nước mắm cốt thu được cũng nhiều hơn hẳn so với mẫu đối chứng. Thêm proteaza vào làm biến đổi nhanh chóng cấu tạo của mô cá do đó muối và các gia vị dễ dàng thấm vào, rút ngắn thời gian muối cá, thời gian xông khói cũng như thời gian xử lý nhiệt khi chế biến cá. Trong nhiều trường hợp khi thêm proteaza còn làm tăng hương vị của sản phẩm. 1.2.4.2. Trong công nghiệp thịt Proteaza được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị của thịt sau khi chế biến. Người ta xác định rằng nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng hương vị rõ rệt của sản phẩm nhận được: như papain được sử dụng để làm mềm thịt, bromelain để thủy phân gan bò... Thịt sau khi làm mềm có thể chế biến thành các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Người ta còn dùng proteaza để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da... Dùng proteaza để thủy phân protein thường ít bị hao hụt axit amin như khi dùng phương pháp hoá học. Thủy phân protein bằng axit thường mất khoảng 30÷50% serine, treonine, còn cystein và cystine thì bị thủy phân hoàn toàn. Để thủy phân sâu sắc protein cần dùng các proteaza có tính đặc hiệu rộng rãi, tuy nhiên khi thủy phân bằng enzym khó lòng thủy phân hoàn toàn protein. Cho nên để thủy phân hoàn toàn protein cần dùng hỗn hợp proteaza từ các nguồn khác nhau. Một ưu điểm khác của phương pháp thủy phân protein bằng proteaza là không phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sẫm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm phụ khác. 1.2.4.3. Trong quá trình chế biến sữa Proteaza không những có khả năng thủy phân protein mà còn có khả năng đông tụ sữa. Ở đây có sử dụng những proteaza có tác dụng làm đông tụ sữa: như renin, pepxin và một số proteaza vi sinh vật khác. Ngoài ra để đáp ứng nhu cầu thực tế, ngày nay proteaza thực vật cũng được sử dụng để làm đông tụ sữa, trong đó fixin từ các cây Ficus và bromelain từ dứa cũng được sử dụng vào mục đích này. Tuy nhiên tất cả proteaza vi sinh vật và thực vật đều khác với Renin của động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ sữa mà còn có thể thủy phân sâu sắc cazein, do đó có ảnh hưởng xấu đến chất lượng của phomat. Vì vậy trong quá trình làm phomat, Renin vẫn chiếm một vị trí đặc biệt trong các proteaza khác. Dưới tác dụng của Renin, cazein của sữa sẽ đông tụ thành khối đặc không hoà tan và tất cả mỡ của sữa sẽ được giữ trong kết tủa này. Các proteaza sẽ thủy phân một phần các axit amin các peptit thấp phân tử, các chất này ảnh hưởng đến hương vị của phomat. Ngoài ra proteaza cũng được dùng để thu cazein kỹ thuật, dùng trong ngành kỹ nghệ như: vecni, chất màu, hương liệu, proteaza cũng được dùng trong sản xuất chao. 1.2.4.4. Trong công nghiệp nước giải khát Proteaza được dùng trong bia, rượu vang, rượu mùi, nước quả và ổn định chất lượng, cụ thể proteaza thường dùng là papain và bromelain. Ngoài ra proteaza được dùng trong sản xuất rượu, ở đây nó phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylaza, do đó tăng nhanh quá trình chuyển hoá tinh bột. 1.2.4.5. Trong công nghiệp da Proteaza được dùng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các proteaza sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi collagen. Khi xử lý bằng proteaza tính đàn hồi của da cũng tăng lên. Sử dụng proteaza cũng rút ngắn được quá trình tẩy lông, lượng lông thu được tăng lên 25÷30% so với phương pháp hoá học. Sử dụng enzym trong công nghệ thuộc da tránh được độc hại cho công nhân, tránh được ô nhiễm môi trường. 1.2.4.6. Trong công nghệ dược phẩm và y học Proteaza được dùng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein của những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tụy tạng không bình thường, thiếu enzym dùng phân giải các chất hữu cơ trong cơ thể, chữa bệnh tắc tĩnh mạch. Proteaza dùng sản xuất môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein trong nuôi cấy sinh vật để sản xuất chất kháng sinh, chất kháng độc... Ngoài ra còn dùng chế phẩm proteaza để cô đặc và tinh chế huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. Trong số các proteaza: papain dùng chế thuốc trị bệnh, bromelain được dùng để điều trị viêm loét, rối loạn tiêu hoá, giảm phù nề, tụ huyết, giúp vết thương chóng lành, bromelain có tính an thần làm tăng khả năng hấp thụ kháng sinh lên bốn lần, bromelain còn dùng để chữa trị hen suyễn. 1.2.4.7. Trong công nghệ phim ảnh Proteaza vi khuẩn và xạ khuẩn được dùng để tái sinh các các nguyên liệu cảm quang khác nhau như phim điện ảnh, giấy phim, phim Rơnghen, phim chụp máy bay... Các proteaza sẽ được phân giải và hoà tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. 1.2.4.8. Trong nông nghiệp Proteaza dùng trong chăn nuôi để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của động vật hoặc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn gia súc gia cầm. 1.2.4.9. Trong sản xuất tơ tằm Sợi thu được sau khi kéo ở kén ra thường chứa 30% xerixin. Chỉ cần một lượng nhỏ xerixin nằm lại trên tơ lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó ta dùng chế phẩm proteaza từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn. 1.2.4.10. Trong nghiên cứu khoa học Proteaza được dùng để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Trong thời gian gần đây người ta dùng chế phẩm proteaza không hoà tan bằng cách gắn vào những chất không tan như xenlluloza, sephadex, sepharoza... Enzym được giữ trên chất mang nhờ lực hấp phụ, lực liên kết hoá trị... để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong thực phẩm, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Ngoài ra proteaza còn được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt, thuốc đánh răng... làm cho da mịn, làm sạch cao răng, chữa viêm lợi và trong chừng mực nhất định có tác dụng diệt vi khuẩn. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ vi sinh vật : Quá trình sinh tổng hợp enzym nói chung cũng như quá trình tổng hợp proteaza của vi sinh vật nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : độ ẩm, nhiệt độ, pH, độ thông khí, thành phần môi trường .v.v…do đó sự sinh tổng hợp proteaza của Bacillus subtilis cũng không nằm ngoài quy luật chung đó . 1.2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Tuỳ theo từng loại vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp khác nhau: các loài nấm mốc topt= 22 (320C còn vi khuẩn thì thích hợp ở nhiệt độ cao hơn topt= 35 (550C. Nói chung đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzym không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. 1.2.5.2. Ảnh hưởng pH của môi trường : Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi truờng ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym ở vi sinh vật. Hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật, với các nấm mốc pHopt=6 (6.5, với vi khuẩn thì pH= 6.6 (7.4. Khi dùng phương pháp bề sâu thì pH có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự tích luỹ proteaza trong môi trường. pH môi trường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH ban đầu của môi trường thích hợp cho các loài vi khuẩn là khác nhau, với nấm mốc pH= 3.8 (5.6, còn với vi khuẩn pH = 6.2( 7.4. 1.2.5.3. Độ thông khí : Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp proteaza. Tuy nhiên ảnh hưởng này khác nhau tuỳ theo vi sinh vật.Trong một số trường hợp, thiếu oxi tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình sinh tổng hợp proteaza. Lượng oxi thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp ở các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau.Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lại kìm hãm mạnh sự sinh tổng hợp enzym. 1.2.5.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường : Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym. Để tăng lượng enzym trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng chất cảm ứng. Đối với một vi sinh vật nhất định, điều kiện cho quá trình tổng hợp các enzym khác nhau không giống nhau. Nắm vững các quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh vật tổng hợp định hướng một enzym xác định. Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Ở vi khuẩn Bac.subtilis, quá trình tổng hợp proteaza xảy ra khá mạnh khi dùng cacbon là tinh bột với nồng độ khoảng 2%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống dưới 2% sẽ làm giảm một ít hoạt độ phân giải protein của dịch môi trường nuôi cấy. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp proteaza vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ thường dùng là : các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein v.v…Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon và nitơ thích hợp cần phải chọn tỷ lệ thích hợp. Có như vậy mới bảo đảm cho việc sinh proteaza là lớn nhất. Ngoài những yếu tố kể trên thì các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin và các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá sinh tổng hợp. Người ta đã chứng minh được rằng với Bac.subtilis có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau để thu được các chế phẩm có tỷ lệ khác nhau hoặc là chủ yếu là phức hệ amylaza hoặc chủ yếu là hệ proteaza. Theo Ortrosko (1977) để thu proteaza từ Bac.subtilis thì thành phần môi trường gồm: dịch thuỷ phân cazein :0.3%, glucoza :1%, MgSO4.7H2O:0.05%, KH2PO4 :0.005%. Còn để thu amylaza thì dùng bằng nước chiết cám 20% . 1.3. Một số nghiên cứu, ứng dụng của proteaza hiện nay : 1) Theo Thạc sĩ Vũ Xuân Dũng, năm 1997 đã làm nghiên cứu “Phân lập, lựa chọn chủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính proteaza cao và thăm dò khả năng ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày”. Sau khi phân lập được chủng vi khuẩn sinh proteaza mạnh kí hiệu là Bacillus D15 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm ngắn ngày. Khi bổ sung 5% dịch nuôi cấy vào chượp cá sau 30 ngày thuỷ phân thì hàm lượng nitơ toàn phần đạt :22.6g/kg, nitơ foocmol đạt:12.7g/kg, nitơ amin đạt:7.5g/kg. Dịch lọc từ chượp sau 30 ngày đạt được những chỉ tiêu chuẩn của chượp chín và đạt được các chỉ tiêu chất lượng về cảm quan: màu vàng sáng, mùi thơm, vị mặn, ngọt (7,tr125_133( 2) Dùng Bacillus subtilis CNTP_B_08 có khả năng sinh tổng hợp (_amylaza cao, để ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia nhằm thay thế một phần malt đại mạch bằng các loại nguyên liệu có sẵn trong nước như: ngô: 30%; gạo: 30%; malt: 40%. Do đó giá thành sản phẩm hạ 22% (báo cáo khoa học, 43) 3) Nghiên cứu và triển khai sản xuất nước mắm ngắn ngày vào thực tiễn bằng bromelain từ dứa. 4) Ảnh hưởng của muối ăn đến quá trình thuỷ phân cá mối bằng proteaza của Bacillus và nồng độ muối thích hợp là 3% (Tạp chí thuỷ sản ,2003) 5) Theo kết quả nghiên cứu thu nhận và bảo quản proteaza từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bac.subtilis. Proteaza của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất 40 (50oC ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn ( trên 60oC ) thì proteaza mất hoạt độ đáng kể chỉ còn lại khoảng 40%. pH thích hợp cho proteaza hoạt động là 6.4 (7. Proteaza vi khuẩn rất bền với nhiệt độ, ở nhiệt độ 50oC, hoạt độ proteaza không giảm sau 6h. Ở nhiệt độ cao hơn thì hoạt độ proteaza giảm dần theo thời gian và đặc biệt ở nhiệt độ 70oC thì hoạt độ proteaza giảm rất nhanh. 6)"Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh proteaza của Bac.subtilis" là kết quả của quá trình nghiên cứu của Th.S Đỗ Thị Bích Thuỷ và TS Trần Thị Xô, năm 2004 đã cho thấy nguồn cacbon và nitơ có tác dụng kích thích cao nhất là tinh bột hoà tan và cazein. Thành phần nuôi cấy chủng Bac.subtilis ở quy mô phòng thí nghiệm bao gồm: pepton 1%, cao thịt 0.3%, muối 0.5%, tinh bột hoà tan 1.75%, cao nấm 0.1%. pH ban đầu bằng 6.5 và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp ứng với môi trường tối ưu để Bac.sutillic sinh proteaza mạnh nhất là 35oC. CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu được sử dụng là cá cơm than được đánh bắt từ biển Quảng Nam -Đà Nẵng. Muối biển dạng hạt của Sa Quỳnh - Quảng Ngãi. Chủng vi khuẩn Bacillus subtillis C10 từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chế biến nông sản trường Đại học Nông Lâm - Huế. 2.1.2. Các hoá chất Hoá chất : Các hoá chất tinh khiết : K2HPO4, NaH2PO4.2H2O, foocmol 40%, cồn tuyệt đối, NaOH 0.1N, H2SO4 0.1N.Các chỉ thị màu: thimolphtalein, phenolphtalein, metyl đỏ. NaCl tinh khiết, cao nấm, agar-agar từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng . Pepton, cazein tinh khiết, tinh bột sắn, tinh bột tan, phế liệu tôm từ phòng thí nghiệm Hoá Sinh bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm_Sinh Học . Thiết bị : Máy li tâm : MIRRO 24R Tủ ổn định nhiệt, máy lắc từ, thiết bị thanh trùng, thiết bị màng lọc vô khuẩn, thiết bị phân tích đạm Kiendal, tủ lạnh đông –200C Máy đo pH, bút đo pH Các thiết bị xay thô, xay mịn, nghiền Các loại cân kỹ thuật chính xác đến 10-2, 10-4 Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm . 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1. Quy trình thu nhận dịch chiết enzym : Qui trình thu nhận enzym proteaza từ Bacillus subtilis: Các chế phẩm enzym được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác nhau. Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật trong đó có chứa enzym được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó không gây tác hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này. Cũng có nhiều trường hợp người ta cần đến chế phẩm enzym tinh khiết với mức độ khác nhau tuỳ theo yêu cầu sử dụng . Qua tài liệu nghiên cứu về cách thu nhận proteaza vi sinh vật mà enzym được khuếch tán ra môi trường ( nuôi theo phương pháp chìm ) thì để thu dịch enzym người ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng cách ly tâm hoặc ép lọc với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất tạo kết tủa nếu cần thiết. Dựa vào các tài liệu đã nghiên cứu, tôi xây dựng qui trình thu nhận enzym để nghiên cứu như trên. Thuyết minh qui trình công nghệ : Hoạt hoá giống Bacillus subtilis ( nuôi cấy tăng sinh ): Giống Bacillus subtilis sau khi phân lập được giữ trong môi trường thạch nghiêng ở 50C. Trước khi đưa vào sản xuất enzym, giống này được hoạt hoá bằng cách chuyển vào 1ml môi trường tối ưu cơ bản trong ống nghiệm và nuôi cấy lắc 200vòng/phút, trong 24h, ở 350C. Chuẩn bị môi trường: tiến hành theo mục 1 phụ lục Nuôi cấy sản xuất enzym: tiến hành theo mục 2 phụ lục: Quá trình nuôi cấy như sau: Cho giống tăng sinh vào nuôi trong môi trường thay thế với tỉ lệ giống là 1%. Quá trình nuôi được thực hiện trong tủ ấm có máy lắc 200vòng/phút, nhiệt độ 350C. Tách và tinh chế enzym: Dịch chiết enzym thô thu được bằng cách ly tâm lạnh ở 4000vòng/phút , ở nhiệt độ 40C, trong 10 phút . 2.2.2.Xác định hoạt độ enzym proteaza bằng phương chuẩn độ foocmol: 2.2.2.1.Nguyên tắc: Theo mức độ thuỷ phân protein, các nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng dần, do đó dựa vào sự tăng của một trong các nhóm này để xác định hoạt độ enzym. Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng foocmol bao vây nhóm acid amin và chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ xác định. Từ lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương ứng. Hoạt độ enzym được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành trong 1h ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau 1h ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1mg đạm amin. 2.2.2.2.Hoá chất : Được thực hiện theo mục 4 phụ lục 2.2.2.3.Cách tiến hành: Được thực hiện theo mục 3 phụ lục 2.2.2.4.Tính kết quả:
Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch nghiên cứu là: HđP=
đơn vị V1: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình thí nghiệm V2 : số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình kiểm tra f: Hệ số chỉnh lý của dung dịch dung dịch NaOH 0.1N t: thời gian enzym tác dụng, h V: thể tích dung dịch enzym đã dùng, ml 1,42: là số mg đạm amin tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N 2.2.3. Phương pháp xác định nitơ foocmol: 2.2.3.1.Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở dụng foocmol bao vây nhóm amin và chuẩn độ nhóm carboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ dung dịch xác định. Từ lượng kiềm dùng chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương ứng. 2.2.3.2.Cách tiến hành: được thực hiện theo mục 5 phụ lục 2.2.3.3.Tính kết quả: Hàm lượng nitơ foocmol của 1lít nước mắm được tính theo công thức : X =
V1 -Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml V2 -Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml 10 -Thể tích dịch lấy chuẩn 100 - Hệ số pha loãng 0,0014-số gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N 1000: hệ số quy đổi ra lít 2.2.4. Xác định hàm lượng nitơ amôniac: 2.2.4.1.Nguyên tắc: Trong thực vật, amôniac tự do chiếm một lượng không đáng kể. Trong các sản phẩm thực vật, NH3 có ở dạng tự do cũng như liên kết (chủ yếu là ở dạng muối của các axit hữu cơ), ở một số phẩm vật thực phẩm như thịt,cá, chao, nước mắm, các loại đồ hộp thịt cá…amôniac tích tụ một lượng khá lớn, thường tồn tại dưới dạng muối NH4Cl, (NH4)2SO4... Việc xác định nó có ý nghĩa đặc trưng cho mức độ hư hỏng của sản phẩm, để giải phóng NH3 ra khỏi dung dịch, người ta thường dùng các kiềm yếu ít tan trong nước như MgO, CaO. Cất amôniac ở nhiệt độ 35-400C và dưới áp suất thấp khoảng 15-20mmHg. 2.2.4.2.Hoá chất: NaOH 30%, H2SO4 0.1N, NaOH 0.1N. Thuốc thử: + Thuốc thử metyl đỏ + Thuốc thử phenolphtalein 1% trong cồn tuyệt đối. 2.2.4.2.Cách tiến hành: tiến hành theo mục 6 phụ lục 2.2.4.3.Tính kết quả: Hàm lượng amoniac (X) được tính bằng g/l theo công thức sau : X =
Trong đó : V1-Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml V2-Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml 50-Thể tích nước mắm pha loãng cho vào bình cất máy cất đạm 0,0014- gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N 1000:hệ số quy đổi ra lít 2.2.5. Xác định hàm lượng nitơ amin (đạm tan): Hàm lượng nitơ amin chính là hiệu số giữa nitơ foocmol và nitơ amoniac, đặc trưng cho lượng đạm tan trong dung dịch. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thu nhận enzym từ Bacillus subtilis : 3.1.1.Hoạt hoá giống và quan sát một số đặc điểm hình thái của Bac.subtilis: Chủng vi khuẩn Bac.subtilis sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chế biến nông sản trường Đại học Nông Lâm -Huế. Sau một thời gian bảo quản, để đảm bảo giống không bị thoái hoá, tôi tiến hành hoạt hoá và tuyển chọn lại. Để thu được chủng vi khuẩn Bac.subtilis thuần khiết, chúng tôi tiến hành nuôi nó trên môi trường thạch-thịt-pepton trong 24h ở 300C. Rồi tiến hành phân lập lựa chọn dựa trên nguyên tắc pha loãng để tách từng khuẩn lạc riêng biệt. Để thuần khiết vi khuẩn Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng môi trường thạch-thịt-pepton, được hấp tiệt trùng 1210C trong 30 phút. Bằng phương pháp pha loãng thập phân canh trường chứa vi khuẩn như ở sơ đồ hình 1 đã mô tả. Tương ứng với mỗi độ pha loãng thập phân lấy 0,1ml canh trường cho lên bề mặt của môi trường thạch trong mỗi hộp peptri. Dùng que trang dàn đều canh trường trên bề mặt thạch nhằm thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Các hộp peptri được nuôi trong 24h ở 350C, các khuẩn lạc xuất hiện thì đem ra quan sát. Khuẩn lạc mọc trên hộp peptri phụ thuộc vào độ pha loãng . Sơ đồ pha loãng như sau: Canh trường Vi khuẩn 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml Bac.subtilis 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Môi trường Thạch-thịt-pepton 1 2 3 4 5 Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và chọn giống Bảng 1:Một số đặc điểm về hình thái của khuẩn lạc Bac.subtillis trên môi trường thạch-thịt-pepton Độ pha loãng  Số khuẩn lạc đếm được  Đặc điểm khuẩn lạc   10-6  Rất nhiều  Các khuẩn lạc rất nhỏ, dính lại với nhau   10-7  98  7 khuẩn lạc dính lại với nhau   10-8  67  4 khuẩn lạc dính lại với nhau   10-9  42  Từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ   10-10  18  Từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ   Sau khi nhận thấy ở hộp peptri số 5 các khuẩn lạc mọc riêng lẻ, chúng tôi tiến hành quan sát hình dáng khuẩn lạc : Hình dạng chung: dạng rễ. Màu sắc khuẩn lạc: màu trắng. Đặc tính bề mặt: trơn ướt Đặc tính mép khuẩn lạc: mép hình răng cưa, xẻ không đều. Sau đó chọn các khuẩn lạc còn trẻ, riêng biệt để cấy chuyền qua ống thạch nghiêng và được nuôi ở 300C trong 24h và được bảo quản ở 40C, sau một tháng thì cấy chuyền qua ống thạch nghiêng để giữ và bảo quản giống. 3.1.2.Khảo sát khả năng tổng hợp proteaza của Bac.subtillis trên môi trường rắn: Bac.subtilis từ ống thạch nghiêng, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát triển của nó trên môi trường đĩa thạch có thành phần môi trường sữa như đã trình bày ở mục 8 phần phụ lục. Sau khi Bac.subtilis được cấy trên đĩa thạch, chúng tôi tiến hành nuôi ở 300C trong 24h Nhận xét: Trên môi trường sử dụng, Bac.subtilis đã sử dụng nguồn cơ chất để sinh trưởng và phát triển. Bên cạnh quá trình sử dụng nguồn cacbon, nitơ có trong môi trường thì Bac.subtilis đã sinh tổng hợp proteaza làm thuỷ phân protein trong sữa. Chính vì vậy, ta thấy ở đĩa thạch có miền trắng đục do protein của sữa chưa bị thuỷ phân và miền trắng trong bao quanh khuẩn lạc do protein của sữa đã bị thuỷ phân, chỉ còn lại bề mặt của đĩa thạch. Hình ảnh Ta tiến hành nhuộm màu đĩa thạch trên với thuốc nhuộm amido black 10B để kiểm tra khả năng thuỷ phân của proteaza . Amido black 10B là một loại thuốc nhuộm có khả năng bắt màu với protein cho màu xanh, dựa vào đặc tính này người ta có thể xác định được vị trí của protein bị thuỷ phân trên đĩa thạch bằng cách đem nhuộm đĩa thạch trong dung dịch amido black 10B. Quá trình tiến hành như sau: Pha thuốc nhuộm trong dung dịch acid axetic 7% để đạt thuốc nhuộm có nồng độ 0,025%. Hút 5ml dung dịch thuốc nhuộm cho đều vào đĩa thạch trên. Để yên trong 24 giờ. Sau 24 giờ nhuộm màu ta thấy trên đĩa thạch có những vùng màu xanh và vùng trong suốt. Những vùng màu xanh là do trong sữa có cazein là protein chưa bị thuỷ phân nên nó bắt màu với thuốc nhuộm. Còn vùng trong suốt là vùng protein đã bị thuỷ phân, do đó nó không bắt màu với thuốc nhuộm. Hình ảnh 3.1.3.Khảo sát khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis trên môi trường lỏng: Để thu được nguồn enzym dồi dào từ vi sinh vật, người ta phải nuôi cấy chúng trên các môi trường đặc hiệu. Về nguyên tắc, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzym: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu.Việc nghiên cứu sản xuất enzym bằng phương pháp bề mặt đã được tiến hành và cho kết quả tốt. Tuy nhiên, do sản xuất enzym theo phương pháp bề mặt có nhiều nhược điểm hơn so với phương pháp nuôi cấy bề sâu. Chính vì vậy, trên thế giới việc sản xuất enzym theo phương pháp bề mặt chỉ chiếm 10%, còn lại 90% được thay thế bằng phương pháp chìm. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề sâu so với phương pháp nuôi cấy bề mặt: Tiết kiệm diện tích sản xuất. Dễ cơ giới hoá, loại bỏ được lao động thủ công, tạo năng suất cao. Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường, tránh được sự lãng phí chất dinh dưỡng nằm lại trong khối canh trường ỳ rắn mà vi sinh vật không sử dụng được. Thu được enzym chứa ít tạp chất hơn. Đảm bảo được điều kiện vệ sinh và vô trùng, do đó hiện tượng nhiễm vi sinh vật lạ ít xảy ra hơn. Do những ưu điểm trên mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis trong môi trường lỏng. Khi sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm thì môi trường để vi khuẩn phát triển là môi trường lỏng. Thành phần môi trường thích hợp cho Bac.subtilis phát triển và sinh tổng hợp proteaza theo Đỗ Thị Bích Thuỷ bao gồm: pepton:0,5%; cao thịt: 0,05%; NaCl: 0,5%;cao nấm: 0,1%; tinh bột sắn: 5,5%; bột phế liệu tôm: 1,1%; nước 1000ml; pH=10
Trong phương pháp nuôi cấy chìm, để đảm bảo điều kiện vô trùng thì phải thực hiện theo hai bước: Môi trường lỏng được tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút . Quá trình cấy giống tiến hành trong điều kiện vô trùng. Sau khi cấy giống với tỉ lệ 2%, pH môi trường bằng 10 thì vi sinh vật được nuôi ở 350C. Quá trình nuôi được thực hiện trong máy lắc .
Trong quá trình nuôi vi sinh vật ở những điều kiện như vậy, do môi trường có độ nhớt cao nên giai đoạn đầu quá trình sinh tổng hợp enzym rất chậm, môi trường rất đục nên không thể kiểm tra động thái sinh trưởng và phát triển của Bac.subtilis mà chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra quá trình sinh tổng hợp enzym ngoại bào của nó . Để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn độ foocmol ở thời điểm cách nhau 8 giờ. Dịch chiết enzym được thu nhận bằng cách lọc qua bông thấm nước . Dịch chiết enzym sau khi thu nhận được đánh giá hoạt lực proteaza. Về nguyên tắc, để đánh giá hoạt lực enzym bất kỳ có thể dựa vào tốc độ chuyển hoá của cơ chất hoặc tốc độ tích luỹ sản phẩm phản ứng sau một thời gian nhất định. Ở đây, để xác định hoạt lực enzym proteaza, chúng tôi dựa vào lượng sản phẩm tạo thành sau khoảng thời gian xác định.Theo mức độ thuỷ phân protein, nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng lên. Dựa vào độ tăng một trong hai nhóm này để xác định hoạt độ enzym. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành xác định hoạt lực enzym proteaza theo phương pháp chuẩn độ foocmol, bằng cách cho dịch chiết enzym tác dụng với 5ml dung dịch cazein 1% trong thời gian 30 phút ở 300C. Dưới tác dụng của enzym proteaza, các nhóm acid amin giải phóng ra. Sau đó bao vây nhóm amin, còn chuẩn độ nhóm cacboxyl. Hoạt lực enzym càng cao thì hàm lượng acid amin càng lớn. Hoạt độ enzym ở đây được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành sau 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định, cũng có thể tính bằng đơn vị hoạt động enzym. HđP(1đvhđ/1ml): đơn vị hoạt động của enzym theo phương pháp chuẩn độ foocmol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau một giờ ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1 mg acid amin.( 2, tr296) Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza tại các thời điểm khác nhau. Kết quả thu được biểu diễn ở hình 2. Hình 2: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza của Bac.subtilis. Dựa vào kết quả thu được chúng tôi nhận thấy rằng sau 88 giờ nuôi cấy thì Bac.subtilis có khả năng sinh tổng hợp proteaza là mạnh nhất. Hoạt lực enzym proteaza tại thời điểm đó là 5.68HđP. Trong khoảng thời gian 64
giờ nuôi cấy thì khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis rất mạnh. Đây là giai đoạn sinh tổng hợp proteaza mạnh nhất trong suốt quá trình sinh tổng hợp của Bac.subtilis. Qua các nghiên cứu cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp proteaza diễn ra chủ yếu trong giai đoạn phát triển luỹ tiến của vi sinh vật. Ở giai đoạn này, vi sinh vật phát triển mạnh mẽ dẫn đến nhu cầu dinh dưỡng cao, cho nên nó phải sinh tổng hợp enzym mạnh để thuỷ phân cơ chất, tạo nhiều các chất dinh dưỡng để hấp thụ. Năm 1973, Conovalop đã kết luận rằng:"Sự phát triển tế bào và sự sản sinh enzym có liên quan chặt chẽ với nhau. Tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp enzym ở các giai đoạn nhất định trong quá trình sinh trưởng. Tốc độ sinh tổng hợp enzym thường không đồng nhất với chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật". Sau 88 giờ thì hoạt lực proteaza của Bac.subtilis giảm dần, điều đó có thể giải thích rằng càng về cuối quá trình nuôi cấy thì hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đã cạn kiệt, vi sinh vật trải qua giai đoạn suy vong, nên khả năng sinh tổng hợp proteaza của nó cũng yếu dần. Như vậy, sau 88 giờ nuôi cấy trong môi trường thay thế có pH bằng 10 ở nhiệt độ 350C thì chúng tôi thu nhận được enzym proteaza từ Bac.subtilis có hoạt lực mạnh nhất. Không phải mỗi loài vi sinh vật chỉ sinh tổng hợp một loại enzym nhất định mà chúng có thể tổng hợp nhiều loại enzym khác nhau với hàm lượng không giống nhau và điều đó tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Năm 1988 và 1996, tác giả Đỗ Thị Giang và Lê Đức Mạnh dùng Bac.subtillis để sinh tổng hợp
-amylaza theo phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men bề sâu. Điều đó khẳng định một lần nữa trong tế bào vi sinh vật tồn tại nhiều hệ enzym khác nhau. Do đó tuỳ thuộc vào phương pháp và môi trường nuôi cấy mà ta có thể thu nhận được các loại enzym khác nhau. 3.1.4.Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện hoá lý đến hoạt tính của chế phẩm enzym proteaza từ Bac.subtilis: Cũng như các loại enzym khác, tốc độ phản ứng hay hoạt tính của enzym đều chịu sự tác động của nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ của các ion trong môi trường, nồng độ chất kìm hãm, chất hoạt hoá, do đó hoạt lực của chế phẩm proteaza có thể tăng hoặc giảm. Tìm ra các điều kiện mà enzym có hoạt lực cao nhất gọi là điều kiện tối ưu cho enzym hoạt động .