Sơ lược về các bước tổng hợp protein có hoạt tính mong muốn

TIỂU LUẬN HOÁ SINH Chủ đề: Sơ lược về các bước tổng hợp protein có hoạt tính mong muốn Sinh viên: Nguyễn Trọng Tuấn Dương Mã SV: 0601080 Tổ 3 - Lớp A3K61 Các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để làm thuốc như các hormon, enzym...trước đây nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt nên việc tổng hợp protein được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong công nghệ sinh học phân tử việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, growht hormon...mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác mà nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn. Sau đây xin trình bày các bước cơ bản để tổng hợp một protein theo phương pháp tổng hợp sinh học (synthetic biology) trên tế bào vi khuẩn nhờ plasmid tái tổ hợp. 1. Thiết kế plasmid (vector) tái tổ hợp: Nếu hai loại ADN được xử lý với cùng một enzyme giới hạn (restrictase) thì mỗi ADN sẽ có đầu dính tương hợp nhau và 2 đoạn ADN ấy sẽ gắn lại được với nhau tạo thành ADN duy nhất. Plasmid tái tổ hợp là plasmid có chứa 2 loại ADN có nguồn gốc khác nhau. Trong quy trình sản xuất protein, ta có thể gắn gen (bản sao cADN) của sinh vật nhân thật bậc cao vào một plasmid: từ mô sinh vật chủ chiết lấy pre-m-ARN từ gen mục tiêu rồi loại bỏ các intron và ghép nối các exon ta được m-ARN trưởng thành. Từ m-ARN trưởng thành nhờ enzyme phiên mã ngược tổng hợp cADN bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction), và cADN được ghép với plasmid tạo thành plasmid lai. 2. Đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn và tạo dòng vi khuẩn: Phương pháp dùng phổ biến để dưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn là phương pháp biến nạp. Để tăng cường tần suất biến nạp ta xử lý tế bào nhận với dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp (0-40C với E.coli), bổ sung plasmid tái tổ hợp rồi đun nóng tế bào nhận (tới 420C) để gây shock nhiệt chung. Nhờ vậy tính thấm của tế bào thay đổi, cho phép plasmid xâm nhập vào tế bào. Cũng có thể dung shock điện để đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào. Người ta thường sử dụng gen kháng kháng sinh để làm dấu hiệu chỉ thị tế bào đã dung nạp plasmid và để phân lập những tế bào này trên môi trường thạch chứa kháng sinh chỉ thị. Tế bào nhận plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy để phát triển thành 1 dòng. Với một số plasmid, việc cho vào môi trường nồng độ thấp chloramphenicol ssẽ dẫn đến việc sao chép plasmid mất điều khiển khiến cho hàng trăm bản sao plasmid có thể được tổng hợp bởi một tế bào vi khuẩn (sự khuếch đại) 3. Nuôi cấy nhân bản dòng vi khuẩn đã được biến đổi để tổng hợp protein: Sau khi đã có được dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp như mong muốn, ta đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy thích hợp. Quần thể vi khuẩn sẽ phát triển nhanh chóng và tổng hợp ra chuỗi polypeptide mà gen mục tiêu đưa vào mã hoá. Bằng các kỹ thuật khác nhau ta có thể tách và tinh chế các sản phẩm này. 4. Xử lý chuỗi polypeptide để được protein có hoạt tính mong muốn: Chuỗi polypeptide được tổng hợp xong thường ở dạng pro-protein. Dạng này thường không có hoạt tính sinh học (protein chưa trưởng thành). Các chuỗi protein này cần được xử lý bằng các enzyme hoặc các tác nhân thích hợp để có được cấu trúc không gian và hoạt tính mong muốn. * Ngoài phương pháp dung plasmid tái tổ hợp ta còn có thể dung phage để đưa gen mục tiêu vào genome của vi khuẩn bằng tải nạp. Hiện nay kỹ thuật trên đã được áp dụng để tổng hợp rất nhiều thuốc có bản chất protein. Tổng hợp insulin người dung trong điều trị tiểu đường là một điển hình: Thiết kế plasmid: Gen mã hoá insulin chứa hai chuỗi ADN (chuỗi dài chứa 18 phân đoạn nucleotide, chuỗi ngắn chứa 11 phân đoạn) hai chuỗi nucleotide này được tổng hợp thành 2 đoạn gen riêng biệt và được ghép riêng rẽ vào plasmid pBR322 gần phần cuối của gen β-galactosidase. Plasmid được biến nạp vào E.coli và được nhân bản lên trong E.coli.
Sau khi được phiên mã sang mARN hai mạch của insulin được tạo thành và được bài tiết ra cùng với β-galactosidase. Sau khi tách từng polypeptide khỏi enzyme bằng BrCN, hai mạch được gắn lại với nhau tạo insulin hoạt động (kỹ thuật 2 block) Kỹ thuật sản xuất insulin một bước cũng bằng kỹ thuật tái tổ hợp ADN , gen được gắn vào ở đây là gen mã hoá proinsulin. Sau khi chiết, proinsulin được thuỷ phân bằng protease cắt mạch peptid cho insulin hoạt động THE END ^-^