Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng - Nha Trang

ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm. Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180o và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C1, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất. Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Aspergillus niger A.oryzae A.terreus A.syndovii A. flavus Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Mucor pusilus Pen. notatum Penicillium spp Trichoderma lignorum Trichoderma reesei Trichoderma viride Trichoderma konongi Actinomyces aureus Act.cellulose Act.diastaticus Act. roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act. hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospora curvata Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp. Acetobacter xylinum Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacteroides Amylophillus sp. Clos.butiricum Clos.locheheadil Cellulosemonas 1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp ... Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo, mỳ… hay xử lý chè và các loại tảo biển… Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase cùng với hemicellulase được ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từ thức ăn. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và quá trình đường hóa. Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agar-agar có chất lượng cao hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm môi trường so với phương pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trường. Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trường: enzyme cellulase đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trường. Trong nông nghiệp, cellulase được dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền thống làm giảm ô nhiễm môi trường cũng như sự thoái hóa đất. Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase được sử dụng như một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay). Cellulase được ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Người ta có thể thu nhận các tế bào trần bằng phương pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu được tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast). Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các nhân tố di truyền. Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công nghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả như : Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp. (Lusta và cộng sự, 1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàn cellulose. Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus (Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989). Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzyme cellulase như: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng như xác định khối lượng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995); Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự (2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự (1992); Macarrón và cộng sự (1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ưu (Macarrón và cộng sự, 1993; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hưởng của ion kim loại (Sang và cộng sự, 1995). 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng penicillium sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 (Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006). Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy. Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm. CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU Rong giấy: Mẫu rong giấy mục được lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Rong Giấy có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp: Chlorophyceae, bộ: Ulvales. VSV sinh cellulase: Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy. 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật * Môi trường phân lập VSV: các loại môi trường sử dụng: thạch thường, capek, ISP4, các môi trường đường (glucose, maltose, manitol, D-frucrose, sucrose, lactose) đều của Merck - Đức cung cấp. * Môi trường ISP - 4 (g/l): K2HPO4.3H2O 1 g MgSO4.7H2O 1 g CaCO3 2 g (NH4)2SO4 2 g Tinh bột tan 10 g NaCl 1 g Agar 15 g Nước 1 lít pH 6 - 7 * Môi trường Capek - dox (g/l): NaNO3 3 g KH2PO4 1 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g Saccarose 30 g Agar 20 g Nước cất 1 lít pH 5 - 6 * Môi trường thạch thường (g/l): Nước mắm 10 ml Pepton 10 g Agar 15 - 20 g Nước 1 lít pH 7 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất cellulose. Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thường hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cưa mục hay hiện diện trên thân rong… Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase cao theo các bước sau: - Thu rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. - Phân lập và tuyển chọn các chủng VSV trên môi trường thạch đặc trưng (chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh cellulase cao nhất). - Sơ bộ phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp truyền thống. - Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng VSV được tuyển chọn. 2.2.1. Phương pháp phân lập Tiến hành phân lập các mẫu rong như sau: Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước cất đã vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Pha loãng mẫu theo các nồng độ từ 10-1 - 10-8. Lấy 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nước cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệm thứ hai, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết trước được nồng độ VSV trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lượng VSV nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường từ 10-3 – 10-8). Dùng môi trường thạch thường để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trường Capek để phân lập các chủng nấm và môi trường ISP4 để phân lập các chủng xạ khuẩn. Các môi trường được hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri. Dùng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 370C. Sau khoảng 24 h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn. Sau 2 - 3 ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn. + Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ướt, khi dùng que gạt không còn lại trong thạch. + Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn. + Đối với nấm: có hệ sợi. Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C. Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống (hình 2.1). Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần khiết cần được hoạt hóa. Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy Lưu ý: Mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng: Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy được khử trùng bằng cồn. Không khí trong tủ cấy được khử trùng bằng tia UV. Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. 2.2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất VSV được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong môi trường dịch thể. Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩn tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thu dịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp Miller (phụ lục 02), (Miller, 1959). 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp * Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h. Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme. * Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 45; 50oC. Sau 36 - 48 h sấy ở nhiệt độ 500C, đem nghiền mịn bằng máy nghiền bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4 - 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan protein-enzyme từ khối canh trường nấm sợi. Sau đó đem xác định hoạt độ enzyme cellulase bằng phương pháp đổ dịch. * Phương pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có chứa nồng độ chất cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% - 8%. Sau 36 - 48 h thu dịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulase. * Phương pháp xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có pH là : 3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng. Sau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2.2.4. Phương pháp phân loại chủng VSV (phân loại theo phương pháp truyền thống) Phân loại theo phương pháp truyền thống là phương pháp phân loại chủng VSV dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Dựa vào đó người ta phân loại chúng và các chi. Đối với nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại bằng phương pháp quan sát đặc điểm hình thái đặc trưng trên kính hiển vi. Nguyên lý: Nấm thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát được dưới kính hiển vi. Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể. Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử. Cuống mang bào tử có thể phân nhánh hay không phân nhánh. Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm là bào tử kín và bào tử trần. Cách tiến hành: Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên đĩa petri. Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm, sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính. Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi. 2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hơi Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37oC. Sau 24 - 72 h lấy ra đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngược lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml. 2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trường đặc trưng với các nồng độ muối khác nhau từ 1 - 11%, giữ trong tủ ấm 37oC. Sau 1 - 5 ngày lấy ra đọc kết quả, nếu VSV mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại. 2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác (protease và amylase) Nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường capek lỏng, lắc 200 vòng/phút, sau 36 – 48 h tiến hành thu dich lọc và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với protease và tinh bột với amylase). Để tủ ấm 370C trong 24 h rồi đổ lugol và xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo vòng thủy phân. 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm. Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R ≥ 0,95. 2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM Sử dụng các thiết bị hiện đại có tại phòng thí nghiệm CNSH: thiết bị ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R - Mỹ), máy vortex (máy trộn mẫu BE34), tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam), kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300 - Mỹ), máy lắc (GFL 3005 - Đức), tủ cấy (Telstar AV 100 - Tây Ban Nha), tủ sấy (Binder - Đức), tủ ấm Memmert - Đức, .... CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Sử dụng môi trường thạch thường để phân lập vi khuẩn, môi trường Capek để phân lập nấm mốc và môi trường ISP4 để phân lập xạ khuẩn. Sơ tuyển VSV bằng phương pháp đặt thỏi thạch trên môi trường CMC và xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng cách đo vòng thủy phân trên CMC. Kết quả phân lập thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập STT Ký hiệu chủng Hoạt tính cellulase (D-mm) 1 VK1 27 2 VK2 24 3 VK3 23 4 VK4 30 5 VK5 24 6 VK6 12 7 VK7 15 8 N1 32 9 N2 36 10 N3 48 11 N4 40 12 N5 31 13 XK1 24 14 XK2 26 15 XK3 31 16 XK4 30 Nhận xét: Kết quả phân lập ở bảng 3.1 cho thấy đã phân lập được 16 chủng VSV có khả năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn. Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn được bốn chủng VSV có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK4, N3, N4 và XK4. Tiếp tục xác định hoạt độ enzyme cellulase theo phương pháp Miller để chọn chủng có hoạt tính cellulase cao nhất. Kết quả xác định hoạt tính cellulase được thể hiện như sau (bảng 3.2). Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển Chủng Hoạt tính cellulase (mm) Hoạt tính C1 (đơn vị/ml) Hoạt tính Cx (đơn vị/ml) VK4 24 x x N3 35 0,147 0,189 N4 32 0,192 0,182 XK4 25 x x Ghi chú: x coi như không có hoạt tính (lượng dịch enzyme không đủ làm chuyển màu của methylene xanh (phụ lục 02)). Qua bảng kết quả xác định họat tính cellulase, chúng tôi chọn được hai chủng nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình 3.1 và 3.2). Hai chủng này được đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về sau. Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất (N3 và N4) được tuyển chọn Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC 3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYỂN CHỌN ĐƯỢC 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian Tiến hành nuôi cấy hai chủng N3 và N4 trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong môi trường Capek, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48; 54; 60 h lấy mẫu để xác định hoạt tính của enzyme cellulase và đo sinh khối tế bào. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở phụ lục 01, hình 3.3 và hình 3.4. Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 Nhận xét Kết quả phân tích cho thấy khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của chủng N3 tăng mạnh từ 17% (6 mm) ở 6h nuôi cấy lên 94% (33 mm) ở 30h nuôi cấy, đạt cực đại 100% (35 mm) ở 36 h nuôi cấy, sau đó giảm dần đến 91,5% (32 mm) ở 48 h và giảm mạnh xuống 83% (29 mm), 51,5% (18 mm) sau 60 h. Như vậy chủng N3 sinh enzyme cellulase ngoại bào mạnh nhất sau 30 ÷ 48 h nuôi cấy và đạt cực đại ở 36 h. Tương tự chủng N4 sinh cellulase ngoại bào mạnh nhất ở 30-54 h và đạt cực đại 100% (31 mm) ở 42 h nuôi cấy, sau đó hoạt tính cellulase giảm mạnh còn 71% (22 mm) ở 60 h. Những nghiên cứu trước đây cho thấy, một số chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48 h nuôi cấy (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999). Các chủng xạ khuẩn phân lập từ bể ủ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48÷72 h nuôi cấy (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999), còn các chủng xạ khuẩn Actinomyces ưa ẩm sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 72÷96 h nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999; Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự, 1999). Các chủng nấm sợi phân lập từ rác sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 144 h nuôi cấy (Đặng Minh Hằng, 1999), còn ba chủng nấm sợi Penicillium pinophinum, P. persicinum, P. brasilianum có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 110-140 h nuôi cấy (Henning và cộng sự, 2005). Chủng nấm sợi Penicillium sp. DTQ-KH1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở 120 h nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hai chủng nấm mốc N3 và N4 có thời gian sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở 36-48 h. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004; Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998 cho rằng nấm sợi phát triển từ 36-48 h đã cho hoạt tính enzyme cellulase cao, trong khi đó xạ khuẩn phải mất ít nhất 72 h mới tổng hợp cellulase nhiều. Đặc biệt hai chủng trên có thời gian sinh tổng hợp cellulase nhanh hơn nhiều so với các chủng Penicillium pinophinum, P. persicinum, P. brasilianum (Henning và cộng sự, 2005) và Penicillium sp. DTQ-KH1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Vậy N3 và N4 là hai chủng có khả năng ứng dụng sản xuất cellulase cao vì có thời gian sinh tổng hợp cellulase nhanh nhất trong các chủng đã nghiên cứu. 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là thông số quan trọng, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến ảnh hưởng của enzyme cellulase ta tiến hành bố trí thí nghiệm với hai chủng nấm nuôi trong môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 45; 500C. Sau đó sấy khô ở 500C, nghiền mịn trong máy nghiền bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4-5 lần khối lượng canh trường trên để hòa tan protein-enzyme từ khối canh trường. Tiến hành lọc thu dịch lọc đem xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đổ dịch. Kết quả được trình bày trong bảng 2 - phụ lục 01 và hình 3.5, hình 3.6. Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4 Nhận xét Kết quả phân tích ở trên cho thấy khi nhiệt độ tăng từ 250C - 350C thì hoạt tính cellulase của chủng N3 tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 350C. Cụ thể, ở 250C hoạt tính cellulase H = 27 mm và 350C hoạt tính cellulase H = 37 mm (tăng 1,4 lần). Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên thì hoạt độ enzyme giảm dần và mất hoạt tính ở 500C. Chủng N4 có họat tính cellulase tăng dần và đạt cực đại (36 mm) ở 400C khi nhiệt độ tăng từ 25 - 400C, sau đó giảm dần đến mất hoạt tính ở 500C. Do bản chất của enzyme là protein nên khi ở nhiệt độ cao (≥ 500C) sẽ làm biến tính protein dẫn đến làm mất hoạt tính enzyme. Các nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu về các chủng nấm sợi khác cũng sinh tổng hợp cellulase mạnh ở dải nhiệt độ từ 31-340C (Đặng Minh Hằng, 1999), chủng nấm sợi Penicillium sp. DTQ-KH1 sinh tổng hợp cellulase mạnh ở 300C (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). 3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng Tiến hành 8 mẫu nghiên cứu nuôi cấy lỏng, lắc hai chủng N3 và N4 trên môi trường Capek có bổ sung các chất cảm ứng là rơm và rong với các nồng độ từ 1 ÷ 8%. Sau 36 - 48 h lọc thu dịch enzyme và xác định hoạt tính enzyme cellulase. Kết quả được trình bày ở phụ lục 01 và các hình 3.7, hình 3.8. Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 Nhận xét Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.7 và 3.8 cho thấy khi dùng rơm làm chất cảm ứng: hoạt độ cellulase của cả hai chủng N3 và N4 đều tăng dần khi môi trường nuôi có bổ sung rơm với tỷ lệ từ 1% ÷ 5%. Sau đó nếu tiếp tục tăng tỷ lệ rơm bổ sung lớn hơn 5% thì họat độ cellulase của cả hai chủng N3 và N4 đều giảm mạnh. Hoạt độ enzyme cellulase của hai chủng đạt cực đại 100% (57 mm đối với N3 và 43 mm đối với N4) khi bổ sung 5% bột rơm làm chất cảm ứng. Ở tỷ lệ bổ sung bột rơm 8%, hoạt độ cellulase chỉ đạt 44% (25 mm) đối với N3 và 56% (24 mm) đối với N4. Như vậy khi chất cảm ứng là bột rơm thì nồng độ thích hợp là 5% đối với cả hai chủng N3 và N4. Tương tự khi chất cảm ứng là rong thì hoạt độ enzyme cũng tăng dần nhưng đạt cực đại ở 6% đối với N3 (30 mm) và 7% đối với N4 (30 mm) rồi giảm dần khi tăng thêm nồng độ rong. Như vậy chủng N3 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở 6% rong và 7% đối với N4. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy cả hai chủng N3 và N4 đều sinh tổng hợp cellulase mạnh hơn khi chất cảm ứng là rơm. Sở dĩ có hiện tượng này là vì enzyme cellulase là một enzyme ngoại bào, sẽ được kích thích sinh tổng hợp khi có chất cảm ứng (cellulose) trong môi trường. 3.2.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu pH môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng, tác động sâu sắc đến các quá trình trao đổi chất của VSV. Những biến đổi dù nhỏ của các ion (H+ và OH-) trong nồng độ của chúng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến VSV. Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme cũng phụ thuộc vào pH của môi trường. Vì vậy, trong thời gian nuôi cấy VSV sinh enzyme cellulase, việc xác định pH ban đầu và duy trì pH là cần thiết. Hai chủng nấm mốc được nuôi cấy nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trên môi trường Capek có pH từ 3 - 8, ở nhiệt độ phòng. Sau 36 - 48h, xác định hoạt tính của enzyme. Kết quả được trình bày ở phụ lục 01 và các hình 3.9, 3.10. Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 Nhận xét Kết quả trình bày ở các hình 3.9 và 3.10 cho thấy khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào của chủng N3 mạnh trong khoảng pH 3 ÷ 5, chủng N4 trong khoảng pH 3 ÷ 6 và đều đạt cực đại 100% ở pH 5 (36 mm với chủng N3, 34 mm với chủng N4). Trong khoảng pH này sinh khối tế bào cũng cao nhất và cực đại ở pH 5 (9,743 g/l với chủng N3 và 8,565 g/l với chủng N4). Ở pH 6 hoạt tính cellullase ngoại bào của các chủng này chỉ đạt 53% - 83% họat tính so với hoạt tính cực đại, sinh khối cũng đạt 72 % - 87% so với cực đại. Sau nuôi cấy tất cả các môi trường nuôi đều có pH giảm chút ít so với pH ban đầu. So sánh với các nghiên cứu trước đây, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH 4,5 - 6 (Đặng Minh Hằng, 1999); pH 4,5 - 5,5 (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004); pH 5 - 6 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007); pH ban đầu thích hợp với các chủng vi khuẩn là 6 - 10, còn đối với xạ khuẩn là 7 - 10 (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999). Như vậy hai chủng N3 và N4 phân lập được sinh tổng hợp cellulase mạnh trong điều kiện pH môi trường ban đầu nghiêng về acid và phù hợp với các kết quả trước đó. 3.3. SƠ BỘ PHÂN LOẠI HAI CHỦNG NẤM N3 VÀ N4 Tiến hành nuôi cấy, quan sát hình thái khuẩn lạc và hệ sợi của các chủng N3 và N4 phân lập được. Kết quả thể hiện ở các hình 3.11 ÷ 3.15. Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng N3 trên đĩa petri Hình 3.12. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X Hình 3.13. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri Hình 3.15. Hệ sợi chủng N4 ở các độ phóng đại 40 X và 100X Hình 3.16. Cuống đính bào tử của chủng N4 ở độ phóng đại 100X Hình 3.17. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus theo Samson và cộng sự, (1995) (a.1 lớp, b. 2 lớp, c. phiến, d. tia, e. bào tử) Nhận xét Từ hình ảnh chụp về chủng N3 cho thấy N3 có khuẩn lạc không tròn, bề mặt bóng sau đó lan sợi rất nhanh. Sợi nấm màu trắng, có dạng thân bò (stolon - đoạn sợi có hình thẳng hoặc hình cung). Sợi bò cứ lan dần ra mọi phía kể cả trên thành thủy tinh của ống nghiệm, của nắp đĩa petri… (hình 3.11). Hệ sợi không có vách ngăn, cuống bào tử không phân nhánh (hình 3.12 và hình 3.13). Từ những kết quả quan sát trên và dựa vào hệ thống phân loại của Bergey, (1994) có thể dự đoán N3 là Rhizopus. Từ hình ảnh chụp về chủng cho thấy chủng N4 có khuẩn lạc mới ra có màu trắng rồi chuyển thành màu xanh lục - vàng, lúc già có màu xanh lục thẫm hoặc vàng nâu. Sợi nấm mọc lan hình tia tỏa ra xung quanh (hình 3.14). Sợi nấm có vách ngăn (hình 3.15). Theo khóa phân loại của Samson và cộng sự, (1995) thì chủng N4 thuộc chủng Aspergillus (hình 3.16 và hình 3.17). Tuy nhiên để có thể khẳng định chắc chắn N3 và N4 thuộc chi nào, loài nào cần phải giải trình tự và các phân tích chuyên sâu về các chủng N3 và N4 này. 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA N3 VÀ N4 * Khả năng lên men các loại đường Kiểm tra khả năng lên men của N3 và N4 trên môi trường có bổ sung các loại đường khác nhau (glucose, fructose, maltose, manitol, sucrose, lactose), sau 24-72 h nuôi cấy đánh giá khả năng sử dụng các lọai đường này. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đường của N3 và N4 Đường Chủng Glucose fructose Maltose Manitol Sucrose Lactose N3 + + + + - - N4 + + + - - - Nhận xét Kết quả phân tích cho thấy chủng N3: cho kết quả dương tính (lên men đường làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng) với các loại đường: glucose, fructose, maltose, manitol và cho kết quả âm tính (không lên men môi trường đường, không chuyển màu) với các loại đường lactose, sucrose. Và tất cả các môi trường đều không sinh hơi. Chủng N4: cho kết quả dương tính (lên men đường làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng) với các loại đường: glucose, fructose, maltose và cho kết quả âm tính (không lên men môi trường đường, không chuyển màu) với các loại đường lactose, sucrose, manitol và tất cả các môi trường đều không sinh hơi. Như vậy chủng N3 sử dụng đường (glucose, fructose, maltose, manitol), chủng N4 sử dụng đường (glucose, fructose, maltose) tạo thành các sản phẩm trung gian có tính axit làm giảm pH của môi trường. Môi trường chuyển sang màu vàng với chỉ thị phenol red. Các kết quả này càng cho phép dự đoán N3 là Rhizopus và N4 là Aspergillus. Hình 3.18. Một số hình ảnh về khả năng lên men đường của N3 và N4 (màu vàng: dương tính; màu đỏ: âm tính) * Khả năng chịu muối: chủng N3 chịu được nồng độ muối 10%, N4 chịu được nồng độ muối 8%, bảng 3.4. Đây sẽ là cơ sở cho việc ứng dụng khả năng tổng hợp cellulase trong xử lý môi trường ao nuôi thủy sản đặc biệt đối với những vùng nuôi có độ mặn cao. Bảng 3.4. Khả năng chịu muối của N3 và N4 Nồng độ muối (%) Chủng 6 7 8 9 10 11 N3 +++ + + - - - N4 +++ +++ ++ ++ + - Hình 3.19. Khả năng chịu muối của N3 và N4 ở nồng độ 6% * Khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác (protease và amylase) Để khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác chủng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp đổ dịch trên đĩa thạch chứa cơ chất đặc trưng (phụ lục 03), để tủ ấm sau 36-48 h đổ lugol và đo vòng phân giải xác định hoạt tính enzyme. Kết quả được thể hiện ở bảng 5- phụ lục 01 và hình 3.16 Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân của N3 và N4 Nhận xét Từ kết quả ở trên cho thấy cả hai chủng N3 và N4 đếu có khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân: protease và amylase cao. Chủng N3 cho hoạt tính protease là 41 mm (cao hơn cả hoạt tính cellulose), chủng N4 là 29 mm và hoạt tính amylase là 29 mm đối với N3 và 30 mm đối với N4. Đây là kết quả rất có ý nghĩa khi đưa hai chủng này ứng dụng trong xử lý môi trường ao nuôi thủy sản và phế thải nông nghiệp cũng như công nghiệp xử lý rác thải. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu ở trên chúng tôi có thể đưa ra một số kết luận như sau: 1) Đã phân lập được 16 chủng vi sinh vật có họat tính sinh cellulase từ rong giấy thu tại bãi biển Hòn chồng - Nha Trang. Trong đó có 15 chủng có họat tính cellulase cao. 2) Từ nhiều chủng phân lập trên rong giấy tại bãi biển Hòn chồng - Nha Trang, đã tuyển chọn được hai chủng nấm sợi có hoạt tính cellulase cao là chủng N3 và N4. 3) Đã xác định được chủng N3 sinh trưởng, phát triển và sinh enzyme cellulase tốt trong điều kiện môi trường nuôi cấy có khoảng pH 3 - 5, pH tối thích 5, nhiệt độ 30 - 400C, nhiệt độ tối thích là 350C, thời gian thu enzyme từ 30 – 54 h, thời gian thích hợp là 36 h, nồng độ chất cảm ứng tối ưu: 5% đối với rơm và 7% với rong, rơm cho hiệu quả cảm ứng mạnh hơn rong. 4) Chủng N4 sinh trưởng, phát triển và sinh enzyme cellulase tốt trong điều kiện môi trường nuôi cấy có pH 3 – 6, pH tối thích 5) nhiệt độ 30 - 400C, nhiệt độ tối thích là 400C, thời gian thu enzyme từ 30 - 54 h, thời gian thích hợp là 42 h, nồng độ chất cảm ứng tối ưu: 5% đối với rơm và 6% với rong, rơm cho hiệu quả cảm ứng mạnh hơn rong. 5) Khả năng chịu mặn của hai chủng N3 và N4 khá cao: chủng N3 chịu được độ mặn 7% còn chủng N4 chịu được nồng độ tới 10%. 6) Phân loại sơ bộ hai chủng nấm sợi đã tuyển chọn thì thấy N3 gần vơi Rhizopus và N4 gần với giống Aspergilluss. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Qua quá trình nghiên cứu cho phép đề xuất một số ý kiến sau: 1) Tinh sạch và đánh giá một số tính chất hóa lý của cellulase từ hai chủng nấm sợi trên. 2) Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cellulase thô của hai chủng N3 và N4 trong xử lý rong. 3) Bước đầu nghiên cứu ứng dụng hai chủng nấm sợi trên để thủy phân rơm và rong nhằm sản xuất giá thể trong trồng rau sạch và trồng cây, hoa cảnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng (2003), “Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinase và cellulase của Trichoderma harzianum ảnh hưởng của 2 enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 321 – 324. Đặng Minh Hằng (1999), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật đẻ xử lý rác”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 333-339. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003), “Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL-363”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 304-307. Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), “Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Atinomyces griseus”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 804-809. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999), “Sử dụng VSV có hoạt độ phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp”, Báo cáo Khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 546-551. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), “Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Penicilium SP. DTQ-HK1”. Tạp trí công nghệ sinh học 5(3), tr. 355-362. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), “Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng VSV ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải”. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 790-797. TIẾNG ANH Bergey DH, John GH (1994), “Bergey's Manual of Determinative Bacteriology”. Science, 787 p. Christakopoulos P, Hatzinikolaou DG, Fountoukidis G, Kekos D, Claeyssens M, Macris BJ (1999), “Purification and mode of an alkali-resitant endo-1,4-beta-glucase from Baciluss pumilus”. Archives in Biochemistry and Biophysics. Vol. 364, p. 61-66. Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002), “Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild – type strai”. Turk J Biol 26, p. 209-213. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70. Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999). “Endoglucanase 28 (Cell2A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase”. Eur J Biochem 259, p. 88-95. Hiroshi T, Satoshi T, Makoto O, Yoshihiko A, Takahisa K, Mitsuo O, Makoto S (2005), “Gene cloning of an endoglucanase from the basidiomycete Irpex lacteus and its cDNA expression in Saccharomyces cerevisiae”. Biosi Biotechnol Biochem 69 (7), p. 1262-1269. Susumu I, Shitsuw S, Katsuya O, Shuji K, Kikuhiko O, Shigeo I, Akira T, Yu-Ichi O and Tomokazu S (1989), “Alkaline cellulase for laundry detergents: production by Bacillus sp. KSM-635 and enzymatic properties”. Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, p. 1275-1281. Kariksson J, Saloheimo M, Siikaho M, Tenkanen M, Penttila M, Tjereneld F (2001), “Homologous expression and characterization of Cel 61A – (EG IV) of trichoderma reesei”. Eur J Biochem 268, p. 6498-6507. Konstantin AL, Il KC, Ill WS, Hee SP and Dong IS (1999), “Characterization of an extracellular cellulose hydrolyzing enzyme complex from a thermotolerant strain of Aspergillus sp”. Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol. 9, p. 873-876. Macarrón R, Acebal C, Castiilón M, Domínguez J, Manta I (1993), “Mode of action of endoglucanase III from trichoderma reeri”. Biochem J 289: 867-873. Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R, Mattiasson B (2000), “Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains”. Journal of Biotechnology, Vol. 83, p. 177-187. Miller GL (1959), “Anal”. Chem, 31, p. 426-428. Ogawa K, Toyama D, Fujii N (1991), “Microcrystalline cellulose-hydrolyzing cellulase from Trichoderma reseii CDU-II”. Journal of General and Applied Microbiology, Vol.37, p. 249-259. Ozaki K, Ito S (1991), “Purification and properties of an acid endo-1.4-β-glucanase from Bacillus sp”. KSM-330, Journal of General Microbiology, Vol. 137, p. 41-48. Park SH, Kim HK, Pack MY (1991), “Characterization and structure of the cellulase gene of Bacillus subtilis BSE616”. Agricultural and Biological Chemistry, Vol.55, p. 441- 448. Lori MR and Gleen HC (1989), “Cellulases of bacterial origin”. Enzyme and Microbial Technology, Vol. 11: 626-644. Sang J, Yong J, Hyen S (1995), “Characterization of a bifunctional cellulase and its structural sene. The cell gene of Bacillus sp. D04 has exo- and endoglucanese activity”. J Biol chem 270, p. 26012-26019. Samson RA, Hoeskstra ES, Frisvad JC, Filtenborg O (1995), ”Introduction to Food-borne Fungi (4th ed.)”. Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS). CBS Baarn , Netherlands, p. 79-96. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-789, 879-915, 993-1018. Willick V, Seligy L (1985), “Multiplicity in cellulases of Schizopyllum commune derivation partly from heterogeneity in transcription and glycosylation”. European Journal of Biochemistry, Vol. 151, p. 89-96. PHỤ LỤC Phụ lục 01: Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới sinh tổng hợp cellulase từ chủng N3, N4 Chủng Thời gian (h) Hoạt tính cellulase (mm) Sinh khối (g/l) N3 0 0 2,216 6 6 3,325 12 16 5,195 18 20 7,441 24 26 8,713 30 33 9,645 36 35 9,778 42 33 9,697 48 32 9,147 54 29 8,852 60 18 8,135 N4 0 0 2,142 6 4 3,116 12 11 5,344 18 16 7,962 24 25 8,873 30 29 9,375 36 30 9,727 42 31 9,691 48 29 9,256 54 28 8,758 60 24 8,437 Bảng 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh enzyme cellulase từ chủng N3, N4 Chủng Nhiệt độ (0C) Hoạt tính cellulase (mm) N3 25 27 30 33 35 37 40 31 45 25 50 0 N4 25 30 30 32 35 33 40 36 45 27 50 0 Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới hoạt tính enzyme cellulase từ chủng N3, N4 Chủng Nồng độ (%) Rơm Rong N3 1 25 20 2 27 22 3 40 23 4 42 25 5 57 28 6 28 29 7 26 30 8 25 24 N4 1 24 19 2 26 20 3 34 22 4 35 22 5 43 29 6 30 30 7 26 28 8 24 26 Bảng 4: Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sinh tổng hợp cellulase của chủng N3, N4 Chủng pH ban đầu Sinh khối sau nuôi (g/l) Hoạt tính cellulase (mm) pH sau nuôi cấy N3 2 8,055 20 1,697 3 9,684 31 2,475 4 9,672 31 3,843 5 9,743 36 4,241 6 9,678 28 4,181 7 7,130 27 4,055 8 7,015 25 4,356 N4 2 7,364 18 1,854 3 8,349 32 2,549 4 8,258 31 3.783 5 8,565 34 4,770 6 8,437 31 4,820 7 7,437 28 4,127 8 7,041 26 4,116 ,Bảng 5: Hoạt tính enzyme thủy phân của hai chủng N3 và N4 Chủng Hoạt tính cellulase (mm) Hoạt tính protease (mm) Hoạt tính amylase (mm) N3 36 41 25 N4 34 29 30 Phụ lục 02: Xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp Miler: a. Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân Nguyên lý: Khi enzyme celulase tác dụng lên cơ chất cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục của môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỷ lệ với độ hoạt động của enzyme. Thiết bị vật liệu và hóa chất: - Tủ ấm, đĩa peptri, Na- CM- cellulose, thước đo mm, thạch. - Dung dịch đệm citrate phosphate, pH = 5,0. Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường có chứa 2% thạch, 0,5% Na- CMC trong dung dịch đệm citrate phosphate, pH = 5 rồi phân phối vào đĩa peptri. Sau khi thạch đông, khoét những lỗ nhỏ trên mặt thạch, cho vào 0,1-0,5 ml dung dịch enzyme, giữ trong tủ ấm. Sau 24 h đổ lugol và đo đường kính phần môi trường trong suốt không bắt màu với lugol. Biểu diễn hoạt độ của enzyme bằng số mm đường kính vòng thủy phân. Hoạt tính enzyme (H) xác định theo công thức: H = D – d (cm) D: Đường kính vòng phân giải cộng đường kính lỗ khoan. d: Đường kính lỗ khoan. b. Xác định hoạt độ cellulase dựa vào lượng đường khử tạo thành Tùy theo yêu cầu của từng thí nghiệm và mức độ hoạt động của enzyme mà có thể sử dụng các phương pháp định lượng đường khử khác nhau. Hoạt độ của enzyme được tính bằng đợn vị/ml môi trường hoặc g chế phẩm. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme phân giải cơ chất tạo thành 1 mg glucose sau một giờ tác dụng ở 400C, pH 5. Hóa chất: Ống nghiệm. Tủ ấm hay bể ổn nhiệt. Dung dịch Na-CMC (3 ml dung dịch chứa 50 mg Na-CMC). Sợi bông hay CMC. Dung dịch đệm acetate 0,5 M, pH 5. Dung dịch đệm acetate 0,2 M, pH 5,6. Các thiết bị vật liệu và hóa chất sử dụng định lượng đường khử theo phương pháp Graxianop. Cách tiến hành: Với enzyme Cx: cho 3 ml dung dịch có chứa 50 mg Na-CMC vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch acetate 0,5 M, pH 5 và 1 ml dung dịch enzyme, nâng nhiệt đến 400C và giữ trong 1 h. Tiến hành xác định đường khử ngay theo phương pháp Grixianop. Tiến hành mẫu kiểm tra theo cách tương tự, nhưng sau khi trộn lẫn enzyme với cơ chất, tiến hành xác định đường khử ngay. Hoạt động enzyme được tính bằng số lượng đường khử (tính theo glucose) giữa bình thí nghiệm và bình kiểm tra. Từ đó tính ra đơn vị hoạt động của 1 ml dịch môi trường hoặc 1 g chế phẩm. Với enzyme C1: Cho vào ống nghiệm (đường kính khoảng 3cm) 150mg sợi bông đã loại tạp chất (hoặc 100 mg CMC), thêm 5 ml dung dịch enzyme, 10 ml dung dịch đệm acetate 0,2 M, pH 5,6 và 5 ml nước cất. Giữ ở 400C trong 24 h rồi đem xác định đường khử theo phương pháp Graxianop. Mẫu kiểm tra cũng được giữ ở cùng điều kiện như trên. Xác định hàm lượng đường: Sử dụng phương pháp Graxxianop (phương pháp Ferixianua kali). Nguyên tắc Phương pháp này dùng chất oxi hóa là Frixianua kali, có phản ứng chính: 2K3Fe(CN)6+ 2KOH ® 2K4Fe(CN)6+ H2O+ O Tiếp theo, oxy nguyên tử oxy hóa mạnh đường để tạo ra acid tương ứng: CH2OH(CHOH)4CHO+ 2O ® COOH(CHOH)4COOH Phản ứng tổng quát: 4K3Fe(CN)6+ 4KOH + CH2OH(CHOH)4CHO ® 4K4Fe(CN)6+ COOH(CHOH)4COOH + 2H2O Khi dư một giọt dịch đường, đường sẽ khử chỉ thị màu Methilene xanh rồi chuyển sang màu tím hồng và chuyển sang màu vàng khi kết thúc định phân. Từ lượng đường tiêu hao khi định phân ta suy ra lượng đường khử có trong dung dịch cần phân tích. Tiến hành Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% cho vào bình tam giác 250 ml. Sau đó cho vào 5 ml dung dịch KOH 2,5N và 3-4 giọt Mythylene xanh. Lắc đều và dặt trên bếp điện đun sao cho 1-2 phút thì sôi. Tiếp theo dùng lượng đường khử cần phân tích chuẩn bằng cách nhỏ liên tục vào bình và để bính sôi liên tục đến mất màu của methylene xanh. Tính kết quả Hàm lượng đường khử trong dung dịch cần phân tích sẽ tính theo công thức: Trong đó: a: Lượng glucose tương ứng với 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1%. b: Số ml dung dịch đường tiêu hao khi chuẩn 20 ml Ferixianua kali 1%. 100: Hệ số qui đổi. Xác định hệ số a: Cân 0.5 g glucose hoặc fructose tinh khiết sấy khô, pha với nước cất thành 100 ml. Dùng dung dịch này làm chuẩn để chuẩn với 20 ml dung dịch Ferixianua kali vừa pha xem nó tương ứng với bao nhiêu mg đường.