Cà chua tên khoa học là Lycopersicon esculentum Mill, thuộc họcà cây thảo hàng
năm, gồm hai loại sinh trưởng có hạn và sinh trưởng vô hạn, cao 1m hay hơn. Thân
mọng nước, có lông mềm dính. Lá có cuống, mọc so le, xếp lông chim không ñều hay
xếp lông chim 2 lần, dài 10 – 40 cm, lá chét thay ñổi, hình trứng hay hình trứng mũi
mác, mép có răng. Hoa thành chùm xim ởnách lá, ñài 5 – 8 thùy dài khoảng 12mm,
tràng hoa màu vàng cam, dài 10 – 15mm. Quảmọng màu ñỏhay vàng, có kích thước
và hình dạng thay ñổi, trong chứa chất dịch chua ngọt và nhiều hạt dẹt.
41 trang |
Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 3534 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Phân tách sắc tố cà chua chín, cà rốt và đu đủ chín bằng sắc kí bản mỏng, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
.3 %
Chất xơ 5.4 %
Cacbonhydrat 1.9 %
Protein 2.1 %
Licopen và
β- caroten
Canxi 0.6 %
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
8
Sắt 3.1 %
Vitamin C 39.2 %
Vitamin E 1.6 %
Các amino axit và các axit hữu cơ Hàm lượng ít
1.1.2. Dược tính của quả cà chua:
Cà chua vị ngọt chua, tính mát, có công dụng thanh nhiệt, giải khát, dưỡng âm và
làm mát máu thường ñược dùng ñể chữa những bệnh phiền khát, môi khô họng khát do
vị, hoa mắt chóng mặt, chảy máu cam, chảy máu chân răng tiêu hóa kém, loét dạ dày,
huyết áp cao.
Nghiên cứu hiện ñại cho thấy cà chua giàu nguyên tố vi lượng. Chất tomatin trong
cà chua có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn, vi nấm, vitamin P rất có ích cho việc
phòng chống cao huyết áp.
Y học hiện ñại nghiên cứu và cho rằng sắc tố licopen trong quả cà chua có tính
chống oxy hóa cao, lycopen và caroten khi vào cơ thể người sẽ chuyển hóa thành
vitamin A. Do ñó dùng cà chua sẽ tránh bệnh khô mắt, quáng gà…
1.2. Sơ lược về cà rốt [8]
− Cà rốt thuộc họ hoa tán
− Cà rốt là loại cây thảo sống 2 năm. Lá cắt thành bản hẹp. Hoa tập hợp thành tán
hẹp, trong mỗi tán, hoa ở chính giữa thì không sinh sản và màu tía, còn các hoa sinh
sản ở chung quanh thì màu trắng hay hồng. Hạt cà rốt có vỏ gỗ và lớp lông cứng che
phủ
− Bộ phận dùng: củ
− Cà rốt là một trong những loại rau trồng rộng rãi nhất và lâu ñời nhất trên thế
giới. người La Mã gọi cà rốt là nữ hoàng của các loại rau. Cà rốt ñược trồng nhiều ở
nước ta. Hiện nay các vùng rau của nước ta ñang trồng phổ biến 2 loại có củ to nhỏ
không ñều, lõi to, nhiều xơ, hay phân nhánh, kém ngọt.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
9
1.2.1. Thành phần hóa học:
Thành phần Hàm lượng(%)
Nước 88.5
Protit 1.5
Gluxít 8.8
Xenlulo 1.2
Chất tro 0.8
ðường (fructozơ, glucozơ) 50
Vitamin (C, D, E, B)
Axit amin
Muối khoáng (K, Na, Ma, Cu.....)
Hàm lượng ít
1.2.2. Dược tính của cà rốt:
− Củ cà rốt có vị ngọt cay, tính hơi ấm có tác dụng hạ khí bổ trung, yên ngũ tạng,
tăng tiêu hóa, kèm khoan khoái trong bụng.
− Hạt có vị ñắng cay, tính bình có tác dụng sát trùng, tiêu ích
− Củ cà rốt ñược dùng làm thuốc uống trị suy nhược (rối loạn sinh trưởng, thiếu
chất khoáng, còi xương, sâu răng, …) trị thiếu máu, bệnh trực tràng coli, viêm ruột non
kết, bệnh ñường ruột, dự phòng các bệnh nhiễm trùng, ñề phòng sự lão hóa và các vết
nhăn…
− Thành phần quan trọng nhất trong cà rốt là caroten. Các caroten khi vào cơ thể
người mới chuyển thành vitamin A nên ñược coi là tiền sinh tố A, nó có cấu trúc hóa
học và hoạt tính sinh học tương tự vitamin A nhưng ở người nó dự trữ ở khắp các mô
còn vitamin ñược dự trữ ở gan. Một số nhà khoa học khuyến cáo nên dùng caroten.
1.3. Sơ lược về ñu ñủ chín [9]
− ðu ñủ còn có tên Phan Qua Thụ, Mắc Hung (Lào), Cà Lào, Phiên Lộc
− Tên khoa học Carica papaya L, họ ñu ñủ.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
10
− Là loại cây cao 6 – 7 m, thân ñứng thẳng có phân nhánh hoặc không phân
nhánh, vỏ mang nhiều sẹo của cuống lá. Lá chỉ có nhiều ở ngọn, lá chia 6 – 7 thùy,
hình trứng, mép có răng cưa không ñều. Lá to, cuống rỗng dài 30 – 50 cm, gân lá hình
chân vịt.
− Hoa màu trắng nhạt hay xanh, mọc ở kẻ lá. Hoa cái có tràng nhiều hơn tràng của
hoa ñực mọc thành chùm ở kẻ lá. Cụm hoa ñực phân nhánh nhiều, cụm hoa cái chỉ có 2
ñến 3 hoa. Sau 1 tháng hoa thụ phấn. Lá mang hoa rụng sẽ ñể lại sẹo trên cây. Quả thịt
dầy mọng, ở giữa rỗng có nhiều hạt hình trứng.
− ðu ñủ không chịu ñược xứ lạnh, thích hợp với ñất khô xốp, nhiều mùn, phát
triển rất tốt ở vùng nhiệt ñới.
1.3.1. Thành phần hóa học:
− Trong ñu ñủ chín có 19 loại carotenoit chủ yếu cryptoxanthin (48%), beta
caroten (30%), cryptoflavine (13%).
− Có thể tóm tắt thành phần hóa học của 100g ñu ñủ chín:
Thành phần
Hàm lượng
(g; mg; mcg; calo)
Nước 90 (g)
Vitamin A 125 (mcg)
Canxi 40 ( mg)
Năng lượng 36 (calo)
Vitamin B1 20 (mcg)
Photpho 32 (mg)
Protein 1,0 (g)
Vitamin B2 20 (mcg)
Kali 221 (mg)
Lipit 0,1 (g)
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
11
Niacin 400 (mcg)
Sắt 2,6 (mg)
Cacbonhydrat 7,7 (g)
Vitamin C 64 (mg)
Kẽm 6,4 (mg)
1.3.2. Dược tính của ñu ñủ chín:
− Hoa ñu ñủ ñực tươi hoặc phơi khô hấp với ñường phèn dùng chữa ho, mất tiếng.
− Nước sắc lá ñu ñủ dùng ñể rửa vết thương, vết loét. Lá ñu ñủ thái nhỏ với thóc
dùng chữa bệnh biếng ăn cho bò, ngựa.
− Rễ ñu ñủ ñược dân gian sắc làm thuốc cầm máu
− ðu ñủ chín làm món ăn có tác dụng bồi bổ cơ thể và giúp tiêu hóa tốt các chất
thịt, chất lòng trắng trứng.
− Trong ñu ñủ có chứa nhiều β-caroten (tiền vitamin A) từ 1000 – 2100 mcg |
100g ñược ñưa vào cơ thể sẽ ñược chuyển thành vitamin A. Cơ thể con người là một
bộ máy tuyệt vời, β-caroten chỉ chuyển hóa thành vitamin A ñúng nhu cầu, β-caroten
không chuyển hóa khi cơ thể có ñủ vitamin A.
1.4. Sơ lược về licopen và β-caroten [6],[7],[8],[9],[10]
− Licopen và β-caroten gọi chung là carotenoit là những hợp chất có màu phân bố
rộng rãi trong giới ñộng vật và thực vật.
− Licopen và β-caroten thuộc hợp chất xanthophylle
− Có nhiều phương pháp ñể làm sáng tỏ cấu trúc carotenoit là :
+ Hydro hóa
+ Cộng hợp halogen, clorua iot hoặc cộng oxy ñể xác ñịnh các nối ñôi.
+ Oxi hóa với axit cromic các nhóm metyl mạch nhánh thành các nhóm cacbonyl
.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
12
1.4.1 β – caroten:
− Có công thức phân tử C40H56
− Công thức cấu tạo
− β-caroten thuộc loại hợp chất không no
− Tan trong các dung môi không phân cực hoặc kém phân cực như ete dầu hỏa,
n- hexan, heptan.
− ðiểm nóng chảy: 181 – 1830C
− ðược phát hiện từ những năm 1830 và ñược biết như nguồn cung cấp vitamin A
cho cơ thể.
− β-caroten ngăn chặn các gốc tự do có tác hại ñến cơ thể và do ñó ngăn ngừa
ñược các bệnh mãn tính liên quan ñến các gốc tự do như bệnh ung thư, bệnh tim mạch.
− Từ xưa người ta cho rằng ăn rau quả sống sẽ cung cấp nhiều vitamin hơn là nấu
chín, thực ra ñiều này chỉ ñúng với các vitamin tan trong nước, còn ñối với β-caroten
là chất tan trong dầu và ñược bao bọc bởi các bao sợi cơ của tế bào rau quả nên việc
nấu chín sẽ giúp giải phóng nhiều β-caroten hơn. Kể từ năm 1980 các nhà dinh dưỡng
nhận thấy β-caroten không chỉ ñơn thuần là tiền vitamin A mà β-caroten còn ñược biết
là một chất chống oxi hóa tế bào và chức năng này hoàn toàn ñộc lập với cơ thể cung
cấp vitamin A.
1.4.2. Licopen:
− Công thức phân tử C40H56
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
13
− Công thức cấu tạo:
− Cũng giống như β- caroten, licopen tan trong các dung môi không phân cực
hoặc kém phân cực như ete dầu hỏa, heptan, n – hexan.
− Về công thức của licopen là một chuỗi dài cấu trúc phân tử gồm có 13 nối ñôi,
lycopen ñược kiểm nghiệm là rất hữu hiệu trong việc ngăn chặn các oxygen ñơn trong
cơ thể của con người một cách rất hiệu quả.
− Là một trong 600 hợp chất carotenoit nhưng lại là chất có hiệu quả trong chống
ung thư phổi, dạ dày, trực tràng.
− Trong quả cà chua màu ñỏ licopen thường ñược tập trung ở vỏ, khi nấu chín cà
chua mới giải phóng ñược licopen. Vì vậy khi ăn cà chua chín không nên ăn sống mà
phải nấu chín và ăn cả vỏ.
− Ngoài ra nó là carotenoit duy nhất có khả năng ngừa ñược chứng nhồi máu cơ
tim và bảo vệ gan khỏi bị tổn thương. Licopen là một carotenoit cơ thể con người
không thể tự tổng hợp ñược mà phải lấy từ thức ăn.
1.5. Sơ lược về sắc kí
1.5.1. Sơ lược về lịch sử phát triển sắc kí [3]
− Năm 1903 nhà khoa học Nga Mikhail TsVet ñã dùng cột nhôm oxit tách thành
công các picmen của lá cây xanh thành các vùng màu riêng biệt. Ông ñã giải thích hiện
tượng bằng ái lực hấp thụ khác nhau của sắc tố và ñặt tên phương pháp này là phương
pháp sắc kí vì ñã tách ñược những chất có màu. Tuy nhiên phát minh của TsVet gần
như lãng quên trong một thời gian dài. Mãi ñến năm 1931 sau khi Vinterstin và
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
14
Lederer dùng phương pháp của TsVet tách caroten thô thành β-caroten và nhận thấy
giá trị của phương pháp về phương diện ñiều chế, phương pháp sắc kí mới bắt ñầu
ñược chú ý ñúng mức và phát triển nhanh chóng.
− Năm 1938, Izmailov và Shraiber ñặt nền móng ñầu tiên cho sắc kí lớp mỏng và
sau ñó những công trình của Stahl ñã làm cho sắc kí lớp mỏng phát triển nhanh chóng
và ứng dụng rất rộng rãi.
− Năm 1941 sắc kí phân bố ra ñời khi Martin và Synge ñề xuất tách không phải
theo ái lực của các cấu tử ñối với chất hấp thụ mà do sự phân bố khác nhau của các cấu
tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn. Các tác giả trên ñã phát triển một dạng mới của
sắc kí phân bố: sắc kí giấy.Vào những năm 1941 – 1942 Martin ñã làm một bước
ngoặc lớn trong sắc kí do dùng sắc kí giấy tách thành công các ancaloit chiết ñược từ
các cây thuốc.
− Năm 1952 Martin công bố công trình ñầu tiên về sắc kí khi dựa trên sự phân bố
của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha ñộng là chất khí. Chỉ trong vài ba chục năm,
sắc kí khí ñã ñạt ñược nhiều thành tựu tuyệt vời và hiện nay là một trong những
phương pháp hiệu nghiệm nhất về phân tích hỗn hợp các chất ñặc biệt là các chất hữu
cơ.
1.5.2. Sắc kí bản mỏng [2].[3],[4].
− Sắc kí bản mỏng hay còn gọi là sắc kí phẳng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng. Trong
ñó pha ñộng là chất lỏng ñược ñi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc
nhôm oxit, chất hấp thụ này ñược tráng thành một lớp mỏng, ñều, phủ lên một nền
phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Do chất hấp thụ ñược tráng thành
một lớp mỏng nên phương pháp này ñược gọi là phương pháp sắc kí lớp mỏng (hay sắc
kí bản mỏng)
− Trước ñây sắc kí bản mỏng chủ yếu dùng trong phân tích ñịnh tính, nhưng từ
năm 1966 ñã áp dụng sang phân tích ñịnh lượng do những tiến bộ của kĩ thuật làm tăng
tính lặp lại và ñộ chính xác.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
15
− Trong thời gian gần ñây, nhờ sử dụng tổ hợp sắc kí bản mỏng với các phương
pháp phân tích có ñộ nhạy cao như cực phổ, ñộng học xúc tác, huỳnh quang… sắc kí
bản mỏng ñược phát triển thêm một bước.
1.5.2.1. Nguyên tắc [1],[4].
− Bản mỏng ñược chuẩn bị sẵn là loại bản có thể tự tráng hoặc mua loại có sẵn
trên thị trường, sau ñó chấm mẫu phân tích (mẫu ñã ñược hòa tan trong một dung môi
dễ bay hơi sau ñó dùng vi quản ñể chấm) lên bản mỏng, chấm thành một vết nhỏ gọn,
sấy nhẹ ñể ñuổi phần dung môi hòa tan mẫu, khi ñó mẫu chất chỉ còn lại bột khô trên
tấm lớp mỏng. ðặt tấm bản mỏng theo chiều thẳng ñứng trong bình có chứa sẵn dung
môi phù hợp. Do tác dụng của lực mao quản dung môi thấm theo bản mỏng qua ñiểm
xuất phát. Sau ñó các vết sẽ ñược xác ñịnh bằng phương pháp vật lý (nhìn bằng mắt,
soi dưới ñèn tử ngoại…) bằng phương pháp hóa học (phun lên tấm bảng các loại dung
môi thuốc thử).
− Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn có giá trị Rf không ñổi trong một
dung môi xác ñịnh.
− Các yếu tố ảnh hưởng ñến Rf
+ Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ
+ Bề dày của lớp mỏng
+ Chất lượng và ñộ tinh khiết của pha ñộng
+ ðộ bão hòa của dung môi trong bình sắc kí
+ Lượng mẫu ñưa lên bản mỏng
1.5.2.2. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký bản mỏng [2]
Trong sắc kí bản mỏng thông thường người ta dùng các chất hấp thụ sau:
silicagen, nhôm oxit, xenlulo, tinh bột, nhựa trao ñổi ion…ngoài ra còn dùng các chất
hấp thụ biến tính khác.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
16
Bảng 1.1: Các chất hấp thụ dùng trong sắc kí lớp mỏng (SKLM)
(sắp xếp theo Stahl )
Chất hấp thụ ðộ axit Hoạt năng Cơ chế Công dụng
Silicagen Axit Có
Hấp thụ và
phân bố
Cho tất cả các hợp chất
Oxit nhôm Kiềm Có Phân bố Steorid
Magie photphat Yếu Hấp thụ Carotenoit, tocopherol
Caxihydroxit Yếu Hấp thụ Tocopherol
Canxi sunfat Kiềm Yếu Hấp thụ Tocopherol
Fe(OH)3 Có Hấp thụ Chất phân cực
Than Có Hấp thụ Chất không phân cực
1.5.2.3. Dung môi khai triển:
Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi và thuốc
thử khác nhau.
Bảng1.2: Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất tự nhiên
Hợp chất Chất hấp thụ Hệ dung môi
Thuốc thử hiện
màu
Ankaloic SiO2G
3
3 3
3
(9 :1)
(20 : 20 :3:1)
(20 : 20 :1)
min
(7 : 2 :1)
CHCl MeOH
CHCl axeton MeOH NH
CHCl ETOAC MeOH
Benzen ETOAC Dietyla
−
− − −
− −
− −
Hơi I2
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
17
Saponin SiO2G
2
4
3 2
2
3
Butanol
(4 :1: 5)
Butanol
(7 : 2 :5)
(61:32 : 7)
(100 :17 :13)
(9 :1)
n ACOH H O
n EtOH NH OH
CHCl MeOH H O
EtOAC MeOH H O
CHCl MeOH Genin
− − −
− − −
− −
− −
−
Vanillin | H3PO4
SbCl3 | CHCl3
H2SO4
Caroten
SiO2G
Ete dầu hỏa – toluen – axeton
(45: 1: 5)
Hơi I2
Tinh dầu SiO2G
(95 :5)
(95 : 5)
Benzen EtOAC
Benzen MeOH
−
−
2 2 4
3 4
,I H SO
H PO
Tanin SiO2G
2
(100 :17 :13)
(4 :3:1)
EtOAC MeOH H O
Toluen EtOAC MeOH
− −
− −
FeCl3
Flavonit SiO2G
Toluen – Etyl fomiat – axit
formol (5:4:1)
MeOH 10%(H2O)
1.5.3. Sắc kí cột [2],[3],[4].
− Sắc kí cột là một phương pháp hiện ñại, tinh vi ñể tách các cấu tử hóa học ra
khỏi hỗn hợp của chúng. Nếu lựa chọn ñúng các ñiều kiện người ta có thể tách hầu hết
các chất bất kì một hỗn hợp nào. Nhưng phương pháp mất nhiều thời gian nên chỉ sử
dụng khi tách các chất trong hỗn hợp mà các phương pháp khác không làm ñược
− Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng tách ra gồm:
+ Lựa chọn chất hấp thụ
+ Sự lựa chọn dung môi giải li
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
18
+ Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp thụ, lượng mẫu ñược dùng
+ Vận tốc giải li
− Trong sắc kí cột sự tách xảy ra ở ranh giới rắn – lỏng, trong ñó pha ñộng là chất
lỏng, pha tĩnh là các chất rắn ở trạng thái xốp, mịn. Thông thường các hợp chất phân
cực bị hấp phụ mạnh hơn các chất không phân cực bởi các chất hấp phụ phân cực. Sự
hấp phụ các chất phân cực trong môi trường không phân cực mạnh hơn trong môi
trường phân cực do sự cạnh tranh giữa chất tan và các phân tử của dung môi.
− Lực hấp thụ bao gồm các loại sau ñây:
+ Lực Vande Van
+ Lực cảm ứng
+ Hấp phụ hóa học
+ Liên kết hiñro
1.5.3.1. Nguyên tắc [1]
− Cột ñược rửa sạch sấy khô. Cột là một ống thủy tinh dưới ñáy có một robinet
khóa, cột ñược bắt vào giá ở vị trí thẳng ñứng dưới có một bình hứng, dưới ñáy cột
ñược lót một lớp bông gòn dày 2 – 3 mm. Sau ñó tiến hành nhồi cột, có hai cách nhồi,
nhồi sệt hoặc nhồi khô. Khi ñã cho chất hấp phụ hết vào cột theo một trong hai phương
pháp trên tiếp tục cho dung môi chảy ngang qua chất hấp phụ liên tục trong một thời
gian ñể giúp cho việc nạp cột ñược chặt chẽ, trong quá trình này không ñược ñể cột
khô. ðể ổn ñịnh sau khoảng 5 – 10 giờ mới sử dụng.
− Sau khi cột ñã ổn ñịnh cho mẫu chất cần phân tích vào cột, nếu mẫu chất là chất
lỏng cần làm bay hơi ñến khô rồi hòa tan trở lại trong dung môi, nếu mẫu là chất rắn
hòa tan mẫu vào dung môi lượng dung môi là tối thiểu. Mở khóa cột hạ mực dung môi
ñến sát mực chất hấp phụ ñang có trong cột, dùng một ống nhỏ giọt cho mẫu vào ñầu
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
19
cột mở khóa cho dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp thụ tiến hành như vậy ñến
khi cho hết mẫu vào cột. Tiến hành thêm dung môi vào rửa cột sau khi cho một lớp
bông gòn ñặt nhẹ lên mặt thoáng của chất hấp phụ. Tiến hành quá trình giải li.
1.5.3.2. Các chất hấp phụ và dung môi trong sắc kí cột[2]
Bảng 1.3: Các dung môi và chất hấp phụ dùng trong sắc kí cột
Hợp chất phân tích Dung môi Chất hấp phụ
Gluxit
Nước, ancol Isopropylic,
ancol butylic, ñioxan, ete dầu
hỏa, benzen, clorofom
Than hoạt tính, nhôm oxit,
silicagen
Vitamin Ete dầu hỏa, benzen, nước… Nhôm oxit, Ca(OH)2, MgO
Tecpen
Cacbon tetraclorua, ete dầu
hỏa,n-hexan, benzen, ete
etylic, axeton, ancol metylic,
etyl axetat, clorofom
Nhôm oxit
Ancaloit Nước, benzen, clorofom.. Nhôm oxit, silicagen
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
20
CHƯƠNG 2: TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM
2.1. Thu mẫu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín:
Cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ñược thu mua tại chợ Tân Tịch vào lúc sáng sớm.
Cà chua lựa loại quả chín ñỏ, ñặc ruột, ít hạt. Cà rốt lựa củ căng bóng, tươi màu da
cam. ðu ñủ loại quả chín to trái.
2.2. Tiến hành tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
2.2.1. Hóa chất và dụng cụ:
Hóa chất Dụng cụ
− Etanol 960
− Tinh thể iot
− Toluen
− Axeton
− Ete dầu hỏa
− Al2O3
− Phễu thủy tinh
− Ống ñong; Cốc; Ống nghiệm
− Phễu chiết; Giấy lọc; bông gòn
− Bình hút ẩm; Bình lọc chân không
− Mao quản ñường kính 1,5-1,6 mm
− Lọ penicilin
− Cột sắc kí kích thước 50cm, ñường kính15cm
2.2.2. Tóm tắt quá trình tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín:
Thời gian Công việc
28/10
Thu mẫu và xử lý mẫu cà chua chín bằng etanol 960 và dung môi ete dầu
hỏa ñể bay hơi 12 giờ
29/10 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu cà chua thu ñược
30/10
Thu mẫu và xử lý mẫu cà rốt bằng etanol 960 và dung môi ete dầu hỏa ñể
bay hơi 12 giờ
31/10 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu cà rốt thu ñược
1/11
Thu mẫu và xử lý mẫu ñu ñủ chín bằng etanol 960 và dung môi ete dầu
hỏa ñể bay hơi 12 giờ
3/11 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu ñu ñủ chín thu ñược
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
21
Kết quả chạy sắc kí bản mỏng thu ñược chúng tôi thấy rằng vết không tròn, vết
còn có ñuôi chúng tôi kết luận rằng dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chưa tinh khiết
vì vậy chúng tôi tiến hành tách licopen và β-caroten bằng sắc kí cột và kiểm tra lại
bằng sắc kí bản mỏng
Thời gian Công việc
4/11 Nhồi cột
5-8/11 Cho ete dầu hỏa chạy qua cột làm cho cột mịn, ñể ổn ñịnh trước 10 giờ
10/11 Chuẩn bị dịch cà chua chín lần 1
11-13/11
Nạp mẫu cà chua chín, thu các phân ñoạn. Rửa cột và cho bay hơi dung
môi các phân ñoạn 12 giờ
14/11 Chạy bản mỏng các phân ñoạn
15-19/11 Tiến hành như trên ñối với mẫu cà chua lần 2
21/11 Chuẩn bị dịch cà rốt lần 1
22-25/11
Nạp mẫu cà rốt, thu các phân ñoạn. Rửa cột và cho bay hơi dung môi các
phân ñoạn 12 giờ
26/11 Chạy bản mỏng các phân ñoạn của dịch cà rốt thu ñược
27-3/12 Tiến hành như trên ñối với mẫu cà rốt lần 2
4/12 Chuẩn bị dịch ñu ñủ chín lần 1
5-8/12
Nạp mẫu ñu ñủ chín, thu các phân ñoạn. Rửa cột và cho bay hơi dung môi
các phân ñoạn 12 giờ
9/12 Chạy bản mỏng các phân ñoạn của dịch ñu ñủ chín thu ñược
2-6/3 Tiến hành như trên ñối với mẫu ñu ñủ chín lần 2
2.2.3. Chuẩn bị dịch các chất màu [4]
- Chuẩn bị dịch cà chua chín:
Quả cà chua chín bổ ra chỉ bỏ hạt, nghiền nhỏ thu ñược dịch cà chua. Lấy 30 g dịch
cà chua thêm 45 ml etanol 960 khuấy mạnh trong 4-5 phút. Lọc lấy bã cà chua trên giấy
lọc cho vào cốc thêm 30 ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
22
ete dầu hỏa. Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không. Chuyển dịch lọc sang cốc
cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ ñược chất màu caroten của cà chua chín
-Chuẩn bị dịch cà rốt:
Cà rốt bỏ vỏ, xay nhuyễn thu ñược dịch cà rốt. Lấy 30 g dịch cà rốt thêm 45 ml
etanol 960 khuấy mạnh trong 4-5 phút. Lọc lấy bã cà rốt trên giấy lọc cho vào cốc thêm
30 ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào ete dầu hỏa. Lọc lấy
dung dịch bằng bình lọc chân không. Chuyển dịch lọc sang cốc cho bay hơi dung môi
ete dầu hỏa 12 giờ ñược chất màu caroten của cà rốt
- Chuẩn bị dịch ñu ñủ chín:
ðu ñủ chín bổ ra bỏ vỏ và hạt, nghiền nhỏ thu ñược dịch ñu ñủ chín. Lấy 30 g dịch
ñu ñủ chín thêm 45 ml etanol 960 khuấy mạnh trong 4-5 phút. Lọc lấy bã ñu ñủ chín
trên giấy lọc cho vào cốc thêm 30 ml ete dầu hỏa khuấy mạnh trong 2-3 phút cho sắc tố
tan vào ete dầu hỏa. Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không. Chuyển dịch lọc
sang cốc cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ ñược chất màu caroten của ñu ñủ
chín
2.2.4. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ
chín chưa tinh khiết [1],[4].
2.2.4.1. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của cà chua chín.
-Chuẩn bị bản mỏng:
Bản mỏng mua trên thị trường ñã ñược tráng silicagel có kích thước 20x20 cm. Cắt
bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 2 x 8 cm ñể phân tích nhanh. Dùng
bút chì vót nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm mức tiền tuyến
dung môi cách mép trên bản mỏng 1cm.
- Lựa chọn dung môi:
Mẫu cần phân tách ñã biết có thành phần chủ yếu là licopen và β-caroten.Theo [4]
thì chúng tôi chọn hệ dung môi là ete dầu hỏa: toluen: axeton và chọn thêm một số hệ
dung môi ñược trình bày ở bảng 2.1
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
23
Bảng 2.1 : Một số hệ dung môi chạy bản mỏng với
dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín (dịch chưa tinh khiết)
Dung môi hòa tan mẫu
Hệ dung môi chạy sắc kí bản
mỏng
Tỉ lệ
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:1:5
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:5:1
Toluen: axeton 45:5
Ete dầu hỏa: : axeton 45:5
Ete dầu hỏa
Ete dầu hỏa : Toluen 45:5
-Chuẩn bị mao quản:
Mao quản có chiều dài 7cm, ñường kính 1,5-1,6 mm, mao quản dùng ñể hút dung
dịch chấm lên bản mỏng yêu cầu mao quản phải có ñường kính bé hơn, với kích thứơc
này quá lớn ñể lấy mẫu cà chua chạy bản mỏng các vết mẫu sẽ rất to làm cho kết quả
không chính xác. ðể có ñầu mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách:
Hai tay cầm hai ñầu ống, ñặt phần giữa ống lên ngọn lửa ñèn cồn, vừa hơ vừa xoay
tròn ñều ống ñến khi ñoạn giữa mao quản trở nên mềm dẻo, ñưa ống ra khỏi ngọn lửa,
dùng hai tay kéo hai ñầu ống dang ra hai phía. Khi ñó phần ống mao quản ở giữa trở
nên nhỏ và hẹp hơn. Ống mao quản cứng lại, bẻ ống ra làm ñôi ở chỗ ñã ñược kéo nhỏ.
- ðưa mẫu lên bản mỏng:
Hòa tan hết lượng dịch chất màu của cà chua bằng 1 ml ete dầu hỏa. Dùng mao
quản ñã vuốt nhọn nhúng nhẹ phần ñầu nhọn vào dung dịch mẫu cà chua chín, lực mao
dẫn sẽ hút dung dịch cà chua chín vào mao quản, khi dung dịch lên khoảng 6mm thì
lấy ra. Cẩn thận nhẹ nhàng chấm phần ñầu nhọn có chứa mẫu cà chua chín lên bản
mỏng tại vạch xuất phát. Chạm vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thật
nhanh ñể dung dịch mẫu cà chua chín thấm vào bản mỏng tạo thành một ñiểm tròn nhỏ
vì nếu chạm lâu ñiểm này sẽ lan to. ðể khô dung môi ete dầu hỏa ngoài không khí
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
24
khoảng 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua chín
dùng ñể chạy sắc kí
- Chuẩn bị bình chạy sắc kí:
Bình hút ẩm ñã rửa sạch, phơi khô. ðặt cốc 250 ml vào giữa bình. Cho dung môi
giải li vào cốc, dung môi ete dầu hỏa: Toluen: axeton trộn theo tỉ lệ 45:1:5, sau ñó dùng
pipet hút 30 ml cho vào cốc, ñể yên 5-10 phút ñể bão hòa dung môi trong bình.
Bản mỏng ñược cầm thẳng ñứng và ñược nhúng vào cốc chứa dung môi trong bình,
khi nhúng phải cẩn thận ñể hai cạnh của bản mỏng không chạm vào thành cốc, sau ñó
nhẹ nhàng ñể bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng một góc khoảng 15 ñộ. Vị trí vết
chấm dịch cà chua nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5 cm
ðậy nắp bình thật kín trên nắp có thoa vazơlin ñể ñảm bảo không khí không lọt vào
và khi mở nắp cũng dễ dàng, theo dõi quá trình chạy sắc kí, khi dung môi lên cách
tuyến dung môi 1cm thì lấy bản mỏng ra, ñể bay hơi dung môi ngoài không khí 10 phút
- Hiện hình các vết chấm sau khi triển khai:
Cho một ít tinh thể iot vào 1 cái lọ nhỏ và ñặt vào bình hút ẩm khác. ðưa bản mỏng
ñã khô dung môi vào miệng lọ ñậy kín nắp, hơi iot tỏa ra chiếm hết lọ và các vết sẽ
hiện hình rõ trên bản mỏng. Lấy bản mỏng ra, ñậy nắp bình hút ẩm lại, dùng bút chì
ñánh dấu tâm vệt. Xác ñịnh Rf , quan sát vệt chúng tôi thấy vệt có màu da cam, vệt
không tròn là do dịch chưa tinh khiết, nên muốn vệt chạy sắc kí bản mỏng tròn sắc nét
thì dịch phải tinh khiết vì vậy chúng tôi phải tách dịch cà chua chín bằng cột sắc kí
Tiến hành chạy sắc kí bản mỏng với các hệ dung môi còn lại ñã ñược trình bày
trong bảng 2.1. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua
dùng ñể chạy sắc kí.
2.2.4.2. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của cà rốt.
Tiến hành chạy bản mỏng với dịch cà rốt như ñã tiến hành với dịch cà chua cũng
qua các bước như ñã trình bày. Kết quả chạy bản mỏng tương tự vệt cũng có màu da
cam, vệt không tròn.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
25
2.2.4.3. Chạy sắc kí bản mỏng với các dịch chất màu của ñu ñủ chín.
Tiến hành chạy bản mỏng với dịch ñu ñủ chín như ñã tiến hành với dịch cà chua
cũng qua các buớc như ñã trình bày. Kết quả chạy bản mỏng tương tự vệt cũng có màu
da cam, vệt không tròn.
2.2.5. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten [1],[4].
2.2.5.1. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch cà chua
chín.
- Chất hấp phụ: Al2O3
- Dung môi chạy sắc kí cột: do chất cần tách là licopen và β-caroten nên chúng tôi
dùng ete dầu hỏa ñể chạy cột
- Cách nhồi cột: nhồi khô
Cột có kích thước 50cm ñược rửa sạch bằng hỗn hợp nước rửa sunfocromic, tráng
và làm khô nước, sấy thật khô cột, khóa cột, thoa vazơlin vào khóa cột cho ñều, cho
một ít bông vào ñáy cột, cột ñược ñổ ñầy ete dầu hỏa, vừa cho ete dầu hỏa chảy ra
chầm chậm bên dưới vừa cho từng ít một của 20 g bột Al2O3 ở dạng khô vào ñầu cột,
vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột, cho ñến hết 20 g bột Al2O3 và dừng lại.Tiếp tục cho
ete dầu hỏa vào cột, dung môi ete dầu hỏa ñược lấy ra ở phía dưới cột với tốc ñộ 10
giọt/phút chứa vào cốc và dung môi này tiếp tục ñược dùng ñể rót trở lại lên ñầu cột
vài ba lần ñể giúp cho việc nạp cột ñược chặt chẽ và ñảm bảo không có bọt khí trong
cột. Không ñược ñể cho ñầu cột bị khô, cho lớp bông gòn lên trên bề mặt lớp bột Al2O3
ñể khi cho ete dầu hỏa chạy qua cột bề mặt cột không bị xáo trộn. Cho ete dầu hỏa
chảy qua cột ñến khi cột mịn. ðể ổn ñịnh trước 10 giờ.
- Cách cho dịch cà chua chín vào ñầu cột:
Dịch chất màu của cà chua chín ñược hòa tan vào 1 ml ete dầu hỏa. Mở khóa cột
ñể hạ mực ete dầu hỏa bằng với mực chất hấp phụ ñang có trong cột, khóa cột lại, dùng
ống nhỏ giọt hút dung dịch mẫu cà chua chín cho vào ñầu cột. Từ từ mở khóa cột ñể
cho dung dịch mẫu cà chua chín thấm xuống bề mặt lớp Al2O3 trên ñầu cột, lúc thấy
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
26
dung dịch ñã xuống gần lớp Al2O3 thì khóa cột lại, dung dịch không chảy ra nữa, tiếp
tục nạp cho hết lượng chất màu dịch cà chua vào ñầu cột.
Mở khóa ñể hạ mực dung dịch màu cà chua chín xuống sát mặt thoáng chất hấp
phụ Al2O3, dùng ống nhỏ giọt cho một lượng nhỏ 5-10 ml ete dầu hỏa vào ñầu cột lại
mở khóa ñể dịch màu cà chua chảy ra sao cho mặt thoáng chất hấp phụ Al2O3 vừa vặn
khô.Tiếp tục khóa lại cho thêm 2 ml ete dầu hỏa nữa, làm như thế ñến khi thấy dịch
chất màu cà chua chín ñã gắn chặt vào chất hấp phụ Al2O3 ở phần ñầu cột. Cho thêm
ete dầu hỏa ñầy cột và theo dõi quá trình tách các phân ñoạn
- Theo dõi quá trình tách các phân ñoạn:
Chất màu cà chua nạp vào cột quan sát chúng tôi thấy trong cột có hai màu: màu
vàng da cam bên dưới cột và màu ñỏ bên trên. Cho ete dầu hỏa chảy qua cột, 15 phân
ñoạn ñược tách ra với tốc ñộ 7-10 giọt/phút. Mỗi phân ñoạn lấy từ 15-20 giọt ñựng vào
các lọ penicilin ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 15. Các phân ñoạn có màu không khác
nhau nhiều có 2 màu chủ yếu là màu da cam và màu ñỏ. Khi dịch chất màu trên cột ñã
chảy xuống hết ñóng khóa lại.
Kiểm tra các phân ñoạn bằng sắc kí bản mỏng ñể xác ñịnh các phân ñoạn này ñã
sạch chưa.
2.2.5.2. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch cà rốt
Tiến hành tách licopen và β-caroten trong dịch chất màu của cà rốt bằng sắc kí
cột cũng qua các bước chuẩn bị mẫu, cho mẫu vào cột, theo dõi quá trình tách các phân
ñoạn như ñã tiến hành ñối với dịch cà chua chín. Sau ñó tiến hành kiểm tra các phân
ñoạn bằng sắc kí bản mỏng ñể xác ñịnh các phân ñoạn này ñã sạch chưa.
2.2.5.3. Tiến hành sắc kí cột phân tách licopen và β-caroten của dịch ñu ñủ chín
Tiến hành tách licopen và β-caroten trong dịch chất màu của ñu ñủ chín bằng sắc kí
cột cũng qua các bước chuẩn bị mẫu, cho mẫu vào cột, theo dõi quá trình tách các phân
ñoạn như ñã tiến hành ñối với dịch cà chua chín. Sau ñó tiến hành kiểm tra các phân
ñoạn bằng sắc kí bản mỏng ñể xác ñịnh các phân ñoạn này ñã sạch chưa
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
27
2.2.6. Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà chua, cà rốt, ñu ñủ
chín bằng sắc kí bản mỏng [1],[4]
2.2.6.1. Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà chua chín bằng
sắc kí bản mỏng
- Chuẩn bị bản mỏng: thao tác tiến hành như cách trình bày ở trên
- Chọn dung môi: Ban ñầu chạy sắc kí bản mỏng với dịch chưa tinh khiết của cà
chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chúng tôi thấy rằng hệ dung môi toluen:axeton cho hình
dạng vệt không tròn sắc nét, vệt có ñuôi dài lan rộng nên hệ dung môi này không phù
hợp do ñó mà chúng tôi chỉ chọn các dung môi trình bày trong bảng 2.2 ñể chạy sắc kí
bản mỏng kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột
Bảng 2.2: Dung môi chạy sắc kí bản mỏng với dịch tinh khiết
Dung môi hòa tan mẫu Hệ dung môi chạysắc kí bản mỏng Tỉ lệ
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:1:5
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 45:5:1
Ete dầu hỏa: : axeton 45:5
Ete dầu hỏa
Ete dầu hỏa : Toluen 45:5
- Chuẩn bị mao quản: giống như cách ñã trình bày ở trên
- ðưa mẫu cà chua chín lên bản mỏng:
Lấy các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột ñể bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ
chúng tôi thu ñược các dạng tinh thể có màu vàng da cam và ñỏ. Hòa tan hết tinh thể
trong lọ thu ñược ở phân ñoạn 1 của cà chua chín vào 1 ml ete dầu hỏa dùng mao quản
ñã ñược vuốt nhọn nhúng nhẹ phần ñầu nhọn vào dung dịch mẫu của cà chua chín.
Chấm mẫu dịch của cà chua chín lên bản mỏng. ðể khô dung môi ngoài không khí 5
phút. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà chua chín dùng ñể
chạy sắc kí
- Chuẩn bị bình chạy sắc kí: Tiến hành giống như các bước ñã trình bày phần sắc kí
bản mỏng ñối với mẫu là các dịch màu của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
28
- Hiện hình vết chấm sau khi triển khai:
ðưa bản mỏng ñã khô dung môi ete dầu hỏa: Toluen: axeton vào miệng bình ñựng
một ít tinh thể iốt, ñậy nắp bình lại lấy bản mỏng ra ñánh dấu tâm của vệt. Xác ñịnh Rf
và màu sắc vệt.
Tiếp tục chạy sắc ký bản mỏng của dịch màu cà chua chín với các dung môi còn lại
và các phân ñoạn còn lại. Lặp lại 3 lần như trên ta ñược một bản mỏng có chấm mẫu cà
chua chín dùng ñể chạy sắc kí với hệ dung môi xác ñịnh nêu ở trên.
2.2.6.2. Kiểm tra các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột của dịch cà rốt bằng sắc kí
bản mỏng
Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng lần lượt ở các phân ñoạn của dịch cà rốt tinh
khiết với các hệ dung môi trình bày ở bảng 2.2. Chuẩn bị tương tự như thao tác với
mẫu là dịch cà chua chín tinh khiết.
2.2.6.3. Kiểm tra các phân ñoạn của sắc kí cột của dịch ñu ñủ chín bằng sắc kí
bản mỏng
− Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng lần lượt các phân ñoạn của ñu ñủ chín với các
hệ dung môi trình bày ở bảng 2.2 giống như ñối với dịch cà chua chín và dịch cà rốt.
− Sau khi tiến hành việc phân tách sắc tố các mẫu bằng phương pháp sắc kí cột,
chúng tôi tiến hành thử lại với phương pháp sắc kí bản mỏng, các bước tiến hành ñã
ñược nêu ở trên. Kết quả quan sát ban ñầu giúp chúng tôi có cơ sở ñể kết luận rằng: các
phương pháp sử dụng ở trên ñối với các mẫu khảo sát là cà chua chín, cà rốt và ñủ chín
ñã thu ñược những sắc tố màu tương ñối sạch. Các kết quả thực nghiệm thu ñược qua
các giai ñoạn và kết quả thảo luận ñược trình bày ở chương sau.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
29
CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chạy sắc ký bản mỏng với dịch chưa tinh khiết
3.1.1. Chạy sắc ký bản mỏng với dịch cà chua chín
Quả cà chua chín sau khi ñi qua bước chuẩn bị dịch ñã ñược trình bày ở trên
chúng tôi thu ñược dịch chất màu vàng da cam của cà chua chín, ñể bay hơi dung môi
chúng tôi thu ñược dạng tinh thể màu da cam. Hòa tan hết tinh thể màu vàng da cam
thu ñược bằng 1ml ete dầu hỏa và tiến hành chạy sắc kí bản mỏng lần lượt với các hệ
dung môi ñược trình bày trong bảng 2.1. Theo dõi quá trình chạy sắc kí bản mỏng dịch
màu cà chua chín chúng tôi ñã thu ñược kết quả: màu sắc, hình dạng vệt, giá trị Rf của
vệt ñược trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng dịch màu cà chua chín
Hệ dung môi và tỉ lệ Rf Màu sắc Hình dạng vệt
Ete dầu hỏa:Toluen:Axeton
45 : 1 : 5
5.3 0.964
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa:Toluen:Axeton
45 : 5 : 1
5.4 0.982
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Toluen:Axeton
45 : 6
5.5 1
5.5f
R = = Da cam ðuôi dài lan rộng
Ete dầu hỏa:Axeton
45 : 5
5.23 0.95
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa: Toluen
45 : 5
5.33 0.969
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
• Nhận xét và thảo luận:
Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của dịch màu cà chua chín chúng tôi thấy rằng
màu sắc vệt thu ñược chủ yếu là màu da cam, hình dạng vệt bầu dục không tròn. Riêng
ñối với hệ dung môi Toluen: axeton (45:5) chúng tôi thấy hình dạng vệt ñuôi dài lan
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
30
rộng, giá trị Rf =1 khác so với Rf khi chạy với các hệ dung môi còn lại trong bảng 3.1.
Từ kết quả trình bày ở 3.1 chúng tôi kết luận dịch cà chua chín thu ñược là chưa tinh
khiết.
3.1.2. Chạy sắc ký bản mỏng với dịch cà rốt.
Cũng giống như dịch chất màu của cà chua chín, chúng tôi cũng chạy sắc kí bản
mỏng ñối với dịch màu vàng da cam của cà rốt lần lượt với các hệ dung môi trình bày
ở bảng 2.1. Theo dõi quá trình chạy sắc kí bản mỏng dịch màu cà rốt chúng tôi ñã thu
ñược kết quả: màu sắc, hình dạng và giá trị Rf của vệt, kết quả ñược trình bày trong
bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng dịch chất màu của cà rốt
Hệ dung môi và tỉ lệ Rf Màu sắc Hình dạng vệt
Ete dầu hỏa:Toluen:Axeton
45 : 1 : 5
5.3 0.964
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa:Toluen:Axeton
45 : 5 : 1
5.4 0.982
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Toluen:Axeton
45 : 5
5.5 1
5.5f
R = = Da cam ðuôi dài lan rộng
Ete dầu hỏa:Axeton
45 : 5
5.23 0.95
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa: Toluen
45 : 5
5.33 0.969
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
• Nhận xét và thảo luận:
Hệ dung môi Toluen: axeton (45:5) cho giá trị Rf = 1 rất lớn, các giá trị Rf khi chạy
với các hệ dung môi còn lại cũng cho giá trị tương ñối lớn và khác nhau không nhiều.
Màu sắc vệt có màu da cam ,vệt không tròn sắc nét chúng tôi kết luận sơ bộ rằng dịch
cà rốt chưa tinh khiết
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
31
3.1.3. Chạy sắc ký bản mỏng với dịch ñu ñủ chín
Dịch màu của ñu ñủ chín thu ñược cũng ñược chạy sắc kí bản mỏng. Kết quả về
màu sắc, hình dạng vệt, giá trị Rf ñược trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng dịch chất màu ñu ñủ chín
Hệ dung môi và tỉ lệ Rf Màu sắc Hình dạng vệt
Ete dầu hỏa:Toluen:Axeton
45 : 1 : 5
5.3 0.964
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa:Toluen:Axeton
45 : 5 : 1
5.4 0.982
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Toluen:Axeton
45 : 5
5.5 1
5.5f
R = = Da cam ðuôi dài lan rộng
Ete dầu hỏa:Axeton
45 : 5
5.23 0.95
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa: Toluen
45 : 5
5.33 0.969
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
• Nhận xét và thảo luận:
Tiến hành sắc kí bản mỏng ñối với dịch ñu ñủ chín chúng tôi quan sát vệt có màu
da cam, giá trị Rf lớn, vệt không tròn rõ ràng. Chúng tôi kết luận sơ bộ rằng dịch ñu ñủ
chín chưa tinh khiết vì nếu mẫu tinh khiết sẽ cho vệt tròn sắc nét.
* Nhận xét chung:
- Qua 3 lần chạy sắc ký bản mỏng dịch chất màu của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ
chín chúng tôi thấy rằng: kết quả chạy với hệ dung môi giống nhau cho kết quả giống
nhau chứng tỏ trong dịch cà chua chín, ñu ñủ chín, cà rốt có chứa những chất giống
nhau. Giá trị Rf thu ñược tương ñối lớn, các giá trị Rf khác nhau không nhiều; màu các
sắc tố sau khi chạy bản mỏng ñều có màu da cam, hình dạng vệt thu ñược chủ yếu có
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
32
hình bầu dục không tròn rõ ràng và sắc nét vì dịch chúng tôi thu ñược chủ yếu vẫn là
hỗn hợp 2 chất licopen và β- caroten, dịch chưa tinh khiết.
- ðối với hệ dung môi Toluen: axeton khi chạy sắc ký làm cho hỗn hợp licopen và
β- caroten trong mẫu di chuyển lên mức tiền tuyến dung môi, theo [1] thì hệ dung môi
Toluen: axeton quá phân cực không phù hợp ñể chạy sắc ký bản mỏng phân tách sắc tố
cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín. Vì vậy chúng tôi phải tách dịch bằng sắc kí cột và khi
chạy bản mỏng ñối với dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín tinh khiết chúng tôi chỉ sử
dụng các hệ dung môi trình bày ở bảng 2.2
3.2. Kết quả chạy sắc ký cột
Qua kết quả chạy sắc kí cột ñối với 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín có
cùng số phân ñoạn màu sắc của phân ñoạn giống nhau nên chúng tôi xin phép ñược
trình bày chung trong bảng giá trị sau:
Bảng 3.4: Màu sắc các phân ñoạn tách sắc tố cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
bằng sắc ký cột
Các phân ñoạn của 3 mẫu cà chua
chín, cà rốt, ñu ñủ chín tính từ
dưới cột lên trên ñầu cột
Màu sắc
Phân ñoạn 1 Vàng da cam
Phân ñoạn 2 Vàng da cam
Phân ñoạn 3 Vàng da cam
Phân ñoạn 4 Vàng da cam
Phân ñoạn 5 Vàng da cam
Phân ñoạn 6 Vàng da cam
Phân ñoạn 7 Vàng da cam
Phân ñoạn 8 Vàng da cam
Phân ñoạn 9 ðỏ da cam
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
33
Phân ñoạn 10 ðỏ da cam
Phân ñoạn 11 ðỏ
Phân ñoạn 12 ðỏ
Phân ñoạn 13 ðỏ
Phân ñoạn 14 ðỏ
Phân ñoạn 15 ðỏ
• Nhận xét và thảo luận:
Từ kết quả chạy cột sắc ký cột chúng tôi nhận thấy rằng từ phân ñoạn 1 → phân
ñoạn 8 dịch thu ñược có màu vàng da cam, từ phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 dịch thu
ñược có màu ñỏ da cam, từ phân ñoạn 11 → 15 dịch có màu ñỏ. Chúng tôi kết luận sơ
bộ rằng từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 của 3 mẫu dịch cà chua chín, ñu ñủ chín chứa
những chất giống nhau, phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 chứa những chất giống nhau,
phân ñoạn 11 → 15 chứa những chất giống nhau. Mặt khác theo lý thuyết thì β-
caroten có màu vàng da cam, licopen có màu ñỏ do ñó chúng tôi tạm kết luận từ phân
ñoạn 1 → phân ñoạn 8 dịch thu ñược là β- caroten, phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15
dịch thu ñược là licopen, phân ñoạn 9→ phân ñoạn 10 có thể là hỗn hợp của licopen
và β- caroten
3.3. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn tách ra từ sắc ký cột của cà
chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Kết quả chạy sắc kí cột ñối với 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín có
cùng số phân ñoạn màu sắc của phân ñoạn giống nhau nên chúng tôi tiến hành chạy sắc
kí bản mỏng kiểm tra các phân ñoạn
Kết quả chạy sắc kí bản mỏng các phân ñoạn tách ra từ sắc kí cột 3 mẫu dịch cà
chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín cho kết quả như sau: hình dạng, màu sắc vệt và các giá trị
Rf ở từng ñoạn (từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8, phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10, phân
ñoạn 11 → 15) tương ñối giống nhau nên chúng tôi xin phép trình bày kết quả ở phân
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
34
ñoạn 1 → phân ñoạn 8 trong cùng bảng 3.5. Phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 trong cùng
bảng 3.6 và phân ñoạn 11 → 15 trong cùng bảng 3.7
3.3.1. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 tách ra từ
sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 của dịch chất màu của cà chua, cà rốt, ñu ñủ chín lần
lượt ñược ñể bay hơi dung môi ete dầu hỏa thu ñược dạng tinh thể có màu da cam. Hòa
tan lần lượt ñến hết các tinh thể thu ñược của các dịch màu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ
chín ở các phân ñoạn trong mỗi cốc chứa 1ml ete dầu hỏa, mẫu này ñược chạy sắc kí
bản mỏng với hệ dung môi trình bày trong bảng 2.2 chúng tôi thu ñược kết quả trình
bày trong bảng sau:
Bảng 3.5: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8
của dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Phân ñoạn Hệ dung môi và tỉ lệ Rf
Màu
sắc
Hình
dạng vệt
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton
45 :1 :5
0,91 0.165
5,5f
R = =
Da cam tròn
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton
45 :5 :1
0,8 0,145
5,5f
R = =
Da cam tròn
Ete dầu hỏa: : axeton
45 :5
0,93 0.169
5,5f
R = =
Da cam tròn
Phân ñoạn 1
phân ñoạn 8
Ete dầu hỏa : Toluen
45 :5
0,86 0,156
5,5f
R = =
Da cam tròn
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
35
- Giá trị Rf lý thuyết β- caroten theo [3]
Dung môi Rf Màu sắc
Hình
dạng vệt
Ete dầu hỏa/axeton,etanol Rf = 0,1- 0,6 Da cam Tròn
• Nhận xét và thảo luận
- Chạy sắc kí bản mỏng từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 của 3 mẫu dịch cà chua,
cà rốt, ñu ñủ chín ñược tách ra từ sắc kí cột về màu sắc, hình dạng vệt, giá trị Rf giống
nhau; hình dạng của mẫu khi chạy sắc kí là vệt tròn, sắc nét nên chúng tôi tạm kết luận
từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ñã tinh
khiết và cùng là một chất.
- Giá trị Rf dao ñộng trong khoảng không rộng từ 0,145- 0,169, so sánh với giá trị
lí thuyết về màu sắc và Rf là phù hợp chúng tôi tạm kết luận từ phân ñoạn 1 → phân
ñoạn 8 chứa β-caroten
3.3.2. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 tách ra
từ sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Tiến hành tương tự như ở phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 ñối với phân ñoạn 9→ phân
ñoạn 10 của dịch chất màu của cà chua, cà rốt, ñu ñủ chín rốt, ñu ñủ chín với hệ dung
môi trình bày trong bảng 2.2 chúng tôi thu ñược kết quả trình bày trong bảng sau
Bảng 3.6: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng từ phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10
của dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Phân ñoạn Hệ dung môi và tỉ lệ Rf
Màu
sắc
Hình
dạng vệt
Phân ñoạn 9
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton
45 :1 :5
5.3 0.964
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
36
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton
45 :5 :1
5.36 0.974
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
Ete dầu hỏa: : axeton
45 :5
5.2 0.945
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
phân ñoạn 10
Ete dầu hỏa : Toluen
45 :5
5.3 0.963
5.5f
R = = Da cam Bầu dục
• Nhận xét và thảo luận
Chạy sắc kí bản mỏng từ phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 của dịch cà chua, cà rốt,
ñu ñủ chín ñược tách ra từ sắc kí cột màu sắc, hình dạng vệt, giá trị Rf cũng giống
nhau. Hình dạng sắc nét nhưng vệt không tròn, nên chúng tôi tạm kết luận từ phân
ñoạn 9 → phân ñoạn 10 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín là hỗn hợp của
β- caroten và licopen.
3.3.3. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 tách ra
từ sắc ký cột của cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Tiến hành chạy sắc kí bản mỏng từ phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 giống như ñã tiến
hành chạy sắc kí bản mỏng từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 cũng như ở phân ñoạn 9
→phân ñoạn 10 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín kết quả ñược trình bày
trong bảng 3.7
Bảng 3.7: Kết quả chạy sắc ký bản mỏng phân ñoạn 11 →15 của
dịch màu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín
Phân ñoạn Hệ dung môi và tỉ lệ Rf
Màu
sắc
Hình
dạng vệt
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton
45 :1 :5
1,5 0.272
5,5f
R = =
ðỏ tròn
Phân ñoạn 11
phân ñoạn 15
Ete dầu hỏa: Toluen: axeton 1,53 0, 278
5,5f
R = =
ðỏ tròn
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
37
45 :5 :1
Ete dầu hỏa: : axeton
45 :5
1,55 0, 281
5,5f
R = =
ðỏ tròn
Ete dầu hỏa : Toluen
45 :5
1,6 0, 291
5,5f
R = =
ðỏ tròn
Theo lí thuyết, hình ảnh vệt khi sử dụng sắc kí bản mỏng với mẫu licopen là màu
ñỏ, tròn [3], chúng tôi vẫn chưa tìm thấy giá trị Rf lý thuyết của licopen. Nhưng theo
kết quả thu ñược từ thực nghiệm chúng tôi mạnh dạn kết luận mẫu mà chúng tôi phân
tách ñược là mẫu sạch.
• Nhận xét và thảo luận:
- Khảo sát với sắc kí bản mỏng từ phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 của dịch cà chua,
cà rốt, ñu ñủ chín ñược tách ra từ sắc kí cột chúng tôi nhận thấy: màu sắc, hình dạng
vệt, giá trị Rf gần như giống nhau. Hình dạng vệt tròn, màu ñỏ và sắc nét nên chúng tôi
cũng tạm kết luận từ phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà
rốt, ñu ñủ chín ñã tinh khiết và thu ñược cùng một chất
- Giá trị Rf dao ñộng trong khoảng không rộng từ 0,272- 0,291, so sánh với lí thuyết
về màu sắc vệt là màu ñỏ và hình dạng vệt tròn là phù hợp chúng tôi tạm kết luận từ
phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 chứa licopen
* Nhận xét chung
Thông qua kết quả chạy sắc ký bản mỏng các phân ñoạn ñược tách ra ñược từ sắc
ký cột chúng tôi thấy rằng hình dạng các vệt tròn, có giá trị Rf của β-caroten (phân
ñoạn màu vàng da cam) thu ñược là giá trị thuộc khoảng Rf của β - caroten theo lí
thuyết, kết quả chạy bản mỏng cho hình dạng vệt tròn, màu sắc vệt ñúng với màu sắc
của lí thuyết trình bày do ñó chúng tôi tạm kết luận ñược phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8
là β-caroten. Chúng tôi chưa tìm thấy nguồn tài liệu nào trình bày giá trị Rf lý thuyết
của licopen nhưng dựa vào màu sắc vệt là màu ñỏ, vệt chạy sắc ký bản mỏng có hình
tròn sắc nét nên chúng tôi tạm kết luận phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 là licopen. Kết
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
38
quả Rf và màu sắc của từ phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 khi chạy bản mỏng gần giống
với dịch các chất màu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín khi chưa tách mẫu bằng sắc kí
cột, do ñó chúng tôi kết luận từ phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 là hỗn hợp của licopen
và β - caroten.
3.4. Hướng phát triển:
Tách β-caroten và licopen bằng các phương pháp như: sắc ký cột và xác ñịnh ñộ
sạch của các hợp chất thu trong từng phân ñoạn bằng chạy sắc ký bản mỏng sau ñó so
sánh giá trị Rf và màu sắc các vệt thu ñược với giá trị lý thuyết chúng tôi cũng chỉ tạm
kết luận ñược ñó là licopen và β -caroten. ðể xác ñịnh chính xác cấu tạo của chúng cần
phải xác ñịnh các tiêu chuẩn sau: ñiểm nóng chảy của chất ñó; bằng các phương pháp
vật lý khác như: phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng... .Nếu
có ñiều kiện nghiên cứu tiếp chúng tôi sẽ thực hiện các giai ñoạn tiếp theo như trình
bày ở khẳng ñịnh rõ hơn về cấu trúc của các hợp chất trong sắc tố màu này.
Ở phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 vẫn còn hỗn của hai chất β - caroten và licopen,
cần phải lựa chọn các hệ dung môi khác hoặc bằng phương pháp khác ñể tách chúng ra
khỏi nhau.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
39
PHẦN KẾT LUẬN
Từ những kết quả ñạt ñược chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Dùng etanol và ete dầu hỏa chúng tôi ñã thu ñược dịch chất màu của cà chua chín,
cà rốt, ñu ñủ chín. Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu của 3 mẫu cà chua chín, cà
rốt, ñu ñủ chín cho kết quả hình dạng vệt không tròn sắc nét, màu sắc vệt chủ yếu là
màu da cam, giá trị Rf thu ñược rất lớn. Chúng tôi ñã tạm kết luận dịch thu ñược của 3
mẫu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chưa tinh khiết vì vậy mà chúng tôi ñã tiến hành
chạy sắc kí cột ñể tách dịch 3 mẫu cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín.
- Chúng tôi tiến hành quá trình chạy sắc kí cột với dung môi ete dầu hỏa ñối với 3
mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín và ñều thu ñược 15 phân ñoạn, màu sắc từ
phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín cùng có
màu da cam, phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 có màu ñỏ da cam, phân ñoạn 11 → phân
ñoạn 15 của 3 mẫu dịch có cùng màu ñỏ. Dựa vào kết quả ñó chúng tôi ñã tạm kết luận
từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 chứa những chất giống nhau, phân ñoạn 9 → phân
ñoạn 10 chứa những chất giống nhau, phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 chứa những chất
giống nhau.Vì vậy chúng tôi ñã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng kiểm tra các phân ñoạn
tách ra từ sắc kí cột.
- Chúng tôi ñã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng với dung môi trình bày ở bảng 2.2
kiểm tra các phân ñoạn và thu ñược kết quả: từ phân ñoạn 1 → phân ñoạn 8 của 3 mẫu
dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ñều cho màu sắc vệt có màu da cam, hình dạng
vệt tròn sắc nét, giá trị Rf trong các hệ dung môi từ 0,145 – 0,169 thuộc khoảng giá trị
Rf của β-caroten theo lí thuyết 0,1-0,16 nên chúng tôi ñã tạm kết luận phân ñoạn 1 →
phân ñoạn 8 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chứa β-caroten. Phân ñoạn
9 → phân ñoạn 10 của 3 mẫu dịch ñều cho kết quả hình dạng vệt bầu dục, vệt có màu
da cam chúng tôi tạm kết luận phân ñoạn phân ñoạn 9 → phân ñoạn 10 của 3 dịch cà
chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín chứa hỗn hợp β-caroten và licopen. Phân ñoạn 11 → phân
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
40
ñoạn 15 của 3 mẫu dịch cà chua chín, cà rốt, ñu ñủ chín ñều cho hình dạng vệt tròn,
màu sắc vệt là màu ñỏ, giá trị Rf trong các hệ dung môi từ 0,272- 0,291, do giá trị Rf lí
thuyết chúng tôi chưa thấy tài liệu nào trình bày nhưng màu sắc vệt sau khi chạy sắc kí
bản mỏng có màu ñỏ, vệt tròn phù hợp với màu sắc và hình dạng vệt theo lí thuyết nên
chúng tôi tạm kết luận từ phân ñoạn 11 → phân ñoạn 15 chứa licopen
Như vậy bằng thực nghiệm chạy sắc ký cột dùng dung môi ete dầu hỏa và kiểm tra
lại bằng sắc kí bản mỏng dùng các hệ dung môi trình bày trong bảng 2.1và bảng 2.2
chúng tôi ñã tách riêng ñược licopen và β-caroten trong sắc tố của cà chua chín, cà rốt
và ñu ñủ chín.
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Lê Văn ðăng – Chuyên ñề một số hợp chất thiên nhiên,NXB ðHQG TPHCM
2. GS Nguyễn Xuân Dũng – Các phương pháp sắc kí, NXB ðại học & Kỹ thuật
3. Lê Chí Kiên-Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y Học
4. PGS.TS Lê Thị Anh ðào – Thực hành Hóa hữu cơ, NXB ðại học Sư Phạm
TRANG WEB
5. http//www.google.com/Vietbao/suc khoe/ nhung dieu chua biet ve licopen
6. http//www.google.com/Thư viện Khoahoc/Tusach/ Caroten
7. http//www.google.com/thong tin ve ca chua/Noidung/tintuc/sukien/bi quyet
chong lao hoa
8. http//www.google.com/thong tin ve ca rot
9. http//www.google.com/thong tin ve du du chin
10. www.medilatex.com.vn
PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial ::
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- phan-tach-sac-to-ca-chua-chin-ca-rot-du-du-chin-bang-phuong-phap-sac-ky-ban-mong.pdf