Phân tích hàm lượng Aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG Giảng viên hƣớng dẫn : THS. NGUYỄN THANH NAM Lớp : 01DHTP1 Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Khóa học : 2010-2014 Năm học : 2012-2013 TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2012 BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG Giảng viên hƣớng dẫn : THS. NGUYỄN THANH NAM Sinh viên thực hiện : HUỲNH TẤN ĐẠT 2005100054 NGUYỄN HOÀNG PHÚC 2005100031 NGUYỄN HỮU NHÂN 2005100262 NGUYỄN TẤN PHÚC 2005100040 BIỆN THỊ HỒNG THẮM 2005100062 VÕ MINH TRÍ 2008100088 PHẠM QUỐC HUY 2005100171 NGUYỄN VŨ M.CƢỜNG 2005100150 PHAN HƢNG THỊNH 2005100286 TRẦN VĂN TOÀN 2005100428 Lớp : 01DHTP1 Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Khóa học : 2010-2014 Năm học : 2012-2013 TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2012 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ ii CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN......................................... 1 1.1. Tổng quan về độc tố aflatoxin ..................................................................... 1 1.2. Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin ....................................................... 1 1.3. Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng ............................................. 4 CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG ................................................................................................................ 5 2.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 5 2.2. Các phương pháp xác định aflatoxin B1 ......................................................... 5 2.3. Tổng quan phương pháp sắc ký bản mỏng ...................................................... 6 2.3.1. Chuẩn bị sắc ký ...................................................................................... 7 2.3.2. Kỹ thuật .................................................................................................. 7 2.3.3. Phân tích ................................................................................................ 8 2.4. Áp dụng phân tích aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng................................ 9 2.4.1. Nguyên liệu ............................................................................................ 9 2.4.2. Thiết bị và hóa chất ................................................................................ 9 2.4.3. Tiến trình ................................................................................................ 9 2.4.4. Kết quả và bàn luận ............................................................................. 10 2.4.4.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B1 trên các mẫu phân tích ...... 10 2.4.4.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel .................... 11 2.4.5. Kết luận và khuyến nghị ...................................................................... 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 14 LỜI MỞ ĐẦU Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của người tiêu dùng đã được nâng cao đáng kể thông qua các phương tiện truyền thông, sách báo, báo đài,…Do đó, ý thức về thói quen sử dụng thực phẩm sạch và an toàn đang ngày càng được quan tâm và chú trọng hơn. Các bằng chứng rõ ràng là hiện nay các nhà hàng, dịch vụ ăn uống, siêu thị đang ngày càng trở nên gần gũi và quen thuộc với người tiêu dùng. Bên cạnh đó, cũng còn những cơ sở sản xuất thực phẩm nhỏ, lẻ, quán ăn lề đường,…vẫn còn nhiều bất cập và vấn đề an toàn thực phẩm vẫn chưa được quan tâm đúng cách. Cùng với sự lo lắng đó, hiện nay “Phân tích thực phẩm” hiện nay là một công cụ rất hữu dụng, giúp chúng ta phân tích, đánh giá được các mối nguy cũng như các nguy cơ tiềm ẩn trong thực phẩm được phát hiện và ngăn chặn kịp thời. Trong tương lai không xa, ngành “Phân tích thực phẩm” sẽ trở thành một phần không thể thiếu, giúp con người tự tin hơn khi dùng thực phẩm và mang lại cảm giác an toàn cho người tiêu dùng hơn. Đề tài: Phân tích hàm lượng aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng” được nhóm chúng tôi triển khai nhằm mục đích xem xét độc tố của loại nấm mốc này trong các sản phẩm có dầu như đậu, vừng, bắp,…Nhằm có một cái nhìn tổng quát và hạn chế được chúng trong thực phẩm hằng ngày. Dù đã cố gắng rất nhiều nhưng cũng khó tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được sự góp ý từ Thầy (Cô) và các bạn để bài tiểu luận sau đầy đủ hơn. TẬP THỂ NHÓM i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) ML Maximum Level (giới hạn tối đa) RIA Radioimmunoassay (miễn dịch phóng xạ) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (miễn dịch enzyme) FDA Food and Drug Amination (Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ) TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng) IAC Immuno Affinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch) ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lƣợng aflatoxin trong một số loại thức ăn chăn nuôi ở VN ............. 2 Bảng 1.2. Các giới hạn tối đa hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm ...................... 3 Bảng 1.3. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam ............... 3 Bảng 2.1. Hàm lƣợng Aflatoxin B1 trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn Nhất .............................................................................................................................. 11 Bảng 2.2. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B1 của cột IAC và Silicagel ................ 12 ĐẶT VẤN ĐỀ Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là một vấn đề được các tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm. Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kĩ thuật bảo quản gìn giữ các giá trị dinh dưỡng của chúng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó đồng thời chế biến chúng thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật có hại đã gây ra tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổn thất gây nên do nấm mốc chiếm một phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về lượng cho nông sản nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và động vật kinh tế. Nấm mốc phát triển trên lương thực không những sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt: Protein, glucid, lipit và các vitamin, chúng còn tiết ra các độc tố. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus moninus tạo ra là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến, …thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và các động vật kinh tế. Do vậy, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và các độc tố mốc, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc trên lương thực, thực phẩm. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 1.1. Tổng quan về độc tố aflatoxin Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillu flavus vàAspergillus parasiticus. Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư. Sau khi thâm nhập vào cơ thể, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít độc hơn. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của aflatoxin 1.2. Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên. Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán. Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó. Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao. Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 2 (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa… Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin. Bảng 1.1. Hàm lƣợng aflatoxin trong một số loại thức ăn chăn nuôi ở VN Tên thực phẩm n Hàm lƣợng AF trung bình (ppb) Bắp hạt 25 205 Gạo và tấm gạo 2 22 Đậu nành hạt 1 50 Cám gạo 3 29 Khô dầu mè 3 8 Khô dầu dừa 7 17 Khô dầu đậu nành 4 12 Khô dầu đậu phộng 29 1200 Bột khoai mì lát 1 40 Thức ăn hỗn hợp 28 105 Hầu như tất cả các nguồn của bơ lạc thương mại tại Hoa Kỳ có hàm lượng aflatoxin từ 0 ppb đến 20 ppb cho tiêu dùng trực tiếp, mặc dù thức ăn dùng để vỗ béo cho bò thịt/lợn/gia cầm trong giai đoạn cuối có thể chấp nhận mức 300 ppb nhưng trong thực tế thường thấp hơn nhiều mức khuyến cáo an toàn của Cục Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA). FDA đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức khoẻ động vật. Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 3 Bảng 1.2. Các giới hạn tối đa hàm lƣợng aflatoxin trong thực phẩm Hàm lƣợng (ppb) Tiêu chí 20 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng thành (kể cả gia cầm chưa trưởng thành) và các vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích khác không được công bố; và đối với thức ăn chăn nuôi ngoại trừ ngô và bột từ hạt bông 100 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi (bò, lợn) hoặc gia cầm đã trưởng thành 200 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100 pound trở lên 300 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (ví dụ vỗ béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm Bảng 1.3. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam ML (microgam/kg) Tiêu chí 5 Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung 15 Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung Chương 1. Tổng quan về độc tố aflatoxin GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 4 0,5 Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa 1.3. Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng Có ít nhất 13 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên. Aflatoxin B1 được coi là dạng độc nhất và được sản sinh bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin G1 và G2 chỉ được sinh ra từ A. parasiticus. Sự có mặt của Aspergillus trong các sản phẩm thực phẩm không phải lúc nào cũng là chỉ thị về mức aflatoxin có hại mà nó biểu thị cho rủi ro đáng kể khi sử dụng thực phẩm. Aflatoxin M1, M2 thường được phát hiện trong sữa của bò được cho ăn bởi các loại hạt bị nhiễm nấm mốc. Các độc tố này là sản phẩm của một quá trình chuyển hóa trong gan động vật. Tuy nhiên, aflatoxin M1 cũng có mặt trong sản phẩm lên men bởi Aspergillus parasiticus.  Aflatoxin B1 & B2 : được sinh ra bởi Aspergillus flavus và A. parasiticus.  Aflatoxin G1 & G2 : được sinh ra bởi Aspergillus parasiticus.  Aflatoxin M1 : chất chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật  Aflatoxin M2 : chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin  Aflatoxicol Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 5 CHƢƠNG 2. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG 2.1. Đặt vấn đề Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả năng nhiễm độc tố nguy hiểm aflatoxin B1 do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong một số dung môi hữu cơ (clorofoc, methanol, acetone,…) và độc tính cao, rất bền vững với tác nhân hóa lí..., chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên 1200C trong môi trường kiềm. Do cấu trúng hóa học có vòng dihydrofuran (hình 2) nên aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) gây tổn thương gan và gây ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến di tật thai nhi hoặc quái thai, nặng có thể chết non. Do đó, việc kiểm tra thực phẩm có nguy cơ nhiễm aflatoxin B1 là rất cần thiết Hình 2.1. Aspergillus flavus 2.2. Các phƣơng pháp xác định aflatoxin B1 Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người lượng aflatoxin không vượt quá 10ppb. Để phát hiện và định lượng aflatoxin, hiện nay 2 nhóm phương pháp chính sau:  Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 6  Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch enzym (ELISA) và cột sắc kí ái lực miễn dịch. Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, trước khi phát hiện phải trải qua rất nhiều thao tác phức tạp như chiết lấy aflatoxin từ vật liệu, sau đó phải cô đặc trước khi định lượng nên tốn nhiều thời gian thao tác kĩ thuật, hơn nữa thiết bị đầu tư rất đắt tiền. Với phương pháp ELISA, lại có nhiều hạn chế vì aflatoxin thường không bám đặc hiệu vào các giếng polystirene, khoảng phát hiện hẹp, và cần phải có aflatoxin đánh dấu hoặc kháng thể đánh dấu, sai số lớn mặc dù có độ nhạy cao. Vì những lí do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin B1 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng sử dụng cột ái lực miễn dịch và cột silicagel” trong mẫu hay nhiễm nhất là đậu phộng và bắp với những ưu điểm sau:  Cô đặc trên cột với nồng độ thấp và loại bỏ được tạp chất ảnh hưởng đến qui trình định lượng.  Thời gian tiến hành nhanh, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản và hóa chất ít 2.3. Tổng quan phƣơng pháp sắc ký bản mỏng Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:  Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa  Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật  Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 7  Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn  Giám sát các phản ứng hữu cơ Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC). 2.3.1. Chuẩn bị sắc ký Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh. 2.3.2. Kỹ thuật Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc kí lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng. Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi. Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 8 Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl acetate và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu Rf cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silicagel. Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại. 2.3.3. Phân tích Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:  Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese- activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.  Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau. Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 9  Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào, hoặc phun lên bản sắc kí.  Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn, chẳng hạn như khối phổ. Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc kí, và không phải là hằng số. 2.4. Áp dụng phân tích aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng 2.4.1. Nguyên liệu Bắp hạt và đậu phộng lấy từ chợ Bà Chiểu, Chợ Tân Sơn Nhất. 2.4.2. Thiết bị và hóa chất Thiết bị: + Bột thiết bị chạy sắc kí TLC + Dụng cụ làm khô gia nhiệt, bình thổi khí, đèn soi + Các tấm silicagel 10 x 10 cm mua từ Merk + Microsylinge Halmilton 10µ + Các dụng cụ thủy tinh cần thiết Hóa chất: Acetonlintril, methanol, benzen (tinh khiết) và nước cất + Dung dịch triển khai: 2 18  Acetone hloroform ; dung dịch hòa cặn: 2 98 ln  itril Benzen + Aflatoxin B1 chuẩn 0,5ppm trong dung dịch hòa cặn. 2.4.3. Tiến trình Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 10 Cột IAC Kết quả IAC Bắp hạt+đậu phộng Sắc ký bản mỏng TLC Cột silicagel Kết quả silicagel Sơ đồ phân tích hàm lƣợng Aflatoxin B1 bằng cột IAC: Mẫu phân tích (25gam)  chiết xuất (5g NaCl, 37,5ml nước cất, methanol 87,5ml, thời gian 30 phút)  lọc thường (thu 15 ml và cho thêm 15ml nước cất)  lọc giấy thủy tinh (thu 45ml dịch lọc) qua cột IAC (2 giọt/phút)  làm khô dịch chiết (trong N2/40 – 50 0 C) định lượng bằng TLC. Sơ đồ phân tích hàm lƣợng Aflatoxin B1 bằng cột Silicagel:  Chuẩn bị cột Silicagel Sắc ký cột  cho 5gam Na2SO4 khan  cho CHCl3 tới ½ ống  cho 10g silicagel  rửa thành ống 20ml CHCl3 cho từ từ 15gam Na2SO4 khan  cho CHCl3 chảy tới đỉnh Na2SO4.  Tiến hành Mẫu phân tích (50gam)  chiết xuất (25ml nước cất, 250ml CHCl3, đậy kín và lắc mạnh trong 30 phút)  lọc thường (thu 50 ml)  cột silicagel (đã chuẩn bị)  rửa giải tạp (lần 1: 150ml C6H6, lần 2: 150ml (C2H5)2O) rửa giải Aflatoxin B1 (150ml CH3OH : CHCl3 = 3:97) thu dịch Aflatoxin B1 vào bình cầu làm khô với máy cô quay chân không  hòa cặn (2ml CHCl3)  làm khô (trong N2/40 – 50 0 C hoặc chân không/400C)  định lượng Aflatoxin B1. 2.4.4. Kết quả và bàn luận 2.4.4.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B1 trên các mẫu phân tích Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 11 Bảng 2.1. Hàm lƣợng Aflatoxin B1 trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn Nhất STT Tên mẫu Cột IAC Cột Silicagel Hàm lƣợng Aflatoxin B1 (ppb) 1 Bắp không phát hiện không phát hiện 2 Bắp 7 5 3 Bắp 2 không phát hiện 4 Bắp 1 không phát hiện 5 Bắp không phát hiện không phát hiện 6 Đậu phộng 4 2,5 7 Đậu phộng 1 không phát hiện 8 Đậu phộng không phát hiện không phát hiện 9 Đậu phộng 30 25 10 Đậu phộng 2 không phát hiện Nhận xét: theo bảng 3.2, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC phát hiện được 7 mẫu/10 mẫu và cột silicagel phát hiện được 3 mẫu/10 mẫu. Nhìn chung, mức độ nhiễm trên bắp và đậu phộng ≤ 10ppb. Như vậy, độ nhạy của cột IAC cao hơn so với cột silicagel. 2.4.4.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 12 Bảng 2.2. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B1 của cột IAC và Silicagel Mẫu Tổng số mẫu Cột IAC Cột Silicagel Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm (%) Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm (%) Khách hàng 16 3 18,75 2 12,50 Mua chợ 10 7 70,0 3 30,0 Ủ ẩm 4 4 100 4 100 Tổng 30 14 46,67 9 30,0 Nhận xét: theo bảng 3.3, cột có IAC độ nhạy phát hiện tốt hơn cột Silicagel 2.4.5. Kết luận và khuyến nghị Kết luận: Trong tổng số 34 mẫu thu nhận và phân tích tại phòng Sinh hóa, Công ty FCC có 30,77% mẫu nhiễm Aflatoxin B1 với mức độ nhiễm ≤ 20ppb và có 10 mẫu nhiễm với mức độ < 50ppb. Độ nhạy phát hiện Aflatoxin B1 của cột IAC cao hơn so với cột Silicagel. Trong 30 mẫu, cột IAC phát hiện 14 mẫu (chiếm 46,67%) và cột silicagel phát hiện được 9 mẫu (chiếm 30%). Cột silicagel không phát hiện được mẫu nhiễm Aflatoxin B1 dưới hàm lượng 2ppb. Khuyến nghị: Với phương pháp đơn giản, ít tốn kém và phổ phát hiện nhạy và rộng nên phương pháp dùng cột IAC để phát hiện Aflatoxin B1 trong các sản phẩm và nguyên liệu có dầu là phương pháp tối ưu hiện nay. Hi vọng phương pháp này sớm được áp dụng rộng đặc biệt tại các chợ, các nguồn thu mua nguyên liệu. Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: ThS Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 13 Phương pháp này chỉ thử nghiệm một số mẫu giới hạn, đề tài này cần được nghiêu cứu thêm các nội dung sau:  Khảo sát thêm một số mẫu thuộc các nguồn nguyên liệu khác nhau  Khảo sát thêm một số khu vực khác nhau  Khảo sát thêm một số mẫu trong các thời điểm khác nhau. Chương 2. Phân tích aflatoxin B1 GVHD: Ths Nguyễn Thanh Nam Phân tích thực phẩm Trang 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt (tham khảo chỉnh) [1]. Huỳnh Minh Duy, Nguyễn Văn Phú, Xác định hàm lượng độc tố Aflatoxin B1 trong bắp và đậu phộng bằng phương pháp sắc ký bản mỏng, Khoa công nghệ sau thu hoạch-Đại học Nông lâm TP.HCM, 2010 Tài liệu internet [2]. 20120522042524660.chn. [3].