Phương pháp phân tích định tính và định lượng protein

Trường Đại Học Lạc HồngKhoa Công Nghệ Hóa- Thực Phẩm Đề Tài : Cách Xác Định Hàm Lượng Protein Và Acid Amin trong Thực Phẩm Bộ Môn : Hóa Phân Tích GVHD : TS. Phạm Trần Nguyên Nguyên Sinh Viên Đoàn Thị Tuyết Vân Lớp : 08TP113 Protein là thành phần không thể thiếu trong cơ thể sinh vật Là một trong 4 đại phân tử hình thành nên cấu tạo của tế bào Thực phẩm ngày nay rất đa dạng, việc xác định hàm lượng protein trong thực phẩm là thực sự cần thiết để đánh giá chất lượng sản phẩm của thực phẩm Từ đó người tiêu dùng dựa vào đó để quyết định khẩu phần thức ăn hàng ngày Lý Do Chọn Đề Tài Tổng Quan Về Protein. Tính chất của protein. Các phương pháp định tính acid amin. Các phương pháp định lượng acid amin. Các phương pháp định tính protein. Các phương pháp định lượng protein. Những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Kết luận. Tài liệu tham khảo. MỤC LỤC I-Tổng quan về protein. 1.Cấu tạo phân tử protein. Đại phân tử sinh học Có mặt nhiều trong tế bào sống Tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa Thành phần của nhiều phức hợp Hình 1 : Cấu Tạo Phân Tử Protein 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Protein có cấu tạo từ 20 loại acid amin cơ bản Hình 2: Cấu Trúc Chung Của Acid Amin Acid amin (tên gọi và viết tắt) 1-Cấu Tạo Phân Tử Protein 1-Cấu Tạo Phân Tử Protein Acid amin (tên gọi và viết tắt) 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin không phân cực với mạch bên là nhóm hydratcacbon 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin phân cực với mạch bên tích điện dương 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin phân cực với mạch bên tích điện âm Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin với mạch bên không tích điện 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin với mạch bên là vòng thơm 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Cấu trúc không gian của acid amin Acid amin đặc biệt 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Một Số Acid amin ít gặp trong tự nhiên 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Một Số Acid amin không có trong protein 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein Vai Trò Của Acid Amin Rất quan trọng đối với cơ thể Cơ thể không thể tự tổng hợp được Phải cung cấp cho cơ thể bằng con đường thực phẩm Isoleucin, methionin, phenylalanin, valin, leucin, lysin, threonin cần cho cơ thể trưởng thành Arginin, histidin cần cho trẻ nhỏ 1- Cấu Tạo Phân Tử Protein 2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 1 Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi polypepetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của axit amin cuối cùng Hình 3 : Cấu trúc bậc 1 2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 2 Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β Hình 4: Nếp gấp  Hình 5: Nếp gấp  2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 3 Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein Hình 6: Cấu Trúc bậc 3 2.Cấu Trúc Protein Cấu Trúc Bậc 4 Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Hình 7: Cấu Trúc bậc 4 3.Vai trò sinh học của protein Cấu trúc Xúc tác Vận chuyển Vận động Bảo vệ Dẫn truyền xung thần kinh Điều hòa Kiến tạo, chống đỡ cơ học Dự trữ dinh dưỡng Quyết định chất lượng khẩu phần thức ăn Ảnh hưởng đến thành phần hóa học, cấu tạo xương Thiếu protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch, ảnh hưỡng xấu đến chức năng của các cơ quan 4.Giá trị dinh dưỡng của protein Tạo cấu trúc gel cho sản phẩm Giữ kết cấu, giữ khí, tạo độ xốp Tạo độ bền của bọt trong bia Tạo hình khối cho phomai Tạo màng bao 5.Vai trò của protein trong thực phẩm 5.Vai trò của protein trong thực phẩm Tương tác với đường tạo hương và màu cho sản phẩm Kết hợp với polyphenol tạo hương đặc trưng cho trà Cố định mùi, giữ hương II-Tính chất của protein 1.Hình dạng, khối lượng Hình sợi: keratin, miosin… Hình cầu: albumin, globulin… Tuy nhiên hai trạng thái này có thể chuyển đổi qua lại Xác định khối lượng protein bằng nhiều phương pháp: siêu ly tâm, đo áp suất thẩm thấu, đo tốc độ lắng…. II-Tính chất của protein 2.Tính lưỡng tính Thể hiện tính acid trong môi trường kiềm Thể kiện tính kiềm trong môi trường acid II-Tính chất của protein 3.Tính hòa tan Khả năng hòa tan của protein trong nước Khả năng hòa tan của protein trong dung môi Các yếu tố ảnh hưởng đến tính tan Nồng độ muối của dung dịch Nhiệt độ Bản chất và cấu hình protein pH của dung dịch Loại dung môi Các quá trình định tính + định lượng protein và acid amin Dụng cụ Cốc có mỏ Bình nón Bếp điện lót lưới amian Bình định mức Pippet có bầu và pippet thường Burret III-Các phương pháp định tính acid amin 1. Phản ứng tạo phức với kim loại nặng Phản ứng này dùng để nhận biết sự hiện diện của acid amin và được thực hiện khi đun sôi 2. Phản Ứng Ninhydrin Phản ứng này dùng để nhận biết các acid amin do tất cả các acid amin đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tím Aminodixetohidrinden Hợp chất màu xanh tím III-Các phương pháp định tính acid amin 2. Phản ứng ninhydrin Riêng prolin khi tạo phức chất với nynhidrin tạo dung dịch màu vàng Đây là phản ứng nhận biết prolin Hình 8 : dung dịch màu vàng III-Các phương pháp định tính acid amin 3. Phản ứng Xantoprotein Phản ứng để nhận biết các acid amin trong các protein mạch vòng Khi đun nóng protein với HNO3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất nitơ màu vàng Dinitrotyrozin (màu vàng) III-Các phương pháp định tính acid amin 3. Phản ứng Xantoprotein Khi thêm dung dịch kiềm sẽ tạo Quinoit màu cam, ngược lại protein không chứa mạch vòng không sinh phản ứng Dinitrotyrozin (màu cam) III-Các phương pháp định tính acid amin 4. Phản ứng Millon ( nhận biết tyrozin) Khi thuốc thử millon tác dụng với vòng phenol có trong tyrozin sẽ tạo thành hợp chất notrotyrozin có màu đỏ Nitrotyrozin (màu đỏ) III-Các phương pháp định tính acid amin 5. Phản ứng Adamkievic ( nhận biết Tryptophan) Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với các aldehuyt tạo màu đỏ tím đặc trưng Bis – 2-tryptophanalilmetan III-Các phương pháp định tính acid amin 6. Phản ứng sakagichi ( nhận biết arginin ) Khi arginin tác dụng với NaBrO và -naphton sẽ tạo sản phẩm màu đỏ cam Naphtoquinoimin (màu đỏ cam ) III-Các phương pháp định tính acid amin Phương pháp formol Cách tiến hành: cho vào erlen- 20ml dung dịch amino acid- Dd NaOH 0,1N  xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt- Thêm 20ml dd formol 30% đã trung hòa sau 5 phút dd mất màu- Chuẩn độ bằng NaOH đến khi màu vàng xuất hiện trở lại IV-Các phương pháp định lượng acid amin Phương pháp formol Tính kết quả:- 1ml dd NaOH tương đương với 1,4mg nitơ - Số mg nitơ của dung dịch được tính theo công thức N = (A – B) x 1,4 (mg)  Trong đó  - A : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm - B : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra IV-Các phương pháp định lượng acid amin V-Các phương pháp định tính protein 1. Phương pháp Biure- Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-) - Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ.- Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide 1. Phương pháp Biure Cách tiến hành - ống nghiệm 1: cho vào 1 ít Biure và 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1%- ống nghiệm 2 : cho vào 3ml lòng trắng trứng gà 1% và 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO4 1% Kết quả- ống 1: Dung dịch tím đỏ - ống 2: Dung dịch màu tím V-Các phương pháp định tính protein 2. Kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính - Các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ (thường dùng là (NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl, MgSO4­) gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền. - Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với các nồng độ muối khác nhau. V-Các phương pháp định tính protein 2. Kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính Cách tiến hành - ống nghiệm 1: kết tủa globulin+ 3ml nước cất - ống nghiệm 2 : kết tủa albumin+ 3ml nước cất Kết quả- ống 1: kết tủa tan từ từ trong nước cất .- ống 2: kết tủa tan ngay trong nước cất. V-Các phương pháp định tính protein VI-Các phương pháp định lượng protein Phương pháp xác định đạm formol Cách tiến hành Lấy 2 erlen và đánh dấu bình 1 và 2- Bình 1 :dùng kiểm tra,- Cho 50ml dd formol ½- 3 giọt phenolphtalein 3% - Dùng dd NaOH 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt- Ta được formon ½ trung hòa Phương pháp xác định đạm formol Cách tiến hành - Bình 2 :Dùng làm bình thí nghiệm. - 10ml dịch mẫu (pha loãng từ 5 đến 20 lần )- 10ml dd formol ½ đã trung hoà - 3 giọt phenolphtalein 3%- Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn màu ở bình 1) VI-Các phương pháp định lượng protein Phương pháp xác định đạm formol Cách tiến hành thực hiện chuẩn độ 3 lần thật và 3 lần với nước cất VI-Các phương pháp định lượng protein Phương pháp xác định đạm formol Tính kết quả M(g/l) = 1,4 ( V2 – V1 )/a Trong đó :- V1 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không- V2 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật- a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a= 1 ml = 0,001 l).  M(g/l) = 1,4 (0,0 106 – 0,00045 )/0.001 = 14,21 VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành - Hút 1ml (lỏng) hoặc cân 1g (rắn đã nghiền nhuyễn) cho vào bình Kjendanl ,cho thêm 10ml H2SO4 đậm đặc cho thêm 0,5g hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100:10 :1) làm xúc tác, đun nhẹ cho hỗn hợp mất màu, đun mạnh khi dd hoàn toàn hóa lỏng, lắc nhẹ và đun tới khi dd hoàn toàn trắng VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành - Chuyển toàn bộ dd đã vô cơ hóa sang bình định mức 100ml ,thêm nước cất cho đến ngấn chia,lắc đều - Lấy vào bình tam giác 10ml H2SO4 0,1N ,thêm vài giọt chỉ thị phenolphthalein và lắp vào máy cất như mô hình VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành  Hình 9: Mô hình p.p KJELDAHL VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Cách tiến hành - Đun sôi nước trong bình cầu tạo hơi nước ,mở nước vào ống sinh hàn .Sau đó qua phễu cho vào bình cất 10ml dd thí nghiệm từ bình định mức và tiếp đó 8-10ml dung dịch NaOH 40% .Tráng phễu bằng một lượng nhỏ nước cất .Hơi nước từ bình cầu sục qua bình phản ứng và kéo theo NH3 sang bình hấp phụ . Quá trình cất kết thúc sau 15 phút .Định phân lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N. VI-Các phương pháp định lượng protein 2. Phương pháp KJELDAHL Tính toán kết quả. - Hàm lượng nitơ được tính theo công thức Trong đó :- X: hàm lượng nitơ (g/l)- a: số mol H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3- b: số mol NaOH 0,1N tiêu chuẩn tiêu tốn cho chuẩn độ- V: số ml phẩm vật đem vô cơ hóa- 0,0014: lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N VI-Các phương pháp định lượng protein Nồng độ chất chuẩn độ không đảm bảo chính xác Cân mẫu và lấy mẫu không chính xác Nước bị ô nhiễm các ion Thiết bị dùng để chuẩn độ không sạch và không thật khô VII-Những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích VIII-Kết luận ứng dụng của quá trình định tính và định lượng trong thực tế rất rộng rãi Phân tích hàm lượng đạm trong nước mắm, thịt bò, nước tương… Phân tích hàm lượng đạm trong sữa, phomat Xác định nồng độ của NaOH trong quá trình sản xuất bột ngọt Phân tích hàm lượng ion sắt có trong nước giếng IX-Tài liệu tham khảo. www.diendanhoahoc.com.vn www.violet.com.vn www.google.com.vn