Phát hiện white spotsyndrome virus (WSSV) trong mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ (Penaeus Monodon)

mẫu thức ăn tại Bạc Liêu……………25 4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau……………..27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………28 5.1 Kết luận……………………………………………………………...……..28 5.2 Đề xuất……………………………………………………………………..28 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………..29 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi của Kimura et al. 1996 Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi của gen nội chuẩn (Csiro, 2008) Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 1 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước 2 Bảng 4.1 Kết quả về các loại thức ăn tươi sống được sử dụng trong các trại sản xuất tôm sú giống tại Bạc Liêu và Cà Mau Bảng phụ lục A: Câu hỏi điều tra thông tin trại giống Bảng B.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong qui trình PCR của Kimura et al (1996) được tối ưu bởi Trần Thị Phương Trang (2009). Bảng C.1 Dung dịch cố định Davidson/AFA Bảng C.2 Dung dịch nhuộm Haematoxylin Bảng C.3 Dung dịch Eosin/Phloxine PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Các mẫu ốc thu được từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu và Cà Mau Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực và tôm tít Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trong các trại sản xuất giống tại Bạc Liêu Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu Hình 4.5 Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000 Hình 4.6 Tế bào liên kết dạ dày của ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X) Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy của ốc mượn hồn (H&E, 40X) Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các mẫu thu từ Bạc Liêu vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 PHẦN I GIỚI THIỆU Nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam nói chung và Đồng Bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh, là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Trong đó cá tra, cá ba sa và tôm sú là một trong những đối tượng nuôi chính và chiếm ưu thế trong ngành nuôi thủy sản của cả nước. Tuy nhiên trong những năm qua cùng với sự phát triển quá ồ ạt, tự phát, thiếu quy hoạch nhất là sự thiếu nhận thức đúng về môi trường và dịch bệnh của người dân nên tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Đây là nguyên nhân chính làm cho nghề nuôi trồng thủy sản không ổn định và thiếu bền vững. Có nhiều bệnh gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm nói chung và cho tôm sú nói riêng được biết đến như bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus-YHV), bệnh còi (Monodon Baculovirus- MBV)... đặc biệt là bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus-WSSV) là một bệnh rất nguy hiểm do gây tỉ lệ chết cao, lây lan nhanh và đặc biệt phổ loài cảm nhiễm rộng. Tất cả các loài tôm he đều có thể bị cảm nhiễm loại virut này, các loài cua, còng trong ao nuôi hay thậm chí ấu trùng của côn trùng thủy sinh cũng có thể mang mầm bệnh và là nguồn lây bệnh nguy hiểm. Do vậy việc nghiên cứu về phổ loài cảm nhiễm nhằm giúp kiểm soát và khống chế bệnh này là rất cần thiết khi mà công tác chữa trị hầu như không mang lại hiệu quả. Vì vậy đề tài “Phát hiện white spot syndrome virus (WSSV) trong mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu về khả năng nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống dùng trong các trại sản xuất giống tôm sú ở khu vực Cà Mau và Bạc Liêu. Nội dung của đề tài - Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tươi sống. - Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau. - Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có 2 khu vực nuôi tôm lớn bao gồm: các nước Châu Mỹ La Tinh khu vực Đông Bán Cầu - gồm các nước Nam và Đông Nam Á. Trong đó, Đông Nam Á được xem là nơi đứng đầu thế giới về nuôi trồng và xuất khẩu tôm biển, chiếm khoảng 80 % sản lượng tôm nuôi trên thế giới, gồm các nước như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Nhật Bản, Đài Loan,Việt Nam... (trích dẫn bởi Lý Ngọc Hà, 2008). Theo FAO (2006), châu Á có 9 trong tổng số 10 quốc gia đứng đầu về nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi tôm thế giới là sự bùng phát và sự tàn phá của dịch bệnh. Năm 1988, Đài Loan đã bị thiệt hại nặng nề, tiếp đó là Indonesia năm 1992, Trung Quốc năm 1993, Ấn Độ năm 1994, Thái Lan 1997 và Ecuado năm 1999, Mehico năm 1999-2000, Pháp và Iran năm 2002, Brazil 2005 (C M Escobedo-Bonilla et al. 2008). 2.2 Ở Việt Nam Nghề nuôi tôm ở Việt Nam bùng phát vào những năm đầu của thập niên 90 khi Chính phủ ban hành Nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang nuôi trồng thuỷ sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm 2003. Chỉ trong vòng 1 năm sau khi ban hành Nghị quyết 09, đã có 235.000 ha gồm 232.000 ha ruộng lúa, 1.900 ha ruộng muối và 1.200 ha diện tích đất hoang hoá ngập mặn được chuyển đổi thành ao nuôi tôm. Cho đến nay, diện tích nuôi tôm ở Việt Nam vẫn tiếp tục tăng, tuy nhiên tốc độ đã có phần chững lại ( &news-ID=6471106). Tổng kim ngạch xuất khẩu toàn ngành tính đến ngày 14/11/2008 đã chạm mức 4 tỉ USD. Trong mười tháng đầu năm 2008, xuất khẩu cả nước đạt 1.054.600 tấn trị giá 3,828 tỉ USD tăng 39,4 % về lượng và 24,4 % về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái (tạp chí thủy sản Việt Nam, 2009). Trong khoảng năm 1993-1994, bệnh đốm trắng đã được ghi nhận ở Việt Nam, đặc biệt là từ tháng 3 năm 1993 bệnh đã làm thiệt hại cho nghề nuôi tôm ở hầu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 hết các tỉnh ĐBSCL (trích dẫn bởi Nguyễn Trường Quang, 2004). Trong những năm gần đây, bệnh đốm trắng xuất hiện thường xuyên ở các khu vực nuôi tôm ven biển Việt Nam. Hầu hết các ao bị nhiễm đốm trắng sẽ gây chết hàng loạt và tổn thất lớn. Tính đến tháng 5 năm 2004, tổng diện tích hồ tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng ở miền trung lên đến 10.272 ha, nặng nhất là Thừa Thiên Huế (hơn 823/2.700 ha), kế đó là Quảng Nam (60/2.300 ha), ở Quảng Ngãi (139/4.000 ha) và Bình Định (250/1.500 ha) ( =134 3). Báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành đã cho biết: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha tôm nuôi bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Các bệnh xảy ra cũng tương tự, chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi như Sóc Trăng, và các tỉnh nam sông Hậu khác ( khuyennongvn.gov.vn/g-ttdh/ca-mau-xuat-hien-tinh-trang-tom-the-chan-trang- nhiem-benh-va-chet/view). Theo báo cáo năm 2008 của ngành nông nghiệp các tỉnh, dịch bệnh đã xảy ra trên 120.000 ha, trong đó Cà Mau 58.000 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha…( .jsp?menuId=455&articleId=2243.) 2.3 Sơ lược về bệnh đốm trắng 2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý Dấu hiệu lâm sàng khi tôm nhiễm WSSV là xuất hiện những đốm trắng dưới vỏ, và cũng có trường hợp chuyển sang màu đỏ khi tôm gần chết (Hình 2.1). Tôm nhiễm WSSV xuất hiện đốm trắng có đường kính từ 0.5 – 2 mm, đôi khi kèm theo hiện tượng đỏ thân. Tôm yếu, bỏ ăn, dạt bờ, thường xuất hiện ở thời điểm 1 – 2 tháng sau khi nuôi. Tỉ lệ chết cao và nhanh, trong vòng 3 – 10 ngày tôm chết hầu hết trong ao nuôi (100 %). Ngoài ra, khi môi trường nuôi xấu bệnh sẽ dễ xuất hiện hơn (trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2006). Cơ quan đầu tiên và cũng là cơ quan đích mà WSSV tấn công là lớp biểu mô, bao gồm: biểu mô dưới vỏ, biểu mô dạ dày và biểu mô mang. Biểu hiện vi thể khi tôm nhiễm WSSV là sự hoại tử của các tế bào biểu mô (Lightner, 1996). Hình thức hoại tử của các tế PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 bào biểu mô là tạo thể vùi trong nhân phì đại. Thể vùi WSSV bắt màu hồng của Eosin và cả màu tím của Haematoxylin, ở giai đoạn đầu thể vùi bắt màu tím của Haematoxylin và có vùng sáng xung quanh nhưng dần về sau, khi chuyển sang tế bào Cowdry type A thì chúng sẽ bắt màu hồng của Eosin. Theo Lightner 1996, thể vùi là dấu hiệu bệnh lý đặc trưng dùng trong việc chẩn đoán bệnh đốm trắng. Khi xâm nhập vào cơ thể tôm, WSSV tạo các thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày, biểu bì dưới vỏ, cơ quan lymphoid, tim, tuyến râu (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). A B Hình 2.1 Dầu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng (Bùi Quang Tề, 2006) A. Nhân tế bào biểu bì dạ dày tôm bệnh trương to, có thể vùi WSSV. B. Dấu hiệu bên ngoài của bệnh đốm trắng 2.3.2 Phổ loài cảm nhiễm: WSSV thường gây bệnh trên tôm giống và tôm trưởng thành ở các khu vực nuôi tôm thâm canh và quảng canh. Là loài virút gây tỉ lệ chết cao và có phổ loài cảm nhiễm rộng, trên 40 loài động vật giáp xác tự nhiên, có độc lực với hầu hết các loài tôm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Từ khi xuất hiện (năm 1992) WSSV đã là mối đe dọa lớn cho nghề nuôi tôm thế giới. Tác nhân này đã lây lan cho các loài tôm nuôi chủ lực ở các nông trại và hầu hết các giáp xác mười chân. Cho đến nay có: (i) 18 loài tôm he nuôi và hoang dã bị nhiễm WSSV (Fennero- penaeus chinensis, F. indicus, F. mergui- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 ensis, Litopenaeus setiferus, L. Sty- liro- stris, Marsupenaeus japonicus, Metapenaeus ensis, Penaeus monodon, P. penicillatus, Parapenaeopsis stylifera, Solenocera indica, Trachypenaeus cur- virostris...) (Wongteerasupaya et al. 1996; Durand et al 1997; Lu et al. 1997; Chou et al 1998, Lightner et al 1998; Park et al. 1998; (ii) có 8 loài tôm mang bị nhiễm WSSV (Alpheus sp, Callianassa sp, Exopala-emon orientalis...) (Hameed et al. 2000; Shi et al. 2000; Pramod-Kiran et al. 2002); (iii) 7 loài tôm hùm nhiễm WSSV (Panulirus homarus, P. longipes, P. ornatus...) (Chang et al. 1998; Rajen-dran et al. 1999); (iv) 7 loài tôm nước ngọt nhiễm WSSV (Astacus astacus, A. Leptodactylus, Cherax destructor...) (Wang et al. 1998; Corbel et al. 2001; Jiravanichpaisal et al. 2001; Edgerton 2004; Jirava nichpaisal et al. 2004) (trích dẫn bởi C M Escobedo_Bonilla et al (2008)). Số lượng các loài cua bị nhiễm loài virut này là rất lớn, khoảng 38 loài như: Atergatis integerrimus, Calappa philarigus, Callinectes lophos, Cancer pagurus Carcinus maenas, Charybdis annula- ta...(Lo et al. 1996; Kanchanaphum et al. 1998; Kou et al. 1998; Hameed et al. 2003 trích dẫn bởi C M Escobedo_Bonilla et al (2008)). Ngoài ra còn có: (i) 6 loài giáp xác không thuộc bộ mười chân cũng được phát hiện nhiễm WSSV: Sergestoidea, Acetes sp, Cirripedia Balanus sp…(Supamattaya et al. 1998; Otta et al.1999; Hossain et al. 2001); (ii) các loài thuộc ngành hàm tơ và luân trùng cũng có thể nhiễm như chaetognata và Rotifera (Yan, Dong, Huang et al. 2004; Ramirez-Douriet et al. 2005; Yan, Dong, Huang & Zhang 2007); cả nhóm giun nhiều tơ như Marphysa sp (Supak et al. 2005; Vijayan et al. 2005) hay một số loài côn trùng thủy sinh như Coleoptera Ephydridae (Lo et al. 1996b, Flegel 1997; Ramirez-Douriet et al. 2005) (trích dẫn bởi C M Escobedo_Bonilla et al (2008)) cũng được xác định là nhiễm WSSV. Trong số đó có nhiều loài bị nhiễm mãn tính và có thể nhiễm trong điều kiện gây cảm nhiễm một số khác thì có thể bị nhiễm trong tự nhiên. Nhiều loài mang virut đốm trắng với tư cách như là một tác nhân cơ học ví dụ như trong trường hợp của giun nhiều tơ (C M Escobedo_Bonilla et al, 2008). 2.3.3 Phương thức lan truyền Bệnh đốm trắng lây truyền qua đường nằm ngang. Virút lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm. Hiện tượng ăn lẫn nhau dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn trong ao có tôm bị bệnh. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thức ăn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 thừa rơi vào ao nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Bệnh đốm trắng không có khả năng lây truyền qua đường thẳng đứng vì các noãn bào (trứng) phát hiện chúng nhiễm virus đốm trắng thì chúng không thành thục được. Nhưng trong quá trình đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virút đốm trắng từ trong buồng trứng của chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virút ngay từ giai đoạn sớm (Bùi Quang Tề, 2006). 2.3.4 Phương pháp chẩn đoán – phát hiện bệnh Với những thiệt hại đáng kể do virút gây ra đã có không ít nhà khoa học nghiên cứu về tác nhân gây bệnh này với nhiều phương pháp từ truyền thống đến hiện đại, có thể chia thành các mức độ sau: - Dự chuẩn Quan sát chung: bệnh đốm trắng có thể được biểu hiện trước vài ngày với dấu hiệu là ngừng ăn, tôm sắp chết lờ đờ gần bờ, xuất hiện những đốm trắng dưới vỏ hoặc thân tôm thường biến đỏ. Có thể dùng phương pháp làm tiêu bản ép nhanh để chẩn đoán bệnh. Nhưng đây không phải là những dấu hiệu đặc trưng chỉ có ở bệnh do WSSV gây ra nên việc kiểm khẳng định bằng những phương pháp khác là rất cần thiết (trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). - Kiểm khẳng định Việc khẳng định nhiễm WSSV có thể được tiến hành bằng phương pháp PCR (bước đơn hoặc Nested PCR), kỹ thuật lai tại chổ, lai Western, kính hiển vi điện tử (TEM) hay phương pháp mô học hoặc có thể kết hợp nhiều phương pháp (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)(C M Escobedo-Bonilla, 2008). 2.3.5 Cách phòng bệnh Theo Bùi Quang Tề (2006), cách phòng bệnh đốm trắng tốt nhất là chọn tôm bố mẹ có chất lượng tốt, không vận chuyển tôm với mật độ cao, không nên dùng thức ăn tươi sống, nguồn nước nuôi và nước thải phải qua xử lý, ngăn chặn giáp xác vào ao...bên cạnh đó việc cải tạo kỹ ao nuôi và tránh gây sốc, quản lý môi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 7 trường nuôi cũng rất cần thiết và quan trọng trong quá trình nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Nghiên cứu khả năng phòng bệnh đốm trắng cho tôm thông qua phương pháp cho ăn vacxin được tạo ra từ protein vỏ của WSSV cũng đã được thử nghiệm. Cụ thể, tôm sú (Penaeus monodon) được cho ăn thức ăn viên áo bên ngoài 1 lớp vi khuẩn không hoạt động biểu hiện 2 loại protein vỏ của WSSV là VP19 và VP28. Vacxin chứa VP28 cho thấy tỉ lệ chết của tôm thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với lô đối chứng (vi khuẩn chỉ chứa vector rỗng). Còn thông qua phương pháp ngâm thì tỉ lệ sống 61 %. Trong hiện tại, động vật không xương sống không có hệ thống đáp ứng miễn dịch nhưng kết quả này cho thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khả năng bảo vệ có thể được tạo ra ở Penaeus monodon kháng lại với WSSV (Witteveldt et al. 2004). 2.3.6 Một số các nghiên cứu phát hiện WSSV Lo et al (1999) đã nghiên cứu mối quan hệ của virut gây bệnh đốm trắng ở những vùng địa lý khác nhau và nhiều vật chủ khác nhau gồm: Trung Quốc (P. Chinesis), Ấn Độ (P.monodon), Thái Lan (P.monodon), Mỹ (Orconectes punc- timanus), Thái Lan (P.vannamei) gây nhiễm thực nghiệm, Nam California (P. vannamei), Texas (P. Vannamei). Sử dụng phương pháp lai tại chỗ, PCR và phân loại bằng enzyme để tiến hành kiểm tra thì thấy những mẫu nhiễm virut đốm trắng từ những vùng địa lý khác nhau có quan hệ gần gũi với nhau trừ những mẫu được thu ở Texas. Theo Lo et al (1996) thì virut đốm trắng được tìm thấy trên các loài tôm khác nhau ở các nước khác nhau của châu Á. Việc phát hiện WSSV có thể được thực hiện bằng phản ứng PCR một bước hoặc PCR 2 bước. Trong thí nghiệm, họ thử đưa vào phản ứng PCR hai bước với đoạn mồi chuyên biệt để thử độ nhạy trong việc phát hiện WSSV và chất lượng của đoạn ADN chiết tách được kiểm tra bằng 2 đoạn mồi của 18S rRNA của họ mười chân. Khi sử dụng hai phương pháp này họ đã thành công trong việc phát hiện WSSV trên tôm nuôi, tôm đánh bắt từ tự nhiên, các loài cua và cả các một số loài động vật chân đốt khác. Với mỗi nhóm đối tượng trên họ có phương pháp phát hiện WSSV khác nhau. Đối với các loài trong nhóm mười chân đươc nuôi như tôm sú (P. monodon), tôm he Nhật (P. japonicus), tôm thẻ đuôi đỏ (P. penicillatus), tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và cua bùn có dấu hiệu đốm trắng được thu từ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 8 những vùng địa lý khác nhau với những giai đoạn khác nhau, vào những mùa khác nhau ở Đài Loan. Mẫu thu được trữ trong nitơ lỏng -70 0C cho đến khi dùng kỹ thuật PCR để kiểm tra. ADN của chúng được chiết tách theo qui trình của Lo et al (1996) đã được tối ưu sau một số nghiên cứu. Kết quả khi phân tích những mẫu tôm lớn đánh bắt từ tự nhiên bằng phương pháp PCR bước 2 cho thấy tỉ lệ nhiễm với WSSV của tôm sú (P. monodon) là 50/66 mẫu; tôm he Nhật (P. japonicus) là 14/23 mẫu; tôm rằn (P. semi- sulcatus) là 2/32 mẫu và tôm thẻ đuôi đỏ (P. penicillatus) là 3/27 mẫu. Kết quả nghiên cứu mô học cũng tìm thấy những thể vùi nội nhân WSSV tồn tại trong tế bào của mang, dạ dày, cơ quan lymphoid và chân bơi. Riêng tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii thì cũng cho kết quả dương tính với WSSV ở PCR 2 bước nhưng nhóm tác giả không đề cập đến tỉ lệ nhiễm. Các mẫu tôm dại, cua dại, côn trùng thủy sinh và nhóm giáp xác mười chân thu từ nông trại tôm đang bùng phát bệnh đốm trắng cũng cho kết quả dương tính với WSSV. Nhộng của côn trùng thủy sinh (Ephydridae) nhiễm với tỉ lệ là 8/10 mẫu, họ mười chân là 4/6 mẫu, tôm mang (Palaemonidae) là 12/15 mẫu và mẫu cua dại (Helice tridens) là 5/11 mẫu. Nghiên cứu mô học không được thực hiện trên nhóm đối tượng này cũng cho thấy các thể vùi nội nhân của các cơ quan có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì. S. K. Otta et al. 1999 đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi và hoang dại ở Ấn Độ. Trong nghiên cứu này thì tôm hậu ấu trùng và tôm bố mẹ được kiểm tra với hai đoạn mồi là WSSV PJ dành cho tôm he Nhật (P. japonicus) và WSSV PM dành cho tôm sú (P. monodon). Kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp nested PCR trên các mẫu tôm hậu ấu trùng là 28/58 mẫu: (i) Trên nhóm có dấu hiệu bên ngoài khỏe như: tôm giống là 3/3 mẫu, các mẫu tôm lứa đang nuôi thì không bị nhiễm (0/2 mẫu) trong khi mẫu tôm hoang dại từ tự nhiên nhiễm 1/1 mẫu; các mẫu tôm mẹ là 3/3 mẫu và mẫu artemia là 1/1 mẫu, mẫu cua (Scylla serrata) nhiễm 3/20 mẫu, mẫu cua Sesarma oceanica nhiễm 1/10 mẫu, Charybdis lucifera là 2/5 mẫu và Matuta planipes là 2/2 mẫu, còn lại các mẫu cua có dấu hiệu bình thường như Chary- bdis cruciata, Portunus sanguinolentus, Doclea gracilipes, Macrophthalmus sulcatus, Pseudograpsus intermedius thì cho kết quả âm tính với số lượng mẫu kiểm tra khác nhau (ii) Trên nhóm có dấu hiệu bệnh như: tôm giống có dấu hiệu đốm trắng nhiễm 1/1 mẫu, mẫu tôm mẹ là 7/7 mẫu, các mẫu cua (Scylla serrata) thì nhiễm với tỉ lệ 1/1 mẫu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 9 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện Thời gian nghiên cứu: tháng 04-07/2009 Địa điểm: Phòng thí nghiệm – Bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản - Khoa Thủy Sản trường ĐHCT 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Mẫu vật Mẫu thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn -147 mẫu, mực - 5 mẫu, tôm tít -3 mẫu) được thu từ các trại sản xuất giống ở Bạc Liêu (15 trại) và Cà Mau (18 trại). 3.2.2 Dụng cụ hóa chất Dùng trong kỹ thuật PCR Dụng cụ: que nghiền, đầu col (xanh, vàng, trắng), máy Vortex, máy ly tâm, máy ủ, máy sấy chân không, máy PCR, bộ điện di, thiết bị chụp ảnh gel, tủ lạnh, lò vi sóng, cân điện tử, micropipette các loại, ống eppendorf chuyên dùng trong PCR (1,5 ml; 0,5 ml; 0,2 ml), bộ kit IQ2000-WSSV… Hoá chất: Nitơ lỏng, nước đá, dung dịch đệm TAE 0.5X, agarose, Ethidium Bromide, nước cất, ethanol, chloroform, nước Javel… Dùng trong nghiên cứu mô Dụng cụ: bộ tiểu phẩu, kính hiển vi, lame, lamelle, lọ đựng mẫu, khay nhựa, máy đúc khối, máy cắt mẫu, máy chụp ảnh, máy xử lý… Hoá chất: Cồn tuyệt đối, Davidson’s AFA, nước cất, parafin, sáp ong, keo Enterlan, Xylen, dung dịch 2% Potassium, dung dịch 1% acid-alcohol, thuốc nhuộm Haematoxylin và Eosin… PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp chiết tách ADN (bộ chiết tách CTAB-DTAB của công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan) Chuẩn bị mẫu: cho khoảng 20mg mẫu vào ống eppendorf (1,5 ml) chứa 600µl dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền tiệt trùng. Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 750C trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 0,7 ml Chloroform, lắc đều 20 giây và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong ở trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 100 µl CTAB Solution và 900 µl nước cất, lắc đều sau đó ủ ở 750 C trong 5 phút. Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trrong 10 phút. Bỏ phần nước trong ở trên, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl Dissolve solution, ủ ở 750C trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong phía trên sang eppendorf mới chứa 300 µl methanol 95%. Lắc đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 µl ethanol 70%, để lắng xuống. Làm khô ADN và hòa tan trong TE buffer. Bảo quản ADN ly trích tạm thời trong ngăn đá của tủ lạnh sau đó trữ ở -800C . PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 3.3.2 Phương pháp PCR phát hiện WSSV (Kimura et al. 1996) Qui trình PCR phát hiện WSSV được thực hiện với các đoạn mồi do Kimura et al (1996) thiết kế và được Trần Thị Phương Trang tối ưu (2009). Đoạn mồi có trình tự như sau: Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi của Kimura et al. 1996 Tên mồi Trình tự P1 5’-ATC-ATG-GCT-GCT-TCA-CAG-AC-3’ P2 5’-CGC-TGG-AGA-GGA-CAA-GAC-AT-3’ P3 5’-TCT-TCA-TCAGAT-GCT-ACT-GC-3’ P4 5’-TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3’ Việc kiểm tra chất lương ADN ly trích được thực hiện dựa vào đoạn mồi đặc hiệu cho giáp xác mười chân có trình tự như sau: Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi của gen nội chuẩn (Csiro, 2008) Tên mồi Trình tự 20a2 5’-ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT-3’ 20s9 5’-GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A-3’ Phản ứng PCR được thực hiện qua hai bước với thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng như sau: PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 PCR bước 1: thể tích phản ứng 20 µl Thành phần hóa chất qui trình PCR phát hiện WSSV như sau: Hóa chất Nồng độ PCR buffer (5X) 1 X MgCl2 (25mM) 1,5 mM dNTP (10nm) 200 µM P1 (mồi xuôi) 20 pmol P2 (mồi ngược) 20 pmol Taq DNA polymerase (5U) 1,5 U 20a2 10 pmol 20s9 10 pmol Nước cất tiệt trùng ADN chiết tách Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 1 Chu kỳ nhiệt của phản ứng 01 chu kỳ: 940C trong 5 phút Sau đó 30 chu kỳ 940C trong 30 giây 550C trong 30 giây 72 0C trong 30 giây 01 chu kỳ:72 0C trong 5 phút PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 PCR bước 2: thể tích phản ứng là 20 µl, sử dụng sản phẩm của PCR bước 1 là 1 µl, và thành phần hóa chất giống như bước một nhưng đoạn mồi là P3 và P4 và nồng độ MgCl2 cũng thay đổi nhưng với điều kiện phản ứng như bước 1. Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước 2 Hóa chất Nồng độ PCR buffer (5X) 1 X MgCl2 (25mM) 1 mM dNTP (10 nm) 200 µM P3 (mồi xuôi) 20 pmol P4 (mồi ngược) 20 pmol Taq DNA polymerase (5U) 1,5 U 20a2 10 pmol 20s9 10 pmol Nước cất tiệt trùng Sản phẩm bước 1 Điện di Chuẩn bị bản thạch (gel): đun nóng dung dịch đệm TAE 0.5X với agarose 1,5% (1,5 g/100ml) cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội (500C) và nhuộm gel với 2 µl Ethidium Bromide cho bản gel nhỏ (40 ml-12 hay 15 giếng) hoặc 4 µl cho bảng gel lớn (120 ml- 40 giếng), lắc đều hòa tan dung dịch, đổ dung dịch agarose từ từ vào khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược khoảng 0,3-0,5 cm, bề dày của gel không quá 0,8 cm. Sau đó cẩn thận cho mẫu, thang ADN, đối chứng âm, đối chứng dương vào trong từng giếng. Sau đó điện di với dóng điện 90 V trong khoảng thời gian 45 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 Đọc kết quả: kết quả điện di được ghi nhận với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart). Căn cứ vào thang ADN 1 kb plus (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR. Những mẫu nhiễm WSSV xuất hiện vạch tương ứng 570 bp (base pair – bp). Mẫu chiết tách tốt sẽ xuất hiện vạch nội chuẩn tại vị trí 240 bp. 3.3.3 Phương pháp PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000–WSSV (công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan) - Chuẩn bị các chất phản ứng Bước 1: 8µl/phản ứng, bao gồm các chất - First PCR Premix 7,5 µl - IQzyme ADN polymerase 2U/µl 0,5 µl Bước 2: 15µl/phản ứng, bao gồm các chất - Nested PCR Premix 14 µl - IQzyme ADN polymerase 2U/µl 01 µl - Điều kiện phản ứng PCR bước 1: 940C trong 2 phút, 940C trong 20 giây, 620C trong 20 giây, 720C trong 30 giây. Lặp chu kỳ trên 15 lần. Sau đó, ở 720C trong 30 giây, 200C trong 30 giây. PCR bước 2: 940C trong 20 giây, 620C trong 20 giây, 720C trong 30 giây. Lặp chu kỳ trên 30 lần. Sau đó, ở 720C trong 30 giây, 200C trong 30 giây. - Điện di: được thực hiện theo các bước đã được mô tả ở phần điện di mục 3.3.2. - Đọc kết quả: Những mẫu dương tính theo bộ kit IQ2000 – WSSV hiện vạch tương ứng 296 bp và/hoặc 550 bp.Vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 3.3.4 Phương pháp mô học Phương pháp thực hiện theo qui trình đang được áp dụng tại phòng thí nghiệm mô – Khoa Thuỷ Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Mẫu sau khi được cố định, tiến hành: Cắt tỉa định hướng: cắt các phần phụ không cần thiết sau đó cho vào khuôn nhựa xử lý mẫu. Xử lý mẫu: qui trình xử lý mẫu mô (>= 5mm) được cài đặt trong máy xử lý mô (Program 4) theo các bước: - Cồn 80o trong 60 phút - Cồn 95o trong 60 phút - Cồn 95o trong 60 phút - Cồn 100o trong 1giờ 30 phút - Cồn 100o trong 1giờ 30 phút - Cồn 100o trong 1giờ 30 phút - Xylen trong 2 giờ - Xylen trong 2giờ - Xylen trong 2giờ - Paraffin + xylen (1:1) trong 2 giờ 30 phút - Paraffin + sáp ong (1:1) trong 2 giờ - Paraffin + sáp ong (7:3) trong 2giờ Đúc khối: sau khi xử lý, chuyển khuôn nhựa chứa mẫu sang máy đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 65oC. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho paraffin nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định. Khi mẫu mô được tẩm vào trong PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 paraffin, đặt khuôn nhựa có ký hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách paraffin khỏi khuôn. Cắt lát mẫu mô: trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày của lát cắt. Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12 mm. Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt bằng 4 mm. Dán lát cắt vào phiến kính: Chuẩn bị một cốc nước ấm (40-50oC), lát cắt sẽ được thả nổi trong cốc này. Sau khi lát cắt giãn thẳng trong cốc nước ấm, nhúng phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt. Cẩn thận đính một đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính ra khỏi nước, lát cắt sẽ được dán vào phiến kính. Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bản bằng cách sấy khô trên bàn sấy ở nhiệt độ 45-60oC qua đêm (hoặc ít nhất 4 giờ) để lát cắt thẳng ra và khô. Nhuộm màu: Tiêu bản được nhuộm màu Haematoxylin và Eosin (H&E) gồm các bước như sau: - Xylen trong 5 phút (lặp lại 3 lần) - Cồn 100o trong 5 phút (lặp lại 2 lần) - Cồn 70 trong 2 phút - Haematoxylin trong 1 phút - 1% acid-alcohol 10 giây (nhúng 1 lần) - Rửa nước trong 1 phút - Potassium trong 5 phút - Eosin trong 2 phút - Cồn 95o trong 2 phút - Cồn 100o trong 2 phút - Cồn 100o trong 2 phút PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 - Xylen trong 5 phút (lặp lại 2 lần) Dán mẫu: Nhỏ một giọt keo Enterlan lên trên lame, dán lamelle lên trên ngay vùng có lát cắt mô. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào lát cắt mô. Đọc kết quả mô: đọc kết quả mô dưới kính hiển vi quang học. Những tế bào có nhân phì đại bắt màu hồng đỏ đều, có tính kiềm là thể vùi của WSSV. 3.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý thống kê Các giá trị thu được tính giá trị trung bình, dùng phần mềm excel và xử lý và vẽ biểu đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình sử dụng thức ăn tươi sống nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại hai tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau Hiện nay tình hình sử dụng thức ăn tươi sống trong các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu là rất đa dạng với nhiều loại thức ăn tươi sống khác nhau như mực, ốc mượn hồn, tôm tít, thịt bò…Thông tin ghi nhận từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu (15 trại) và Cà Mau (18 trại) về các loại thức ăn tươi sống đang được sử dụng được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả về các loại thức ăn tươi sống được sử dụng trong các trại sản xuất tôm sú giống tại Bạc Liêu và Cà Mau Loại thức ăn sử dụng Cà Mau Bạc Liêu Ốc mượn hồn 18/18 (trại) 14/15 (trại) Mực 0 9/15 Tôm tít 0 1/15 Trong các trại thu tại Bạc Liêu thì 9/15 trại là có sử dụng mực cho tôm ăn trong quá trình nuôi vỗ tôm sú bố mẹ. Ngoài chín trại này, một số trại có sử dụng mực nhưng không thu được tại thời điểm thu mẫu. Loại thức ăn được sử dụng nhiều nhất là ốc mượn hồn 14/15 trại, chỉ có duy nhất một trại ở Bạc Liêu là không sử dụng vì nghi ngờ khả năng mang WSSV vào hệ thống sản xuất. Tôm tít chỉ có duy nhất một trại ở Bạc Liêu sử dụng, đây là trại sử dụng nhiều loại thức ăn có nguồn gốc từ thủy sản (ốc mượn hồn, mực, tôm tít). Trong khi đó các trại ở Cà Mau thì hoàn toàn chỉ sử dụng một loại thức ăn có nguồn gốc từ thủy sản là ốc mượn hồn (18/18 trại). Các loại thức ăn tươi sống này được mua từ những vựa thức ăn ở chợ và những vựa này thu mua từ nhiều nơi khác nhau cả trong và ngoài tỉnh. Dù số lượng loại thức ăn có khác nhau nhưng các trại đều có cùng cách xử lý và cách cho ăn. Ốc mượn hồn thì trữ nơi khô thoáng, đập và rửa sạch bằng nước máy trước khi cho ăn. Mực thì cắt nhỏ, rửa sạch và trữ lạnh để cho ăn dần. Riêng tôm tít thì trữ trong chậu nước và rửa sạch trước khi cho ăn. Tất cả PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 đều cho ăn theo nhu cầu của tôm và cho ăn xoay vòng với các loại thức ăn khác (trừ các trại tại Cà Mau). 4.2 Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn 4.2.1 Sự nhiễm WSSV ở mẫu ốc mượn hồn Ốc mượn hồn là mẫu thu được nhiều nhất tại các điểm thu mẫu, loài ốc này rất đa dạng về hình thái cũng như màu sắc (hình 4.1) và tỉ lệ nhiễm WSSV là rất cao. Hình 4.1 Các mẫu ốc thu từ các trại sản xuất giống ở Bạc Liêu và Cà Mau Sự tồn tại của WSSV trong các mẫu ốc mượn hồn được phát hiện bằng phương pháp PCR 2 bước (Kimura et al. 1996) (hình 4.2). Lo et al. (1996) cũng đã nghiên cứu và phát hiện việc nhiễm WSSV trên các loài giáp xác hoang dã như các loài cua thu trong ao tôm và ngoài tự nhiên. S. K. Otta et al. (1999) cũng đã dùng kỹ thuật PCR phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi và tự nhiên ở Ấn Độ. Nghiên cứu này phát hiện WSSV trên nhiều đối tượng khác nhau (tôm, cua, artemia…), cả trên đối tượng biểu hiện bệnh và không biểu hiện bệnh đốm trắng. Cả hai nghiên cứu trên đều sử dụng phương pháp phát hiện WSSV là kỹ thuật PCR 2 bước. Theo kết quả của Trần Thị Phương Trang (2009), các mẫu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 cua thu ngoài tự nhiên và mẫu ốc mượn hồn thu từ huyện Cái Nước – Cà Mau cũng cho kết quả dương tính với WSSV. Từ đó cho thấy khả năng nhiễm WSSV trong các loài giáp xác hoang dại ở Bạc Liêu và Cà Mau là rất lớn. Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực và tôm tít Giếng M là thang DNA 1kb Giếng 1, 2, 3, 4 là những mẫu ốc mượn hồn dương tính Giếng 5 là mẫu mực dương tính Giếng 6, 7, 8 là những mẫu tôm tít dương tính Giếng 9 là đối chứng dương Giếng 10 là đối chứng âm Hình 4.2 cho thấy, WSSV hiện diện trong các mẫu ốc mượn hồn được phát hiện bằng phương pháp PCR. Trong đó có cả mẫu của Bạc Liêu (giếng 1, 2) và mẫu của Cà Mau (giếng 3,4). Những mẫu này xuất hiện đồng thời hai vạch tương ứng 570bp của WSSV và 240bp là nội chuẩn của họ mười chân. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 4.2.2 Sự nhiễm WSSV ở mẫu mực Bạc Liêu là điểm thu mẫu thức ăn đa dạng nhất có mực, ốc và cả tôm tít. Các mẫu mực được phân tích là phần thân được cắt sợi. Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trong các trại sản xuất giống tại Bạc Liêu Trong các mẫu mực thu về có một mẫu dương tính với phản ứng PCR 2 bước (phương pháp được sử dụng chung cho việc phát hiện WSSV trên ốc và tôm tít). Kết quả báo cáo của Trần Thị Phương Trang (2009) cũng có một mẫu mực dương tính khi sử dụng cùng một qui trình phát hiện như trên. Theo Lo et al. (1996), kết quả phân tích cho thấy nhóm giáp xác được thu từ ao tôm cũng cho kết quả WSSV dương tính với một qui trình PCR khác. Như vậy sự tồn tại của WSSV trong mực là hoàn toàn có khả năng. Hình 4.2 (giếng 5) cho thấy, WSSV hiện diện trong mẫu mực, được phát hiện bằng phương pháp PCR (đây là mẫu mực thu tại một trại sản xuất giống tại Bạc Liêu). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 4.2.3 Sự nhiễm WSSV trên tôm tít Các loài tôm tít cũng là một trong những thức ăn ưa thích của tôm bố mẹ tuy nhiên các trại ít sử dụng loại tôm này vì nghi khả năng nhiễm WSSV của chúng. Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu Cả mẫu tôm tít thu về từ một trại sản xuất giống thuộc khu vực Bạc Liêu thì tất cả đều dương tính với WSSV. Kết quả ở hình 4.2 (giếng 6, 7, 8) cho thấy WSSV hiện diện trong 3 mẫu tôm tít thu được ở Bạc Liêu, được phát hiện với phương pháp PCR 2 bước. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học ở Ấn Độ (Hossain et al. 2000). Với phương pháp PCR 2 bước, nhóm tác giả này đã công bố sự hiện diện của WSSV ở nhiều loài khác nhau (Metapenaeus dobsoni, Parapenaeopsis stylifera, Solenocera indica…) và cả trên tôm tít (Squilla mantis). Bên cạnh đó kết quả nghiên cứu của Lo et al (1996) trên các loài giáp xác hoang dại đánh bắt từ tự nhiên (tôm sú tự nhiên, tôm he Nhật, tôm rằn, tôm thẻ đuôi đỏ) cũng cho kết quả WSSV dương tính ở PCR bước 2. Tuy số lượng mẫu tôm tít được kiểm tra là không nhiều nhưng cũng có thể tin vào khả năng tồn tại của WSSV trong mẫu tôm này. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 4.2.4 Xác định sự nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV-IQ2000 Một số mẫu dương tính ở hai tỉnh Bac Liêu và Cà Mau còn được chọn để kiểm tra với bộ kit WSSV-IQ2000. Kết quả cho thấy các mẫu được kiểm tra đều bị nhiễm WSSV với cường độ nhẹ (hình 4.5). Các mẫu hiện vạch tương ứng 296 bp và xuất hiện cả vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp. Theo nghiên cứu của Chưng Thị Nghiễm (2009) những mẫu cua tạp thu từ ao tôm ở Cà Mau cũng được phát hiện nhiễm WSSV với qui trình của kit WSSV-IQ2000. Hình 4.5 Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000 Giếng M là thang ADN Giếng 1 là mẫu ốc của Cà Mau Giếng 2, 4 là mẫu ốc của Bạc Liêu Giếng 3 là mẫu mực dương tính của Bạc Liêu Kết quả này góp phần khẳng định sự nhiễm WSSV trong các mẫu được nghiên cứu. Tuy sản phẩm PCR khi sử dụng bộ kít WSSV-IQ2000 cho vạch không rõ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 như sử dụng phương pháp của Kimura et al. 1996 nhưng qui trình này có thể đánh giá mức độ nhiễm của mẫu. 4.2.5 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn với phương pháp mô học Kết quả nghiên cứu mô học trên ốc mượn hồn cũng cho dấu hiệu đặc trưng khi nhiễm WSSV. Các tế bào của mô liên kết của cũng xuất hiện các thể vùi WSSV với vùng sáng bao quanh (hình 4.6). Do đây là lần đầu tiên mô ốc mượn hồn được cắt thử theo qui trình của tôm nên hình ảnh còn chưa được đẹp cũng như các cơ quan phát hiện có thể vùi WSSV là không nhiều. Hình 4.6 Tế bào liên kết của ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X) Dấu mũi tên chỉ tế bào có nhân phì đại với thể vùi WSSV. Dấu hiệu này không khác so với dấu hiệu mô học trên tôm của Lightner (1996) và của Lo et al. (1997). Theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) khi xâm nhập vào cơ thể tôm, WSSV tạo các thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày, biểu bì dưới vỏ, cơ quan lymphoid, tim, tuyến râu. Cơ quan tấn công của WSSV trên ốc mượn hồn được phát hiện trong nghiên cứu là tế bào liên kết của dạ dày nhưng chúng không tấn công trên các tế bào của tuyến gan tụy (hình 4.7). Kết quả này cũng cần được tìm hiểu thêm với số lượng mẫu nhiều hơn. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy của ốc mượn hồn (H&E, 40X) Từ kết quả mô học có thể tin rằng WSSV hoàn toàn có khả năng gây ra những biến đổi về mô học ở tế bào liên kết của dạ dày ốc mượn hồn hay các loài ốc này cũng mẫn cảm với WSSV và những tổn thương gây ra cũng tương tự trên tôm. 4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu Ở khu vực Bạc Liêu, ba loại thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn, mực, tôm tít) được thu với số lượng mỗi loại khác nhau. Trong đó 1/5 mẫu mực cho kết quả dương tính với WSSV chiếm tỉ lệ 2,17 % tổng số mẫu được kiểm tra. Trong khi tôm tít kiểm tra 3 mẫu thì tất cả đều dương tính chiếm 6,52 %. Các mẫu chiếm đa số trong đợt kiểm tra là mẫu ốc mượn hồn với tỉ lệ nhiễm WSSV là 45,65 %. Tỉ lệ nhiễm giữa các trại là không giống nhau, có trại thì dương tính cả 5/5 mẫu kiểm tra (2 trại), có trại thì chỉ nhiễm 1 hoặc 2 mẫu (5 trại). Theo Lo et al. (1996), kết quả phân tích PCR của họ mười chân trong nhóm chân đốt hoang dại được thu từ ao tôm thì tỉ lệ nhiễm WSSV là 12,5 %. Cùng với kết quả nghiên cứu của Lo et al (1996) trên các loài giáp xác đánh bắt từ tự nhiên cũng cho kết quả dương tính với WSSVcủa các mẫu cũng khác nhau. Cụ thể là đối với tôm sú tự nhiên thì tỉ lệ nhiễm là 33,78 %, đối với tôm he Nhật là 9,45 %, tôm rằn 1,35 % và tôm thể đuôi đỏ là 2,02 %. Tỉ lệ nhiễm trung bình trên tôm tít là có thể chấp nhận so với các loài tôm được thu từ tự nhiên như PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 trên. Lo et al. 1996 cũng đã nghiên cứu và phát hiện việc nhiễm WSSV trên cua hại mà họ thu được chiếm 15,62 %. Tỉ lệ này là thấp hơn so với tỉ lệ nhiễm của ốc mượn hồn được nghiên cứu nhưng cũng không thể kết luận được vì phương pháp được sử dụng trong các nghiên cứu là khác nhau. Nhưng điều có thể khẳng định ở đây là sự tồn tại của mầm bệnh WSSV trong các mẫu được kiểm tra. Tóm lại, tùy thuộc vào phương pháp và số lượng mẫu thu mà tỉ lệ nhiễm của các mẫu có thể khác nhau. Các mẫu được kiểm tra đa số là ốc mượn hồn và đây cũng là nhóm chiếm tỉ lệ nhiễm cao nhất (hình 4.8). Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các mẫu thu từ Bạc Liêu Phần trăm các mẫu nhiễm WSSV tại Bạc Liêu Mẫu mực 2,17% Mẫu tôm tích 6,52% Mẫu ốc 45,65% Mẫu âm tính 45,66% PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau Ở khu vực Cà Mau, ốc mượn hồn là loại thức ăn duy nhất được sử dụng trong tổng số 18 trại được thu và tỉ lệ nhiễm WSSV là 59,26 % (48/81 mẫu) trong tổng số mẫu được phân tích khi được kiểm tra bằng PCR 2 bước. Tình hình nhiễm WSSV giữa các trại cũng khác nhau, 8 trại nhiễm toàn bộ 5 mẫu kiểm tra, 3 trại chỉ có 1/5 hoặc 2/5 mẫu nhiễm WSSV, 1 trại nhiễm 4/5 mẫu kiểm tra hay hoàn toàn cho kết quả âm tính trên các mẫu kiểm tra (4 trại). Theo S. K. Otta et al. (1999) cũng đã dùng kỉ thuật PCR phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi và tự nhiên ở Ấn Độ. Nghiên cứu được tiến hành trên nhiều đối tượng khác nhau (tôm, cua, artemia…), cả trên đối tượng biểu hiện bệnh và không biểu hiện bệnh đốm trắng. Trên mẫu cua Scylla serrata không có dấu hiệu bệnh, tỉ lệ nhiễm là 15 % (3/20 mẫu cua khỏe), tôm mẹ không có dấu hiệu của WSSV là 3/3 mẫu, tôm mẹ có dấu hiệu của WSSV là 7/7 mẫu, artemia khỏe là 1/1 mẫu. Một số mẫu cua khác được kiểm tra thì cho kết quả âm tính với WSSV. Theo Chu-Fang Lo et al. (1996), đối với các loài côn trùng thủy sinh, họ mười chân, cua tạp, tôm tạp hại có kích thước nhỏ thì kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả trên như sau: nhộng của côn trùng thủy sinh 19,04 %, họ mười chân 9,52 %, tôm tạp 28,57 % và cua tạp là 11,9 % mẫu dương tính với PCR bước 2. Dù các mẫu được thu ngẫu nhiên từ hai tỉnh khác nhau (Bạc Liêu là 15 trại và Cà Mau là 18 trại) nhưng kết quả dương tính với WSSV lại chiếm tỉ lệ gần bằng nhau (Bạc Liêu là 54,34 % và Cà Mau là 59,26 %). Tóm lại, tỉ lệ nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn tươi sống thu từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Cà Mau (59 %) là cao hơn Bạc Liêu (54 %) nhưng thành phần thức ăn có nguồn gốc thủy sản thì ở Bạc Liêu là đa dạng hơn ở Cà Mau. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - WSSV đã được phát hiện trên thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn, mực, tôm tít) sử dụng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại các trại sản xuất tôm sú giống ở khu vực Bạc Liêu và Cà Mau. - Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các loại thức ăn tươi sống ở Bạc Liêu là 54 %. - Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các loại thức ăn tươi sống ở Cà Mau là 59 % . - Phát hiện những thể vùi WSSV trong tế bào của mô liên kết trên ốc mượn hồn khi bị WSSV xâm nhập. 5.2 Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu và phát hiện WSSV trên các mẫu thức ăn tươi sống dùng trong các trại sản xuất giống. - Nghiên cứu và tối ưu qui trình cắt mô trên nhiều đối tượng khác nhau để có thể nghiên cứu sâu hơn về những ảnh hưởng của WSSV ở mức độ tế bào. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học Thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp 2. C M Escobedo-Bonilla, V Alday-Sanz, M Wille, P Sorgeloos, M B Pensaert and H J Nauwynck, 2008. A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus. Journal of Fish Diseases 31: 1-18. 3. CSIRO, 2008. Phương pháp PCR phát hiện ADN của giáp xác mười chân theo OIE, sử dụng mồi của CSIRO. Hội thảo về PCR phát hiện WSSV, Việt Nam, trang 18. 4. Chu- Fang Lo, Jiann-Horng Leu, Ching-Hui Ho, Chau-Huei Chen, Shao-En Peng, You-Tzung Chen, Chih-Ming Chou, Pei Yan Yeh, Chang-Jen Huang, Hsin-Yiu Chou, Chung-Hsiung Wang, Guang-Hsiung Kou, 1996b. Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSSV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms 25: 133-141. 5. Chu-Fang Lo, Ching-Hui Ho, Shao-En Peng, Chau-Huei Chen, Hui-Chen Hsu, Ya-Lin Chiu, Chen-Fang Chang, Kuan-Fu Liu, Mao-Sen Su, Chung- Hsiung Wang, Guang-Hsiung Kou, 1996a. White spot syndrome baculovirus (WSSV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Diseases of Aquatic Organisms 27: 215-225. 6. Chưng Thị Nghiễm, 2009. Ứng dụng phương pháp PCR – Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Luận văn tốt nghiệp đại học. 7. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Bài giảng Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh. Khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ. 8. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình Bệnh học thủy sản. Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, trường Đại học thủy sản Nha Trang. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 9. Franklin Pérez, Filip A.M. Volckaert, Jorge Calderón, 2005. Pathogenicity of white spot syndrome virus on postlarvae and juveniles of Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Aquaculture,205,586-591. 10. 0323ea3/ADD567A73BB5E6B947257508004CF07E?OpenDocument&Start =6.8 11. si=123. Ngày truy cập 01/01/2009. 12. Ngày truy cập 01/01/2009 13. the-chan-trang-nhiem-benh-va-chet/view. Cập nhật ngày 01/01/2009 14. =3436. Ngày truy cập 02/01/2009 15. Ngày truy cập 02/ 01/2009. 16. Jeroen Witteveldt, Carolina C. Cifuentes, Just M. Vlak, and Marie¨lle C. W. van Hulten. Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination, 2004. Journal of Virology, p. 2057–2061 Vol. 78, No. 4 17. Lê Xuân Sinh, 2003. A Bio-economic Model of a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Vietnam. Luận án tiến sĩ Kinh tế nông nghiệp- Đại học Sydney, Australia. 18. Lightner D.V, 1996.A handbook of shrimp patholgy and diagnostic procedures for disease of cultured penaeid shrimp. The world aquaculture society. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 19. Lo. C. F, Ho. C. H, Chen. C. H and Chui. Y. L, 1997. Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSSV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproduction organs. In Dis Aquat Org 30: 53-72. 20. Lê Như Nguyệt, 2004. Ứng dụng và so sánh các phương pháp phát hiện virus đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp đại học 21. Lý Ngọc Hà, 2008. Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 của WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm nuôi tại Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp đại học. 22. Md. Shahadat Hossain, Anirban Chakraborty, Biju Joseph, S.K. Otta, Indrani Karunasagar and Iddya Karunasagar, 2001. Detection of new hosts for white spot syndrome virus of shrimp using nested polymerase chain reaction. Aquaculture 198: 1-11. 23. Nguyễn Văn Hảo,2003. Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại Việt Nam- Viện NXNTTS II 24. Nguyễn Minh Hậu, 2002. Xác định tỉ lệ cảm nhiễm WSSV và MBV trên tôm sú (P. monodon) giống ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt nghiệp đại học. 25. Nguyễn Trường Quang, 2004. Khảo sát tình hình bệnh đốm trắng trên tôm sú (P. monodon) ở tỉnh Sóc Trăng. Luận văn tốt nghiệp đại học. 26. Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003. Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú (P. monodon). Luận văn tốt nghiệp đại học. 27. S.K. Otta, Indrani Karunasagar, Iddya Karunasagar, 2003. Detection of monodon baculovirus and whitespot syndrome virus in apparently healthy Penaeus monodon postlarvae from India by polymerase chain reaction. Aquacuture 220: 59-67. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 28. Syed Musthaq, R. Sudhakaran, V.P. Ishaq Ahmed, G. Blasubramanian, 2006. Variability in the tadem repetitive DNA sequences of white spot syndrome virus (WSSV) genome and suitability of VP28 gene to detect different isolates of WSSV from India, 256, 34-41. 29. Trần Thị Tuyết Hoa, 2006. Bài giảng Bệnh virút trên động vật thuỷ sản. Khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ. 30. Trần Thị Phương Trang, 2009. Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện WSSV trong mẫu tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp đại học. 31. Van Hulten C. W. Marielle, Rob W. Goldbach and Just M. Vlak. (2000). Three functionally diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by gene duplication. Journal of General Virology, 81, 2525- 2529. 32. Wongteerasupaya. C, Pungchai. P, Withyachumnarnkul. B and Boonsaeng. V, 2003. High variation in repetitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand. Dis Aquat org 54: 253-257. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 PHỤ LỤC A BẢNG CÂU HỎI ĐIỀU TRA THÔNG TIN TRẠI GIỐNG Số tt………. 1. Tên trại……………………………………………….. 2. Ngày thu………………………………………………. 3. Số điện thoại……………. địa chỉ……..……………… 4. Nguồn gốc thức ăn……………………………………. 5. Cách bảo quản………………………………………… 6. Cách xử lý………………………………………........... 7. Cách sử dụng…………………………………………... 8. Lượng……….., hoàn toàn………..hay phối hợp……… 9. Số lần cho ăn……………… PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 PHỤ LỤC B Bảng B.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong qui trình PCR của Kimura et al (1996) được tối ưu bởi Trần Thị Phương Trang (2009). Bước 1/(2): tổng thể tích 20µl Hóa chất Nồng độ Thể tích 1 mẫu (µl) PCR buffer 1 X 4 MgCl2 1,5/(1) mM 1,2/(0,8) dNTP (10M mol) 200 µM 0,4 P1/(3) (mồi xuôi) 20 pmol 1 P2/(4) (mồi ngược) 20 pmol 1 Taq DNA 1,5 U 0,3 Nước cất tiệt trùng 10,1/(10,5) ADN (Mẫu) 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 PHỤ LỤC C CÁCH PHA CÁC LOẠI DUNG DỊCH Bảng C.1 Dung dịch cố định Davidson/AFA Thành phần Thể tích (ml) Ethyl alcohol 95 % 330 Formalin 220 Acid acetic 115 Nước cất 335 Bảng C.2 Dung dịch nhuộm Haematoxylin Thành phần Thể tích/Khối lượng Nước cất đun sôi 2000 ml Haematoxylin 2 g Sodium iodate 0.4 g Potassium aluminium sunfate 180 g Acid citric 2 g Chloral hydrate 100 g PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 Bảng C.3 Dung dịch Eosin/Phloxine Thành phần Thể tích (ml) Stock Eosin (1 % Eosin Y trong nước) 100 Stock Phloxine (1 % Phloxine B trong nước 10 Cồn 95 % 780 Acid glacial acetic 4 Dung dịch Gelatin Gelatin 1 % Potassium dichromate 1 % Trộn đều nhau theo tỉ lệ 1 : 1. Cho dung dịch này vào chậu nước ấm để tạo thành dung dịch 0,002 % cho mỗi chất. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version