Sự biến đổi các chỉ huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau

g cầu phân hủy B: Hồng cầu khơng nhân 4.3.1.2 Số lượng hồng cầu Từ kết quả định lượng hồng cầu cĩ thể nhận thấy, cá sau khi gây cảm nhiễm ở cả ba chủng E.ictaluri đều cĩ số lượng hồng cầu thu ở lần 1 giảm cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với cá trước TN, sau 12 ngày gây cảm nhiễm cá cĩ dấu hiệu phục hồi, số lượng hồng cầu của cá thu ở lần 2 tăng lên so với lần 1 nhưng vẫn cịn thấp hơn so với cá trước TN. Kết quả phân tích số lượng hồng cầu ở cá đối chứng cĩ giảm hơn so với cá trước TN nhưng khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05). Riêng đối chứng ở chủng T8, cĩ số lượng hồng cầu giảm nhiều so với cá trước TN nhưng kết quả vi sinh ở các mẫu này là âm tính nên khơng cĩ khả năng cá đối chứng bị nhiễm từ các bể gây cảm nhiễm. Tuy nhiên, theo Branson (1993) cho biết các thơng số về huyết học cĩ liên quan đến khẩu phần ăn, chất lượng thức ăn khơng đủ dinh dưỡng, ăn khơng đủ nhu cầu cơ thể hay cá bỏ ăn đều cĩ thể làm số lượng máu của cơ thể, cĩ thể vì các yếu tố trên mà hồng cầu ở cá đối chứng bị giảm. Bảng 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu (tế bào x 105/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri. Hình 4.3.1.1a Hồng cầu cá khỏe Hình 4.3.1.1b Hồng cầu cá cĩ dấu hiệu bệnh lý A B PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Thời điểm thu mẫu Số mẫu T8 KSL 103 CAF 258 Trước TN 5 20,7±4a 20,1±4,5a 20,1±4,5a Lần 1 10 5,6±1,5b 5,4±1,9b 3,9±2b Lần 2 10 12,6±2,1c 13,6±4,2c 12,9±2,7c Sau TN 4 16,6±1,2d 18,7±1,5a 18,7±1,5a Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả định lượng hồng cầu cá khỏe ở chủng T8 trung bình là 20,7x105tb/mm3, chủng KSL 103 và chủng CAF 258 là 20,1x105tb/mm3, số liệu cũng phù hợp với báo cáo của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) (2,05x106 tb/mm3) và Trần Hoa Cúc (2009) (2,39x106tb/mL), Nguyễn Chí Dũng (2009) (20,1x105tb/mm3) khi nghiên cứu về huyết học trên cá tra giống. Các thơng số về huyết học của cá liên quan đến tuổi, giới tính, khẩu phần ăn, lồi, mùa vụ, nhiệt độ (Branson, 1993) nên sự khác biệt của các thơng số huyết học giữa các nghiên cứu cĩ thể là do ảnh hưởng của các nhân tố trên . Từ bảng 4.3.1.2 cĩ thể thấy sự biến động số lượng hồng cầu ở cả 3 chủng là tương tự nhau, đều giảm so với cá trước TN ở lần thu thứ 1 và tăng lên so với lần 1 ở lần thu thứ 2 nhưng vẫn cịn thấp hơn so với cá trước TN. Ở lần thu thứ 1, số lượng hồng cầu ở chủng CAF 258 được xác định trung bình là 3,9x105tb/mm3, cĩ tỷ lệ giảm cao nhất, giảm 80,6% so với cá khỏe, tỷ lệ này ở chủng KSL 103 và T8 lần lược là 73,1% và 72,9% tương ứng với mật độ hồng cầu là 5,6x105tb/mm3 và 5,4x105tb/mm3. Cịn ở lần thu thứ 2, lượng hồng ở chủng KSL 103 cĩ tỷ lệ tăng nhanh nhất, tỷ lệ giảm cịn 32,3% so với cá khỏe, tỷ lệ này ở chủng T8 và CAF là 39,1% (258 là 12,6x105tb/mm3) và 35,8% (12,9x105tb/mm3) so với cá trước TN. Các số liệu trên đều cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 0 5 10 15 20 25 30 T8 KSL CAF Chủng vi khuẩn Số lư ợn g hồ ng c ầu (tb x1 0^ 5/ m m ^3 ) Cá khỏe Lần 1 Lần 2 Đối chứng Hình 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri Khi phân tích các thơng số huyết học đối với cá tra giống được thu từ các ao bị bệnh mủ gan Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) xác định số lượng hồng cầu của cá bệnh giảm đến 63,4% so với cá khỏe. Cịn trong nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học trên cá tra bệnh trắng gan trắng mang (TGTM), Phạm Thị Phương Tiến (2008) cho rằng đối với từng mức độ bệnh khác nhau thì sự biến động về số lượng hồng cầu cũng khác nhau, đối với cá khơng cĩ biểu hiện TGTM trong ao TGTM thì số lượng hồng cầu giảm 30% so với cá khỏe; cá bị TGTM nhẹ hồng cầu cịn 18,7% và TGTM nặng chỉ cịn 4,57% so với cá khỏe. Khi nghiên cứu về những thơng số huyết học trên cá rơ phi (Oreochromis niloticus) cảm nhiễm E. tarda, Benli & Yildiz (2004) cũng cho rằng số lượng hồng cầu trên cá bệnh đã giảm đáng kể so với cá khỏe. 4.3.2 Bạch cầu 4.3.2.1 Tổng bạch cầu Kết quả định lượng tổng bạch cầu (TBC) của cá trước TN ở chủng T8 trung bình là 19,1x104 tb/mm3; chủng KSL 103 và chủng CAF 258 là 14,4x104 tb/mm3. Nguyễn Chí Dũng (2009) xác định TBC trên cá tra là 13,1x104 tb/mm3; Trần Hoa Cúc (2009) thì xác định TBC trên cá tra là 12,1x104 tb/mm3, nhìn chung kết quả TBC chủng T8 là cao. Tuy nhiên, Branson (1993) cho rằng các thơng số huyết học của cá liên quan đến tuổi, giới tính, khẩu phần ăn, lồi, PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 mùa vụ, nhiệt độ, cĩ lẽ vì những yếu tố này mà số lượng TBC cĩ sự chênh lệch như vậy. Bảng 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC (tế bào x 104/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri Thời điểm thu mẫu Số mẫu T8 KSL 103 CAF 258 Trước TN 5 19,1±5,9a 14,4±2,4a 14,4±2,4a Lần 1 10 6,1±1,8c 2,8±1,4c 1,6±0,9c Lần 2 10 16,2±3,3a 8±3,8b 9,6±3,6b Sau TN 4 11,8±1,5b 12,9±5,3a 12,9±5,3ab Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tương tự như sự biến động số lượng hồng cầu, từ bảng 4.3.2.1 cĩ thể thấy số lượng TBC ở cả ba chủng cũng đều giảm ở lần 1 và tăng trở lại ở lần 2. Ở đợt thu mẫu lần 1, số lượng TBC của chủng T8 được xác định trung bình là 6,1x104 tb/mm3, giảm 68,1% so với cá trước TN, nhưng ở lần 2, số lượng TBC là 16,2x104 tb/mm3, tăng 2,6 lần so với lần 1. Mặc dù số lượng TBC chủng T8 ở lần 2 thấp hơn số lượng TBC cá trước TN (15,2%) nhưng khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê giữa 2 nhĩm cá này. Ở chủng CAF 258 và chủng KSL 103 số lượng TBC lần 1 được xác định lần lược là 1,6x104 tb/mm3 và 2,8x104 tb/mm3, đối với chủng CAF 258 giảm tới 88,9% so với cá trước TN, cịn chủng KSL 103 giảm 80,5%. Đến đợt thu mẫu lần 2, số lượng TBC ở cả 2 chủng này cũng đều tăng lên so với lần 1 với số lượng TBC ở 2 chủng này lần lược là 9,6x104 tb/mm3 và 8x104 tb/mm3 nhưng vẫn cịn thấp hơn so với cá trước TN là 33,3% và 44,4%. Khi cảm nhiễm vi khuẩn E. tarda trên cá rơ phi (Oreochromis niloticus), Benli & Yildiz (2004) cho rằng tổng lượng bạch cầu tăng rất cao sau khi cảm nhiễm và báo cáo Trần Hồng Ửng (2003) cũng cho rằng như vậy. Tuy nhiên, trong những nghiên cứu gần đây thì lại cho rằng tổng bạch cầu ở cá bệnh giảm so với cá khỏe, Trần Hoa Cúc (2009) gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri trên cá tra giống cho biết TBC cá sau khi cảm nhiễm giảm xuống cịn 2,3x104 tb/mm3, trong khi đĩ TBC cá khỏe là 12,1x104 tb/mm3. Trong đánh giá các yếu tố miễn dịch khơng đặc hiệu trên cá tra nuơi trong ao bị bệnh mủ gan, Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) báo cáo TBC cá bệnh giảm 2,37 lần so với cá khỏe. Khi xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra trắng gan trắng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 mang (TGTM), Phạm Thị Phương Tiến (2008) cho rằng TBC giảm trong từng mức độ của bệnh, đối với cá TGTM nhẹ TBC giảm 67,6% so với cá khỏe, cá TGTM nặng giảm tới 90,2%, trong khi đĩ cá khơng cĩ biểu hiện TGTM thì TBC tăng 12,9% nhưng giá trị này khơng cĩ sự khác biệt thống kê. Theo Balfry et al. (1994); Yildiz (1998) và Caruso et al. (2002), tăng mật độ bạch cầu trong máu là cơ chế để vật chủ chống lại mầm bệnh xâm nhập, cịn Vosyliene (1999) tổng kết nghiên cứu của nhiều tác giả về sự biến động của các tế bào máu khi cá bị ngộ độc kim loại nặng đã đưa ra kết luận rằng, trong thời gian đầu bạch cầu của cá luơn tăng để cân bằng nội mơ, nhưng nếu tình trạng ngộ độc kéo dài TBC của cá sẽ giảm xuống chứng tỏ sự suy yếu của hệ miễn dịch ( Trích dẫn bởi Phạm Thị Phương Tiến, 2008). Máu rất dễ bị tổn thương bởi mầm bệnh trên cá và sự ảnh hưởng đĩ cĩ thể thay đổi theo lồi Hibiya (1982). Khi giải phẩu thấy gan, thận, tỳ tạng của cá bị sưng đồng thời cĩ nhiều đốm mủ trắng, đơi khi thấy thận bị nhũng, đều đĩ chứng tỏ những cơ quan này đã bị tổn thương nghiêm trọng và chức năng của nĩ cũng bị ảnh hưởng. Gan, thận là nơi dự trữ và tạo ra các tế bào máu cung cấp cho cơ thể, khi bị vi khuẩn xâm nhập các tế bào máu cũng như các tế bào bạch cầu sẽ được tăng cường sản sinh ra để chĩng chọi lại với mầm bệnh, đây cũng chính là phản ứng của hệ miễn dịch trong cơ thể cá. Khi cá bệnh nặng, tổ chức của các cơ quan này bị hủy hoại, vi khuẩn xuất hiện với mật độ cao dẫn đến tình tạng quá tải của các tế bào bạch cầu hay là các thành phần tủy trắng của tỳ tạng làm cho các tế bào này đến một lúc nào đĩ sẽ mất chức năng và thối hĩa. Tỳ tạng bị hoại tử dẫn đến mất khả năng tạo hồng cầu và phá hủy hồng cầu già, cũng như khơng thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu, mơ tạo máu bị phá hủy làm mất chức năng cung cấp máu cho cơ thể (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Đây chính là nguyên nhân làm cho số lượng hồng cầu và tổng bạch cầu đều giảm. Hiện tượng này chỉ tồn tại một thời gian, nếu hệ miễn dịch của cá chống chọi lại được với mầm bệnh thì cơ thể sẽ dần hồi phục, đều này cũng giải thích cho việc số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu cũng như các chỉ tiêu bạch cầu ở đợt thu mẫu lần 2 đều tăng lên so với lần 1. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 0 5 10 15 20 25 30 T8 KSL CAF Chủng vi khuẩn Số lư ợn g TB C (tb x1 0^ 4/ m m ^3 ) Cá khỏe Lần 1 Lần 2 Đối chứng Hình 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 4.3.2.2 Các loại tế bào bạch cầu Cĩ 4 loại bạch cầu quan sát được trong quá trình định loại và định lượng tế bào bạch cầu bao gồm: lympho, bạch cầu trung tính (BCTT), bạch cầu đơn nhân (BCĐN) và tiểu cầu, khơng tìm thấy bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính. Quan sát này phù hợp với báo các của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008), Trần Hoa Cúc (2009), Chinabut et al. (1991), Đồn Nhựt Phương (2007). Về hình thái các tế bào bạch cầu thì khơng cĩ gì biến đổi giữa cá khỏe với các lần thu mẫu và giữa các chủng vi khuẩn với nhau nhưng cĩ sự biến động rất lớn về số lượng tế bào lympho, tiểu cầu giữa cá trước TN với các đợt thu mẫu, cịn bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân nhìn chung ít biến động. Lympho: Theo Hibiya (1982) tế bào lympho chiếm 70-90% TBC của cá, kết quả định lượng lympho ở chủng T8 là156,1x103 tb/mm3, chiếm 81,2% TBC; chủng KSL 103 và chủng CAF 258 là 14,4x103 tb/mm3, chiếm 66,7% TBC, như vậy giá trị trên cũng phù hợp với giá trị của Hibiya (1982) đưa ra. Trên tiêu bản lympho, cĩ hình trịn, kích thước nhỏ hơn hồng cầu, nhân trịn, lớn, bắt màu xanh đen và tế bào chất ở dạng một lớp rất mỏng. Kết quả phân tích mẫu cá lần 1 cho thấy mật độ tế bào lympho ở cả ba chủng đều giảm cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với cá khỏe, đến đợt thu lần 2, cả ba chủng lại cùng tăng lên, theo thống kê thì mật độ tế bào lympho giữa cá khỏe với lần 2 khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê. Theo Phạm Thị Phương Tiến (2008) thì mật độ tế bào lympho càng giảm khi cá càng bệnh nặng, đối với cá bệnh TGTM nhẹ giảm 63,3%, cá bệnh TGTM nặng giảm tới 90%, cịn cá khơng bệnh TGTM trong ao cá bệnh TGTM thì lại tăng lên 11,5%. Theo Lê PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 Thị Hồng Mỹ (2007) thì lympho cĩ vai trị quan trọng trong đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào nên kết quả mật độ tế bào lympho tăng ở lần 2 cho thấy hệ miễn dịch của cá dần được phục hồi sau 12 ngày cảm nhiễm. Bảng 4.3.2.2a Sự biến động số lượng lympho (tế bào x 103/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri Thời điểm thu mẫu Số mẫu T8 KSL 103 CAF 258 Trước TN 5 156,1±52,6a 96,3±17,4bc 96,3±17,4bc Lần 1 10 42,4±13,8b 17,1±9,3a 10,6±7,7a Lần 2 10 139,9±32,7a 69,1±33,6b 77,8±27,6b Sau TN 4 74,8±29,4b 114,5±50,4c 114,5±50,4c Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tiểu cầu: Cũng giống như các lồi động vật cĩ xương sống khác, tiểu cầu cĩ vai trị quan trọng trong quá trình đơng máu. Quan sát trên tiêu bản, tiểu cầu cĩ hình thoi dài, đơi khi cĩ hình cầu, nhân bắt màu xanh đen, tế bào chất dạng viền mỏng. Sự biến động các tế bào tiểu cầu cũng giống như sự biến động các tế bào lympho, đều giảm ở lần thu mẫu đầu tiên, sau đĩ lại tăng lên. Bảng 4.3.2.2b Sự biến động số lượng tiểu cầu (tế bào x 103/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri Thời điểm thu mẫu Số mẫu T8 KSL 103 CAF 258 Trước TN 5 16,6±19,8a 38,7±29,8a 38,7±13,3a Lần 1 10 4,4±4,8a 1,8±3b 0,5±0,2b Lần 2 10 6,4±7,9a 5,6±7,2b 7,9±3,2b Sau TN 4 15,8±11,6a 5,9±5,3b 5,9±2,7b Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Bạch cầu trung tính: Trên tiêu bản cĩ thể thấy BCTT đặc trưng bởi nhân nhỏ bắt màu xanh tối và nằm lệch về một gĩc tế bào. Đơi khi thấy BCTT cĩ 2 hoặc nhiều hơn 2 nhân, tế bào chất cĩ dạng lưới màu hồng nhạt, viền tế PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 bào thường cĩ màu nhạt hơn BCĐN và bên trong tế bào chất cĩ hạt bắt màu tím xanh. Kết quả phân tích cho thấy mật độ BCTT cũng biến động theo hướng giảm xuống ở lần 1 và tăng lên ở lần 2, đối với chủng T8 và chủng CAF 258 mật độ ở lần 2 tăng hơn mật độ của cá trước TN, cịn chủng KSL 103 thì lại tiếp tục giảm nhưng các giá trị đĩ đều khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê. Bảng 4.3.2.2c Sự biến động số lượng bạch cầu trung tính (tế bào x 103/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri Thời điểm thu mẫu Số mẫu T8 KSL 103 CAF 258 Trước TN 5 12,1±10,2a 4,8±4,1a 4,8±4ab Lần 1 10 10,7±3,5a 4,1±3a 2,2±1,8a Lần 2 10 15,2±6,1a 4±2,1a 8±3,9b Sau TN 4 15,7±7,4a 6,5±3,7a 6,5±3,7b Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Bạch cầu đơn nhân: BCĐN cũng là một loại bạch cầu cĩ kích thước lớn, cĩ nhân nằm lệch về một gĩc tế bào giống như BCTT nhưng nhân cĩ hình dạng khơng cố định, bắt màu xanh đen khơng đồng nhất, tế bào chất cĩ màu xanh xám, ở một số BCĐN cĩ thể quan sát được khơng bào trong tế bào chất. Kết quả định lượng BCĐN được thể hiện ở bảng 4.3.2.2d. Giống như BCTT sự biến động về mật độ các tế bào BCĐN khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê. Bảng 4.3.2.2d Sự biến động số lượng bạch cầu đơn nhân (tế bào x 103/mm3) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri Thời điểm thu mẫu Số mẫu T8 KSL 103 CAF 258 Trước TN 5 6,5±6,5ab 3,8±2,9b 3,8±2,9a Lần 1 10 3,1±2,6a 4,8±2,5b 3±1,3a Lần 2 10 2,4±1,2a 1,1±1,1 a 3,4±1,7a Sau TN 4 11,4±13,7b 2,4±1,7ab 2,4±1,7a PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Hình 4.3.2.2 Hình thái các tế bào bạch cầu L: Lympho T: Tiểu cầu P: Bạch cầu trung tính M: Bạch cầu đơn nhân 4.4 Mức độ biến động về huyết học giữa các chủng vi khuẩn Ở mục 4.3 cho thấy cĩ sự biến động rất lớn về số lượng hồng và bạch cầu giữa 2 đợt thu mẫu, ở đợt thu mẫu lần1, hồng cầu và bạch cầu trong cơ thể cá bị thiếu hụt nghiêm trọng do đây là thời điểm bộc phát của bệnh cũng như hệ miễn dịch suy giảm, cơ thể chưa kịp phản ứng lại với tác nhân xâm nhập nhưng sau 12 ngày (đợt thu mẫu lần 2) số lượng hồng cầu và bạch cầu tăng lên cho thấy cơ thể cá đã phản ứng lại với tác nhân xâm nhập này, hệ miễn dịch dần được phục hồi. Tuy nhiên, mức độ nhiễm bệnh cịn tùy thuộc vào khả năng gây bệnh của tác nhân đĩ, vì vậy mà sự biến động về số lượng hồng cầu, bạch cầu giữa ba chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm cũng khác nhau. Kết quả phân tích cho thấy, ở đợt thu mẫu lần 1, TBC cĩ sự biến động rõ ràng nhất (cĩ ý nghĩa thống kê), trong đĩ TBC ở chủng CAF 258 giảm nhiều nhất (88,7%) kế đến là chủng KSL 103 giảm 80,4% và thấp nhất là chủng T8 giảm 68,2%. Lympho, tiểu cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân ở chủng CAF 258 và KSL 10 đều cĩ tỷ lệ giảm cao hơn (cĩ ý nghĩa thống kê) so với chủng T8, cịn giữa chủng KSL 103 và chủng CAF 258 thì khơng cĩ sai khác về mặt thống kê. Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 1. M P L M L P P T PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 Tế bào T8 KSL 103 CAF 258 Hồng cầu -72,8±7,3 a -72,8±9,4a -80,6±10,2a Tổng bạch cầu -68,2±9,5a -80,4±9,6b -88,7±6,1c Lympho -72,8±8,8a -82,2±9,6b -89±8b Tiểu cầu -74±28,4a -95,2±7,9b -100±1,7b Bạch cầu trung tính -10,4±9,2a -14,9±19,8a -53,1±11,9a Bạch cầu đơn nhân -48,5±13,9a 27,8±20,7b -20,8±10,6a Ghi chú: Các giá trị trong cùng một hàng cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Các giá trị cĩ mang dấu (-) thể hiện tỷ lệ (%) giảm so với cá khỏe. Các giá trị cĩ mang dấu (+) thể hiện tỷ lệ (%) tăng so với cá khỏe. Ở đợt thu lần 2, tỷ lệ giảm các tế bào hồng cầu và bạch cầu ở ba chủng đều giảm hơn, nhưng nhìn chung thì sự biến động này giữa các chủng vi khuẩn là như nhau về mặt thổng kê (p>0,05). Ngoại trừ, TBC chủng T8 cĩ tỷ lệ giảm cao hơn và BCTT ở chủng CAF 258 tăng cao hơn 2 chủng cịn lại (p<0,05). Nếu như TBC chủng T8 ở đợt thu lần 1 cĩ tỷ lệ giảm thấp hơn chủng KSL 103 và CAF 258 lại thì ở đợt thu lần 2 tỷ lệ giảm này cũng giảm nhanh hơn, như vậy cĩ thể nĩi khả năng hồi phục TBC ở chủng T8 nhanh hơn chủng KSL 103 và CAF 258. Riêng BCTT ở chủng CAF 258 khơng chỉ hồi phục nhanh hơn chủng T8 và chủng KSL 103 mà cịn tăng hơn 66,7% so với cá khỏe. Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 2. Tế bào T8 KSL 103 CAF 258 Hồng cầu -39,1±10,1 a -32,1±21a -35,7±13,6a Tổng bạch cầu -15±5,4a -44,2±8,5b -32,5±8ab Lympho -10,3±6,6a -28,3±11a -19,2±9a Tiểu cầu -62±46,4a -85,5±18,6a -79,5±26,5a Bạch cầu trung tính 26,6±16,1ab -16,9±14a 66,7±25,9b Bạch cầu đơn nhân -60,5±8,4a -70,7±9,6a -11,6±14,2b Ghi chú: Các giá trị trong cùng một hàng cĩ các chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). Các giá trị cĩ mang dấu (-) thể hiện tỷ lệ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 (%) giảm so với cá khỏe. Các giá trị cĩ mang dấu (+) thể hiện tỷ lệ (%) tăng so với cá khỏe. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 PHẦN 5 KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Các tế bào hồng cầu và bạch cầu ở cả 3 chủng T8, KSL 103 và CAF 258 đều biến động theo chiều hướng giảm ở thời điểm cá biểu hiện dấu hiệu bệnh lý và phục hồi trở lại sau 12 ngày gây cảm nhiễm. Sự biến động về số lượng tế bào hồng cầu giữa 3 chủng T8, KSL 103, CAF 258 là giống nhau. Ở chủng T8 cĩ tỷ lệ giảm số lượng TBC, lympho, tiểu cầu ít hơn, BCĐN thì cao hơn chủng KSL 103 và CAF 258. Khả năng phục hồi TBC ở chủng T8 nhanh hơn, cịn BCTT và BCĐN thì chủng CAF 258 nhanh hơn. 5.2 Đề xuất Tiếp tục bố trí thí nghiệm tìm hiểu các chỉ tiêu huyết học ở những thời điểm lâu hơn 12 ngày sau khi gây cảm nhiễm để biết được các chỉ tiêu huyết học này cĩ tiếp tục tăng nữa khơng? nếu tăng thì tăng tới mức độ nào? vì đây là những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu trong cơ thể cá. Nĩ cũng rất quan trọng trong nghiên cứu tạo vacxin phịng ngừa bệnh cho cá. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aqualex Multimedia Consortium Ltd Ireland, 1988. Basic Techniques in Fish Haematology. 2. Benli, C.K and Yildiz. H.Y, 2004. Blood parameters in Nile tiapia (Oreochromis niloticus L.) Spontaneously infected with Edwardsiella tarda. Aquaculture Research, 35, 1888-1380 3. Chinabut, S., Limsuwan. C. and Kitsawat. P. , 1991. Histology of the walking catfish, Clarias batrachus. International development research centre, Canada. 96pp. 4. Crumlish, M., T.T.Dung, J.F. Turnbull, N.T.N Ngoc and H.W.Ferguson, 2002. Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus, cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish diseases. 25: 733-736 5. Dương Thành Long, 2008. Tìm hiểu một số chỉ tiêu huyết học ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá rơ phi (Oreochromis niloticus). Luận văn Đại Học, khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ, 48 trang. 6. Ferguson, H.W, JF Turnbull, A Shinn, K.Thomson, TT Dung and M.Crumlish, 2001, Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, VietNam. Journal of fish diseasea 2001, 24, page 509-513. 7. Hawke, J.P, 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508-1512. 8. Hawke, J.P, A.C. Mc whorter, A.C. Seigerwalt and D.J. Brenner, 1981. E.ictaluri sp.nov, the causative agent of enteric septicemia of catfish. International Journalof systematic Bacteriology. 31: 396- 400 9. Hawke, J.P, R.M Durborow, R.L Thune and A.C Camus, 1998. ESC – Enteric Septicemia of Catfish. SRAC Publication No.477 10. Hibiya, T., 1982. An atlas of fish histology, nomal and pathological features. Tokyo. 14pp. 11. 12. J.K.Jena, P.C.Das and S.Ayyappan, 2006. Haematological changes in the three Indian major carps, Catla catla (Hamilton), Labeo rohita (Hamilton) and Cirrhinus mrigala (Hamilton) exposed to acidic and alkaline water pH .Aquaculture.2006.02.019. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 13. Keskin, O., S. Secer, M. Izgur, S. Turlyilmaz và R.S. Mkakosya, 2004. Edwardsiella ictaluri infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Turk. J. Vet. Anim. Sci. 28:649-653. 14. Lê Minh Đương, 2007. So sánh khả năng xâm nhập của hai dịng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp đại học. 15. Lê Thượng Khởi, 2009. Xác định LD50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 40trang. 16. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 51trang. 17. Lý Thị Thanh Loan, 2008. Hiện trạng mơi trường và bệnh trên cá tra nuơi ở đồng bằng song Cửu Long- Giải pháp khắc phục. Báo cáo tham luận tại hội nghị giải pháp phát triển bền vững nghề nuơi và chế biến cá tra ở đồng bằng sơng Cửu Long, Vĩnh Long, 28/4/2008. 18. M Crumlish, T T Dung, J F Turnbull, N T N Ngoc and H W Ferguson, 2002. Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish dieases, 25, 733-736. 19. M.L.Martins, J.L.P.Mouriđo , G.V.Amaral, F.N.Vieira, G.Dotta, A.M.B.Jatobá, F.S. Pedrotti, G.T.Jerơnimo, N.Buglione-Neto and J. Pereira, 2008. Haematological changes in Nile tilapia experimentally infected with Enterococcus sp. Brazilian Journal of Biology ISSN 1519- 6984. 20. Ngơ Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và A.hydrophila trên cá tra. Luận văn tốt nghiệp đại học. 21. Nguyễn Chí Dũng, 2009. Điều tra tình hình xuất hiện bệnh và theo dõi các yếu tố huyết học trên bệnh trắng gan, trắng mang trong ao ương nuơi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở tỉnh Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 41 trang PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 22. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc hĩa chất trong nuơi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tại An Giang- Cần Thơ. Luận văn cao học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 74 trang.. 23. Nguyễn Quốc Thịnh, 2002. Bước đầu nghiên cứu mơ bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 40 trang. 24. Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung, Ferguson H.W, 2003. Nghiên cứu mơ bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan. Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, chuyên ngành thủy sản, 2004, 120-125. 25. Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008. Điều tra hiện trạng nuơi, bệnh và tình hình sử dụng thuốc và hĩa chất trong nuơi thâm canh cá tra ao. Luận văn tốt nghiệp. Khoa thủy sản. Trường đại học Cần Thơ. 84 trang. 26. Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008. Đánh giá các yếu tố miễn dịch khơng đặc hiệu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuơi trong ao bị bệnh mũ gan.. Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 47 trang. 27. Phạm Thị Phương Tiến, 2008. Xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) TGTM ở một số tỉnh nuơi cá tra tại đồng bằng Sơng Cửu Long. Luận văn tốt nghiệt đại học. Khoa Thủy Sản. Trường Đại học Cần Thơ. 73 trang 28. Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 47 trang. 29. Phuong, DN, M.Efendy Abd. Wahid, A.M. Ambok Bolong, 2007. Non- specific immune response towards ascorbic acid supplementation in hybrid catfish (Claria gariepinus x C. macrocephalus) feed. Faculty of Science and Technology, Malaysia. 30. Plumb, J.A, 1999. Edwardsiella Septicaemias. Fish dieases and Disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal infections. 31. R.Harikrishnan, M.Nisharanrani and C.Balasundaram, 2003. Hematological and biochemical parameters in common carp, Cyprinus carpio, following herbal treatment for Aeromonas hydrophila infection. Aquaculture 221: 41-50. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 32. Trần Hoa Cúc, 2009. Ảnh hưởng của Antistress lên khả năng đề kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra (Pangasius hyphothalmus). Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 42 trang. 33. Trần Hồng Ửng, 2003. Bước đầu xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mơ tỳ tạng trên cá tra (pangasius hyphopthalmus) bệnh trắng gan. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy Sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 46 trang. 34. Từ Thanh Dung, 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản đại cương. Khoa Thủy Sản. Đại học Cần Thơ. 50 trang 35. Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (pangasius hyphopthalmus). Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, 2004. 373 trang. 36. Williams, M.L and M.L. Lawrence. 2005. Identification and characerization of a two component hemolysin from E. Ictaluri. Journal of aquatic animal Health. 108: 281-289. 37. Yazlak, O.Ibrahim and D.Mustafa, 2003. Haematology parameters of three Cyprinid fish species from Karakaya lake, Turkey. Journal of Biological sciences 3: 320-328. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 PHỤ LỤC 1 1 Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khơ ở nhiệt độ phịng sau đĩ hơ lướt lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lam. Các bước thực hiện: 1. Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam. Để 1 phút. 2. Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lam (khoảng 2 giây), để khơ. 3. Nhỏ dung dich Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng 1 phút. 3. Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine trên lam. 4. Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu bằng cách nghiêng lam kính rồi nhỏ từ từ dung dịch III cho đến khi giọt nước cuối trên lam khơng cịn màu tím. Rửa và để khơ. 5. Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng 2 phút. Rửa và để khơ ở nhiệt độ phịng. Quan sát ở vật kính 100X. Đọc kết quả Vi khuẩn Gram dương (G+) cĩ màu tím xanh. Vi khuẩn Gram âm (G-) cĩ màu hồng đỏ. 2 Quan sát tính di động Sự di động của vi khuẩn cĩ thể quan sát bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện như sau: 1. Cho vaseline lên 4 gĩc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. 2. Cho một giọt nước lên lame. 3. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lame hịa vào nước. 4. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame khơng chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn. 5. Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle 6. Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. 3 Phản ứng oxidase: dùng dung dịch oxidase Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm dung dịch oxidase. Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển sang màu xanh trong vịng 10 giây và ngược lại. 4 Phản ứng catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong 100ml nước cất). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 1.Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lam. 2. Nhỏ lên vi khuẩn một giọt 3% H2O2 Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại. 5 Khả năng len men và oxy hố đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: 1. Đun và khấy cho tan hồn tồn mơi trường O/F. 2. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C. 3. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml mơi trường vào ống nghiệm. 4. Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm cĩ chứa mơi trường OF. Sau đĩ phủ 0.5- 1ml dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. Theo dõi và đọc kết quả sau từ một đến bảy ngày. Lên men (F) khi ống cĩ phủ parafin chuyển sang màu vàng. Oxidation (O) khi ống khơng cĩ phủ parafin chuyển sang màu vàng. Khơng đổi (N) cả hai ống đều cĩ màu xanh lá cây hoặc xanh lơ. 6 Phản ứng decarboxylase (Arginine, Lysine, Ornithine) Các bước thực hiện: 1. Pha mơi trường Decarboxylase (cơng thức trên nhãn) + 0.5% yeast extract. 2. Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Mơi trường làm đối chứng khơng cĩ amino acid. 3. Cho 3ml mơi trường vào ống nghiệm. 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm sau đĩ phủ lên mỗi ống 0.5ml parafin tiệt trùng, để trong tủ ấm ở 280C. Đọc kết quả từ 1-4 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm cĩ amino acid chuyển màu khác với màu của ống đối chứng và ngược lại. 7 Khả năng sử dụng citrate 1. Pha mơi trường Simmon,s Citrate agar (cơng thức pha chế trên nhãn). 2. Đun sơi và khuấy cho tan. 3. Cho khoảng 6ml mơi trường vào ống nghiệm PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của ống nghiệm. Ủ ở 280C Sau 2-7 ngày, vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong mơi trường Simmon,s Citrate agar cho kết quả (+) và ngược lại. 8 Khả năng sinh H2S Các bước thực hiện: 1. Mơi trường TSI (60g/1000ml nước cất). 2. Đun và khuấy cho tan hồn tồn. 3. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội ở 450C. 4. Cho khoảng 3ml mơi trường vào ống nghiệm. 5. Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở 280C. Đọc kết quả sau 14-28 giờ Vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose và Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)). Vi khuẩn chỉ lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)). Vi khuẩn khơng lên men đường Glucose, khơng lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)). Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm. 9 Khả năng sử dụng urea. Các bước thực hiện: 1. Pha 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4+ 0.0012% Phenol Red +0.1 % Glucose 2. Thêm 2% ure cho phản ứng. Mơi trường làm đối chứng khơng cĩ urea. 3. Cho khoảng 3ml mơi trường vào ống nghiệm. 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 Đọc kết quả trong vịng 2 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm cĩ urea chuyển sang màu hồng. 10 Khả năng sinh indole Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml mơi trường Nutrient broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. 3. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vịng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của mơi trường và ngược lại. 11 Phản ứng voges- proskauer (VP) Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml mơi trường MR – VP broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. Thuốc thử: A : Hịa tan 5g alpha naphthol trong 100ml ethyl alcohol. B: Hịa tan 40g KOH trong 100ml nước cất. 3. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ 0.6ml thuốc thử A và 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút. Kết quả: Sự chuyển màu hồng của mơi trường cho phản ứng (+) và ngược lại. 12 Khả năng sử dụng các nguồn cacbohydrate Các bước thực hiện: 1. Mơi trường Nutrient broth (cơng thức pha chế trên nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) 2. Thêm 1% đường (glucose, arabinose, cellobiose…) 3. Chỉnh pH = 6.8 4. Cho khoảng 3ml mơi trường vào ống nghiệm 5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội 6. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 43 7. Đọc kết quả trong vịng 2-7 ngày Nếu mơi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại 13 b-galactosidase Cho vi khuẩn vào mơi trường NB, thêm vào 0.2ml của 1.5% NaCl. Ủ qua đêm. Sau 48 giờ cho đĩa ONPG vào, giữ 20 phút và đọc kết quả: dương tính cho màu vàng trong vịng 4 giờ, ngược lại là âm tính PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 44 PHỤ LỤC 2 CƠNG THỨC PHA CHẾ MỘT SỐ HĨA CHẤT ĐƯỢC SỬ DỤNG Dung dịch Natt & Herrick NaCl: 3,88g Na2SO4: 2,5g Na2HPO4.12H2O: 2,91g KH2PO4: 0,25g Formaline(37%): 7,5ml Methyl violet 2B: 0,1g Nước cất: 1000ml Sau khi để yên trong bĩng tối qua đêm thì tiến hành lược qua mắc lưới 125µm. Dung dịch Wright Hịa tan 1g Wright trong 600ml methanol, khuấy liên tục trong đêm. Sau đĩ lọc qua mắc mắc lưới 125µm. Dung dịch Giemsa Hịa tan 3,8g Giemsa trong 25ml Glycerol và ủ ở 600 trong 2 giờ. Sau đĩ cho thêm vào 75ml methanol. Dung dịch nhuộm sẽ được pha lỗng từ dung dịch gốc 10 lần bằng nước cất. Dung dịch pH 6.2-6.8 Hịa tan 27,6g monobacsic sodium phosphate trong 1000 ml nước cất. Hịa tan 53,6g dibasic sodium phosphate trong 1000ml nước cất. Tiến hành pha lỗng 68ml dung dịch 6g monobacsic sodium phosphate với 32ml dung dịch dibasic sodium phosphate. Dung dịch pH 6,2 Hịa tan 19,212g acid citric trong 1000ml nước cất. Hịa tan 53,628g Na2PO4.7H2O trong 100ml nước cất. Trộn 6,78ml dung dịch đầu với 13,22ml của dung dịch 2. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 45 PHỤ LỤC 3 BẢNG THƠNG TIN CHI TIẾT CỦA MẪU CÁ TIÊM CHỦNG T8 Thời điểm thu mẫu Số TT mẫu Trọng lượng mẫu (g) Chiều dài mẫu (cm) Biểu hiệu bên ngồi Biểu hiệu bên trong Kết quả vi sinh Lần 1 (Cá khỏe) 1 30 17.5 Bình thường Bình thường 2 30 17.5 Bình thường Bình thường 3 25 16 Bình thường Bình thường 4 30 17.5 Bình thường Bình thường 5 25 16 Bình thường Bình thường Lần 2 (cá cĩ dấu hiệu bệnh lý) 1 25 16.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng, gan nhạc màu X 2 30 16.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng, X 3 30 15 Da nhợt màu Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng, gan nhạc màu, dạ dày phình to X 4 40 18 Bình thường Tùy tạng, thận cĩ những đốm trắng X 5 30 17 Bình thường Thận trước cĩ những đốm trắng X 6 40 19 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 7 30 16 Bình thường Thận trước cĩ những đốm trắng, gan nhạc màu, ruột và thành bụng bị xuất huyết nhẹ X 8 30 17.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 9 25 16.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng, gan nhạc màu X 10 30 16 Bình thường Thận trước cĩ những đốm trắng, gan nhạc màu, ruột và thành bụng bị xuất huyết nhẹ X PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 46 Lần 3 ( cá sau thí ngiệm) 1 25 16 Da nhợt màu Thận, tùy tạng cĩ đốm trắng, dạ dày phình to X 2 25 15.5 Bình thường Thận cĩ những đốm trắng X 3 30 16.5 Bình thường Tùy tạng cĩ những đốm trắng, gan nạc màu X 4 25 16.5 Bình thường Thận bị nhủn, gan nhạc màu, dạ dày phình to 5 30 17 Bình thường Thận bị nhủn, gan nhạc màu, dạ dày phình to 6 30 17 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ những đốm trắng X 7 25 15.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ những đốm trắng X 8 35 18.5 Bình thường Thận, túy tạng cĩ những đốm trắng X 9 30 17.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ những đốm trắng, gan nhạc màu. X 10 30 17 Da nhợt màu Thận, tùy tạng, gan cĩ những đốm trắng X Đối chứng tiêm nước muối sinh lý 1 30 15 Bình thường Bình thường 2 30 16,5 Bình thường Bình thường 3 25 16,5 Bình thường Bình thường 4 30 17 Bình thường Bình thường 5 23 15 Bình thường Bình thường Đối chứng khơng tiêm 1 25 16 Bình thường Bình thường 2 27 17 Bình thường Bình thường 3 30 16,5 Bình thường Bình thường PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 47 PHỤ LỤC 4 BẢNG THƠNG TIN CHI TIẾT CỦA MẪU CÁ TIÊM CHỦNG KSL 103 Thời điểm thu mẫu Số TT mẫu Trọng lượng mẫu (g) Chiều dài mẫu (cm) Biểu hiệu bên ngồi Biểu hiệu bên trong Kết quả vi sinh Lần 1 (Cá khỏe) 1 25 16 Bình thường Bình thường 2 15 12 Bình thường Bình thường 3 15 12 Bình thường Bình thường 4 12 12 Bình thường Bình thường 5 18 13 Bình thường Bình thường Lần 2 (cá cĩ dấu hiệu bệnh lý) 1 20 15 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ đốm trắng X 2 30 17 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng, dạ dày phình to X 3 20 15 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 4 20 13.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 5 20 16 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 6 15 13 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 7 25 15.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng, ruột và xoang bụng bị xuất huyết nhẹ X 8 20 15.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ đốm trắng X 9 20 16 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 10 15 13 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 48 Lần 3 ( cá sau thí ngiệm) 1 20 15 Bình thường Thận trước, tùy tạng cĩ những đốm trắng X 2 15 15.5 Bình thường Tùy tạng cĩ đốm trắng, thận bị nhủn X 3 20 15 Bình thường Thận bị nhủn, gan nhạc màu 4 18 14.5 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 5 25 15.5 Bình thường Tùy tạng cĩ đốm trắng, thận bị nhủn X 6 25 15 Da nhợt màu Thận bị nhủn, gan nhạc màu 7 15 13.5 Bình thường Thận bị nhủn, gan nhạc màu 8 20 15 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ đốm trắng X 9 20 15 Bình thường Thận, tùy tạng cĩ đốm trắng X 10 19 15.5 Bình thường Thận, gan nhạc màu, dạ dày phình to Đối chứng tiêm nước muối sinh lý 1 20 15 Bình thường Bình thường 2 20 15 Bình thường Bình thường 3 19 15.5 Bình thường Bình thường 4 15 12.5 Bình thường Bình thường Đối chứng khơng tiêm 1 18 14.5 Bình thường Bình thường 2 25 15.5 Bình thường Bình thường 3 15 13.5 Bình thường Bình thường PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 49 PHỤ LỤC 5 BẢNG THƠNG TIN CHI TIẾT CỦA MẪU CÁ TIÊM CHỦNG CAF 258 Thời điểm thu mẫu Số TT mẫu Trọng lượng mẫu (g) Chiều dài mẫu (cm) Biểu hiệu bên ngồi Biểu hiệu bên trong Kết quả vi sinh Lần 1 (Cá khỏe) 1 25 16 Bình thường Bình thường 2 15 12 Bình thường Bình thường 3 15 12 Bình thường Bình thường 4 12 12 Bình thường Bình thường 5 18 13 Bình thường Bình thường Lần 2 (cá cĩ dấu hiệu bệnh lý) 1 11 12 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ đốm trắng X 2 10 11.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 3 10 12.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 4 11 13 Da nhợt màu Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 5 15 13 Da nhợt màu Thận, tùy tạng cĩ nhiều đốm trắng X 6 11 12 Bình thường Thận, tùy tạng, cĩ nhiều đốm trắng, dạ dày phình to X 7 11 11.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ đốm trắng X 8 15 13 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ đốm trắng X 9 10 12 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 10 15 13 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ đốm trắng X PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 50 Lần 3 ( cá sau thí ngiệm) 1 10 12 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 2 11 11.5 Bình thường Thận trước, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 3 10 12 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 4 10 11.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 5 10 11.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 6 15 14 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 7 11 12.5 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 8 15 13 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 9 14 12 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X 10 13 11 Bình thường Thận, tùy tạng, gan cĩ nhiều đốm trắng X Đối chứng tiêm nước muối sinh lý 1 20 15 Bình thường Bình thường 2 20 15 Bình thường Bình thường 3 19 15.5 Bình thường Bình thường 4 15 12.5 Bình thường Bình thường Đối chứng khơng tiêm 1 18 14.5 Bình thường Bình thường 2 25 15.5 Bình thường Bình thường 3 15 13.5 Bình thường Bình thường PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 51 PHỤ LỤC 6 BẢNG PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TIÊM CHỦNG T8 Lần Thu Mẫu Số mẫu thu Mật Độ HC (tb/mm3) 1500 tế bào TBC (tb/mm3) 200 tế bào Mật Độ Từng Loại Bạch Cầu ( tế bào/ mm3) HC BC L T N M L T N M Lần 1 (Cá khỏe) 1 1740000 1390 110 137698 177 2 9 12 121863 1377 6196 8262 2 1575000 1365 135 155769 130 63 4 3 101250 49067 3115 2337 3 2160000 1325 175 285283 165 4 19 12 235358 5706 27102 17117 4 2520000 1385 115 209242 170 21 5 4 177856 21970 5231 4185 5 2335000 1389 101 169788 170 6 22 1 144319 5094 18677 849 Lần2 ( Thu đợt giữa) 1 675000 1371 156 76805 155 5 37 3 59524 1920 14209 1152 2 675000 1343 173 86951 134 11 50 5 58257 4782 21738 2174 3 950000 1144 385 319712 60 68 60 12 95913 108702 95913 19183 4 785000 1259 251 156501 135 21 36 8 105638 16433 28170 6260 5 270000 1322 194 39622 131 51 13 5 25952 10104 2575 991 6 630000 1375 136 62313 154 0 37 9 47981 0 11528 2804 7 910000 1250 251 182728 97 10 50 43 88623 9136 45682 39287 8 900000 1368 223 146711 98 7 83 12 71888 5135 60885 8803 9 580000 1336 181 78578 153 0 41 6 60112 0 16108 2357 10 300000 1369 134 29364 135 9 51 5 19821 1321 7488 734 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 52 Lần 3 ( Thu đợt cuối) 1 1350000 1352 207 206694 194 2 2 0 200493 2067 2067 0 2 2950000 1325 199 443057 182 3 14 1 403182 6646 31014 2215 3 1040000 1320 180 141818 165 0 33 2 117000 0 23400 1418 4 1475000 1363 176 190462 139 2 53 6 132371 1905 50472 5714 5 1195000 1320 181 163860 147 0 48 5 120437 0 39326 4096 6 860000 1291 233 155213 183 3 14 0 142020 2328 10865 0 7 2445000 1331 212 389437 130 6 60 4 253134 11683 116831 7789 8 1180000 1373 200 171886 156 2 42 0 134071 1719 36096 0 9 1220000 1308 197 183746 170 20 8 2 156184 18375 7350 1837 10 1020000 1397 114 83236 181 8 7 4 75328 3329 2913 1665 Đối chứng tiêm nước muối sinh lý 1 1590000 1459 86 93722 140 9 46 5 65605 4217 21556 2343 2 1025000 1539 54 35965 61 37 38 64 10969 6654 6833 11509 3 1805000 1422 77 97739 127 38 20 15 62064 18570 9774 7330 4 1650000 1442 91 104126 167 3 22 8 86945 1562 11454 4165 5 1755000 1498 87 101926 131 52 10 7 66761 26501 5096 3567 Đối chứng khơng tiêm 1 1445000 1465 35 34522 133 27 24 16 22957 4660 4143 2762 2 1290000 1450 63 56048 106 50 40 4 29706 14012 11210 1121 3 1415000 1358 148 154212 130 28 32 10 100238 21590 24674 7711 Ghi chú: HC: hồng cầu TBC: tổng bach cầu T: tiểu cầu M: bạch cấu đơn nhân BC: bạch cầu L: lympho N: bạch cầu trung tính PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 53 PHỤ LỤC 7 BẢNG PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TIÊM CHỦNG KSL 103 Lần Thu Mẫu Số mẫu thu Mật Độ HC (tb/mm3) 1500 tế bào TBC (tb/mm3) 200 tế bào Mật Độ Từng Loại Bạch Cầu (tế bào/ mm3) HC BC L T N M L T N M Lần 1 (Cá khỏe) 1 1590000 1400 100 113571 149 43 4 4 84611 24418 2271 2271 2 2350000 1407 93 155330 108 79 5 8 83878 61356 3883 6213 3 1855000 1387 113 151128 167 8 15 10 126192 6045 11335 7556 4 1645000 1394 106 125086 152 38 9 1 95065 23766 5629 625 5 2620000 1407 93 173177 106 90 1 3 91784 77930 866 2598 Lần 2 ( Thu đợt giữa) 1 910000 1590 69 39491 141 47 4 8 27841 9280 790 1580 2 660000 1630 51 20650 115 2 40 43 11874 207 4130 4440 3 590000 1539 69 26452 90 10 2 98 11904 1323 265 12962 4 480000 1500 51 16320 139 3 7 51 11342 245 571 4162 5 225000 1650 15 2045 143 10 26 21 1463 102 266 215 6 555000 1331 169 70470 123 0 37 40 43339 0 13037 14094 7 805000 1259 241 154095 75 2 90 33 57785 1541 69343 25426 8 385000 1425 75 20263 121 1 23 55 12259 101 2330 5572 9 390000 1447 100 26952 93 38 69 12533 5121 9299 0 10 585000 1453 108 43482 129 5 16 50 28046 1087 3479 10871 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 54 Lần 3( Thu đợt cuối) 1 2140000 1540 57 79208 182 2 12 4 72079 792 4752 1584 2 1090000 1595 105 71755 170 20 9 1 60992 7176 3229 359 3 1075000 1475 54 39356 179 11 9 1 35224 2165 1771 197 4 1355000 1503 114 102774 190 8 2 0 97636 4111 1028 0 5 550000 1500 3 1100 161 4 31 4 886 22 171 22 6 1975000 1556 106 134544 123 72 5 0 82744 48436 3364 0 7 1260000 1555 44 35653 159 22 15 4 28344 3922 2674 713 8 940000 1550 97 58826 178 4 17 1 52355 1177 5000 294 9 1630000 1430 127 144762 185 5 6 4 133905 3619 4343 2895 10 1090000 1497 122 88831 173 17 8 2 76839 7551 3553 888 Đối chứng tiêm nước muối sinh lý 1 1925000 1536 126 157910 174 17 3 6 137382 13422 2369 4737 2 2055000 1533 58 77750 166 3 27 4 64532 1166 10496 1555 3 1805000 1402 147 189255 184 6 9 1 174114 5678 8516 946 4 1715000 1430 77 92346 178 7 10 5 82188 3232 4617 2309 Đối chứng khơng tiêm 1 1110000 1414 100 78501 127 45 25 3 49848 17663 9813 1178 2 1765000 1398 130 164127 176 2 13 9 144432 1641 10668 7386 3 1195000 1560 51 39067 163 6 23 8 31840 1172 4493 1563 Ghi chú: HC: hồng cầu TBC: tổng bach cầu T: tiểu cầu M: bạch cấu đơn nhân BC: bạch cầu L: lympho N: bạch cầu trung tính PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 55 PHỤ LỤC 8 BẢNG PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TIÊM CHỦNG CAF 258 Thời điểm thu mẫu Số mẫu thu Mật Độ HC (tb/mm3) 1500 tế bào TBC (tb/mm3) 200 tế bào Mật Độ Từng Loại Bạch Cầu (tb/mm3) HC BC L T N M L T N M Lần 1 (Cá khỏe) 1 1590000 1400 100 113571 149 43 4 4 84611 24418 2271 2271 2 2350000 1407 93 155330 108 79 5 8 83878 61356 3883 6213 3 1855000 1387 113 151128 167 8 15 10 126192 6045 11335 7556 4 1645000 1394 106 125086 152 38 9 1 95065 23766 5629 625 5 2620000 1407 93 173177 106 90 1 3 91784 77930 866 2598 Lần 2 ( cá nhiễm bệng) 1 1420000 1730 67 54994 177 14 3 6 48670 3850 825 1650 2 280000 1400 115 23000 140 0 19 41 16100 0 2185 4715 3 520000 1440 77 27806 113 7 37 43 15710 973 5144 5978 4 90000 1580 58 3304 65 5 28 102 1074 83 463 1685 5 315000 1495 81 17067 39 5 58 98 3328 427 4949 8363 6 295000 1570 68 12777 131 0 27 42 8369 0 1725 2683 7 430000 1554 28 7748 99 2 40 59 3835 77 1550 2286 8 250000 1579 48 7600 137 3 18 52 5206 114 684 1976 9 635000 1459 41 17844 143 0 15 42 12759 0 1338 3747 10 285000 1428 72 14370 53 4 96 57 3808 287 6897 4095 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 56 Lần 3 (cá sau thí nghiệm) 1 1325000 1378 185 177885 162 12 15 11 144087 10673 13341 9784 2 1025000 1127 361 328327 152 33 9 6 249529 54174 14775 9850 3 1475000 1441 59 60392 178 1 18 3 53749 302 5435 906 4 1710000 1419 93 112072 133 51 22 4 74528 28578 12328 2241 5 1090000 1419 117 89873 172 10 9 9 77291 4494 4044 4044 6 1360000 1455 50 46735 189 0 6 5 44165 0 1402 1168 7 980000 1426 74 50856 162 1 26 11 41193 254 6611 2797 8 1070000 1439 134 99639 160 2 37 1 79711 996 18433 498 9 1055000 1385 162 123401 157 0 35 8 96870 0 21595 4936 10 1710000 1386 150 185065 179 7 14 0 165633 6477 12955 0 Đối chứng tiêm nước muối sinh lý 1 1925000 1536 126 157910 174 17 3 6 137382 13422 2369 4737 2 2055000 1533 58 77750 166 3 27 4 64532 1166 10496 1555 3 1805000 1402 147 189255 184 6 9 1 174114 5678 8516 946 4 1715000 1430 77 92346 178 7 10 5 82188 3232 4617 2309 Đối chứng khơng tiêm 1 1110000 1414 100 78501 127 45 25 3 49848 17663 9813 1178 2 1765000 1398 130 164127 176 2 13 9 144432 1641 10668 7386 3 1195000 1560 51 39067 163 6 23 8 31840 1172 4493 1563 Ghi chú: HC: hồng cầu TBC: tổng bach cầu T: tiểu cầu M: bạch cấu đơn nhân BC: bạch cầu L: lympho N: bạch cầu trung tính PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 57 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 58 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version