Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ

cặp mồi 35S1/2, SPA/B, LE1/2, Cry1/2, IVR1/2, một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Anh về khả năng nhận biết ngô GM và đậu t−ơng GM trong thực phẩm nhờ PCR cũng đã đ−ợc chấp nhận [15]. Một ứng dụng khác của PCR là định l−ợng GMC cũng đã đ−ợc các nhà khoa học Argentina nghiên cứu thử nghiệm trên đối t−ợng là ngô Bt 176. ở nghiên cứu này, các mẫu ngô GM đ−ợc trộn lẫn với ngô không biến đổi gen ở các tỷ lệ khác nhau (0,5%, 1%, 2%, 5%, 20%) và nghiên cứu này cho thấy ở hàm l−ợng GMC lớn hơn 5% cho phản ứng d−ơng tính [14]. 2.7. Đa dạng di truyền Các cá thể trong một quần thể th−ờng có bộ gen (genom) khác nhau. Sự đa dạng về bộ gen có đ−ợc là do các cá thể có các gen khác nhau, dù chỉ là rất ít. Những alen khác nhau của một gen có thể ảnh h−ởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những cây trồng đ−ợc lai Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -27- ghép hay những động vật đ−ợc lai tạo phát huy những gen của mình để hình thành những giống cây con cho năng suất cao, có khả năng chống chịu sâu bệnh, cỏ dại tốt. Trong quá trình sinh sản hữu tích, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp hoặc do đột biến. Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sựu tồn tại các kểu gen dị hợp trong quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể này thích nghi hơn so với những thay đổi của môi tr−ờng. 2.7.1. ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và rất quan trọng đối với con ng−ời. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả các sinh vật để duy trì khả năng sinh sản, khả năng đề kháng với các loại dịch bệnh và khả năng thích nghi với những thay đổi của môi tr−ờng sống. Sự đa dạng di truyền ở cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc bệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con ng−ời. 2.7.2. Một số ph−ơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 2.7.2.1. Ph−ơng pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái. Các chỉ tiêu hình thái trong phân loại sinh vật đ−ợc sử dụng từ rất sớm. Tuy nhiên, những đặc tính hình thái đ−ợc sử dụng nh− là một chỉ thị di truyền là những tính trạng do một locus gen quy định và sự thể hiện của chúng không bị ảnh h−ởng của nhân tố môi tr−ờng. Trong tr−ờng hợp này dấu chỉ tiêu hình thái đ−ợc sử dụng nh− một chỉ thị di truyền. Việc sử dụng các chỉ tiêu hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: – Số l−ợng các chỉ tiêu hình thái có hạn – Chúng bị ảnh h−ởng bởi quá trình t−ơng tác gen và các nhân tố môi tr−ờng (Staub J.E. và Crubaugh., 1995). Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -28- – Các chỉ tiêu hình thái thể hiện những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Paterson., 1996). 2.7.2.2. Ph−ơng pháp sử dụng các chỉ thị phân tử ™ Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): Ph−ơng pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt giới hạn) do Botstein và cs, phát minh năm 1980. Nguyên lý của ph−ơng pháp này là: ADN của bộ gen sau khi đ−ợc xử lý bằng enzym giới hạn sẽ bị cắt thành những đoạn có kích th−ớc khác nhau. Sau khi điện di, các đoạn này phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này sẽ trở thành sợi đơn và đ−ợc chuyển lên màng celulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi. Trong quá trình lai ADN tiếp theo trên mẫu dò (thực chất là một đoạn ADN) sẽ bắt cặp với những đoạn có trình tự nucleotic t−ơng đồng với nó trên màng lai – kỹ thuật lai Southern. Khi phân tích đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thể đ−ợc thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng lai. ™ Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP vμ ion Mg P2+P hoạt động nh− một chất xúc tác. Phản ứng PCR gồm các giai đoạn sau: – Giai đoạn biến tính (Denaturation): Hỗn hợp phản ứng đ−ợc làm nóng đến khoảng 90-98PoPC, nhiệt độ này th−ờng lớn hơn Tm của phân tử ADN, do đó các phân tử ADN mạch kép đ−ợc tách nhau ra hoàn toàn tạo nên sợi đơn dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và taq ADN polymerase hoạt động. Giai đoạn này th−ờng kéo dài trong vòng 30 giây đến 1 phút. – Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ của giai đoạn này phải thích hợp cho quá trình bắt cặp bổ sung của mồi với chuỗi ADN khuôn, nó nhỏ hơn Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -29- Tm của 2 đoạn mồi khoảng 2-3 PoPC. Tại đây, các đoạn mồi sẽ gắn bổ sung với trình tự bổ trợ trên các phân tử ADN khuôn. Thời gian của giai đoạn này th−ờng kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. – Giai đoạn tổng hợp (Extention): Nhiệt độ ở giai đoạn này đ−ợc tăng lên đến nhiệt độ thích hợp cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp nên sợi mới từ phức hợp mồi-khuôn. Đối với Taq ADN polymerse thì nhiệt độ hoạt động tối −u là khoảng 72Po PC. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của chuỗi ADN, th−ờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ phản ứng với 3 giai đoạn trên sẽ đ−ợc lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi l−ợng mẫu của lần tr−ớc. Số chu kỳ phản ứng th−ờng là 20-40 chu kỳ. Sau khi chu kỳ cuối cùng kết thúc, giữ nhiệt độ ở 72Po PC trong khoảng 5-10 phút để tất cả các sợi ADN đ−ợc tổng hợp xong và các sợi đơn ADN xoắn lại tạo sản phẩm PCR. Cuối cùng, nhiệt độ đ−ợc hạ xuống 4Po PC để bảo quản. Kỹ thuật PCR đ−ợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau nh−: sản xuất mẫu dò, phân lập gen, nhân bội ARN, nhận dạng ở mức độ phân tử, xác định và chẩm đoán bệnh... Tuỳ theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mμ có những hệ thống chỉ thị đặc tr−ng gồm chỉ thị RAPD, SSR, AFLP… Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -30- Hình 6: Các giai đoạn của một chu kỳ PCR ™ Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphism ADN) RAPD (Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) đ−ợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn ADN đ−ợc khuếch đại ngẫu nhiên. PCR_RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các mồi đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn. Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn ADN trong khoảng cách có thể khuếch đại đ−ợc (d−ới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn ADN có kích th−ớc khác nhau sau khi khuếch đại. Sản phẩm thu đ−ợc là tập hợp đa dạng các dòng đoạn ADN đặc tr−ng cho mỗi loài thậm trí cho mỗi cá thể. William và cộng sự (1990). Theo lý thuyết 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotid thì xác suất bắt gặp bằng 1/4P10 P = 1/1.048.576, nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp nucleotic có một trình tự bắt cặp với mồi. Nh− vậy, với một đoạn mồi ngẫu nhiên có thể có 524 vị trí bắt cặp mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN đ−ợc nhân bội. Trong thực tế số l−ợng các đoạn đ−ợc nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ thuộc vào độ dài đoạn đ−ợc nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADN của bộ gen. Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng nh− nguyên tắc phản ứng PCR thông th−ờng. Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30Po PC-36 PoPC. Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD th−ờng có độ lặp lại không cao và khó tối −u phản ứng. Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều yếu tố nh− thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần MgP2+P và chất l−ợng ADN bản mẫu), các thiết bị cũng nh− thao tác thí nghiệm. Khi phân tích đa hình di truyền bằng ph−ơng pháp RAPD, nếu 2 cá thể có bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR_RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho băng ADN giống nhau. Nếu chúng ít nhiều có sự khác nhau Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -31- về bộ gen thì với một số mồi sẽ cho những băng khác nhau giữa chúng. Sự khác nhau này thể hiện sựu đa hình di truyền của các cá thể cần nghiên cứu. Do đó, nó đ−ợc sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm về di truyền phân tử. ™ Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates) Chỉ thị vi vệ tinh, lμ những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn. Bản chất đa hình của SSR có thể đ−ợc sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Giá trị của SSR lμ ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng t−ơng ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen vμ có bản chất đồng trội, dễ dμng phát hiện bằng PCR. Những chuỗi đa hình đơn giản nμy đã đ−ợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối t−ợng động vật vμ thực vật. ở ng−ời, SSR đ−ợc gọi lμ thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử. ở thực vật, tần số vμ số l−ợng SSR đã đ−ợc xác định trên các cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải, lúa mì, vμ 34 giống cây trồng khác [38]. 2.7.3. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị RAPD Cũng nh− một số ph−ơng pháp sinh học phân tử khác, PCR_RAPD đã đ−ợc ứng dụng thành công vào nghiên cứu mối quan hệ di truyền thực vật. Bên cạnh cây ngô, đã có rất nhiều đối t−ợng đ−ợc nghiên cứu sử dụng ph−ơng pháp này. Kaudun SS và CS., dựa trên kỹ thuật PCR_RAPD để nghiên cứu 27 dòng chè có nguồn gốc khác nhau từ Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan. Kết quả thu đ−ợc với 50 mồi ngẫu nhiên , trong đó 17 mồi cho 58 băng đa hình. Orozeo và CS, (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê đ−ợc lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc điểm quý để lai tạo giống cà phê mới... Còn ở Việt Nam, kỹ thuật PCR_RAPD đ−ợc áp dụng khá nhiều trong phân tích di truyền của thực vật. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -32- – Nguyễn Văn Đồng, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã dùng 15 mồi RAPD để phân tích đa hình di truyền 19 dòng lúa, thu đ−ợc 97 băng đa hình và hệ số t−ơng đồng từ 0,67 đến 1,0 [12]. – Nguyễn Thị Dung, Viện công nghệ sinh học đã phân tích mối t−ơng đồng di truyền của 11 cây vải ở các độ tuổi khác nhau dựa trên cơ sở phân tích đa hình ADN bằng ph−ơng pháp PCR_RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên [12]. – Nguyễn Văn Khiêm và CS., Viện Di truyền Nông nghiệp, đã dùng 17 đoạn mồi RAPD để đánh giá mối quan hệ di truyền của 20 mẫu khác nhau thuộc loài Boswellia sacra flueck [12]. PCR_RAPD đ−ợc ứng dụng thành công vào phân tích đa hình di truyền ở ngô (tuy còn hạn chế về số l−ợng các nghiên cứu) và đã thu đ−ợc một số kết quả sau: – L.L.B.Lanza et al (1997) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để xác định khoảng cách di truyền và dự đoán cặp lai đơn −u tú của các dòng ngô tự phối đ−ợc tạo ra từ nguồn BR106 và BR105 [1]. – Bùi Mạnh C−ờng và CS, Viện nghiên cứu ngô đã sử dụng chỉ thị RAPD với 60 mồi ngẫu nhiên 29 dòng thuần để nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn giống ngô lai [12]. – Khuất Hữu Trung và CS, Viện Di truyền nông nghiệp đã sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu đa dạng di truyền của 14 dòng ngô mang gen kháng sâu. Kết quả là 9 mồi cho băng đa hình. Những kết quả trên phần nào cho thấy sự hữu ích của PCR_RAPD trong nghiên cứu đa hình di truyền ở sinh vật nói chung và ở ngô nói riêng. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -33- Phần III. Vật Liệu Vμ PHƯƠNG Pháp NGHIÊN Cứu 3.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là một 180 dòng ngô đ−ợc tạo ra từ 2 dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ thu thập từ Achentina ký hiệu CG3 và CG4; Cặp mồi 35S1/35S2 sử dụng trong phản ứng PCR để khuyếch đại đoạn trình tự đặc tr−ng của promoter CaMV-35S (195bp) có trong ngô chuyển gen; Cặp mồi PA01/CM03 dùng để khuyếch đại đoạn 231 bp của gen PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase), là gen kháng thuốc trừ cỏ có trong cây ngô chuyển gen; 20 mồi khác nhau sử dụng trong các phản ứng PCR-RAPD có độ dài từ 8- 10 nucleotit thuộc nhóm OPA, OPM, BIO và nhóm S của hãng Operon Technology và hãng Bioneer. Bảng 3: Trình tự nucleotic của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR Tên cặp mồi Trình tự Gen đích Kích th−ớc đoạn khuếch đại 35S1/35S2 5′-CTCCTACAAATGCCATCA- 3′ 5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA- 3′ Promoter CaMV 35s 195 bp PA01/CM03 5′-AGATCATCAATCCACTCTTGTGGTG- 3′ 5′-CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA- 3′ PAT 231bp Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -34- Bảng 4: Trình tự nucleotic của các primer đ−ợc sử dụng trong các phản ứng PCR_RAPD STT Primer Trình tự nucleotit STT Primer Trình tự nucleotit 1 OPA1 CAGGCCCTTC 11 S201 GGGCCACTCA 2 OPA9 GGGTAACGCC 12 S202 GGAGAGACTC 3 OPA10 GTGATCGCAG 13 S208 AACGGCGACA 4 OPA12 TCGGCGATAC 14 S211 TTCCCCGCGA 5 OPA15 TTCCGAACCC 15 S216 GGTGAACGCT 6 OPA18 AGGTGACCGT 16 S256 CTGCGCTGGA 7 OPA10 GTGATCGCAG 17 BIO3 GAAACGGGTG 8 OPM9 GTCTTGCGGA 18 BIO12 CAATCGCCGT 9 OPM12 GGGACGTTGG 19 BIO16 CTGAGACGGA 10 OPM18 CACCATCCGT 20 BIO27 TGACGCGCTC Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết: các hoá chất tách chiết ADN, hoá chất làm PCR, hoá chất chạy gel agarose. + Hoá chất tách chiết AND: Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại nh−: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, Isopropanol, Isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan. – Đệm tách chiết ADN của mẫu lá cây chuyển gen: 200 mM Tris-HCl pH8 250 mM NaCl 25 mM EDTA 0,5% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) – Đệm TE: 10 mM Tris-HCl pH8 1 mM EDTA – Phenol : chloroform : isoamyl acohol 70% (25:24:1) – Ethanol 100% (hoặc Isopropanol) và Ethanol 70% Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -35- + Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR: – Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen hoặc Invitrogen. – MgCl2 của Fermentas, Invitrogen. – dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoặc dUTP)) của Fermentas, Invitrogen. – Mồi, Marker 1 kb, Marker 100 bp, Marker λ/HindIII của hãng Fermentas, Invitrogen. – Taq polymerase của Fermentas, Hot- Start Quiagen hoặc Platin từ Invitrogen + Hoá chất chạy điện di: Điện di gel agarose gồm các hoá chất: TAE 1X, Chất nhuộm Bromophenol blue (hoặc Xylene cyanol hoặc hỗn hợp cả 2 chất này), Ethidium bromide, agarose. + Các thiết bị: – Máy PCR (hãng Eppendorf) – Máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5810-R và 2K15 Sigma) – Máy điện di ngang BIO-RAD GT (Anh) – Máy soi gel (T2201, Sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma) – Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker). – Nồi hấp thanh trùng (05MB1-160T-3 -Nga) – Cân điện tử Sartorious (Đức) – Lò vi sóng. – Tủ sấy (Memmert) – Micropipet, ống Eppendorf, bình tam giác 3.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Ph−ơng pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng Các dòng ngô nghiên cứu đ−ợc gieo 3 hàng dài 5m, khoảng cách gieo là 70cm x 25cm x 1 cây/hốc tại khu ruộng thí nghiệm đ−ợc cách li và kiểm soát chặt chẽ. Việc đánh giá các đặc điểm nông sinh học và các đặc điểm hình thái đ−ợc tiến hành qua các thí nghiệm so sánh, ph−ơng pháp chăm sóc các thí nghiệm theo quy trình của Viện nghiên cứu Ngô. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -36- + Thời gian sinh tr−ởng: Theo dõi ngày gieo đến – Ngày tung phấn: khi có 75% số cây tung phấn – Ngày phun râu: Khi có 75% số cây phun râu – Ngày chín sinh lý: Khi chân hạt có điểm đen ở 100% số bắp + Đặc điểm hình thái cây: – Chiều cao cây (cm): Chọn 10 cây ngẫu nhiên, đo từ mặt đất đến đốt mang nhánh cờ đầu tiên. – Chiều cao đóng bắp (cm): Trên 10 cây đã đ−ợc đo chiều cao cây, chiều cao đóng bắp đ−ợc đo từ mặt đất đến đốt mang bắp trên cùng – Số lá thật: lá thứ 5 và lá thứ 10 đ−ợc đánh dấu để tiện cho việc đếm số lá cuối cùng. – Chiều dài bông cờ (chiều dài trục chính) (cm): Đ−ợc đo từ đốt có nhánh cờ đầu tiên đến hết bông cờ. – Màu cờ: Xác định màu sắc của râu lúc râu dài 3 cm. – Màu dạng của hạt và lõi: Xác định màu, dạng của hạt và lõi lúc khô. 3.2.2. Ph−ơng pháp tách chiết ADN 3.2.2.1. Ph−ơng pháp thu mẫu Cây ngô chuyển gen đ−ợc trồng trong điều kiện nhà kính đ−ợc kiểm soát chặt chẽ, khi cây mọc cao 15 – 25 cm, thu khoảng 2,5- 3 g mẫu lá, mẫu đ−ợc rửa sạch, giữ ở - 80P0PC để làm nguyên liệu cho tách chiết ADN. 3.2.2.2. Ph−ơng pháp tách chiết AND tổng số Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn ph−ơng pháp có sử dụng CTAB của Hugo và cs. (1995) có cải tiến để tiến hành tách chiết ADN tổng số từ 180 dòng ngô nghiên cứu. 1. ủ sẵn dung dịch đệm chiết CTAB và SDS ở 60P0PC trong bình ổn nhiệt (30 phút). 2. Lá đ−ợc cắt nhỏ cho vào cối, nghiền cùng nitơ lỏng đến khi thành bột mịn (mẫu ngô, chày, cối đ−ợc giữ tr−ớc ở - 20 P0PC). 3. Chuyển bột nghiền từ lá sang ống Eppendorf 2 ml, bổ sung 800 ml CTAB buffer và 56 ml SDS 10%. 4. ủ ở 65 P0PC trong 40 phút, có lắc nhẹ trong quá trình ủ 5. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -37- 6. Bổ sung 800 ml Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), lắc đều 7. Ly tâm trong máy ly tâm lạnh (4 P0PC) 11000 vòng/phút trong 15 phút. 8. Thu dịch nổi phía trên ống chuyển sang ống Eppendorf mới. 9. Bổ sung 800 ml Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), lắc đều. 10. Ly tâm trong máy ly tâm lạnh (4 P0PC) 11000 vòng/phút trong 15 phút. 11. Thu dịch nổi chuyển sang ông Eppendorf mới, bổ sung bằng isopropanol theo tỷ lệ 1:1. 12. Để trong tủ lạnh sâu 1,5- 2 h. 13. Ly tâm ở 4 P0PC với 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa. 14. Rửa tủa bằng cồn 70% và ly tâm ở 4 P0PC với 11000 vòng/phút trong 10 phút 15. Làm khô ADN, hoà tan ADN bằng 200μl dung dịch TE 0,1X hoặc n−ớc đã khử trùng và đề ion. 16. Loại ARN Thêm 2μl RNase 10mg/ml , ủ 37P0PC trong 3 giờ. Các b−ớc tiếp theo làm t−ơng tự từ b−ớc 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Để kiểm tra nồng độ, tính toàn vẹn của ADN tách đ−ợc chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp điện di trên gel agarose 1% . 3.2.3. Ph−ơng pháp kiểm tra sự có mặt của đoạn Promoter 35S và gen PAT trong cây ngô kháng thuốc diệt cỏ Sau khi kiểm tra hàm l−ợng ADN ngô, chúng tôi tiến hành pha loãng các mẫu ADN ngô tổng số có nồng độ cao để đạt đ−ợc hàm l−ợng cuối cùng là 50ng/μl đây là nồng độ thích hợp để làm phản ứng PCR. Các phản ứng PCR đ−ợc thực hiện trong thiết bị Eppendorf Mastercycler gradient (96 giếng), với thể tích cuối cùng là 15 μl/phản ứng. – Thành phần phản ứng cho một mẫu ADN: Buffer 1,5 μl Mg P2+P 1 μl dNTPs 10 mM 0,6 μl Mồi xuôi và mồi ng−ợc 0,6 μl đối với mồi 35S1/35S2 1,2 μl đối với mồi PA01/CM03 Taq DNA polymerse 0,2 μl ADN 1 μl Bổ sung n−ớc cất khử trùng đã loại ion tới thể tích cuối cùng là 15 μl Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -38- – Phản ứng đ−ợc chạy với chu trình nhiệt của từng cặp mồi nh− sau: Cặp mồi 35S1/35S2: Biến tính ở 94P0PC trong 5 phút (tách mạch ADN khuôn), chạy 40 chu kỳ lặp lại với 94P0PC trong 30 giây, 58P0PC trong 30 giây (gắn mồi), 72P0 PC trong 30 giây (kéo dài), cuối cùng phản ứng đ−ợc giữ ở 72P0PC trong 6 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng). Cặp mồi PA01/CM03: Biến tính ở 95P0PC trong 5 phút (tách mạch ADN khuôn), chạy 40 chu kỳ lặp lại với 95P0PC trong 20 giây, 60P0PC trong 40 giây (gắn mồi), 72P0 PC trong 1 phút (kéo dài), cuối cùng phản ứng đ−ợc giữ ở 72P0PC trong 5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng). Sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng PCR đem đi điện di trên gel agarose 1% (0,4 g agarose, 40ml dung dịch TAE 1X, 2,5μl Ethidium bromide) với marker chuẩn ADN 1kb. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -39- 3.2.4. Ph−ơng pháp PCR_RAPD Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR_RAPD gồm: Buffer 1,5 μl Mg P2+P 1 μl dNTPs 10 mM 0,6 μl Mồi RAPD 1,2 μl Taq DNA polymerse 0,2 μl ADN 1 μl Bổ sung n−ớc cất khử trùng đã loại ion tới thể tích cuối cùng là 15 μl Phản ứng đ−ợc chạy với chu trình nhiệt của từng mồi nh− sau: 3.2.5. Ph−ơng pháp điện di trên gel Agarose Khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử ADN trên gel. Đối với gel Agarose thì ta dùng thuốc nhuộm ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử ADN và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại. Cách tiến hành: – Cân 0,4g agarose cho vào bình tam giác. – Lấy 40ml dung dịch TAE 1X cho vào bình tam giác trên. – Đun đến khi agarose tan hết vào dung dịch. – Để nguội (khoảng 65 Po PC), bổ sung 2,5 μl EtBr. – Đặt l−ợc vào khay, đổ gel vào để nguội đến khi gel đông lại thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -40- – Tra mẫu: Mẫu đ−ợc nhuộm với Xanhmetylen (loading dye), tra vào giếng. – Maker đ−ợc tra vào một trong số các giếng để có thể xác định chiều dài các mẫu. – Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di đ−ợc kết nối với bộ nguồn. Đặt 50V, 90mA. Thời gian chạy khoảng 20 -30 phút. – Quan sát: Gel đ−ợc soi d−ới đèn tử ngoại, ADN sẽ đ−ợc phát sáng nhờ liên kết với EtBr. – Chụp ảnh. 3.2.6. Các ph−ơng pháp tính toán và sử lý số liệu ™ Ph−ơng pháp phân tích và xử lý số liệu: Các số liệu thu thập đ−ợc xử lý theo ph−ơng pháp thống kê sinh học trên nền Excel version 5.0 ™ Phân tích kết quả PCR_RAPD bằng NTSYSpc 2.1: Cơ sở dữ liệu của NTSYSpc là ch−ơng trình máy tính để tự động thiết lập nên sơ đồ cây biểu hiện mối quan hệ hay độ t−ơng đồng di truyền giữa chúng với nhau. Cơ sở dữ liệu của ch−ơng trình này dựa vào hệ mã nhị phân (0,1) để đánh giá sự vắng mặt (ghi 0) hoặc sự có mặt (ghi 1) của các băng đa hình ADN theo thang ADN chuẩn (ADN marker). Dữ liệu này cũng cho phép thiết lập ma trận t−ơng đồng (Similar matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Việc tính toán ma trận t−ơng đồng đ−ợc dựa theo công thức: 2nBijB J Bij B= n Bi B+n BjB Trong đó n BijB là số băng ADN có ở cả hai mẫu i và j n BiB và nj là tổng số băng RAPD của từng cá thể i và j t−ơng ứng J BijB là hệ số t−ơng dồng giữa hai mẫu i và j Trình tự tiến hành phân tích kết quả PCR_RAPD bằng NTSYS – Kết quả PCR_RAPD đ−ợc nhập vào ch−ơng trình excel theo nguyên tắc là nếu không xuất hiện băng ghi "0", nếu xuất hiện ghi băng "1". – Số liệu đ−ợc xử lý tiếp trong ch−ơng trình Notepad. – Ma trận t−ơng đồng và sơ đồ hình cây đ−ợc xây dựng sau khi xử lý trong NTSYSpc 2.1 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -41- IV. Kết Quả Vμ Thảo Luận 4.1. Kết quả tách chiết ADN Tách chiết axit nucleic lμ công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong công nghệ ADN. Nhờ tiến bộ vμ sự đổi mới công nghệ mμ tách chiết axit nucleic ngμy nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay có rất nhiều ph−ơng pháp tách chiết ADN tổng số của mẫu thực vật. Tuy nhiên đối với từng đối t−ợng mẫu thực vật nhất định cần có ph−ơng pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn vμ cải tiến ph−ơng pháp cho phù hợp với đối t−ợng của mình lμ điều rất cần thiết vμ quan trọng. Trong nghiên cứu nμy, chúng tôi đã lựa chọn ph−ơng pháp có sử dụng CTAB của Hugo và CS (1995) có cải tiến để tiến hμnh tách chiết ADN tổng số từ 180 mẫu ngô nghiên cứu. Mẫu ADN sau khi tách chiết đ−ợc kiểm tra nồng độ và tính toàn vẹn của chúng trên gel agarose 1%, chạy trong 30 phút ở hiệu điện thế 50V. Sau đó kết quả đ−ợc quan sát trên máy soi UV và chụp l−u lại ảnh (hình 7). Hình 7: Kết quả kiểm tra ADN tổng số của 34/180 mẫu ngô nghiên cứu Qua phân tích ảnh điện di cho thấy nồng độ ADN của các mẫu t−ơng đối là đồng đều và không bị đứt gãy. Mặt khác không thấy xuất hiện các vết sáng Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -42- ARN phía d−ới, điều đó chứng tỏ ARN đã đ−ợc loại bỏ hoàn toàn khỏi dịch chiết ADN. 4.2. Kết quả nhận biết đoạn Promoter 35S có trong cây ngô kháng thuốc diệt cỏ Sau khi tách chiết và kiểm tra nồng độ ADN chúng tôi kiểm tra sự có mặt của Promoter 35S với cặp mồi 35S1/35S2 bằng ph−ơng pháp PCR (Với cặp mồi 35S1/35S2 xác định đ−ợc trình tự đặc tr−ng của promoter 35S có độ dài 195 bp). Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR cho thấy: có 14/180 mẫu ADN (14/180 dòng ngô nghiên cứu) cho kết quả d−ơng tính đó là các mẫu: CG3-D1, CG4-D1, CG3-D2, CG3-D3, CG3-D4, CG3-D5, CG3-D6, CG3-D7, CG3-D8, CG3-D9, CG4-D2, CG3-D10, CG3-D11và CG3-D12 (14 mẫu đ−ợc kiểm tra lại và chạy chung trên một bản gel - hình 8). Các mẫu này đều xuất hiện băng có kích th−ớc 195 bp giống nh− mẫu d−ơng tính chuẩn (ADN của plasmid pART27, plasmid này có chứa promoter CaMV 35S). Hình 8: Kết quả sản phẩm PCR với cặp mồi 35S1/35S2 của 14 mẫu ngô M1 kb: Marker chuẩn 1kb ĐC (-): Mẫu đối chứng âm tính (HB2BO) ĐC (+): Mẫu đối chứng d−ơng tính Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -43- 4.4. Kết quả nhận biết sự có mặt của gen PAT kháng thuốc diệt cỏ 14 mẫu d−ơng tính với cặp mồi 35S1/35S2 tiếp tục đ−ợc kiểm tra với cặp mồi PA01/CM03 để xác định đoạn trình tự đặc tr−ng có độ dài 231 bp của gen kháng thuốc diệt cỏ PAT. Gen PAT (Phospinotricin acetyltransferase) là một trong những gen kháng thuốc trừ cỏ cũng đã đ−ợc chèn vào một số giống cây trồng nh− ngô, đậu t−ơng và một số giống cây trồng khác. Ng−ời ta đã chứng minh rằng gen PAT có mặt trong ngô chuyển gen T25, giống ngô này đã đ−ợc phát triển để chống chịu thuốc trừ cỏ Ammonium glufosinate. Gen này đã đ−ợc phát hiện nhờ cặp mồi 2F/2R khuyếch đại đoạn 262bp thông qua PCR multipex (Hugo R.Permingeat & CS, in press). Và một cặp mồi khác cũng đã đ−ợc thiết kế để khuyếch đại trình tự 231 bp trên vùng gen cấu trúc của gen PAT, đó là primers PA01/CM03 và chúng tôi cũng sử dụng cặp mồi này để khuếch đại đoạn trình tự dài 231 bp trên vùng gen cấu trúc của gen PAT ở các mẫu ngô thí nghiệm. Sản phẩm PCR đ−ợc kiểm tra trên gel agarose 1% có ethidium bromide với đệm TAE 1X, chạy điện di trong 30 phút ở dòng điện 50V. Sử dụng marker chuẩn ADN 1Kb để so sánh và kết quả đ−ợc quan sát trực tiếp trên máy soi UV, chụp ảnh l−u trong máy tính. Kết quả kiểm tra với cặp mồi PA01/CM03 cho thấy có sự xuất hiện 7 băng kích th−ớc 231 bp đó là các mẫu CG3-D1, CG4-D1, CG3-D2, CG3-D3, CG3-D5, CG3-D8, CG4-D2, (hình 14). 7 mẫu d−ơng tính với cặp mồi 35S1/35S2 nh−ng âm tính với cặp mồi PA01/CM03 (CG3-D4, CG-D6, CG3-D7, CG3-D9, CG3-D10, CG3-D11, CG3-D12) đang tiếp tục đ−ợc kiểm tra với các cặp mồi khác để xác định khả năng kháng với nhóm thuốc trừ cỏ nào, tr−ớc khi bố trí thí nghiệm phun thuốc diệt cỏ. Những mẫu cây ngô d−ơng tính với cặp mồi PA01/CM03 (có gen PAT) sẽ đ−ợc kiểm tra khả năng kháng thuốc diệt cỏ ở ngoài đồng ruộng bằng ph−ơng pháp thí nghiệm phun thuốc diệt cỏ Ammonium glufosinate để kiểm tra sự biểu Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -44- hiện của gen PAT và chọn lọc những dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ phục vụ thí nghiệm lai backross. Hình 9: Kết quả sản phẩm PCR với cặp mồi PA01/CM03 phát hiện gen PAT của các mẫu ngô M1kb: Marker chuẩn 1kb ĐC (–): Mẫu đối chứng âm tính (HB2BO) 4.5. Kết quả đánh giá đa đạng di truyền của các dòng ngô thuần mang gen kháng thuốc diệt cỏ đ−ợc tạo ra từ nguồn vật liệu ban đầu Từ các nguồn vật liệu thu thập, chúng tôi đã xác định đ−ợc nguồn vật liệu CG4 là dòng thuần di truyền ổn định qua các thế hệ. Nguồn vật liệu CG3 di truyền ch−a ổn định có thể là giống lai hoặc vật liệu đ−ợc chuyển gen ch−a thuần. Đối với nguồn vật liệu CG4 là dòng thuần vừa mang gen kháng sâu vừa mang gen kháng thuốc diệt cỏ, chúng tôi tiếp tục tự thụ và sib để giữ dòng. Đối với nguồn vật liệu ch−a thuần, chúng tôi tiến hành tự thụ xác định các vật liệu mang gen kháng thuốc diệt cỏ bằng kỹ thuật PCR ở giai đoạn sớm của cây con ở mỗi thế hệ. Tất cả các cây mang gen kháng thuốc diệt cỏ tiếp tục đ−ợc tự thụ và kiểm tra sự có mặt của gen kháng thuốc diệt cỏ ở các thế hệ tiếp theo, để tạo dòng thuần mang gen kháng thuốc diệt cỏ. Sau 4 thế hệ tự thụ, trong tổng số Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -45- 180 dòng thu đ−ợc có 14 dòng có khả năng kháng thuốc trừ cỏ (bảng 5) đã đ−ợc đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính và đánh giá đa dạng di truyền phục vụ công tác backcross (lai ng−ợc) nhằm tạo ra các dòng ngô thuần mang gen kháng thuốc diệt cỏ có đặc điểm nông sinh học tốt, có triển vọng trong công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ. Bảng 5: Các dòng giống ngô thuần kháng thuốc diệt cỏ đ−ợc tạo ra từ các nguồn vật liệu ban đầu TT Tên dòng Đặc tính Nguồn gốc thu nhập 1 CG3-D1 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 2 CG4-D1 Kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG4 3 CG3-D2 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 4 CG3-D3 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 5 CG3-D4 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 6 CG3-D5 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 7 CG3-D6 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 8 CG3-D7 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 9 CG3-D8 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 10 CG3-D9 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 11 CG4-D2 Kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG4 12 CG3-D10 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 13 CG3-D11 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 14 CG3-D12 Kháng thuốc diệt cỏ Từ nguồn CG3 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -46- 4.5.1. Đa dạng di truyền ở mức hình thái và một số đặc điểm nông sinh học chính của các dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ 14 dòng nghiên cứuđ−ợc bố trí theo khối ngẫu nhiên trong điều kiện kiểm soát chặt chẽ, mỗi dòng gieo thành 3 hàng dài 5m, khoảng cách gieo là 70cm x 25 cm x 1cây/hốc. Các đặc điểm hình thái và nông sinh học chính đ−ợc tiến hành đánh giá qua các thí nghiệm so sánh, kết quả chỉ ra ở bảng 6. Bảng 6: Một số đặc điểm hình thái và đặc điểm nông sinh học chính của các dòng giống ngô kháng thuốc diệt cỏ (vụ Thu Đông 2007) Tên dòng Thời gian sinh tr−ởng (ngày) Cao cây TB (cm) Cao bắp TB (cm) Số lá TB Dài cờ TB (cm) Màu cờ Màu râu Màu dạng hạt Đặc điểm khác CG3-D1 110 104,8 50,3 16 26,6 Trắng xanh Hồng ĐV, LT, RN Cây yếu, lá th−a, bắp nhỏ, kết hạt kém CG4-D1 115 89,2 43,3 16 14,1 Nâu Hồng ĐV, LĐ Cây yếu, lá th−a, bắp nhỏ CG3-D2 110 91,8 53,0 16 24,3 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, lá th−a, bắp nhỏ CG3-D3 110 102,2 38,2 17 27,4 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D4 110 86,6 44,9 16 21,6 Trắng xanh Hồng ĐV. LT. BRN Cây yếu, bắp nhỏ, ít hạt CG3-D5 110 105,2 46,4 16 27,0 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, lá th−a, bắp nhỏ CG3-D6 110 102,6 51,2 16 24,8 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, lá th−a, bắp nhỏ CG3-D7 110 112,1 56,6 17 33,4 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D8 110 111,3 48,8 17 31,8 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D9 110 98,6 57,8 17 28,4 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ, kết hạt kém CG4-D2 115 86,2 51,0 16 13,2 Nâu Hồng ĐV, LĐ Cây yếu, lá th−a, bắp nhỏ CG3-D10 110 108,4 54,0 17 26,0 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ, kết hạt kém CG3-D11 110 102,6 52,2 17 24,3 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D12 110 112,4 48,6 17 32,0 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ ĐV: đá vàng; LT: lõi trắng; LĐ: lõi đỏ; BRN: bán răng ngựa Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -47- Nhìn chung các dòng ngô nghiên cứu có thời gian sinh tr−ởng từ 110-115 ngày ở (vụ Thu Đông 2007), các dòng ngô nghiên cứu có chiều cao trung bình thấp dao động từ 86,2-112,4cm, 16-17 lá, cây yếu bắp nhỏ, khă năng kết hạt kém. Các dòng ngô này không thể sử dụng trực tiếp vào các thí nghiệm tạo giống lai. 4.5.2. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật PCR-RAPD của các dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ Để tiến hành phân tích và đánh giá mức độ đa hình di truyền của các dòng, sản phẩm PCR đ−ợc điện di trên gen agarose 1%. D−ới đây là kết quả phân tích PCR-RAPD với một số mồi đặc tr−ng. + Mồi OPA12 Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi OPA12 Các giếng từ 1-14 t−ơng ứng với thứ tự các dòng ngô Kết quả điện di sản phẩm PCR_RAPD (hình 10) của 14 dòng ngô với mồi OPA12 có 11 loại băng với kích th−ớc khác nhau từ 400-2000bp đ−ợc nhân lên (bảng 7). Trong đó, mẫu số 5 (CG3-D4) có số băng ADN đ−ợc nhân bản nhiều nhất 9 băng, còn mẫu số 3 (CG3-D2) chỉ có 2 băng đ−ợc nhân bản. Mẫu số 3 (CG3-D2) xuất hiện 2 băng cá biệt kích th−ớc khoảng 400 bp, 1600 bp và 4 băng vắng mặt (duy nhất) ở các vị trí 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp và 1500 bp. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -48- Tính đa hình đ−ợc thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện băng ADN khi so sánh giữa các dòng với nhau. ở mồi OPA12 cả 11 băng đều cho đa hình. Bảng 7: Các băng ADN đ−ợc nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR_RAPD với mồi OPA12 Thứ tự các dòng TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 2 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 6 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 7 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 10 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 11 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tổng 7 6 2 5 9 7 7 7 8 8 7 6 7 7 (số 1 là đoạn ADN đ−ợc nhân, Số 0 là đoạn ADN không đ−ợc nhân) + Mồi OPM12 Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi OPM12 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -49- Kết quả điện di sản phẩm PCR_RAPD của các dòng ngô với mồi OPM12 có 5 loại băng với kích th−ớc khác nhau từ 200-700bp đ−ợc nhân lên. Trong đó, mẫu số 5 (CG3-D4) và mẫu số 6 (CG3-D5) có số băng ADN đ−ợc nhân bản nhiều nhất 3 phân đoạn còn mẫu số 3 (CG3-D2) và mẫu số 8 (CG3-D7) không có băng nào đ−ợc nhân bản. Mẫu số 5 (CG3-D4) xuất hiện băng cá biệt kích th−ớc khoảng 700 bp. ở mồi OPM12 cả 5 băng nhân lên đều cho đa hình. Bảng 8: Các băng ADN đ−ợc nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR_RAPD với mồi OPM12 Thứ tự các dòng TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 3 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 4 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 5 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 Tổng 2 2 0 1 3 3 2 0 1 2 1 2 2 1 (Số 1 là đoạn ADN đ−ợc nhân, Số 0 là số đoạn ADN không đ−ợc nhân) + Mồi S208 Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi S208 Kết quả điện di sản phẩm PCR_RAPD của các dòng ngô với mồi S208 có 7 loại băng với kích th−ớc khác nhau từ 100-1700bp đ−ợc nhân lên. Trong đó, Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -50- mẫu số 11 (CG4-D2) có số băng ADN đ−ợc nhân bản nhiều nhất 6 băng còn mẫu số 1 (CG3-D1) chỉ có 2 băng đ−ợc nhân bản. ở mồi S208 có 5 băng đa hình và 2 băng đơn hình đ−ợc nhân lên. Mẫu số 9 (CG3-D8) xuất hiện băng cá biệt kích th−ớc khoảng 1700 bp. Bảng 9: Các băng ADN đ−ợc nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng PCR_RAPD với mồi S208 Thứ tự các dòng TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 6 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 7 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 Tổng 2 3 5 4 3 4 4 5 4 3 6 3 3 1 (Số 1 là đoạn ADN đ−ợc nhân, Số 0 là đoạn ADN không đ−ợc nhân) Bảng 10: Thống kê các mồi xuất hiện băng đa hình TT Tên mồi Đơn hình Đa hình Băng cá biệt 1 OPA12 0 11 2 2 S202 0 3 0 3 OPA15 1 6 1 4 S201 2 0 0 5 OPM12 0 5 1 6 OPM9 0 2 0 7 OPA18 0 8 0 8 BIO12 0 4 0 9 S208 2 5 1 10 OPM18 0 6 0 Số mồi đa hình là 10 5 46 5 Kết quả phân tích PCR_RAPD của 14 dòng ngô với tổng 20 mồi thuộc nhóm OPA, OPM, BIO và nhóm S cho thấy có 10 mồi cho băng đa hình rõ nhất Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -51- đó là các mồi: OPA12, S202, OPA15, S201, OPM12, OPM9, OPA18, BIO12, S208 và OPM18 (bảng 10). Thống kê kết quả phân tích tính đa hình bằng kỹ thuật PCR_RAPD với 10 mồi chỉ ra ở bảng 11. Bảng 11: Kết quả PCR-RAPD của các dòng ngô với 10 mồi cho băng đa hình Số băng ADN thu đ−ợc trên từng mồi T T Tên dòng OPA12 S202 OPA15 S201 OPM12 OPM9 OPA18 BIO12 S208 OPM18 Tổng 1 CG3-D1 7 0 5 2 2 0 4 3 2 0 25 2 CG4-D1 6 1 5 2 2 1 8 4 3 6 38 3 CG3-D2 2 0 2 2 0 0 4 3 5 1 19 4 CG3-D3 5 0 5 2 1 0 6 1 4 1 25 5 CG3-D4 9 0 5 2 3 1 7 2 3 3 35 6 CG3-D5 7 1 5 2 3 1 7 0 4 2 32 7 CG3-D6 7 0 7 2 2 1 6 2 4 0 31 8 CG3-D7 7 0 7 2 0 0 7 3 5 0 31 9 CG3-D8 8 0 7 2 1 0 0 2 4 3 27 10 CG3-D9 8 3 5 2 2 2 6 3 3 5 39 11 CG4-D2 7 0 3 2 1 2 6 2 6 4 33 12 CG3-D10 6 3 2 2 2 1 6 4 3 4 33 13 CG3-D11 7 2 2 2 2 1 7 3 3 3 32 14 CG3-D12 7 1 3 2 1 0 6 2 3 2 27 Tổng 93 11 63 28 22 10 80 34 52 34 427 Các số liệu thu đ−ợc ở bảng 11 cho thấy: Với 140 phản ứng PCR nhân lên đ−ợc tổng số 427 băng thuộc 56 loại băng có kích cỡ khác nhau. Trong đó, có 51 băng cho đa hình chiếm 91,07%, 5 băng đơn hình chiếm 8,93%. Kích th−ớc băng có chiều dài nhỏ nhất khoảng 200 bp và băng có kích th−ớc lớn nhất khoảng 4000bp. Xuất hiện 5 băng cá biệt trong đó có 2 băng chỉ xuất hiện duy nhất ở một mẫu và 3 băng khuyết ở 1 mẫu duy nhất còn xuất hiện ở cả 13 dòng còn lại. Mồi OPA12 nhân lên đ−ợc tổng số băng nhiều nhất là 93 băng và mẫu số 3 (CG3-D2) xuất hiện 2 băng cá biệt kích th−ớc khoảng 400 bp, 1600 bp và 4 băng vắng mặt (duy nhất) ở các vị trí 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp và 1500 bp; Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -52- Mồi OPM18 nhân lên đ−ợc 80 băng; Mồi OPA15 nhân lên đ−ợc 63 băng và mẫu CG3-D12 xuất hiện băng cá biệt kích th−ớc khoảng 2100 bp; Mồi S208 nhân lên đ−ợc 52 băng và mẫu CG3-D8 xuất hiện băng cá biệt kích th−ớc khoảng 1700 bp; Mồi BIO12, OPM18 cùng nhân lên đ−ợc 34 băng; Mồi S201 nhân lên đ−ợc 28 băng; Mồi OPM12 nhân lên đ−ợc 22 băng và mẫu số 5 (CG3- D4) xuất hiện băng cá biệt kích th−ớc khoảng 700 bp; Mồi S202 nhân lên đ−ợc 11 băng; Mồi OPM9 nhân lên đ−ợc 10 băng. Số băng nhân lên trung bình cho cả 10 mồi là 42,7 băng/mồi 4.5.3. Mối quan hệ giữa các dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ dựa trên phân tích RAPD Số liệu thu đ−ợc từ 10 mồi RAPD đ−ợc thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.02, từ đó chúng tôi thiết lập đ−ợc bảng hệ số t−ơng đồng di truyền (bảng 12) và sơ đồ hình cây quan hệ di truyền của 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ (hình 13). Bảng 12: Hệ số t−ơng đồng di truyền của các dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 1.00 2 0.57 1.00 3 0.41 0.42 1.00 4 0.51 0.53 0.51 1.00 5 0.57 0.62 0.42 0.50 1.00 6 0.54 0.66 0.41 0.72 0.55 1.00 7 0.69 0.60 0.47 0.64 0.69 0.70 1.00 8 0.64 0.60 0.51 0.64 0.65 0.57 U0.77 U 1.00 9 0.57 0.47 U0.35U 0.48 0.63 0.43 0.56 0.56 1.00 10 0.52 0.63 0.41 0.42 0.72 0.47 0.55 0.59 0.57 1.00 11 0.56 0.65 0.48 0.52 0.65 0.54 0.56 0.60 0.50 0.63 1.00 12 0.52 0.65 0.48 0.41 0.58 0.51 0.56 0.48 0.39 0.71 0.60 1.00 13 0.50 0.59 0.50 0.54 0.67 0.56 0.61 0.57 0.43 0.65 0.58 0.75 1.00 14 0.57 0.51 0.48 0.52 0.63 0.55 0.61 0.61 0.50 0.60 0.57 0.66 0.68 1.00 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -53- Hình 13. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ Qua bảng 12 và hình 13 cho thấy hệ số t−ơng đồng di truyền của 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ ở từng cặp dao động từ 0,35 đến 0,77. Hai dòng số 7 (CG3-D6) và số 8 (CG3-D7) có hệ số t−ơng đồng di truyền cao nhất là 0,77. Dòng số 2 (CG4-D1) và số 11 (CG4-D2) có cùng nguồn gốc từ dòng thuần CG4 có hệ số t−ơng đồng khá cao là 0,65 (phù hợp với các nghiên cứu đánh giá về hình thái). Dòng số 3 (CG3-D2) có nguồn gốc từ nguồn vật liệu CG3 và dòng số 11 (CG4-D1) có nguồn gốc từ CG4 có hệ số t−ơng đồng thấp nhất là 0,35. Hệ số t−ơng đồng di truyền giữa các cặp dòng dao động từ 0,35 đến 0,77 chứng tỏ các dòng ngô tạo ra từ các nguồn vật liệu ban đầu rất đa dạng và phong phú. Qua kết quả sử lý số liệu cho thấy ở mức t−ơng đồng 55% có thể chia 14 dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ thành 4 nhóm −u thế lai: Nhóm 1 gồm 5 dòng: dòng số 1 (CG3-D1), số 4 (CG3-D3), số 6 (CG3- D5), số 7(CG3-D6) và dòng số 8 (CG3-D7) đ−ợc chia làm 2 nhóm phụ: Nhóm 1.1: gồm 3 dòng số 1, số 7 và số 8. Cả 3 dòng đều có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ban đầu là CG3. Hệ số t−ơng đồng của từng cặp dòng trong nhóm Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -54- rất cao dao động từ 0,64-0,77. Trong đó hai dòng số 7 và số 8 có hệ số t−ơng đồng di truyền cao nhất là 0,77 Nhóm 1.2 gồm có 2 dòng số 4 và dòng số 6 có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ban đầu là CG3 có hệ số t−ơng đồng rất cao là 0,72 Nhóm 2 gồm 7 dòng: dòng số 2 (CG4-D1), số 11 (CG4-D2), số 5 (CG3- D4), số 10 (CG3-D9), số 12 (CG3-D10), số 13 (CG3-D11) và dòng số 14 (CG3- D12) trong đó dòng số 2 và dòng số 11 có nguồn gốc từ CG4, các dòng còn lại có nguồn gốc từ CG3, và đ−ợc chia làm 3 nhóm phụ: Nhóm 2.1: gồm có dòng số 2 và dòng số 11 có hệ số t−ơng đồng khá cao là 0,65 Nhóm 2.2: gồm có dòng số 5 và dòng số 10 có hệ số t−ơng đồng rất cao là 0,72 Nhóm 2.3: gồm có 3 dòng số 12 , dòng số 13 và số 14 có hệ số t−ơng đồng từng cặp rất cao dao động từ 0,66-0,75. Nhóm 3: chỉ có duy nhất dòng số 9 (CG3-D8) có hệ số t−ơng đồng với các dòng còn lại dao động từ 0,35-0,63, trong đó hệ số t−ơng đồng thấp nhất là 0,35 giữa dòng số 9 và dòng số 3. Nhóm 4: chỉ có duy nhất dòng số 3 (CG3-D2) có hệ số t−ơng đồng với các dòng còn lại rất thấp dao động từ 0,35-0,51. Nh− vậy, trên cơ sở phân tích đa dang di truyền ở mức độ phân tử ADN bằng kỹ thuật PCR_RAPD kết hợp với phân tích về hình thái cho thấy sự khác nhau về đặc điểm hình thái vμ sự khác biệt di truyền giữa các dòng ngô. Các dòng có cùng nguồn gốc th−ờng có quan hệ gần gũi với nhau vμ ở cùng một nhóm. Những dòng có hệ số t−ơng đồng di truyền thấp là những dòng có nguồn gốc khác nhau. Dựa trên kết quả phân tích đa dạng di truyền về hình thái và phân tử để thiết kế sơ đồ lai backcross nhằm tạo ra đ−ợc các dòng ngô −u việt mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc trừ cỏ. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -55- Phần V. Kết Luận Vμ Kiến Nghị 5.1. Kết luận – Đã tách chiết đ−ợc 180 mẫu ADN của 180 dòng ngô. – Đã xác định đ−ợc sự có mặt promoter 35S có kích th−ớc 195bp của 14/180 dòng ngô ở thế hệ thứ 4 đ−ợc tạo ra bằng cách tự thụ c−ỡng bức từ 2 nguồn vật liệu CG3 (mang gen kháng thuốc trừ cỏ) và CG4 (mang gen kháng sâu và kháng thuốc trừ cỏ). – Đã xác định đ−ợc sự có mặt của gen PAT (đoạn trình tự đặc tr−ng có độ dài 231 bp) của dòng ngô. – Đã đánh giá đ−ợc một số đặc điểm hình thái, chỉ tiêu nông sinh học chính và đa dạng di truyền ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RAPD của 14 dòng ngô nghiên cứu phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô −u việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ. 5.1. Kiến nghị Trong các vụ tiếp theo: – Tiếp tục kiểm tra sự có mặt của các gen kháng thuốc trừ cỏ khác của 7 dòng ngô phát hiện có promoter 35S (nh−ng không có gen PAT). – Kiểm tra khả năng kháng thuốc trừ cỏ của 7 dòng ngô mang gen PAT bằng ph−ơng pháp phun thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate ở ngoài đồng ruộng. – Giữ nguồn vật liệu là dòng thuần, tiếp tục nghiên cứu tạo các dòng ngô thuần mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ công tác backcross (lai ng−ợc) để chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sang các dòng ngô −u việt nhằm tạo ra dòng dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ có các đặc điểm nông sinh học tốt, phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc trừ cỏ. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -56- VI. Tμi Liệu THAM Khảo 6.1. Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Mạnh C−ờng (2007). Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống Ngô. NXB Nông nghiệp. 2. Bùi Mạnh C−ờng, Trần Hồng Uy, P. W. J. Taylor, R. Ford, Nguyễn Thị Thanh, Lê Quý Kha (2000). Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số dòng ngô đ−ờng bằng ph−ơng pháp RAPD marker. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, số 1/2000, tr. 16-22. 3. Nguyễn Thuý Điệp (2003). Xét nghiệm ADN cây trồng và sản phẩm biến đổi gen. Luận văn thạc sĩ Công nghệ Sinh học. 4. Phan Xuân Hào, Bùi Mạnh C−ờng, Nguyễn văn tr−ờng, Đào Bích Thảo. Phân tích đa dạng di truyền của các dòng thuần và mối quan hệ giữa các hệ số di truyền với năng suất các tổ hợp lai ở ngô đ−ợc thể hiện thông qua chỉ thị SSR. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 6/2005, tr. 22-25. 5. Thạch Mai Hoàng (2000). Tác động của cây trồng biến đổi gen tới môi tr−ờng. Tạp chí Sinh học ngày nay, số 28, tr. 17-19. 6. Nguyễn Thị Lang (2002). Ph−ơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. NXB Nông nghiệp. 7. Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (1999). Đa dạng sinh học. NXB ĐH Quốc gia HN. 8. Khuất Hữu Thanh (2006). Kỹ thuật gen: nguyên lý và ứng dụng. NXB KHKT. 9. Nguyễn Quang Thạch (2005). Giáo trình CNSH Nông nghiệp. NXB Nông nghiệp. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -57- 10. Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Bùi Mạnh C−ờng, Võ Đình Long, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng (1997). Cây ngô, nguồn gốc, đa dạng di truyền và quá trình phát triển. NXB Nông nghiệp. 11. Khuất Hữu Trung và cs (2007). Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lan Kiếm ở mức độ phân tử bằng kỹ thuật PCR_RAPD. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 14/2007, tr. 26-30. 12. Trung tâm Thông tin t− liệu khoa học và công nghệ Quốc gia. Cây trồng biến đổi gen - Tình hình nghiên cứu ứng dụng và các quan điểm phát triển. Số 4/2003. 6.2. Tài liệu tiếng Anh 13. Arne Holst-Jensen (2001). GMO detection methods and vatidation. National Veterinary Institute, Section of Food & Feed Microbiology, Ullevaalsveien 68, P.O.Box 8156 Dep. 0033 Oslo, Norway. 14. Bertheau Y., Diolez A., Kobilinsky A., Magin K. (2002). Detection methods and performance criteria for gennetically modified organisms. J AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp. 801-808. 15. Brodmann P. D., Ilg EC, Berthoud H., Herrmann A (2002). Real-Time quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically modified maize varieties and maize DNA content in food. J AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp. 646-653. 16. Devos K. M., and Gale M. D. (1992) - The use of Random Amplified Polymorphic DNA markers in Wheat. Theor. Appl. Genet 84, pp. 567- 572 17. Hsu Y. L., Lih C., Daniel Y. C. S. (2000). Detection of genetically modifiedsoybeans and maize by the polymerase chain reaction method. Journal of Food and Drug Analysis, 8 (3), pp. 200-207. 18. Huebner P., Studer E., Luethy J. (1999). Quantitation of genetically modified organisms in food. Nature Biotechnol, 17, pp. 1137-1138. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -58- 19. Jaroslava Ovesna, Lenka Dùdicovà, Jiri Horácek, Eva Sadilová, Ladislav Kucera, Ludmila Mésková (2002). Comparison of different PCR-based protocols for detection of Roundup Ready soybean. Czech J.Genet.Plant Breed, 38(1)/2002, pp. 55-63. 20. Javed Akhter Mohammed Qutub, Norman Burnham, Mohammed Akhtar (2001). Genetically modified foods :health and safety issues. Annals of Saudi Medicine, 21 (3-4), pp. 161-164. 21. Keatley K. L., (2000). Controversy over genetically modified organisms: the governing laws and regulation. Qual Assur 2000 Jan-Mar, 8(1), pp. 33-36. 22. Love J., M. Knight A. M., Mcaleer M. A., and Todd J. A. (1990). Towards construction of a high resolution map of the mouse genome using PCRanalyzed microsatellite. Nucl. Acid. Res. 18 (14), pp. 4123 – 4130. 23. Markus L., Anke B., Fabrice E., Lothar K., Heinz S., Guy V., D., E., (2000). Validation of a method based on Polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. Eur Food Res. Technol 2001, 212, pp. 497-504. 24. Martens (2000). Safety evaluation of genetically modified foods. Int Arch Environ Health 2000, 73 (Suppl), pp. 14-18. 25. Matsuoka T., H. Kunbara, H. Akiyama, H. Miura, Y. Goda, Y. Kusakabe, K. Isshiki, M. Toyoda, A. Hino (2001). A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize. J. Food Hyg. Soc. Japan, 42, pp. 24-32. 26. McCough S., R. Chen X., Panaud O., Ternykh S., Xu Y., Cho Y., G. Huang N., Ishii T., and Blair M. (1997). Microsatellite markers development mapping and application in rice genetics. and breeding, Plant Mol. Biol. 35, pp. 89 – 99. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -59- 27. Melody, M. Aguiba (2003). Congress bills press for labeling of GM products. Manila Bulletin, 8-Mar-2003. 28. Meyer R, F. Chardonnens, P. Hubner, J. Luthy (1996). Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya in processed meat products. Z. Lebensm. Unters. Forsch , 203, pp. 339-344. 29. Mitten D. H., MacDonald R, Klonus D (1999). Regulation of foods derived from genetically engineered crops. Curr. Opin. Biotechnol, 10, pp. 298-302. 30. Morgante M., and Olivieri A. M. (1993). PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J.1, pp. 175 – 182. 31. Moseley B. E., (1999). The safety and social acceptance of novel foods. Int J. Food Microbiol 1999, 50, pp. 25-31. 32. Nobuaki S., Keiko M., Sachiko O., Wataru H., Makoto K., Shigeru U., and Kousaku M. (1998). Safety assessment of genetically engineered food: Detection and monitoring of Glyphosate-tolerant Soybeans Biosci. Biotechnol. Biochem 1998, 62(7), pp. 1461-1464. 33. Obara-Okeyo P. & S. Kako, 1998. Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Euphytica 99, pp. 95-1001. 34. Ramon D (2000). Genetically modified foods: a case of information or misinformation. Int Microbiol 2000, 3, pp. 1-2. 35. Stewart C., Richards H., and Halthill M. (2000). Transgenic plants and biosafety: science, misconceptions and public perceptions. Biotechniques, 29/2000, pp. 832-843. 36. Studer E., C. Rhyner, J. Luthy, P. Hubner (1998). Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybeans and maize. Z. Lebensm. Unters. Forsch , 207(A), pp. 207-213. Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu -60- 37. Vos P., Hoggers R., Becker M., rejain M., Lee T., Hornes M., Friejtera P.J., Peleman J., Kuiper M. and Zabeau M. (1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acid. Res. 23, pp. 4407 – 4414. 6.3. Website 38. T 39. 40. http:// www.gmo.gov.vn 41. 42. 43. 44. http:// www.sinhhocvietnam.com 45. H 46.