Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (β-Fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía

siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhƣ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4]. Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông nghiệp và y dƣợc học. Nó đƣợc biết đến nhƣ một kỹ thuật sinh học hiện đại có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật. Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lƣợng lysine trong ngô hoặc loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25]. RNAi là một hƣớng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong các liệu pháp trị bệnh cho con ngƣời trong tƣơng lai cũng nhƣ phân tích chức năng hệ gen cây trồng v.v... 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dòng hóa đoạn DNA. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hƣớng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu quả trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc tách dòng có định hƣớng của các sản phẩm PCR. Hơn nữa các phản ứng đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động. Đây là kỹ thuật hữu ích cho những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector. Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway - Kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bởi hai bƣớc chính: + Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện (expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D). + Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa “entry clone” với một vector đích (destination vector) mà có chứa các trình tự attR1 và attR2 và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB. Trên hình 1.3 cho thấy dòng vector nhận có các điểm tái tổ hợp attL1 và attL2 sẽ phản ứng với các điểm tái tổ hợp trên vector đích attR1 và attR2 để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2. Mặt khác, đoạn gen quan tâm đƣợc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 gắn vào trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB trên vector đích vì thế thu đƣợc trên dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn. 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA Tái sinh cây đƣợc xem là mấu chốt quan trọng, quyết định sự thành công của các thí nghiệm chuyển gen. Hiện nay, hệ thống chuyển gen ở thực vật thông qua A.tumefaciens đã mang lại những thành tựu lớn trong thời gian ngắn có thể tạo ra các giống cây trồng có những đặc tính tốt mong muốn. Ở mía đã chuyển gen thành công với hai phƣơng pháp là súng bắn gen và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens, trong đó chuyển gen thông qua A.tumefaciens là hiệu quả hơn hẳn. Snyman và cs (2006) đã tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía bằng phƣơng pháp súng bắn gen từ mô sẹo [29]. Mô sẹo tạo ra bằng cách đặt những lát cắt nhỏ dày 1 - 2 mm ở phần đỉnh ngọn của cây mía lên môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo là (MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l casein + 0,6 mg/l 2,4D +5 g/l agar), pH = 5,8 trong điều kiện tối, ở 28oC. Trƣớc 4 giờ chuyển gen bằng kỹ thuật súng bắn gen, các mô sẹo đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung thêm 0,2 M Sorbitol; 0,2 M manitol. Sau chuyển gen các mô sẹo đƣợc đồng nuôi cấy ở trong tối, 3 ngày. Tiếp theo mô sẹo đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc và thu đƣợc cây chuyển gen hoàn chỉnh với các môi trƣờng có bổ sung 45 mg/l geneticin. Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đƣờng tạo đa chồi với hiệu quả thu đƣợc là 49,6% cây chuyển gen [22]. Lây nhiễm A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thƣơng của mía trong 10 phút. Sau đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trƣờng MS trong 3 ngày. Các mô đƣợc diệt khuẩn bằng nƣớc cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Ông tạo đƣợc các cây chuyển gen trên các môi trƣờng chọn lọc tái sinh có bổ sung 5 mg/l ppt. Santosa và cs (2004) chuyển gen thành công vào mô sẹo của mía thông qua A.tumefaciens GV2260. Kết quả kiểm tra các cây sau chọn lọc thấy rằng có khoảng 85 - 100% cây sống sót có mang gen chuyển [34]. Mô sẹo đƣợc tạo từ đoạn thân non trên môi trƣờng [4,3 g/l MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l NZ- amine + 0,3 ml vitamin (0,1 g / 75 ml hydrochloride thiamine; 0,05 g / 75 ml biotin; 1 g / 75 ml pyrodoxine hydrochlorid; 0,25 g / 75 ml myo-inositol) + 3 mg/l 2,4D + 100 ml nƣớc dừa + 8 g/l agar, pH = 5,8] trong điều kiện tối, 1 tháng. Trƣớc 7 giờ biến nạp với A.tumefaciens bổ sung thêm 75 μl chất chống ôxyhóa vào dịch khuẩn. A.tumefaciens đƣợc hòa tan với môi trƣờng cảm ứng tạo chồi có bổ sung 5 ml chất chống ôxyhóa với OD578 = 0,2 và đƣợc lây nhiễm với các mảnh mô sẹo nhỏ (2 - 3 mm) trong 5 - 10 phút. Diệt khuẩn và chuyển mô sẹo lên môi trƣờng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime ở 28oC, lắc 60 vòng/2 ngày. Cây chuyển gen đƣợc tạo thành với các môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 100 mg/l kanamycin. Zhangsun và cs (2007) tái sinh và chuyển gen ở mía từ mô sẹo thông qua A.tumefaciens (OD600=0,2; 0,4; 0,6) trong thời gian 10 - 20 phút với kháng sinh chọn lọc 500 mg/l carbenicillin và 1 mg/l ppt [28]. Nhƣ vậy, các tác giả đã tái sinh và chuyển gen thành công chủ yếu từ mô sẹo và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Để thành công việc chuyển gen vào thực vật nói chung cũng nhƣ ở mía thì nhất thiết phải có một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã thử nghiệm và cải biến hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen của các nghiên cứu thành công về mía ở trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Chúng tôi sử dụng giống mía ROC1 và ROC10 in vitro đang đƣợc giữ tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm Plasmid Kích thƣớc (bp) Kháng sinh chọn lọc Nguồn cung cấp pENTR TM /D- TOPO 2580 Kanamycin Invitrogen (Mỹ) pK7GWIWG2(II) 12904 Spectinomycine, streptomycine Trƣờng Đại học Ghent (Bỉ) - Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng CV58C1 mang plasmid pGV2260 - Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs - Các enzyme T4 ligase, T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp 2.1.3. Hóa chất khác - Cặp mồi 3’INV/5’INV nhân đoạn gen mã hóa enzyme Invertase và cặp mồi M13for/rev kiểm tra sự có mặt của gen Invertase trong vector tách Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 dòng pENTR TM /D-TOPO do chúng tôi thiết kế và đặt tổng hợp tại hãng Bioneer (Hàn Quốc). - Gateway LR Clonase TMII Enzyme Mix Kit (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction) - Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). - Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) và các hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs... 2.1.3. Các thiết bị máy móc Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy biến nạp bằng xung điện, máy đo OD, máy vortex, máy xác định trình tự nucleotid tự động... của Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Thiết kế mồi Khai thác dữ liệu trong GenBank để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá Invertase của cây mía (Bảng 3.2). Sử dụng phần mềm chuyên dụng DNAstar so sánh độ tƣơng đồng giữa các trình tự Invertase thu đƣợc và thiết kế cặp mồi đặc hiệu tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 2.2.2. Tách RNA tổng số Sử dụng hóa chất Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá và bẹ thân non của 2 giống mía in vitro ROC1 và ROC10 theo hƣớng dẫn kèm theo. 2.2.3. RT-PCR Phân lập gen mã hóa enzyme Invertase ở mía bằng kỹ thuật RT-PCR một bƣớc (RT-PCR one step) theo chu kỳ sau: Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ 1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 2 Biến tính 95 5 phút 1 3 Biến tính 94 20 giây 35 4 Gắn mồi 52 1 phút 35 5 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35 6 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 7 Kết thúc phản ứng 8 24 giờ 1 Thành phần của phản ứng với tổng thể tích 25 l đƣợc bổ sung vào ống effendorf 0,5 ml đã đƣợc xử lý DEPC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Bioneer) gồm có: 2X dung dịch đệm RT-PCR; 1 µg RNA tổng số; 0,4 - 0,6 mM 3’INV; 0,4 - 0,6 mM 5’INV; 0,5 g enzyme RT. Mix mẫu nhẹ nhàng và thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2. Sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8 - 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X và nhuộm bản gel trong ethidium Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 bromide (EtBr). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction Kit. 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn (INV_pENTR). Phản ứng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli Top 10 và nhân nuôi lƣợng lớn trong môi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 mg/l kanamycin. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Sambroock và đƣợc cất giữ ở -20oC. INV_pENTR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev với tổng thể tích 25 μl bao gồm: 1X dung dịch đệm PCR, 50 ng plasmid, 50 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, 10 ng M13for, 10 ng M13rev, 0,5 g Taq polymerase. Chu kỳ của phản ứng nhƣ sau: Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 95 5 phút 1 2 Biến tính 94 20 giây 35 3 Gắn mồi 52 1 phút 35 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35 5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Mẫu plasmid tái tổ hợp INV_pENTR sau khi kiểm tra sẽ đƣợc loại RNA và thực hiện xác định trình tự nucleotide trên máy ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen. 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi INV_pENTR sẽ đƣợc gắn vào vector pK7GWIWG2(II) theo kỹ thuật Gateway để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa Invertase (INV_RNAi). Trong kỹ thuật này, vector pENTR/D mang vị trí tái tổ hợp attL trong khi ở vector nhận là attR. Các vị trí này giúp phản ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra khi có mặt đồng thời plasmid INV_pENTR với vector nhận pK7GWIWG(II) gắn đoạn gen Invertase theo cả 2 chiều xuôi-ngƣợc vào vector nhận, tạo nên cấu trúc INV_RNAi mong muốn. Các dòng plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc nhân lên trong tế bào E.coli trên đĩa môi trƣờng thạch LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol ở 37 oC qua đêm. Sau đó tiến hành tách plasmid theo kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi thu đƣợc sẽ đƣợc phân lập và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen Invertase bằng phƣơng pháp cắt giới hạn với hai enzyme HindIII và XbaI sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Dòng tế bào mang vector INV_RNAi sẽ đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens CV58C1 bằng xung điện ở 400 Ω / 2,5 KV / 25 μF. Plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân nuôi trong môi trƣờng có bổ sung 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin ở 28oC qua đêm. Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo Chúng tôi tiến hành tái sinh mía theo phƣơng pháp của hai nhóm nghiên cứu Santosa và cs (2004); Zhangsun và cs (2007) có cải biến nhƣ sau: cắt những đoạn thân mía non có chứa đỉnh sinh trƣởng của cây mía in vitro dài khoảng 0,5 cm sau đó đặt lên môi trƣờng môi trƣờng tạo mô sẹo (M1 - M4). Các mẫu cấy sẽ đƣợc nhân nuôi trong buồng tối ở 25oC trong vòng 15 - 20 ngày thì thu đƣợc các mô sẹo lên tốt. Các mô sẹo nhân lên trong môi trƣờng tạo mô sẹo (M1) lỏng có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong tối, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút, 1 tuần để đạt kích thƣớc lớn phục vụ cho việc biến nạp. Sau đó, các mô sẹo đƣợc loại bỏ phần thân xanh và đặt lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc. Khi chồi có kích thƣớc khoảng 1- 3 cm (25 - 30 ngày) thì chuyển sang môi trƣờng tạo rễ Mr. Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía Môi trƣờng Thành phần pH Nhân mía M0: MS + 0,8 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar 5,8 Tạo mô sẹo M1: MS + 3 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M2: MS + 4 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M3: MS + 5 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M4: MS + 6 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar 5,8 Nhân mô bằng nuôi lỏng lắc M1 lỏng: MS + 3 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose 5,8 Tạo chồi Mc: MS +1,5 mg/l kinetin + 2 mg/l BAP + 30 g/l sucrose +9 g/l agar Tạo rễ Mr: MS + 1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose +9 g/l agar 5,8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía 2.2.7.1. Tạo huyền phù vi khuẩn Lấy một khuẩn lạc từ đĩa nuôi đặc nuôi trong môi trƣờng LB có bổ sung 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l chloramphenicol + 50 mg/l kanamycine (hoặc 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l rifamycin) ở 28oC, lắc 200 vòng/phút qua đêm. Lấy ra 5 ml khuẩn nuôi phục hồi trong 30 ml môi trƣờng LB lỏng mới, lắc tiếp trong khoảng 2 - 3 giờ trong cùng điều kiện. Sau đó ly tâm khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 10 phút thu sinh khối tế bào rồi hòa tan khuẩn vào ½ MS không đƣờng, (pH = 5,8) có bổ sung AS 100 mM. 2.2.7.2. Đồng nuôi cấy với huyền phù A.tumefaciens và tái sinh Mô sẹo sau khi đƣợc nhân sinh khối từ môi trƣờng lỏng sẽ đƣợc lấy ra tách thành từng mảnh nhỏ. Quá trình lây nhiễm khuẩn đƣợc tiến hành theo hai hƣớng là thổi khô mô sẹo và chuyển lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi với các ngƣỡng thời gian khác nhau. Sau đó mô sẹo đƣợc lấy ra và ngâm trong huyền phù vi khuẩn thời gian từ 10 - 30 phút. Sau đó thấm khô và cấy lên môi trƣờng đồng nuôi cấy M1 (thổi khô) hoặc Mc (cảm ứng tạo chồi). Sau 3 ngày, mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng diệt khuẩn M1 có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong 1 tuần. Các mô sẹo sống sót sẽ đƣợc chuyển lên môi trƣờng tái sinh Mc + 500 mg/l cefotaxim và Mc + 500 mg/l cefotaxim + 1 mg/l ppt. Các chồi tái sinh đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và 1 mg/l ppt để tạo cây hoàn chỉnh. Chúng tôi kiểm tra biểu hiện gen gus bằng cách nhuộm mô sẹo sau đồng nuôi cấy với dung dịch X-gluc, ủ ở 37oC trong tối trong khoảng từ 12 - 16 giờ, sau đó rửa với cồn 70% và soi trên kính hiển vi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 KHÁI QUÁT SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM Cắt đoạn thân sát gốc (5 cm) Mô sẹo Chọn lọc mô sẹo Tái sinh cây Đồng nuôi cấy Diệt khuẩn Tách RNA tổng số RT_PCR Tách dòng và xác định trình tự gen Thiết kế vector tái tổ hợp INV_RNAi Thiết kế mồi Cây mía in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THIẾT KẾ MỒI Để nhân đƣợc đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase bằng kỹ thuật RT-PCR điều quan trọng nhất là phải có đƣợc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự của đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase. Chúng tôi đã sử dụng từ khóa “Invertase Sugarcane” để tìm kiếm trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI các trình tự gen Invertase đã đƣợc công bố (www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả đã thu đƣợc sáu trình tự của gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía, trong đó có 5 trình tự mã hóa cho enzyme Invertase hòa tan (soluble acid Invertase) với mã số AF062734, AF 062735, AF083855, AF083856, AY302083; và một trình tự mã hóa cho enzyme Invertase liên kết màng (cell wall Invertase) có mã số AY302084 (Bảng 3.2). Sử dụng chƣơng trình MegAlign (DNAstar) so sánh độ tƣơng đồng của các trình tự trên với nhau cho thấy năm trình tự của Invertase hoà tan tƣơng đồng cao mặc dù đƣợc phân lập từ các giống mía khác nhau và có độ tƣơng đồng 46% với đoạn trình tự mã hoá cho Invertase liên kết màng. Trình tự đầy đủ của gen này với mã số AY302083 có độ dài 1923 bp. Trong nghiên cứu của chúng tôi đoạn gen dài 435 nucleotide (từ nucleotide vị trí 384 tới vị trí 818 bp - vùng có trình tự bảo thủ cao nhất) nằm trên gen mã hoá enzyme Invertase hòa tan (AY302083) đƣợc lựa chọn để tách dòng. Sau đó với mục đích giúp sản phẩm PCR gắn đƣợc vào vector tách dòng pENTR/D chúng tôi đã gắn thêm đồng thời vào mồi đầu 3’ một đoạn trình tự CACC để tạo vị trí bám cho enzyme TOPO-Isomerasse (GTGG) gắn trên vector nhân dòng PENTR/D-TOPO. Cặp mồi đƣợc đặt tổng hợp bởi hãng BIONEER, Hàn Quốc. Trình tự cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc ở bảng 3.1 nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3 ’ INV và 5 ’ INV Mồi Trình tự mồi Tm(oC) %GC (5 ’ INV) 5 ’ -CATCTGGGGCAACAAGATC-3 ’ 52,3 52,6 (3 ’ INV) 5 ’ -CACCAAGTGCACGAAGTCCTTG-3 ’ 59,1 54,5 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI STT Mã số Chiều dài Dạng Tên Tác giả 1 AY302083 2274 bp mRNA Invertase hòa tan Peters,K.F., Grof,C.P.L. and Botella,J.R. 2 AF062734 1808 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 3 AF083856 1402 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 4 AF083855 494 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 5 AF062735 1808 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 6 AY302084 1889 bp mRNA Invertase liên kết màng Peters,K.F., Grof,C.P.L., Albertson,P.L. and Botella,J.R. 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ Do đặc tính của RNA là một loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). RNase có mặt ở khắp nơi trong tế bào và có hoạt tính rất mạnh và vẫn có hoạt tính mạnh ở nhiệt độ cao (100oC trong khoảng 1 giờ). Do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải hết sức cẩn thận để tránh các tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng và tất cả các dụng cụ thí nghiệm để tách RNA đều phải đƣợc xử lý trong dung dịch DEPC 0,1% để loại trừ RNase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Để tách RNA tổng số từ lá và thân non của mía chúng tôi tiến hành thu mẫu lá và bẹ non của hai giống ROC1 và ROC10. Các mẫu đƣợc nghiền nhanh trong N2 lỏng thành bột mịn với cối chày sứ đã đƣợc khử trùng để phá vỡ tế bào. Sau đó phải bổ sung ngay dung dịch Trizol vào vì nếu không các RNase nội bào sẽ đƣợc giải phóng và phân cắt RNA. Các thành phần trong dung dịch Trizol nhƣ: phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chóng làm kết tủa protein và bất hoạt các RNase nội bào. Bổ sung chloroform:isoamyl (24:1) để làm sạch các protein còn sót lại. Tiếp theo việc bổ sung isopropanol vào làm kết tủa RNA. Cuối cùng sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong 20 μl nƣớc cất có DEPC 0,01%. RNA tổng số sẽ đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.1 cho thấy các mẫu RNA từ thân và lá có hàm lƣợng lớn và có 2 băng RNA riboxom rõ nét nên khẳng định rằng RNA tổng số chƣa bị phân hủy và tối ƣu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ lá và thân non của mía ROC1 và ROC10 in vitro. Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% RNA tổng số sẽ đƣợc loại DNA bằng DNase sử dụng cho phản ứng RT-PCR. ROC 1 10 1 10 Lá Thân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 3.3. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE RNA tổng số sau khi đƣợc tinh sạch sẽ sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase với cặp mồi 5’INV và 3’INV đã thiết kế. Nếu phản ứng này xảy ra đặc hiệu theo lý thuyết thì sẽ có một băng duy nhất có kích thƣớc dài tƣơng ứng với tính toán lí thuyết là 435 bp của đoạn Invertase cần phân lập đƣợc nhân lên. Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% (M): Marker 1kb; (INV): sản phẩm thôi gel Phản ứng RT-PCR có thể bị giảm hiệu quả do một số nguyên nhân nhƣ chất lƣợng và hàm lƣợng RNA tổng số của gen mã hóa enzyme Invertase, nhiệt độ bắt cặp với mồi chƣa phù hợp... Vì vậy khi tiến hành phản ứng chúng tôi đã điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+, nhiệt độ bắt cặp với mồi... để đảm bảo cho phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Thành phần hỗn hợp của phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng đã đƣợc tối ƣu hóa trình bày ở mục 2.2.1.3. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR một bƣớc với khuôn là RNA tổng số thu đƣợc từ bẹ mía non (giống ROC1) đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2). Kết quả cho thấy chúng tôi INV M 450 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 đã nhân đƣợc 1 đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 450 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA dự đoán khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu. 3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR Để khẳng định chắc chắn rằng đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng RT-PCR chính xác là đoạn gen mã hóa enzyme Invertase, chúng tôi tiến hành việc tiếp theo là tách dòng và xác định trình tự gen. Để việc tách dòng đạt đƣợc hiệu quả nhất chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR theo bộ kit Qiagen của hãng QIAquick Gel Extraction. Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo “entry clone” INV_pENTR. Vector pENTR/D có kích thƣớc 2580 bp, trên vector này có hai vị trí gắn attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển Invertase sẽ đƣợc gắn vào giữa hai vị trí này. Vector này còn có gen kháng kháng sinh kanamycin và có vị trí gắn mồi M13 phục vụ cho việc chọn dòng các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp INV_pENTR. Ngoài ra, enzyme Topoisomerase sẽ giúp cho việc gắn gen vào vector diễn ra trong một khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 5 phút) và có thể đạt hiệu quả cao tới 90%. Thành phần và chu trình của phản ứng đƣợc trình bày ở mục 2.2.4.1. Kết quả của phản ứng sẽ thu đƣợc vector tái tổ hợp INV_pENTR. 3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 Vector tái tổ hợp INV_pENTR thu đƣợc sau phản ứng lai sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt nhằm tách dòng và nhân nhanh plasmid tái tổ hợp với số lƣợng lớn. Hiệu quả của phản ứng này phụ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm vector tái tổ hợp và tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 khả biến. Ở đây, toàn bộ vector tái tổ hợp INV_pENTR sẽ đƣợc biến nạp với tế bào khả biến và đƣợc cấy trải khuẩn trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine 50 mg/l và ủ ở 37oC, qua đêm. Kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa môi trƣờng. Song không phải tất cả các khuẩn lạc đều mang plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vì bản thân plasmid này có gen kháng kháng sinh còn tế bào khả biến E.coli lại không kháng bất kỳ kháng sinh nào. Vì vậy, có thể có một lƣợng nhỏ nào đó các tế bào chứa plasmid pENTR/D nhƣng lại không gắn gen Invertase, do enzyme TOPO ở hai đầu vector bị mất và plasmid tự đóng vòng. Vậy trong số những khuẩn lạc thu đƣợc, khuẩn lạc nào mang vector chứa đoạn gen mã hóa Invertase và khuẩn lạc nào không có? Để xác định rõ các plasmid tái tổ hợp chính là dòng INV_pENTR mong muốn, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo Sambrock từ những khuẩn lạc sống sót trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc và thực hiện phản ứng PCR plasmid thu đƣợc với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev. 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR với cặp mồi M13 (F/R) Quá trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng sốc nhiệt có hiệu quả có thể tới 95%. Song rất có thể còn có những gen không đƣợc gắn vào và chúng sẽ tồn tại bên trong hoặc xung quanh những khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc. Do đó, PCR plasmid với cặp gen đặc hiệu 3 ’ INV, 5 ’ INV vẫn có thể thu đƣợc những băng có kích thƣớc khoảng 435 bp nhƣng không có đoạn gen Invertase đƣợc gắn vào vector. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi M13for/rev đặc hiệu của vector pENTR/D với các plasmid của các dòng khuẩn số 1, 2, 3 để có kiểm tra chính xác xem đoạn gen Invertase đã gắn đƣợc vào vector tách dòng hay chƣa. Theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 lý thuyết thì vị trí gắn mồi M13for/rev trên vector pENTR/D đƣợc thiết kế đặc hiệu và cho phép nhân một đoạn DNA từ nucleotide vị trí 537 tới vị trí 861 trên vector pENTR/D. Nhƣ vậy, PCR với cặp mồi này sẽ thu đƣợc các sản phẩm có chiều dài khoảng 750 bp hoặc 324 bp từ các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng hoặc âm tính tƣơng ứng khi kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13(For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong vector pENTR/D (M): Marker 1kb; (1), (2),( 3): sản phẩm PCR từ plasmid INV_ pENTR/D; (-): đối chứng âm Với kết quả thu đƣợc ở hình 3.3 cho thấy rằng 2 dòng plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn số 1 và 2 cho các băng có kích thƣớc khoảng 750 bp đúng với kích thƣớc của tính toán lý thuyết của các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng tính. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đoạn gen Invertase đã đƣợc gắn và tạo “entry clone” INV_pENTR ở dòng khuẩn số 1 và 2. Dòng plasmid INV_pENTR tái tổ hợp đã đƣợc gửi đi để xác định trình tự đoạn gen Invertase. 750 bp 3 2 1 - M Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit Đoạn gen mã hóa Invertase đƣợc gửi đi xác định trình tự nuclotide trên máy xác định trình tự tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa enzyme Invertase này với trình tự Invertase có mã số AY302083 đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi. Kết quả nhƣ sau: Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 Trên hình 3.4 cho thấy, trình tự gen Invertase phân lập đƣợc ở cây mía ROC1 in vitro có độ tƣơng đồng khá cao với trình tự gen AY302083 đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi đặc hiệu (90,1%). Điều này chứng tỏ chúng tôi đã phân lập chính xác đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn ở cây mía ROC1 in vitro. 3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi 3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway Kỹ thuật Gateway Cloning là một kỹ thuật nhân dòng phổ biến và hiệu quả cho việc gắn trình tự DNA vào hệ thống một hoặc nhiều vector. Trong thí 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 AGGAACTGGATGAACGACCCCAATGGCCCGGTGTACTACAAGGGCTGGTACCACCTGTTCTACCAATACAACCCGGACGGCGCCATCTGGGGCAACAAGA amplified -----------------------------------------------------------------------------------CATCTGGGGCAACAAGA 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGCTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTCTGGAC amplified TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGGTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTGTGGAC 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACCGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC amplified GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACGGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGCATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA amplified GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGGATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 CGGCGTGGTTCGACCCGTCGGACAACACCTGGCGCATCGTCATCGGCTCCAAGGACGACGCCGAGGGCGACCACGCCGGCATCGCCGTGGTGTACCGCAC amplified CGGCGTGGTTCGACCA------------------------------------------------------------------------------------ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 nghiệm này chúng tôi thực hiện phản ứng LR với các thành phần đã trình bày ở mục 2.2.2.1. để gắn vector INV_pENTR với vector pK7GWIWG2(II) nhằm thu đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi của gen mã hóa Invertase. Phản ứng này đƣợc tiến hành với sự xúc tác của enzyme LR-clonase và Proteinase K ở nhiệt độ phòng. pK7GWIWG2(II) là một vector chuyển gen đƣợc cấu trúc bởi hai vùng gắn đặc biệt là: attR1-ccdB-attR2 có chiều ngƣợc nhau và đƣợc nối với nhau nhờ một đoạn intron. Do đó, khi thực hiện phản ứng lai LR thì sẽ tạo ra sản phẩm là một plasmid INV_RNAi có hai vị trí gắn mang đoạn gen Invertase có chiều ngƣợc nhau: sense-intron-antisense (Invertase-intron-antiInvertase). Đoạn intron của vector pK7 có vai trò rất quan trọng trong việc tạo đoạn thắt nút (vòng) để RNA sợi đôi dễ đƣợc hình thành (Invertase-intron- antiInvertase) và hoạt động một cách ổn định trong genome của vật chủ khi nó đƣợc chuyển vào. Đây chính là cấu trúc RNAi cần thiết kế để chuyển gen vào cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của mía cao hơn một cách ổn định. Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli Vector tái tổ hợp INV_RNAi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC với khoảng thời gian là 1 phút 30 giây. Sau đó, khuẩn sẽ đƣợc nuôi phục hồi với 250 μl LB lỏng ở 37oC ở tủ lắc khoảng 60 phút. Tiếp theo khuẩn sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 có kháng sinh 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol. Kết quả thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trƣờng chọn lọc. Vector pK7GWIWG2(II) là vector có cấu trúc mang gen kháng các kháng sinh spectinomycin, streptomycin, chloramphenicol và gen ccdB mã hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trƣởng của tế bào E.coli, còn vector INV_RNAi không có gen ccdB do gen Invertase chèn vào thay thế. Vì vậy, các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc chỉ có thể là những khuẩn lạc có mang plasmid pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến và các khuẩn lạc có mang plasmid INV_RNAi. Chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc đƣợc đánh số từ 1 đến 3 nuôi trong môi trƣờng lỏng có các kháng sinh chọn lọc tƣơng tự và tiến hành tách plasmid từ các dòng khuẩn đó. Để kiểm tra các plasmid thu đƣợc có chính xác là INV_RNAi hay là pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến. Chúng tôi thực hiện phản ứng cắt enzyme giới hạn đặc hiệu XbaI và HindIII đối với 3 plasmid từ khuẩn lạc số 1, 2 và 3. Theo tính toán trên lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho 3 đoạn có kích thƣớc là: Đoạn 1 dài 978 bp mang đoạn Invertase chiều xuôi, đoạn 2 dài 2825 bp mang đoạn Invertase chiều ngƣợc và cuối cùng là phần còn lại của vector nhận pK7GWIWG(II) dài 8114 bp. Hình 3.6 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt enzyme thu đƣợc các phân đoạn có các kích thƣớc tƣơng ứng với dự tính ở cả 3 plasmid 1, 2 và 3 và có sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng là vector không biến nạp pK7GWIWG(II), chứng tỏ cấu trúc INV_RNAi đã đƣợc thiết kế. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII và XbaI (M): Marker 1kb; (1), (2), (3): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng vector pK7GWIWG(II) 3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. Để kiểm tra hoạt động của cấu trúc INV_RNAi trên vector tái tổ hợp trong cây trồng cũng nhƣ tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase ở cây mía, thì cấu trúc INV_RNAi phải đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp xung điện. Đây là một phƣơng pháp biến nạp có hiệu quả cao trong thời gian ngắn. Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi số 2 đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens bằng xung điện với thành phần và các bƣớc tiến hành biến nạp đƣợc trình bày ở mục 2.2.2.3. Kết quả cho thấy trên đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin thu đƣợc những khuẩn lạc màu trắng. Sau đó chọn ngẫu nhiên 2 dòng khuẩn lạc nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng có bổ sung các kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin để tách plasmid. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV (M): Marker 1kb; (1), (2): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng âm Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra sự có mặt của INV_RNAi trong A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV. Kết quả kiểm tra hình 3.7 cho thấy các dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dƣơng tính kích thƣớc khoảng 450 bp mong muốn. Nhƣ vậy, chứng tỏ chúng tôi đã tạo đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi trong chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1. Đây là nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen tiếp theo nhằm tạo dòng mía bất hoạt gen mã hoá Invertase, tăng lƣợng sucrose tích trữ. 3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo Từ các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía cho thấy rằng tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao và hiệu quả thông qua nguyên liệu ban đầu là mô sẹo. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm tạo mô sẹo với giống mía ROC10 in vitro trên môi trƣờng MS đối chứng không có 2,4D và các môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4). Kết quả thu đƣợc cho thấy ở môi trƣờng đối chứng MS (không có 2,4D) hoàn toàn không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 tạo đƣợc mô sẹo. Còn các mẫu trên môi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D đều tạo đƣợc mô sẹo và cho hiệu quả tái sinh mía đƣợc thể hiện thông qua bảng sau: Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. Môi trƣờng 2,4-D (mg/l) Tổng mẫu cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / 1 khối mô sẹo M1 3 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45 M2 4 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96 M3 5 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45 M4 6 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33 Bảng 3.3 cho thấy, các mẫu ở môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo và hiệu suất tái sinh cao hơn hẳn so với các môi trƣờng M2 - M4 có bổ sung 4, 5, 6 mg/l 2,4D; trong đó tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% và số chồi trên một khối mô sẹo đạt khoảng 42,66. Nhƣ vậy, môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh cây ở mía ROC10 in vitro tốt nhất trong thí nghiệm này. Do đó, chúng tôi chọn môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh và chuyển gen ở mía trong các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo đến cây hoàn chỉnh đƣợc minh họa trong hình 3.8. Mặt khác, chúng tôi tiếp tục nhân nuôi mô sẹo trong môi trƣờng lỏng lắc M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong vòng 1 tuần, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút, trong điều kiện tối để phục vụ cho việc biến nạp thử nghiệm gen gus-intron. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm trên môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo Mô sẹo Tạo cây hoàn chỉnh Mô sẹo lên mầm xanh Mô sẹo đang nhú mầm Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen Quy trình chuyển gen có hiệu quả là yếu tố rất quan trọng trong việc chuyển gen vào thực vật. Sau khi thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh cây mía thông qua mô sẹo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào cây mía thông qua việc sử dụng gen chỉ thị gus-intron. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau là EHA1300 và CV58C1 cùng mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 10 và 30 phút. Chúng tôi đã thử nghiệm lây nhiễm khuẩn với mô sẹo theo phƣơng pháp thổi khô sau nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc M1. Song chúng tôi đã không thu đƣợc kết quả chuyển gen mong muốn khi kiểm tra biểu hiện gen chỉ thị gus-intron với dung dịch X-gluc. Do đó, chúng tôi tiến hành hƣớng nghiên cứu thứ hai là chuyển mô sẹo sau nhân nuôi sang môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc sau đó mới tiến hành lây nhiễm khuẩn. Ở thời gian biến nạp 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 phút các mô sẹo ở cả hai chủng vi khuẩn đều không thu đƣợc mẫu có biểu hiện gen gus. Trong khi đó ở thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, mẫu có biểu hiện gen gus xuất hiện ở cả hai công thức với hai chủng khuẩn nghiên cứu. Tỉ lệ biểu hiện gen gus trên mô sẹo đạt 31,67% với chủng CV58C1 và 11,67% khi sử dụng chủng EHA1300. Khi sử dụng hai chủng vi khuẩn này với ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút, chúng tôi đều thu đƣợc các chồi mía sống sót trên môi trƣờng chọn lọc (với CV58C1 là 18,57% và EHA1300 là 7,14%). Bảng 3.4. Kết quả biến nạp gen gus-intron vào cây mía Chủng vi khuẩn A.tumefaciens Thời gian biến nạp (phút) Tỉ lệ biểu hiện gen gus (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trƣờng có bổ sung 2 mg/l ppt (%) CV58C1 30 31,67 ± 0,65 81,43 ± 1,56 18,57 ± 1,28 EHA1300 30 11,67 ± 0,89 92,85 ± 0,31 7,14 ± 0,69 Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thu đƣợc kết quả khi tiến hành chuyển gen gus vào cây mía thông qua mô sẹo theo phƣơng pháp cảm ứng tạo chồi. Tuy nhiên do thời gian có hạn, các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả chuyển gen vẫn chƣa hoàn toàn đƣợc tối ƣu. Mặc dù vậy, việc thu đƣợc các mô sẹo tái sinh có biểu hiện của gen chỉ thị gus đã cho thấy việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo cây mía chuyển gen làm tăng khả năng tích trữ đƣờng trong cây mía là một hƣớng đi triển vọng trong tƣơng lai. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens Mô sẹo biến nạp trên môi trƣờng đồng nuôi cấy Mc Mô sẹo biểu hiện gus khi nhuộm với dung dịch X-gluc Mô sẹo tạo chồi trên Mc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime Chồi cây trên môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 2 mg/l ppt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: 1. Phân lập đƣợc đoạn gen mã hoá Invertase có kích thƣớc khoảng 435 bp từ giống mía ROC1 in vitro xúc tác quá trình phân huỷ sucrose. 2. Thiết kế đƣợc vector chuyển gen INV-RNAi ức chế sự biểu hiện của Invertase và biến nạp thành công chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1. 3. Chọn lọc một số môi trƣờng thích hợp tái sinh cây mía thông qua mô sẹo (môi trƣờng tạo mô sẹo M1, môi trƣờng tạo chồi Mc, môi trƣờng tạo rễ Mr) và bƣớc đầu chuyển gen chỉ thị gus-intron vào cây mía. ĐỀ NGHỊ: Tiến hành chuyển vector ức chế biểu hiện mã hóa Invertase (INV- RNAi) ở cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của các giống mía ở Việt Nam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BÀI BÁO CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ Lƣu Thị Cƣ, Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Lê Quỳnh Liên (2009) Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hoá Invertase (-fructofuranosidase) ở cây mía. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc_Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg, về việc phê duyệt “Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020”. 2. Hoàng Thị Sản (2003) Phân loại học thực vật. Nxb Giáo dục 3. Trần Văn Sỏi (2003) Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. 4. Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen và tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265-275. 5. Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng. Nxb Giáo dục. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 6. Avigad G and Dey PM (1997) Carbohydrate metabolism: storage carbohydrates. Plant biochemistry Acedemic Press Ltd, pp: 143-204. 7. Balibrea ME, Rus-Alvarez AM, Bolarin MC, Perez-Alfocea F (1997) Fast changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J. Plant physiol. (151): 222-226. 8. Baulcomble D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431 (7006): 356-63. 9. Chen S, Hajirezaei M, Bornke F (2008) Differential expression of sucrose phosphate synthase isoenzymes in tobaco reflects their functional specialization during dark governed starch mobilization in source leaves. Plant Cell Environ. 31(1): 165-76 elegans. Nature. 391: 806-811. 10. Geigenberger P, Reimholz R, Deiting U, Sonnewald U and Stitt M (1999) Decreased expression of sucrose phosphate Synthase Strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers. The plant Journal. 19: 119-129. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11. Groenewald J, Botha FC (2007) Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in Sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internoods. Transgenic Res. 12. Guy CL (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187- 223. 13. Haigler CH, Singh B, Zhang D, Hwang S, Wu C, Cai WX, Hozain M, Kang W, Kiedaisch B, Strauss RE, Hequet EF, Wyatt BG, Jwiden GM, Holaday AS (2007) Transgenic cotton over-producing spinach sucrose phosphate synthase showed enhanced leaf sucrose synthesis and improved fiber quality under controlled environmental conditions. Plant Mol Biol. 63 (6): 815-32. 14. Hesse H, Sonnewald U, Willmitzer L (1995) Cloning and expression analysis of sucrose phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L.). Mol Gen Genet. 247 (4): 515-20. 15. Huber SC. and Huber JL. (1992) Role of sucrose-phosphate Synthase in Sucrose Metabolism in leaves. Plant physiol. 99: 1275-1278. 16. Huber SC, and Huber JL(1996) Role and regulation of Sucrose phosphate synthase in higher plants. Annu. Rew. Plant physiol. Plant Mol.Biol. 47: 431-444. 17. Ingram J, Chadler JW, Gallagher L, Salamini F, Bartels D (1997) Analysis of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar interconversions associated with dehydration in the resurrection plant, Craterostigma plantagineum Hochst. Plant Physiol. 115:113-121. 18. Klann EM, Hall B, Bennett AB (1996) Antisense acid invertase (TIV1) gene alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit. Plant Physiol. 112 (3): 1321-30. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19. Le QL, Mahler V, Lorenz Y, Scheurer S, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U (2006b) Reduced allergenicity of tomato fruits harvested from Lyc e 1 silenced transgenic tomato plants. J. Aller. Clin. Immunol. 118(5):1176-83. 20. Liu Q, Singh SP, Green AG (2002) High-stearic and High-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing. Plant Physiol. 129(4): 1732-43. 21. Lunn JE, Gillespie VJ, Furbank RT (2003) Expression of a cyanobacterial sucrose-phosphate synthase from Synechocystis sp. PCC 6803 in transgenic plants. J Exp Bot. 54 (381): 223-37 22. Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar B, Selvaraj N, Vasudevan A, Kasthurirengan S (2004) Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species bybrids) using axillary buds. Plant Cell Rep 23: 134-143. 23. Morgan JM (1984) Osmoregulation and water stress in higher plant, Ann Rev. Plant physiol. 35: 299-319 24. Nguyen-Quoc B, Foyer CH (2001) A role for ‘futile cycles’ involving invertase and sucrose synthase in sucrose metabolism of tomato fruit. J Exp Bot. 52 (358): 881-9. 25. Ogita S, Uefuji H, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H (2003) Producing decaffeinated coffee plants. Nature 423(6942): 823. 26. Quick P, Siegl G, Neuhaus E, Feil R, Stitt M (1989) Sort term water stress leads to stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate synthase. Planta. 177: 535–546. 27. Salerno GL, Pagnussat GC, Pontis HG (1998) Studies on sucrose phosphate synthase from rice leaves. Cell Mol Biol 44(3): 407-16 28. Santosa DA, Hendroko R, Farouk A và Greiner R (2004) A rapid and highly efficient method for transformation of sugarcane callus. Molecular Biotechnology 28: 113-119. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29. Snyman SJ, Meyer GM., Richards JM, Haricharan N, Ramgareeb S, Huckett BI (2006) Refining the application of direct embryogenesis in sugarcane: effect of the developmental phase of leaf disc explants and the timing of DNA transfer on transformation efficiency. Plant Cell Rep. 25: 1016–1023. 30. Stitt M (1989) Product inhibition of potato tuber pyrophosphate, Fructose 6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate. Plant physiol. 89: 628-633. 31. Sugihartor B, Sakakibara H, Sumadi and Sugiyama T (1997) Differential Expression of Two Genes for Sucrose-phosphate-Synthase in Sugarcane: Molecular Cloning of the cDNAs and Comparative Analysis of Gene Expression. Plant cell physiol. 38: 961-965. 32. Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, eddective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90. 33. Worrell AC, Bruneau JM, Summerfelt K, Boersig M, Voelker TA (1991) Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning. Plant Cell. 3(10): 1121-30. 34. Zhangsun D, Luo S, Chen R, Tang K (2007) Improved Agrobacterium- mediated genetic transformation of GNA transgenic sugarcane. Section Cellular and Molecular Biology 62 (4): 386-393. 35. Zhu YJ, Komor E, and Moore PH. (1997) Sucrose Accumulation in the Sugarcane Stem 1s Regulated by the Difference between the Activities of Soluble Acid Invertase and Sucrose Phosphate Synthase. Plant Physiol. 115(2): 609-616. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên PHỤ LỤC Môi trƣờng MS cơ bản: - MS I: KNO3:1900 mg/l; NH4NO3:1650 mg/l; MgSO4.7H2O:370 mg/l; KH2PO4:170 mg/l - MS II: CaCl2.2H2O mg/l - MS III: H3BO3:6,2 mg/l; MnSO4: 22,3 mg/l; ZnSO4: 8,6 mg/l; KI: 0,83 mg/l; Na2MoO4: 0,25 mg/l; CuSO4: 0,025 mg/l; CoCl2: 0,025 mg/l - MS IV:Na2EDTA: 37,3 mg/l; FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l - MS V: Glycin: 2 mg/l; Nicotinic: 0,5 mg/l; B1: 0,5 mg/l; B6: 0,5 mg/l Môi trƣờng LB: - LB lỏng: Môi trƣờng LB lỏng: 0,5% (5 g/l) dịch chiết nấm men (Yeast extract), 1% (10 g/l) bacto-Tryptone, 1% (10 g/l) NaCl. Hoặc dùng 25g LB bột LB pha sẵn cho 1l LB lỏng. - LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,5% (15g/l) Bactor-aga. Dung dịch đệm tách plasmid: - Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 - Sol II: 0.2 NaOH, SDS 1% - Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Các môi trƣờng đƣợc khử ở áp suất 4 atmotphe và 117oC trong 15 phút. Đệm điện di gel agarose: - TAE 50 X (100 ml) : Tris -base 24.2 g, axit axetic 5.71g , EDTA 0.1M pH8 50ml thêm nƣớc đến 100 ml. - Đệm tra mẫu (loading buffer): 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glycerol 100%, thêm nƣớc cất cho đủ 1 ml