Phát triển quy trình MPCR phát hiện MBV (monodon baculovirus), WSSV (white spot syndrome virus) và gen beta-Actin trên tôm sú (penaeus monodon)

gan tụy và nhân của biểu mô ruột giữa. Sự lây nhiễm bệnh MBV còn xảy ra trong cơ quan bạch huyết. (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001) 2.3.2. Vật chủ cảm nhiễm MBV có thể nhiễm ở nhiều loài tôm he khác nhau: Penaeus monodon, P. merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P. penicillatus, P. esculentus, P. Vannamei. Trong đó, tôm sú (P. monodon) thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất. (K.K. Vijayan et al., 1995) 2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý Đối với tôm Postlarvae khi nhiễm nhẹ không có dấu hiệu rõ ràng, khi nhiễm nặng thể hiện một số dấu hiệu như: yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, chuyển giai đoạn chậm không đều. Tỷ lệ chết tích lũy đến 90% nếu môi trường không ổn định. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) Cũng theo Bùi Quang Tề và ctv, (2004) tôm thịt khi bị nhiễm MBV thường có màu đen tối, kém ăn còi cọc, chậm lớn, chu kỳ lột xác kéo dài, nên trên PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 9 - mang và bề mặt cơ thể bị cảm nhiễm rất nhiều các tác nhân cơ hội như vi khuẩn dạng sợi, động vật đơn bào (Protozoa), tảo đơn hay đa bào và các tác nhân khác. Có thể sau 3-4 tháng nuôi, tôm vẫn có kích thước rất nhỏ thường gọi là ”tôm kim”. 2.3.4. Kiểu lan truyền MBV lây truyền qua đường miệng do virus có trong phân của tôm bị nhiễm bệnh, hoặc do tôm ăn thịt tôm đã chết hoặc vừa chết. Tôm trưởng thành bị nhiễm bệnh cũng có khả năng truyền sang con của chúng thông qua làm bẩn khối trứng đã đẻ ra do phân. (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001) 2.3.5. Phương pháp chẩn đoán Theo tài liệu FAO về hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, tôm bị nhiễm MBV cấp tính có biểu hiện yếu, bơi lội lờ đờ kém ăn, cơ thể đổi sang màu xanh lơ hay xanh đen, tôm còi cọc chậm lớn. Tuy nhiên các dấu hiệu này cũng không đặc trưng cho bệnh MBV. Có thể áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh các mô gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng malachite green, dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn hoặc bằng 40X. Thông qua sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu bắt màu xanh đậm mà xác định MBV trên tôm. Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 10 - Có thể dùng phương pháp mô học, để phát hiện các thể ẩn hình cầu bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, trên các lát cắt mô gan tụy với thuốc nhuộm H&E, ở độ phóng đại đại lớn hơn hoặc bằng 40X Có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặt trưng của MBV, dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các thể MBV trong trong nhân tế bào biểu mô gan tụy... Hình 2.5: Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X). (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 11 - 2.3.6. Các biện pháp kiểm soát bệnh Theo Bondad-Reantaso, M.G et al. (2001), mật độ nuôi cao, hóa chất và các stress do môi trường đã làm tăng tính độc của bệnh MBV ở các loài tôm dễ bị nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi Việc phòng tránh nhiễm bệnh bằng cách chọn tôm bố mẹ không bị nhiễm MBV bằng phương pháp kiểm tra phân, tẩy uế bề mặt của ấu trùng nauplius hoặc các trứng đã thụ tinh bằng formalin, iodophore, và lọc sạch nước biển Có thể tiệt trùng các dịch bệnh MBV ở một số cơ sở nuôi trồng thủy sản bằng cách cho tiêu hủy đàn tôm đã bị nhiễm bệnh, khử trùng dụng cụ nuôi, tránh virus tái nhiễm (từ các phương tiện nuôi khác ở bên cạnh, tôm tự nhiên,vv...) 2.4. Bệnh đốm trắng WSSV Năm 1993, WSSV lần đầu tiên được tìm thấy ở Đài Loan. Từ đó virus này phân bố rộng và gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm ở vùng này. Bệnh đốm trắng (WSSV) vẫn là một trong các bệnh virus nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay (Chou et al, 1995 trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hảo, 2003) 2.4.1. Tác nhân gây bệnh Trước năm 2002, có 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hoặc còn gọi là virus Trung Quốc. Tuỳ từng nước nghiên cứu chúng có tên gọi và kích thước như sau: (Bùi Quang Tề, 2004) Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) 84 x 226 nm Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 275 nm 54 x 216 nm Virus bệnh đốm trắng Thái Lan (SEMBV) 121 x 276 nm 89 x 201 nm Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70-150x350-380nm 58-67x330-350nm Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J. Walker đã phân loại virus gây hội chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae. Virus có dạng hình trứng, kích thước 120 x 275nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15- 28 kilodalton. Vỏ bao có hai lớp protein VP28 và VP19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24, VP15. Nhân cấu trúc ADN. (Bùi Quang Tề, 2004) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 12 - 2.4.2. Vật chủ cảm nhiễm Bệnh đốm trắng có số lượng vật chủ khá lớn. Bệnh bùng phát được thông báo lần đầu tiên từ trại nuôi tôm P.japonicus ở Nhật và sự lây nhiễm tự nhiên sau đó đã quan sát thấy ở tôm P.chinensis, P.indicus, P. merguiensis, P.monodon, P. setiferus, P.styliostris và P.vannamei. Trong các nghiên cứu thực nghiệm, bệnh đốm trắng cũng gây chết cho tôm P.aztecus, P.duodarum và P.setiferus. (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001). 2.4.3. Dấu hiệu bệnh lý Bệnh đốm trắng bùng phát thường được đặc trưng bởi việc chết nhiều và nhanh của đàn tôm bị nhiễm bệnh sau khi có biểu hiện lâm sàng. Tôm nhiễm bệnh hoạt động yếu bơi lờ đờ và dạt vào bờ. Dấu hiệu đặ trưng là xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp võ kiti. Những đốm này ở trong lớp vỏ và không thể loại bỏ bằng việc chà sát. Tôm sắp chết cũng có thể biến màu từ hồng sang đỏ. Các loài tôm nhạy cảm khi đã có các biểu hiện lâm sàng thì dễ dàng bị chết nhiều. Triệu chứng bệnh học kết hợp với sự phá huỷ hệ thống mô ngoại bì và trung bì của mang và các mô dưới lớp vỏ. (Bùi Quang Tề, 2004) 2.4.4. Kiểu lan truyền Bệnh đốm trắng lây truyền qua đường nằm ngang là chính. Virus lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm. Khi các loài tôm bị bệnh đốm trắng trong ao sức khoẻ chúng yếu hoặc chết, các con tôm khoẻ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thừa rơi vào ao nuôi. Ngòai ra bệnh đốm trắng còn có khả năng lây truyền qua đường thẳng Hình2.6: Tôm sú bị bệnh đốm trắng có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi Quang Tề, 2004) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 13 - đứng, virus đốm trắng có thể lây lan theo chiều dọc khi gây cảm nhiễm từ tôm bố mẹ mang mầm bệnh đốm trắng đã chuyển sang thế hệ con (Lo et al. 1997, trích dẫn Trần Việt Tiên, 2007) 2.4.5. Phương pháp chẩn đoán Theo tài liệu của FAO (2001) hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau: Quan sát chung: Bệnh đốm trắng thường được báo hiệu trước bằng việc tôm ngừng ăn trong một vài ngày, tôm sắp chết bơi gần mặt nước ở bờ ao nuôi. Những con tôm này sẽ có các thể vùi màu trắng lẫn trong biểu bì và thân tôm thường hơi biến đỏ. Các thể vùi ở lớp vỏ thay đổi từ những chấm nhỏ thành những đĩa có đường kính vài mm và chúng có thể liên kết lại với nhau thành những mảng lớn. Chúng rất dễ nhận thấy nhờ việc bóc lớp vỏ cutin khỏi giáp đầu ngực, loại bỏ các mô bám và vỏ cutine soi ra ngoài ánh sáng. Sự xuất hiện những đốm trắng trong lớp vỏ cutin có thể do một vài nguyên nhân khác tạo ra. Làm tiêu bản ép nhanh: Hai kiểu làm tiêu bản ép nhanh có thể dùng để dự chẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, được cố định trong Formalin 10%, và soi trên nền tối của kính hiển vi với kính tụ quang ướt, và (ii) các mô đã cố định được nhuộm màu bằng Haematoxylin và Eosin (H&E). Mô bệnh học: Tôm nghi bị bệnh đốm trắng sắp chết được cố định trong dung dịch Davidson và nhuộm màu bằng H&E. Với phương pháp này ta có thể quan sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm H&E. Những mô biểu hiện rõ nhất để xét nghiệm là dưới mô ở lớp biểu bì và mang. Hình 2.7: Tôm bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bì dạ dày trương to có thể vùi màu hồng, mẫu mô nhuộm H&E. (Bùi Quang Tề, 2004) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 14 - Việc chẩn đoán bệnh trọn vẹn có thể được hoàn thành bằng kỹ thuật PCR, kỹ thuật lai tại chỗ, lai Western hoặc kính hiển vi điện tử (TEM). 2.4.6. Các biện pháp kiểm soát bệnh Theo Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001 hiện vẫn chưa có biện pháp chữa trị tôm bị nhiễm virus đốm trắng, tuy nhiên đã có nhiều biện pháp phòng ngừa để hạn chế việc lây lan: Với các cơ sở sản xuất tôm PL người ta đề nghị là tôm bố mẹ tự nhiên cần được kiểm tra sơ bộ bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật Nested-PCR Trong quá trình nuôi việc thay đổi nhanh nhiệt độ nước, độ cứng và độ mặn hoặc giảm mức oxy (<2ppm) trong giai đoạn dài có thể gây ra bùng phát bệnh đốm trắng ở tôm đã nhiễm cận lâm sàng. Không nên dùng thức ăn có nguồn gốc động vật thủy sản tươi hoặc qua ướp đông để nuôi tôm thịt, nuôi thành thục và ương ấp trừ khi thức ăn đó đã được tiệt trùng bằng tia gama hoặc thanh trùng (giữ ở 70oC trong 10 phút). Bất cứ ao nuôi nào bị bệnh cũng cần phải được xử lý ngay bằng Chlorin 30 ppm để diệt tôm bệnh và tất cả các vật mang bệnh khác. Tôm và các động vật chết khác cần được dọn sạch và chôn vùi hoặc thiêu huỷ. Nước phải được lưu giữ ít nhất 4 ngày trước khi thải đi. Các chủ ao bên cạnh cần được thông báo ngay và không được thay nước ít nhất 4 ngày sau khi nước được tháo khỏi ao có tôm bệnh nếu như có liên quan đến nguồn nước cấp riêng. 2.5. Sơ lược về gen β-actin Beta-actin có ở khắp nơi trong cơ thể tôm, Beta-actin là một mRNA, đóng vai trò rất quan trọng trong chức năng của cơ thể. Nó có vai trò và chức năng cơ bản trong cơ thể sinh vật như: cấu trúc vỏ, sự phân chia tế bào, sự vận động và co cơ. Hơn nữa, gen Actin được ứng dụng trong nghiên cứu khoa học như phân tích sự phát sinh loài. Actin trong cơ thể sinh vật có thể chia làm 2 nhóm: Actin tế bào chất (β và γ) và 4 Actin cơ (α-skeletal, α-cardiac, α-aortic, α- enteric). Đối với động vật không xương sống và thực vật hầu hết là Actin tế bào chất. (Zhu et al., 2004. trích dẫn Trần Nguyên Diễm Tú, 2008) 2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis et al., 1985. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phần virus. Những virus ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này. (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 15 - Nguyên tắc của phản ứng PCR Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) thì: Tất cả các ADN polymerase khi tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN polymerase sễ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau: Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70oC tùy thuộc Tm của mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Giai đoạn tổng hợp (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq ADN polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/ giây ở nhiệt độ 75 - 80oC; 60 nucleotit/ giây ở nhiệt độ 70oC; 24 nucleotit/ giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/ giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/ giây. Sau một chu kỳ gồm 3 giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mẫu ban đầu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 16 - 2.6.1. Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR ADN chiết tách ADN mẫu có vai trò rất quan trọng và ảnh hưởng rỏ rệt đến kết quả phản ứng PCR. Hàm lượng ADN mẫu nằm trong khoảng 100ng-1μg. Hàm lượng ADN quá thấp sẽ tạo ra ít sản phẩm, nhưng với hàm lượng lớn sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ. Hàm lượng ADN quá cao phản ứng PCR không xảy ra được. (Newton và Graham, 1995 trích dẫn bởi Trần Thị Mỹ Duyên, 2006) Enzyme (Taq ADN polymerase) Thông thường người ta sử dụng nồng độ 2,5 U/phản ứng. Việc tăng nồng độ Tap ADN polymerase hơn 2,5 U/ phản ứng đôi khi làm tăng hiệu quả của phản ứng PCR, nhưng chỉ trong khoảng nhất định. Nếu nồng độ Taq ADN polymerase quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất sản phẩm và sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ không mong muốn. Hơn nửa đây là thành phần đắt nhất của phản ứng PCR nên việc chọn nồng độ thích hợp là rất quan trọng. (Martha et al., 2001 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008) Mồi và nhiệt độ gắn mồi Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR, do đó phải tuân theo một số nguyên tắt sau (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005): + Trình tự mồi được sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và giữa các thành phần khác nhau của cùng một mồi. + Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không được quá chênh lệch nhau (không quá 3°C). + Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. + Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không qua lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu khi trình tự giữa hai mồi nhỏ hơn 1kb. Độ dài mồi tốt nhất là từ 20-30 nucleotic. Nồng độ các nucleotide tự do (dNTP) Nồng độ các dNTP khoảng 200μM cho mỗi phản ứng. Nồng độ thấp hơn tăng cường độ chính xác của phản ứng nhưng tạo ra ít sản phẩm, còn nồng độ cao hơn thì làm giảm tính chính xác của phản ứng. Cần phải có 4 loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi dạng nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20 - 200 μM cho mỗi loại nucleotide. Nếu mất trạng thái cân bằng trong thành phần các dNTP thì sẽ gây PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 17 - ra lỗi khi sao chép của enzyme ADN polymerase (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Nồng độ Mg2+ Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150 – 200 μM. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ không thấy được sản phẩm khuếch đại. Nước sử dụng cho phản ứng phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào (Trần Thị Xô và Nguyễn Hương Lan, 2005) Số lượng chu kì phản ứng Số lượng chu kì cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng 30 – 40 chu kì. Bởi vì phản ứng diễn ra theo hai giai đoạn: ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân và đến một giới hạn nào đó thì số lượng bản sao giảm, hiệu quả khuếch đại giảm do: hoạt tính của enzyme ADN polymerase giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao, sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các sản phẩm vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau. Vì vậy, không nên sử dụng vượt quá 40 chu kì cho mỗi phản ứng PCR (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). 2.6.2. Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản Kỹ thuật PCR được ứng dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau. Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004), kỹ thuật PCR được ứng dụng vào các lĩnh vực sau: + Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi. + Chuẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết khi dịch bệnh xảy ra, đồng thời đề ra hướng ngăn chặn sự xuất hiện của dịch bệnh + Phòng bệnh và kiểm soát bệnh: kiểm tra tôm giống và tôm bố mẹ ở các trại giống, kiểm tra tôm nhập khẩu trước khi cho thả nuôi ở các địa phương. + Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu – sự nhiễm khuẩn hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli. + Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản Hiện nay một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm được chuẩn đoán bằng phương pháp PCR gồm có:(i) ở cá có virus gây bệnh trên cá nheo Mỹ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 18 - (channel catfish virus – CCV), virus gây nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu (IHNV), virus gây nhiễm trùng và hoại tử tuyến tụy (IPNV), virus gây xuất huyết và nhiễm trùng máu (VHSV), virus gây hoại tử hệ thần kinh (VNNV) và Renibacterium salmoninarum; (ii) ở tôm có virus đốm trắng (WSSV), HPV, virus gây bệnh đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặt biệt là nhóm Vibrio (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 19 - CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điễm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: 1/2009 đến 5/2009 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiện- Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản- Khoa Thủy Sản. 3.2. Dụng cụ và hóa chất 3.2.1. Dụng cụ - Máy chu kỳ nhiệt - Máy so màu quang phổ - Máy ủ - Máy li tâm - Bộ điện di - Máy chụp hình UV - Lò vi ba - Cân điện tử - Tủ lạnh - Tủ -200C - Pipet tự động - Ống típ 1.5ml và 0.5ml - Que nghiền mẫu,... 3.2.2. Hóa chất - Dung dịch ly trích DNA - Cồn 950C - Nước cất - TE buffer - Ethidium Bromide - Dung dịch chạy điện di TAE - Dung dịch nạp mẫu 6X PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 20 - - dNTPs - Tag DNA polymerase - MgCl2 - Mồi: Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) Tên mồi Trình tự 361F 5′-TCC AAT CGC GTC TGC GAT ACT-3′ 361R 5′-CGC TAA TGG GGC ACA AGT CTC-3′ β-actin F 5'-CACCAACTGGGACGACATGG-3' β-actin R 5'-GGAGGCGTACAGGGAGAGCA-3' 146F1 5′-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3′ 146R1 5′-TTATGCGGGTGTAATGTTGTTCTTACGA-3′ 146F2 5′-GATACTGCCCCTTCCACTTCCA-3′ 146R2 5′-TACGGCGACTGCTGCACCTTGT-3′ 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu sử dụng phát hiện WSSV là mẫu tôm đã được xác định dương tính với WSSV bằng bộ kít WSSV/IQ2000 và được trữ -80oC tại Khoa Thủy sản Mẫu sử dụng phát hiện MBV là mẫu tôm đã được xác định dương tính với MBV bằng phương pháp nhuộm nhanh Malachite – green và được trữ trong cồn 90% tại Khoa Thủy sản 3.3.2. Ly trích DNA Cho 25 tôm bột vào ống eppendorf 1,5ml, nghiền kĩ với 500 µl Lysis buffer. Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 95oC trong 10phút, ly tâm 12.000vòng/phút Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang ống eppendorf 1,5ml mới có chứa 400 µl dung dịch chứa 95% ethanol Ly tâm 12.000vòng/phút trong 5phút, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô ADN Hòa tan phần viên với 200 µl TE PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 21 - 3.3.3. Đo hàm lượng ADN Hàm lượng ADN của mẫu được xác định bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 260 nm. Đầu tiên, sử dụng 400 μl nước cất để tạo mẫu blank. Thông thường đo mẫu nước cất 3 lần rồi mới đo mẫu DNA đã được pha loãng 100 lần (1 μl DNA + 99 μl nước cất). Hàm lượng DNA được tính theo công thức: 3.3.4. Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006) Bảng 3.4. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV Điều kiện phản ứng 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 60oC trong vòng 1 phút Lặp lại 35 lần 72oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 5 phút Điện di Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1,5% agarose. Chuẩn bị bản thạch (gel): pha 1,5g agarose trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X, sau đó đun bằng lò vi sóng cho agarose tan hết, đợi khi nhiệt độ giảm xuống còn 60oC, cho 4µl ethidium bromide vào rồi lắc nhẹ, tiến hành đổ gel Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 17,25 µl Dung dịch đệm 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 1,5 µl dNTP (10mM) 200 µM 0,5 µl Taq ADN polymerase (5U/ μl) 1,25 U 0,25 µl Mồi MBV-361 F (100μM) 0,4 µM 1 µl Mồi MBV-361 R (100μM) 0,4 µM 1 µl ADN khuôn 200 ng/µl 1 µl Tổng 25 µl Hàm lượng DNA (μg/ml) = Giá trị đo ở 260 nm x 50 x độ pha loãng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 22 - vào khuôn. Thường bề dày của gel không quá 0,8 cm. Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ gel và các keo dán. Điện di: Cho gel vào bồn điện di có chứa dung dịch đệm. Dùng thang ADN cho từng gel để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với 1 giọt dung dịch nạp mẫu vào từng giếng một. Sau đó nối bồn điện di với nguồn điện 100V để chạy. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Đọc kết quả Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang ADN 1kb để đọc kết quả. Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu đối chứng âm sẽ không hiện vạch. 3.3.5. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 14,85 µl Dung dịch đệm 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 1,5 µl dNTP (10mM) 200 µM 0,5 µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 1,25 U 0,25 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 1 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 1 µl Mồi β – actin F (10μM) 0,25 µM 0,625 µl Mồi β – actin R (10μM) 0,25 µM 0,625 µl DNA khuôn 200 ng/µl 2µl Tổng 25 µl Điều kiện phản ứng 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 65oC trong vòng 1 phút Lặp lại 35 lần 72oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 5 phút Điện di (Tương tự như phương pháp chạy điện di phát hiện MBV) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 23 - Đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu hiện lên vạch 216 bp là gen β – actin 3.3.6 Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV Bảng 3.6. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 32,6 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,2mM 1 µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2µl Mồi WSSV-146 F1(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R1(100μM) 1 µM 0,5 µl DNA khuôn WSSV 200 ng/µl 1 µl DNA khuôn MBV 200 ng/µl 2 µl Tổng 50 µl Điều kiện phản ứng: 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 65oC trong vòng 1 phút Lặp lại 35lần 72oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 5 phút PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 24 - Bảng 3.7. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 30,6 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R2(100μM) 1 µM 0,5 µl Sản phẩm PCR bước 1 5 µl Tổng 50 µl Điều kiện phản ứng: 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 65oC trong vòng 1 phút Lặp lại 35lần 72oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 5 phút Điện di (Tương tự như phương pháp chạy điện di phát hiện MBV) Đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu hiện lên vạch 941 bp là mẫu dương tính với WSSV PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 25 - 3.3.7 Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β – actin Bảng 3.8. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 30,1 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F1(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R1(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi β – actin F (10μM) 0,25 µM 1,25 µl Mồi β – actin R (10μM) 0,25 µM 1,25 µl DNA khuôn WSSV 200 ng/µl 1 µl DNA khuôn MBV 200 ng/µl 2 µl Tổng 50 µl Bảng 3.9. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 26,1 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi β – actin F (10μM) 0,25 µM 1,25 µl Mồi β – actin R (10μM) 0,25 µM 1,25 µl Sản phẩm PCR bước 1 5 µl DNA khuôn MBV 200 ng/µl 2 µl Tổng 50 µl PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 26 - Điều kiện phản ứng: 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 65 oC trong vòng 1 phút Lặp lại 35 lần 72oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 5 phút Điện di (Tương tự như phương pháp chạy điện di phát hiện MBV) Đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu hiện lên vạch 941 bp là mẫu dương tính với WSSV Mẫu hiện lên vạch 216 bp là gen β – actin PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 27 - CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thực hiện qui trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006) Mẫu sử dụng phát hiện MBV là mẫu tôm đã được xác định dương tính với MBV bằng bằng phương pháp nhuộm nhanh Malachite – green và được trữ trong cồn 90% tại Khoa Thủy sản. Sau đó được ly trích ADN (Theo mục 3.3.2) và đo hàm lượng (Theo mục 3.3.3). Hàm lượng ADN ly trích được như sau: Bảng 4.10. Hàm lượng ADN của mẫu tôm sú STT Mẫu phân tích Giá trị đo (260 nm) [ADN] (ng/µl) 1 M1 0.52 2500 ADN ly trích được pha loãng ra hàm lượng 200 ng/µl được sử dụng để thực hiện phản ứng khuếch đại theo qui trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006) với thành phần phản ứng được thể hiện trong bảng 3.1, chu kỳ nhiệt: 95°C trong 5 phút; 95°C trong 30 giây, 60°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút lập lại chu kỳ trên 35 lần; 72 °C trong 5 phút. Kết quả điện di sau khi khuếch đại như sau Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV (100 ng/µl) Giếng 3: mẫu bị nhiễm MBV (200 ng/µl) M 1 2 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 28 - Kết quả hình 4.8 cho thấy phản ứng PCR với 2 nồng độ ADN khác nhau 100 ng/µl (giếng 2) và 200 ng/µl (giếng 3) đều không hiện vạch 361bp (vạch thể hiện sự có mặt của của MBV) nguyên nhân có thể là do chu kỳ nhiệt không phù hợp vì vậy cần phải điều chỉnh lại chu kỳ nhiệt để đạt kết quả tốt hơn. Trong quá trình chuẩn hóa thì thành phần hóa chất so với quy trình đã thực hiện thì không có sự thay đổi (Bảng 4.8). Tuy nhiên có một số thay đổi ở chu kỳ nhiệt là nhiệt độ gắn mồi từ 60oC tăng lên 65oC Bảng 4.11. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV Điều kiện phản ứng: Sau khi chuẩn hóa 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 65oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 1 phút Lặp lại chu kỳ trên 35 lần 72oC trong vòng 5 phút Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 17,25 µl Dung dịch đệm 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 1,5 µl dNTP (10mM) 200 µM 0,5 µl Taq ADN polymerase (5U/ μl) 1,25 U 0,25 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 1 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 1 µl ADN khuôn 200 ng/µl 1 µl Tổng 25 µl PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 29 - Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV (200 ng/µl) Dựa vào hình 4.9 ta thấy sau khi điều chỉnh lại chu kỳ nhiệt (tăng nhiệt độ gắn mồi lên 65oC) thì mẫu đối chứng dương hiện rỏ vạch 361bp (vạch thể hiện sự có mặt của MBV), đối chứng âm không hiện vạch. Kết quả này cho thấy chu kỳ nhiệt có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình và sản phẩm khuếch đại. Kết quả cho thấy quy trình có thể sử dụng để phát hiện MBV trong điều kiện phòng thí nghiệm . Đồng thời cũng cho phép ta tiến hành quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β-actin trên tôm. 4.2. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV và gen β – actin Phương pháp PCR hiện nay đang được ứng dụng và phát triển rộng rãi trong y học cũng như trong thủy sản. Tuy nhiên PCR cũng có nhiều hạn chế, một trong những hạn chế của PCR là hiện tượng âm tính giả do thao tác hoặc do DNA ly trích có chất lượng kém. Để khắc phục tình trạng này, trên cơ sở qui trình PCR phát hiện MBV ở trên và qui trình PCR phát hiện gen β-actin (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007), quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β – actin được thực hiện nhằm kiểm soát chất lượng AND của tôm trong quá trình phát hiện MBV cũng để kiểm soát các trường hợp âm tính giả nâng cao hiệu quả xét nghiệm. M 1 2 250bp 500bp 361bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 30 - Bảng 4.12. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 14,85 µl Dung dịch đệm 10X 1X 2,5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 1,5 µl dNTP (10mM) 0,02 mM 0,5 µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 1,25 U 0,25 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 1 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 1 µl Mồi β – actin F (10μM) 0,25 µM 0,625 µl Mồi β – actin R (10μM) 0,25 µM 0,625 µl ADN khuôn 200ng 1 µl Tổng 25 µl Sau khi thực hiện qui trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β-actin theo chu kì nhiệt của quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006 có bổ sung), ta được kết quả như sau. Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV và mồi β – actin Kết quả hình 4.10 cho thấy mẫu đối chứng dương (giếng 2) hiện rỏ vạch ở vị trí 361bp vạch biểu hiện mẫu có sự hiện diện của MBV và vạch ở vị trí 216 bp vạch biểu hiện sự có mặt của β – actin, đối chứng âm không hiện vạch. M 1 2 250bp 500bp 361bp 216bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 31 - Kết quả trên cho thấy có thể ứng dụng quy trình mPCR để phát hiện MBV và β – actin , đồng thời có thể kiểm soát được trường hợp âm tính giả và chất lượng ADN của tôm trong quá trình phát hiện MBV thông qua gen nội sinh β – actin của tôm. 4.3. Thực hiện qui trình PCR phát hiện MBV và WSSV Do không có mẫu bị nhiễm cả hai loại WSSV và MBV nên khi thực hiện phản ứng phải cho cả mẫu ADN có hai loại vi-rút này. Ở bước 1 khi cho ADN vào để tham gia phản ứng khuếch đại thì ta cho 1µl DNA (200 ng/µl) có chứa WSSV và 2µl ADN (200 ng/µl) có chứa MBV. Ở bước 2 cho vào 5 µl sản phẩm PCR bước 1. Bảng 4.13. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 32,6 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,2mM 1 µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2µl Mồi WSSV-146 F1(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R1(100μM) 1 µM 0,5 µl ADN khuôn WSSV 200 ng/µl 1 µl ADN khuôn MBV 200 ng/µl 2 µl Tổng 50 µl Bảng 4.14. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 30,6 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R2(100μM) 1 µM 0,5 µl Sản phẩm PCR bước 1 5 µl Tổng 50 µl PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 32 - Điều kiện phản ứng: Trước khi chuẩn hóa Sau khi chuẩn hóa 95oC trong vòng 5 phút 95oC trong vòng 5 phút Sau đó 95oC trong vòng 30 giây Sau đó 95oC trong vòng 30 giây 65oC trong vòng 1 phút 62oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 1 phút 72oC trong vòng 1 phút Lặp lại chu kỳ trên 35 lần Lặp lại chu kỳ trên 35 lần 72oC trong vòng 5 phút 72oC trong vòng 5 phút Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện M BV và WSSV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 2: mẫu dương tính với MBV và WSSV (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) Giếng 4: mẫu dương tính với MBV và WSSV (PCR bước 2) Thực hiện phản ứng mPCR như bảng 4.5 và bảng 4.6. Kết quả chạy mPCR phát hiện WSSV và MBV cho thấy ở bước 1 giếng số 2 chỉ hiện 1 vạch ở vị trí 1441bp (vạch thể hiện sự có mặt của của WSSV) không hiện vạch 361bp (vạch thể hiện sự có mặt của của MBV). Ở bước 2 thì hiện 1 vạch 941 (vạch thể hiện sự có mặt của của WSSV) và cũng không hiện vạch 361bp. Vì vậy M 1 2 3 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 33 - cần phải điều thành phần hóa chất ở bước 2 (cho thêm 2µl ADN 200 ng/µl có chứa MBV) và chu kỳ nhiệt (giảm nhiệt độ gắn mồi từ 65 oC xuống 62 oC) để kết quả được tốt hơn. Bảng 4.15. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh. Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 28,6 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R2(100μM) 1 µM 0,5 µl Sản phẩm PCR bước 1 5 µl DNA khuôn MBV 200ng 2 µl Tổng 50 µl Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi chuẩn hóa Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 2: mẫu dương tính với MBV và WSSV (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) 1 2 3 4 M 250bp 1000bp 1500bp 1441bp 941bp 361bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 34 - Giếng 4: mẫu dương tính với MBV và WSSV (PCR bước 2) Dựa vào kết quả hình 4.12 sau khi đã điều chỉnh thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt thì ta thấy ở bước 1 giếng 2 hiện một vạch ở vị trí 1441bp không hiện vạch 361bp Ở bước 2 giếng 2 hiện rỏ hai vạch 941bp (vạch thể hiện sự có mặt của của WSSV) và 361bp (vạch thể hiện sự có mặt của của MBV). Đối chứng âm ở cả hai bước điều không hiện vạch. Điều này chứng tỏ có thể ứng dụng quy trình này để phát hiện đồng thời hai loại virut MBV và WSSV. 4.4. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV - WSSV và β – actin Dựa vào kết quả ở mục 4.3 qui trình phát hiện MBV, WSSV và β – actin được thực hiện. Các thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng mPCR được thực hiện như trình bày ở bảng 4.16 và 4.17 Bảng 4.16. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 30,1 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F1(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R1(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi β – actin F (10μM) 0,25 µM 1,25 µl Mồi β – actin R (10μM) 0,25 µM 1,25 µl DNA khuôn WSSV 200 ng/µl 1 µl DNA khuôn MBV 200 ng/µl 2 µl Tổng 50 µl PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 35 - Bảng 4 .17. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 26,1 µl Dung dịch đệm 10X 1X 5 µl MgCl2 (25mM) 1,5 mM 3µl dNTP (10mM) 0,02 mM 1µl Taq DNA polymerase (5U/ μl) 0,04 U/μl 0,4 µl Mồi MBV-361 F (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi MBV-361 R (10μM) 0,4 µM 2 µl Mồi WSSV-146 F2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi WSSV-146 R2(100μM) 1 µM 0,5 µl Mồi β – actin F (10μM) 0,25 µM 1,25 µl Mồi β – actin R (10μM) 0,25 µM 1,25 µl Sản phẩm PCR bước 1 5 µl ADN khuôn MBV 200 ng/µl 2 µl Tổng 50 µl Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV ,WSSV và β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 2: mẫu dương tính với MBV, WSSV và β – actin (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) Giếng 4: mẫu dương tính với MBV, WSSV và β – actin (PCR bước 2) M 1 2 3 4 1650bp 1000bp 1441bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 36 - Kết quả hình 4.12 cho thấy ở bước 1, giếng 2 chỉ hiện 1 vạch ở vị trí 1441bp (vạch thể hiện sự có mặt của của WSSV) không hiện vạch 361bp và 216bp (vạch thể hiện sự có mặt của của MBV và β – actin). Ở bước 2, giếng 4 không hiện vạch nào Sau nhiều lần điều chỉnh thành phần hóa chất như tăng thể tích của β – actin lên gấp đôi (1,25 µl lên 2,5 µl) nhưng kết quả cũng giống như hình 4.13 là ở bước 1 chỉ phát hiện được WSSV và bước 2 không phát hiện được vạch nào. Do thành phần hóa chất và thời gian có hạn nên nghiên cứu dừng lại ở chu trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và WSSV. 4.5. Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin Quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin được thử nghiệm để xét nghiệm một số mẫu tôm giống tại phòng xét nghiệm giống – Bộ môn sinh học và Bệnh Thủy Sản khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin như mục 4.2. Kết quả kiểm tra một số mẫu tôm giống được trình bày ở hình 4.14 và 4.15 Hình 4. 14. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV và mồi β – actin Giếng 3: mẫu 1 (200ng ADN ) Giếng 4: mẫu 2 (200ng ADN) Giếng 5: mẫu 3 (200ng ADN ) M 1 2 3 4 5 6 7 8 361bp 216bp 250bp 500bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 37 - Giếng 6: mẫu 4 (200ng ADN) Giếng 7: mẫu 5 (200ng ADN) Giếng 8: mẫu 6 (200ng ADN) Hình 4. 15. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu đối chứng âm Giếng 2: mẫu bị nhiễm MBV và mồi β – actin Giếng 3: mẫu 7 (200ng ADN) Giếng 4: mẫu 8 (200ng ADN) Giếng 5: mẫu 9 (200ng ADN) Kết quả hình 4.14 và 4.15 cho thấy đối chứng âm không hiện vạch, đối chứng dương hiện 2 vạch ở vị trí 361bp vạch biểu hiện mẫu có sự hiện diện của MBV và vạch ở vị trí 216 bp vạch biểu hiện sự có mặt của β – actin ở vị trí 361bp. Đối với hình 4.13, 6 mẫu phân tích điều hiện vạch 216bp trong đó 2 mẫu ở giếng 5 và giếng 6 không hiện vạch 316bp (mẫu âm tính với MBV), các mẫu còn lại hiện vạch 316bp (mẫu dương tính với MBV). Đối với hình 4.14, 3 mẫu phân tích hiện vạch 216bp nhưng không hiện vạch 361bp (mẫu âm tính với MBV). Điều này chứng tỏ ta có thể áp dụng quy trình này để thực hiện phản ứng phát hiện MBV, và kiểm soát hiện tượng âm tính giả. M 1 2 3 4 5 361bp 500bp 250bp 216bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 38 - 4.6. Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV Trong quá trình xét nghiệm một số mẫu tôm giống tại phòng xét nghiệm giống – Bộ môn sinh học và Bệnh Thủy Sản khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ phát hiện một mẫu vừa nhiễm MBV và WSSV vì vậy dựa vào mục 4.3 thực hiện quy trình phát hiện MBV và WSSV. Hình 4. 16. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV Giếng M: thang đo ADN Giếng 1: mẫu 5/4/2009 (PCR bước 1, 200ng DNA) Giếng 2: mẫu đối chứng âm (PCR bước 1) Giếng 3: mẫu 5/4/2009 (PCR bước 2, 200ng DNA) Giếng 4: mẫu đối chứng âm (PCR bước 2) Kết quả chạy mPCR phát hiện WSSV và MBV cho thấy ở bước 1 giếng số 2 chỉ hiện 1 vạch ở vị trí 1441bp không hiện vạch 361bp. Ở bước 2 thì nó thể hiện rỏ 2 vạch 941 và vạch 361bp. Điều này chứng tỏ có thể ứng dụng quy trình này để phát hiện đồng thời hai loại virut MBV và WSSV. 1 2 3 4 M 1441bp 941bp 361bp 1500bp 1000bp 750bp 250bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 39 - CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận Đã thực hiện thành công quy trình: 1. PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006), sản phẩm PCR cho kết quả hiện vạch vị trí 361bp với thành phần hoá chất tham gia trong một phản ứng như sau: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1.25 U Taq ADN polymerase, 0.4 mM mồi MBV-361F, 0.4mM mồi MBV-361R, 200 ng ADN khuôn, nước cất tiệt trùng. Với chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là: 95ºC trong 5 phút; 95ºC trong 30 giây, 65ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút, lặp lại chu kỳ trên 35 lần; 72ºC trong 5 phút. 2. mPCR phát hiện MBV và β – actin (Karlo et al., 2006 có bổ sung) sản phẩm PCR cho kết quả hiện vạch vị trí 361bp và vạch 216bp với thành phần hoá chất tham gia trong một phản ứng như sau: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1.25 U Taq ADN polymerase, 0.4 mM mồi MBV- 361F, 0.4mM mồi MBV-361R, 0,25mM mồi β – actin F, 0,25mM mồi β – actin R, 200 ng ADN khuôn, nước cất tiệt trùng. Với chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là: 95 ºC trong 5 phút; 95 ºC trong 30 giây, 65ºC trong 1 phút, 72 ºC trong 1 phút, lặp lại chu kỳ trên 35 lần; 72ºC trong 5 phút. 3. mPCR phát hiện MBV và WSSV sản phẩm PCR cho kết quả hiện vạch 1441bp ở bước 1, hiện vạch 941bp và 361bp đối với bước 2. Với thành phần phản ứng PCR Bước 1: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0, 04 U/mM Taq ADN polymerase, 0.4 mM mồi MBV-361F, 0.4mM mồi MBV-361R, 1 mM mồi WSSV R1 , 1mM mồi WSSV F1, 200 ng AND khuôn WSSV, 400 ng AND khuôn MBV, nước cất tiệt trùng. Với chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là: 95ºC trong 5 phút; 95ºC trong 30 giây, 62ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút, lặp lại chu kỳ trên 35 lần; 72ºC trong 5 phút. Bước 2: 1X dung dịch đệm, 1,5mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0, 04 U/mM Taq ADN polymerase, 0.4 mM mồi MBV-361F, 0.4mM mồi MBV-361R, 1 mM mồi WSSV R1 , 1mM mồi WSSV F1, 5ml sản phẩm bước 1, 400 ng AND khuôn MBV, nước cất tiệt trùng. Với chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là: 95ºC trong 5 phút; 95ºC trong 30 giây, 62ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút, lặp lại chu kỳ trên 35 lần; 72ºC trong 5 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 40 - 5.2. Đề xuất 1. Tiếp tục thực hiện và chuẩn hóa quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV và β – actin 2. Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và β – actin trên nhiều mẫu hơn để kiểm tra tính ổn định của quy trình để có thể ứng dụng quy trình này trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3. Cần tối ưu hóa quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và WSSV nhằm tăng khả năng ứng dụng của quy trình. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 41 - TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ thủy sản, 2005. Kết quả thực hiện kế hoạch hằng năm của ngành thủy sản. hhtt://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=49&new_ID=6124705 (Ngày truy cập 29/11/2008) 2. Bộ thủy sản, 2006. Vai trò và vị trí của ngành thủy sản trong nền kinh tế quốc dân. Ngày 18/1/2006 hhtt://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=181639&new_ID=181707 6 3. Bodad-reantaso, Melba G. Bondad-Reantaso, Melba G. Bondad- Reantaso, Iain East, Rohana P. Subasinghe. 2001. Asia diagnostic guide to aquatic amiml. FAO and NACA. 4. Bùi Quang Tề và ctv , 2004. Bệnh học thuỷ sản. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 5. Chanratchakool, P.,D.F. Fegan and M.J. Phillips. 1999. Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture. In: R.P.Subasinge, J.R. Philips and M.B. Reantaso (Editors). The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture. Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999. Page 85-90 6. Dịch bệnh trên tôm sú và những giải pháp khắc phục. Ngày 25/06/2008 Ngày truy cập 29/11/2008 7. Dịch bệnh tàn phá khắp nơi. Ngày 21/5/2008 Ngày truy cập 29/11/2008 8. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Giáo trình nguyên lý và kỹ thuật chuẩn đoán bệnh thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ 9. FAO, 2004. The state of world fisheries and aquaculture (SOFIA). y600e04.htm. Accessed on 13 June 2008. 10. Ngày truy cập 29/11/2008 Thông tin chuyên đề, Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 42 - 11. Karlo Dante T. Natividad, Maria Veron P. Migo, Juan D. Albaladejo, Jose Paolo V. Magbanua, Nakao Nomura, Masatoshi Matsumura . 2006. Simultaneous PCR detection of two shrimp viruses (WSSV and MBV) in postlarvae of enaeus monodon in the Philippines. Aquaculture 257 (2006) 142–149 12. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở duy truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB khoa học và kỹ thuật. 13. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục 14. Thông tin Khoa Học & Công nghệ thủy sản, số 10/2001. Hiện trạng nghề nuôi tôm thế giới. Trích báo cáo tại hội thảo bệnh trên tôm sú tại Hải Phòng tháng 2/2004. 15. Nguyễn Thanh Quang, 2004. Khảo sát tình hình bệnh đốm trắng (White spot disease) trên tôm sú nuôi (P. monodon) ở tỉnh Sóc Trăng. 16. Nguyễn Văn Hảo. 2003. Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thới giới và tại Việt Nam. 17. Nguyễn Văn Hậu, 2006. Xác định tỉ lệ cảm nhiễm WSSV (White spot syndrome virus) và MBV (Monodon bacculovirus) trên tôm sú (Penaeus monodon) giống ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cử Long. Luận văn Đại học. Trường Đại học Cần Thơ. 18. Nguyễn Văn Hảo, 2003. Một số vấn đề về kỷ thuật nuôi tôm sú công nghiệp. Nhà xuất bản nông nghiệp TpHCM.210 trang 19. Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008 .Ứng dụng kỷ thuật PCR – genotyping (ORF125) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV). Luận văn tốt nghiệp đại học. 20. Sở thủy sản tỉnh Bạc Liêu. 2006. Báo cáo “Tổng kết tình hình thực hiện nhiệm vụ 2005 và kế hoạch phát triển Thủy sản năm 2006” 21. Lightner, D.V., R.M. Redman. 1981. A baculovirus-caused diease of the penaeid shrimp, Penaeus monodon. Joumal of invertebrate Pathology 38: 299-302. 22. Thông tin Khoa Học & Công nghệ thủy sản, số 4/2004. Lê Trọng. Tổng quan bệnh virus đốm trắng ở tôm he (Penaeus) 23. Theo lao đông, ngày 13/03/2003. Tôm chết hàng loạt, ngành thủy sản bó tay hhtt://www.vnexpress.net/Vietnam/KinhdOanh/2003/03/3B9C5D27/ (Ngày truy cập 29/11/2008) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version - 43 - 24. Tạp chí thủy sản số 1. 2006 25. Trần Thị Mỹ Duyên, 2006. Ứng dụng kỷ thuật PCR – genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV). Luận văn tốt nghiệp đại học. 26. Trần Thị Xô và Nguyễn Hương Lan. 2005. Cơ sở di truyền và công nghệ gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 27. Bùi Thị Tuyết Hoa, 2004. Bài giảng sinh học phân tử. Trường Đại học Cần Thơ 28. Trần Việt Tiên, 2007. Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR trong chuẩn đoán WSSV (White spot syndrome virus) và GAV (Gill-associated virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. 29. Trần Nguyên Diễm Tú, 2008. Phát triển quy trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát hiện WSSV (White Spot Syndrome Virus), HPV (Hepatopancreatic Parvovirrus) và gen nội chuẩn beta-actin trên tôm sú (Penaeus monodon). 30. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I. Báo cáo tình hình bệnh tôm ở Thái bình (Ngày truy cập 29/11/2008) 31. K.K. Vijayan, S.V. Alavandi, K.L. Rajendran and K. Alagarswami. 1995. Prevalence and Histopathology of Monodon Baculovirus (MBV) Infection in Penaeus monodon and P. Indicus in Shrimp Farms in the South-East Coast of India. Asia fisheries science 8 (1995): 267-272 32. Win Surachetpong*, Bonnie T. Poulos, Kathy F.J. Tang, Donald V. Lightner. Improvement of PCR method for the detection of monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp. Aquaculture 249 (2005) 69– 75 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version