Sàng lọc vi khuẩn lactic từ dạ dày-Ruột của các loài hải sản có tiềm năng trong sản xuất probiotics

NỘI DUNG Mục đích nghiên cứu Vật liệu và phương pháp Kết quả và thảo luận Kết luận 1 4 3 2 1.1 Mục đích của nghiên cứu này là: Lựa chọn các probiotics tiềm năng có hoạt tính kháng các vi sinh vật gây bệnh từ dạ dày-ruột của các loài hải sản sống ở vùng biển nhiệt đới. Mục đích nghiên cứu 1 1.2 Phạm vi nghiên cứu: 24 marine fish: tôm, cá, cua, shellfish mua từ các chợ ở Songkhla (Thailand) để phục vụ cho mục đích nghiên cứu. Có chức năng như probiotics Tính chịu acid và muối mật 1.3 Vì sao lựa chọn vi khuẩn lactic để nghiên cứu? 1.3 Vì sao lựa chọn vi khuẩn lactic để nghiên cứu? Có chức năng như probiotics Tính chịu acid và muối mật Phổ biến trong tự nhiên Lactic acid bateria 1 1.3 Vì sao lựa chọn vi khuẩn lactic để nghiên cứu? 2.1 Nguyên vật liệu: cá + shellfish + tôm + cua 2.2 Môi trường nuôi cấy và hóa chất: MRS, MHB, muối mật (bile salt), acid HCl, NB, NA 2.3 Phương pháp: -Giai đoạn 1: Chuẩn bị các chủng gây bệnh phục vụ cho việc tuyển chọn LAB. -Giai đoạn 2: Tiến hành phân lập và tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn, chịu muối mật và chịu acid. -Giai đoạn 3: Xác định tính kháng khuẩn của LAB. -Giai đoạn 4: Phân tích trình tự rDNA 16S của các chủng lựa chọn. Vật liệu và phương pháp 2 370C, 20h 10 ml MHB 10 ml MHB 10 ml NB 10 ml MHB 1ml 1ml 1ml 1ml GĐ1:Chuẩn bị các chủng gây bệnh L. monocytogenes Salmonella sp. S. aureus E. coli 2 9 ml MHB 9 ml NB 9 ml MHB 9 ml MHB 370C, 18h Điều chỉnh nồng độ đến 106 CFU/ml CFU = colony -forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc GĐ1:Chuẩn bị các chủng gây bệnh(tt) GĐ2:Phân lập và tuyển chọn LAB Tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn Tuyển chọn LAB chịu acid (acid tolerance) Tuyển chọn LAB chịu muối mật (bile salt tolerance) Ruột Ruột Ruột Ruột Cân Cân Cân Cân Tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn 25 gam 25 gam 25 gam 25 gam Pha loãng bằng nước muối vô trùng để đạt được nồng độ pha loãng 10-1, 10-2 10-3 ,10-4 Tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn (tt) 10-1 10-2 10-3 10-4 1ml 1ml 1ml 1ml D C B A NC hiếu khí (aerobically) NC kị khí (anaerobically) 37oC, 24h MRS Agar tan chảy ở 45oC Tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn (tt) 10ml of NA Seeded with Pathogenic E. coli at concentration of 105 -106 CFU/ml Petri dish Chọn Incubated 37oC trong 24h Tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn (tt) Quy trình tiếp theo như sau: Dòng kháng khuẩn được phân lập và sàng lọc thêm trên MT MRS agar Chủng phân lập được nhuộm gram và test qua phản ứng catalase Những chủng gram (+) phản ứng (-) với catalase được lựa chọn và giữ ở -80oC ở môi trường MRS chứa 35% glycerol. Tuyển chọn LAB có hoạt tính kháng khuẩn (tt) Hoạt hóa LAB nuôi cấy ở 37oC trong 24h trong môi trường MRS không muối mật MRS agar 1ml môi trường Bile salt: 2000 ppm Bile salt: 3000 ppm Bile salt: 4000 ppm Nuôi cấy ở 37oC trong 48h Tuyển chọn LAB chịu muối mật Tế bào LAB phát triển trên môi trường MRS ở 370C trong 24h Ly tâm ở 5340 xg rpm trong 15 phút để thu lấy cặn lắng tế bào Cặn lắng được rửa với 10ml PBS và được hòa tan vào 10ml PBS để thu được 108 CFU/ml. Tuyển chọn LAB chịu acid Điều chỉnh pH của PBS (bằng HCl 5M) đạt giá trị pH = 1; 2; 2.5; 3 để thu được 106 CFU/ml. NC MRS agar ở 370C trong 48 giờ.Các TB sống được tính theo số lượng của các khuẩn lạc trên MT MRS agar, và được so sánh với nồng độ vi khuẩn nuôi cấy ban đầu. Các ống được ủ ở 370C, vi sinh vật được tính sau khi nuôi cấy ở 0, 1, 2, 3,và 4 giờ MRS Thu lấy phần dịch (supernatants) GĐ3: Xác định tính kháng khuẩn của LAB(tt) LAB phát triển trên môi trường MRS ở 370C trong khoảng 24h Sau đó tế bào thu nhận bằng cách ly tâm ở 5340 xg trong 15 phút. Xử lý dịch nuôi cấy LAB I III II I: (CFF = culture supernatant ). II: (CFBH ) culture supernatant adjusted to pH 6.5-7.0 with 1m NaOH. III: ( CFB ) culture supernatant adjusted to pH 6.5 - 7.0 with 1M NaOH and treated with 200 unit / ml of catalase. GĐ3: Xác định tính kháng khuẩn của LAB(tt) Xử lý dịch nuôi cấy LAB như sau: Phủ lên đĩa 10ml môi trường MHA đã chứa 105 – 106 CFU/ml vi sinh vật chỉ thị (indicator microorganism) 20ml nutrient agar 80µl dịch xử lý đã lọc ở trên II I Đục 5 giếng d= 5.8 mm Incubated for 24h at 370C GĐ3: Xác định tính kháng khuẩn của LAB (tt) Dịch đã xử lý ở trên được đưa vào các giếng. III Thực hiện riêng lẻ đối với 4 chủng gây bệnh ở trên Positive control (100µg/ml chloramphenicol) Negative control ( MRS Broth) Các đĩa này được ủ trong khoảng 24h ở 370C. Đường kính vùng ức chế VSV được đo bằng compa. So sánh kết quả kháng khuẩn của LAB với đối chứng (-) và (+) 1 2 II I III GĐ3: Xác định tính kháng khuẩn của LAB(tt) Dịch đã xử lý ở trên (CFF; CFBH; CFB ) Hóa chất và dụng cụ: Phản ứng PCR chứa 20ml bao gồm: 2.5ml đệm 10x PCR pH 8.8 Taq DNA polymerase (BioLab). Mỗi deoxynucleoside triphosphate(dNTP) 2mM. 0.4mM của mỗi primer Và 1 đơn vị của Taq polymerase. Mồi oligonucleotid sử dụng cho gene 16S rRNA của vi khuẩn là: mồi UFUL và URUL Khuếch đại trình tự rDNA 16S giải trình tự các nucleotid và phân tích các trình tự này. GĐ4: Phân tích trình tự rDNA 16S Tách chiết DNA: 950C -- 5 phút 950C -- 1 phút 600C ---- 1 phút 720C --- 1 phút 720C --- 3 phút Sau đó gene được điện di trên agarose 1%, nhuộm màu với ethidium bromide và quan sát dưới tia UV. 30 chu kỳ Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại rDNA 16S xảy ra như sau: GĐ4: Phân tích trình tự rDNA 16S (tt) Gene rRNA 16S của vi khuẩn đã khuếch đại được tinh sạch bằng kết tủa trong ethanol pH = 4.6. Sau đó loại bỏ dịch nổi bằng máy ly tâm ở 10645xg khoảng 15 phút  thu kết tủa. Rửa tủa với ethanol 70% Ly tâm để loại bỏ ethanol và làm khô tủa ở 950C trong khoảng 2-3 phút. Tủa khô được hòa tan trong dd Hi – Di Formamide. Sau đó dung dịch được đun nóng ở 950C khoảng 2 phút và được làm lạnh trong đá khoảng 5 phút. Chuẩn bị cho phản ứng PCR để giải trình tự DNA: GĐ4: Phân tích trình tự rDNA 16S (tt) Phản ứng PCR giải trình tự DNA ( sử dụng Kit BigDye Terminator v 3.1 ). Chương trình chu kỳ nhiệt xảy ra như sau: 950C -- 5 phút 950C -- 30 giây 500C ---- 10 giây 600C --- 4 phút 600C --- 4 phút Trình tự các nucleotide được giải bằng máy giải DNA tự động. Dữ liệu các trình tự nucleotide của rDNA 16S được sắp xếp theo chương trình BLAST. 30 chu kỳ GĐ4: Phân tích trình tự rDNA 16S (tt) 3.1 Kết quả phân lập LAB: Các khuẩn lạc thể hiện tính kháng pathogenic E.coli xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc sẽ được lựa chọn Các khuẩn lạc được lựa chọn sau đó được đem đi cấy ria trên môi trường MRS để thu giống thuần chủng. Kết quả và thảo luận 3 116 chủng LAB được phân lập 20 chủng LAB được phân lập 24 chủng LAB được phân lập Kết quả và thảo luận (tt) 3 VSV hiếu khí VSV kỵ khí Có 160 chủng LAB được phân lập là vi khuẩn gram (+) và phản ứng catalase (-), có tính kháng với pathogenic E.coli. Số lượng vi khuẩn sinh trưởng trên môi trường MRS đạt mức 4-5x104-105 CFU/g trọng lượng ướt của hệ tiêu hóa trong các mẫu. Các báo cáo trước đây cho thấy LAB chỉ chiếm số lượng nhỏ trong trong đường tiêu hóa của cá. Tuy nhiên trong nghiên cứu này kết quả cho thấy một số lượng lớn LAB trong tất cả các mẫu cá phụ thuộc và từng loài cá và vị trí địa lý của nó. Kết quả và thảo luận (tt) 3 Kết quả và thảo luận (tt) 3 Ringo và Gatesoupe (1998) đưa ra 3 nhân tố quan trọng trong việc phân lập LAB từ các loài hải sản: Môi trường dinh dưỡng Nhiệt độ ủ Thời gian ủ Ngoài ra, nhiều chủng LAB không thể nuôi cấy theo phương pháp trước đây. Tính chịu muối mật  Các chủng của loài Pediococus acidilactici (P2), Lactobacillus curvatus (RM10) và Lactobacillus sake (L2) là những chủng chịu được nồng độ muối mật lớn nhất ở 3000ppm pH6 phù hợp với nồng độ muối mật trong hệ tiêu hóa người. Các chủng chịu acid được lựa chọn từ 19 chủng được phân lập từ các chủng có tính chịu muối mật ở nồng độ 4000ppm Nhiễm tế bào LAB ở PBS điều chỉnh pH=2.5 với HCl 5M ủ ở 37oC Chỉ có 6 chủng APa4, AIa1, APa5, AEa3, ARa1, AEa2 sống sót 1giờ Thử kiểm tra khả năng chịu acid ở pH 1.0, 2.0, 2.5 và 3.0, xem thử số tế bào sống sót sau 0,1,2,3,4h Tính chịu acid Tính chịu acid (tt) APa 4, AIa 1, ARa 1 ▲ Tính chịu acid thể hiện khả năng sống sót của vi sinh vật khi ở trong dạ dày 60-80% LAB sống sót trong đệm PBS pH 2.5 trong 3h ở 37oC Chủng APa4 AIa1, ARa1 được lựa chọn với khả năng sống sót ở pH 2.5 trong 1h Phân lập được 4 chủng chịu acid từ 200 chủng LAB với 80% chủng sống sót ở pH3 trong 3h Một vài chủng Lactobacillus sống sót ở pH 1 trong 1h Pennacchia Et al (2004) Maragkoudakis Et al., (2006) Prasad et al 1998 Nghiên cứu này Tính chịu acid (tt) P.Pentosaceus LM2 Ent.faecium P.Pentosaceus SL4 Chủng ARa1 Chủng AIa1 Chủng APa4 tỉ lệ giống nhau 98% 655/668 bp tỉ lệ giống nhau 98% 492/501 bp tỉ lệ giống nhau 97% 691/712 bp Dựa trên trình tự nucleotide 16S rDNA Xác định trình tự nucleotide của chủng được lựa chọn P.Pentosaceus LM2 APa4, P.Pentosaceus SL4 AIa1, Ent.faecium ARa1 được lựa chọn dựa trên khả năng chịu muối mật và acid Thử nghiệm khả năng ức chế sự sinh trưởng của S.aureus, Salmonella sp., Pathogenic E.Coli và L.monocytogens Hoạt tính kháng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Hoạt tính kháng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (tt) Hoạt tính kháng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (tt) Tác dụng kháng có thể là do acid hay các hợp chất giống chất kháng sinh (bacteriocin) hoặc sự kết hợp của cả hai. Tất cả các chủng có sản sinh ra hydrogen peroxide nhưng không chứng tỏ được tác dụng kháng. Không có mối tương quan nào giữa hoạt động của bacteriocin, và sự sản sinh ra acid lactic hay hydrogen peroxide. Aslim et al., 2005 Nghiên cứu này Aroutcheva et al, 2001 Hoạt tính kháng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (tt) LAB có thể thể hiện khả năng kháng khuẩn trong quá trình sản sinh ra acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất như: hydrogen peroxide và các acid béo mạch ngắn. Các hợp chất kháng khuẩn đặc trưng như bacteriocins hay antibiotics đã được xác định từ trong môi trường dinh dưỡng của một vài vi khuẩn sinh acid lactic Hoạt tính kháng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (tt) 160 chủng LAB được phân lập từ hệ tiêu hóa của các loài hải sản Các chủng được lựa chọn để ứng dụng làm probiotic dựa trên sự sống sót ở pH thấp và nồng độ muối mật cao, vì chúng có thể tồn tại trong hệ tiêu hóa của người Ngoài ra, chúng còn có khả năng kháng lại các mầm bệnh gây ra cho người của các vsv như: S.aureus, Salmonella sp.., E.coli gây bệnh và L.monocytogens. Các chủng được lựa chọn là P.pentosaceus APa4, P.pentosaceus AIa1 và Ent.faecium ARa1 Kết luận 4 Cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe! Tế bào vi khuẩn phát triển trong môi trường MRS ở 370C trong khoảng 24h được thu nhận bằng máy ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút Cặn được rửa 2 lần với đệm TE-buffer Cặn lắng tế bào được rửa lại trong 300ml đệm TE-buffer sôi ở 1000C khoảng 10 phút Phần dịch ở trên đem ly tâm ở 7392xg khoảng 5 phút. Loại bỏ dịch, thu được DNA hòa tan chứa DNA mẫu. Tách Chiết DNA của LAB