Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam

®ñ "Rainbow" ®· ®­îc ®¨ng ký b¶n quyÒn vµ trë thµnh gièng ®u ®ñ chuyÓn gen th­¬ng m¹i ho¸ ®Çu tiªn trªn thÕ giíi cã kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i PRSV [9]. Ngoµi ra, gen NIb cña PRSV còng ®­îc quan t©m nghiªn cøu. §· cã nhiÒu n­íc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen NIb nh­ ë Th¸i Lan, Poonpipit vµ céng sù (2001) ®· ph©n lËp ®­îc gen NIb cña PRSV cã kÝch th­íc 1596bp [40]; ë Trung Quèc, Ye vµ céng sù (2002) ph©n lËp ®­îc gen NIb cña PRSV cã kÝch th­íc 1600bp [47]... Nh­ng hiÖn nay viÖc nghiªn cøu chuyÓn gen NIb vµo c©y ®u ®ñ ®Ó t¹o c©y kh¸ng bÖnh vÉn cßn ®ang ®­îc tiÕp tôc tiÕn hµnh, ch­a cã gièng th­¬ng phÈm nµo ®­îc ®­a ra thÞ tr­êng. Tuy nhiªn, ®· cã nhiÒu c©y trång chuyÓn gen NIb kh¸ng virut g©y bÖnh kh¸c nhau trªn thÕ giíi ®­îc t¹o ra nh­ c©y ®Ëu, c©y thuèc l¸, c©y khoai t©y... N¨m 1998, Jones vµ céng sù ®· t¹o ra ®­îc ba dßng ®Ëu chuyÓn gen NIb kh¸ng PSbMV (pea seed-borne mosaic potyvirus), trong ®ã dßng PSbMV-DPD1 biÓu hiÖn tÝnh kh¸ng cao ngay lÇn nhiÔm ®Çu tiªn. Theo «ng, tÝnh kh¸ng cña c©y ®Ëu phô thuéc vµo mËt ®é cña virut nhiÔm trªn c©y vµ sè b¶n copy cña gen NIb [31]. Khoai t©y còng lµ ®èi t­îng c©y trång ®­îc nghiªn cøu nhiÒu vÒ chuyÓn gen NIb kh¸ng c¸c lo¹i virut kh¸c nhau nh­ PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus)... N¨m 2004, Schubert vµ céng sù ®· t¹o ra ®­îc c©y khoai t©y chuyÓn gen NIb kh¸ng PVY trong nhµ kÝnh [18,21]. ë c©y thuèc l¸, Suzuki vµ céng sù còng ®· chuyÓn gen sao chÐp ARNs 1 vµ 2 cña CMV (cucumber mosaic virus) thµnh c«ng t¹o ra nh÷ng dßng thuèc l¸ V1 vµ V2, sau ®ã ®em lai hai dßng nµy víi nhau t¹o ra dßng V1V2. KÕt qu¶ lµ dßng V1V2 cã tÝnh kh¸ng cao h¬n so víi dßng V1 vµ V2 [41]. 1.5. Mét sè kü thuËt sinh häc ph©n tö øng dông trong nghiªn cøu bÖnh virut 1.5.1. Kü thuËt RT-PCR Kü thuËt RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) lµ sù kÕt hîp cña hai ph¶n øng sao m· ng­îc (reverse transcription) vµ PCR ®Ó nh©n lªn mét ®o¹n gen quan t©m tõ ARN (H×nh 4). Kü thuËt nµy gåm hai giai ®o¹n: Tæng hîp sîi cADN thø nhÊt: Nguyªn lý cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ sö dông enzym sao m· ng­îc (reverse transcriptase) ®Ó tæng hîp nªn sîi cADN thø nhÊt tõ ARN. Tïy theo môc ®Ých cña thÝ nghiÖm mµ c¸c lo¹i ARN ®­îc sö dông kh¸c nhau. NÕu muèn nh©n mét ®o¹n gen cña sinh vËt bËc cao mµ kh«ng cã intron th× ng­êi ta th­êng tæng hîp cADN tõ mARN víi måi oligo(dT)s. NÕu lµ sinh vËt bËc thÊp nh­ vi khuÈn, virut... ng­êi ta cã thÓ tæng hîp cADN tõ ARN tæng sè víi måi ngÉu nhiªn hoÆc måi ®Æc hiÖu cho gen cÇn nh©n lªn. Khi måi g¾n bæ sung víi sîi ARN khu«n enzym sao m· ng­îc sÏ xóc t¸c cho qu¸ tr×nh tæng hîp cADN tõ c¸c nucleotit tù do cã trong thµnh phÇn ph¶n øng ë mét nhiÖt ®é thÝch hîp. Ph¶n øng tæng hîp cADN chØ x¶y ra trong mét chu kú, theo lý thuyÕt sau khi kÕt thóc ph¶n øng ta sÏ thu ®­îc l­îng cADN t­¬ng øng víi l­îng ARN khu«n ban ®Çu. §Ó t¨ng hiÖu qu¶ cña qu¸ tr×nh tæng hîp, l­îng måi ®­îc cho vµo lín h¬n rÊt nhiÒu l­îng ARN khu«n vµ chÊt k×m h·m RNase còng ®­îc ®­a vµo ®Ó b¶o vÖ cho ARN khái bÞ c¾t bëi RNase. KhuÕch ®¹i gen b»ng PCR: dNTPs 1. Reverse Transcription 2. PCR ARN tæng sè cADN (mÉu PCR) Reverse transcriptase dNTPs Måi nhÉu nhiªn S¶n phÈm PCR Primer-F Primer-R Taq polymerase H×nh 4. S¬ ®å minh häa kü thuËt RT-PCR Sö dông cADN lµm khu«n ®Ó khuÕch ®¹i gen quan t©m b»ng ph¶n øng PCR víi cÆp måi ®Æc hiÖu (Primer-F vµ Primer-R). Nguyªn t¾c cña kü thuËt PCR ®­îc tr×nh bµy ë môc 1.5.2. 1.5.2. Kü thuËt PCR Kü thuËt PCR (Polymerase Chain Reaction – chuçi ph¶n øng trïng hîp) ®­îc Mullis vµ céng sù m« t¶ ®Çu tiªn n¨m 1985. §©y lµ kü thuËt in vitro, t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n cho phÐp nh©n nhanh mét sè l­îng kh«ng h¹n chÕ nguyªn b¶n mét ®o¹n ADN nhÊt ®Þnh trong mét kho¶ng thêi gian ng¾n, nhê sù xóc t¸c cña ADN polymerase. TÊt c¶ c¸c ADN polymerase khi ho¹t ®éng tæng hîp mét m¹ch ADN míi tõ m¹ch khu«n ®Òu cÇn sù hiÖn diÖn cña nh÷ng måi ®Æc hiÖu. Måi lµ nh÷ng ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ sung víi mét ®Çu cña m¹ch khu«n vµ ADN polymerase sÏ nèi dµi måi ®Ó h×nh thµnh m¹ch míi. Qu¸ tr×nh nh©n b¶n b»ng enzym nµy bao gåm 3 b­íc ®­îc lÆp l¹i nhiÒu lÇn: - BiÕn tÝnh ADN tõ d¹ng sîi kÐp thµnh d¹ng sîi ®¬n b»ng c¸ch n©ng cao nhiÖt ®é lªn 94-950C trong kho¶ng thêi gian 30 gi©y ®Õn 1 phót. - G¾n måi (primer) víi ®o¹n ADN cÇn nh©n th«ng qua h¹ nhiÖt ®é xuèng 40-600C, trong kho¶ng thêi gian 30 gi©y ®Õn 1 phót, phô thuéc vµo ®é dµi vµ tØ lÖ G+C cña ®o¹n måi. - Ph¶n øng polymerase tæng hîp ph©n tö ADN kÐo dµi tõ ®o¹n måi. Hai ph©n tö ADN míi ®­îc tæng hîp theo nguyªn t¾c bæ sung tõ hai ®Çu ph©n tö khu«n ban ®Çu. Thêi gian kÐo dµi tõ 30 gi©y ®Õn vµi phót. §Ó tr¸nh hiÖn t­îng b¾t cÆp kh«ng ®Æc thï, ph¶n øng tæng hîp nªn ®­îc thùc hiÖn ë 720C. Lo¹i polymerase dïng trong PCR lµ lo¹i chÞu nhiÖt (Taq polymerase) ®­îc t¸ch chiÕt tõ vi khuÈn Thermus aquaticus, mét lo¹i vi khuÈn ®­îc ph©n lËp tõ suèi n­íc nãng. HiÖn nay, enzym nµy chñ yÕu ®­îc s¶n xuÊt theo con ®­êng t¸i tæ hîp. Nh­ vËy, sau mçi chu kú ph¶n øng l­îng ADN cÇn nh©n b¶n sÏ t¨ng gÊp ®«i, víi N sîi khu«n ban ®Çu sau n chu kú sÏ cã Nx2n sîi ADN ®­îc nh©n lªn. VÝ dô, sau kho¶ng 20 chu kú cã tíi trªn 30 triÖu b¶n ®­îc nh©n lªn tõ mét sîi khu«n ban ®Çu [1,3]. 1.5.3. Kü thuËt biÕn n¹p plasmit vµo E. coli BiÕn n¹p theo nghÜa réng lµ: ®­a bÊt kú ADN nµo vµo bÊt kú tÕ bµo nµo. Trong tr­êng hîp c¸c tÕ bµo E. coli th× biÕn n¹p cã nghÜa lµ ®­a ADN plasmit vµo trong tÕ bµo. LÇn ®Çu tiªn biÕn n¹p ë vi khuÈn ®­îc Frederick Griffith m« t¶ vµo n¨m 1928 trong thÝ nghiÖm næi tiÕng cña «ng vÒ c¸i gäi lµ “nguyªn lý biÕn n¹p”. Trªn thùc tÕ, ph¸t minh nµy vÒ sau ®· chøng minh r»ng c¸c gen ®­îc cÊu thµnh tõ ADN. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i tÊt c¶ c¸c vi khuÈn ®Òu cã thÓ ®­îc biÕn n¹p mét c¸ch dÔ dµng. §Ó cho biÕn n¹p ë E. coli cã hiÖu qu¶, c¸c tÕ bµo cÇn trë nªn kh¶ biÕn (competent). §Ó ®¹t ®­îc ®iÒu nµy, ng­êi ta ng©m c¸c tÕ bµo trong dung dÞch CaCl2 l¹nh trong ®¸, khi ®ã c¸c tÕ bµo trë nªn kh¶ biÕn theo mét c¸ch mµ cho ®Õn nay vÉn ch­a râ nguyªn nh©n. ViÖc biÕn n¹p c¸c tÕ bµo kh¶ biÕn ®­îc thùc hiÖn b»ng c¸ch trén ADN plasmit víi c¸c tÕ bµo, råi ñ trong ®¸ 20-30 phót, sau ®ã t¹o mét sèc nhiÖt ng¾n (kho¶ng 1 phót ë 420C), lµm nh­ vËy ADN sÏ chui vµo tÕ bµo. Sau khi biÕn n¹p, vi khuÈn ®­îc nu«i phôc håi trong m«i tr­êng LB ë 370C trong vßng 60 ®Õn 90 phót. Sau ®ã, c¸c tÕ bµo ®­îc ®­a lªn m«i tr­êng chän läc ®Ó nh©n lªn c¸c tÕ bµo cã plasmit. Trong qu¸ tr×nh biÕn n¹p, chØ cã mét phÇn rÊt nhá c¸c tÕ bµo kh¶ biÕn ®­îc biÕn n¹p. MÆc dï cã nh­îc ®iÓm rÊt lín nµy, biÕn n¹p vÉn lµ mét kü thuËt quan träng, nã cã thÓ t¹o ra tíi 109 c¸c tÕ bµo biÕn n¹p (tøc c¸c thÓ biÕn n¹p) khi ®­a 1 microgam ADN vµo thÝ nghiÖm. Th­êng trªn thùc tÕ víi 1 microgam ADN ng­êi ta t¹o ra ®­îc 106 ®Õn 107 tÕ bµo biÕn n¹p [8]. 1.5.4. Kü thuËt t¸ch dßng T¸ch dßng gen lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu ®­îc sö dông trong kü thuËt di truyÒn vµ lµ b­íc khëi nguån cho c¸c kü thuËt sau nµy [7]. Môc ®Ých cña viÖc t¸ch dßng lµ nh»m thu ®­îc mét l­îng lín b¶n sao cña tr×nh tù gen quan t©m. §Çu tiªn, ADN ngo¹i lai ®­îc nèi vµo mét vect¬ nh»m t¹o ra ADN t¸i tæ hîp. Vect¬ sö dông lµ plasmit thÝch øng cña vi khuÈn E. coli. Sau ®ã vect¬ t¸i tæ hîp ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo chñ vµ tÕ bµo chñ ®­îc nu«i cÊy trong m«i tr­êng thÝch hîp ®Ó nh©n vi khuÈn lªn nhiÒu lÇn. TÕ bµo chñ ë ®©y lµ vi khuÈn E. coli. Cuèi cïng qua c¸c b­íc t¸ch chiÕt ADN, ng­êi ta sÏ thu ®­îc mét l­îng lín plasmit t¸i tæ hîp [3]. C¸c nh©n tè nh­ vect¬, tÕ bµo chñ cã thÓ thay ®æi nh­ng tiÕn tr×nh t¸ch dßng nãi chung ®­îc thùc hiÖn qua 4 b­íc: xö lý ADN cÇn t¹o dßng, t¹o vect¬ t¸i tæ hîp, biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ, chän dßng. Xö lý ADN cÇn t¹o dßng Tr­íc hÕt ADN cÇn t¹o dßng ®­îc khuÕch ®¹i b»ng PCR víi cÆp måi ®Æc hiÖu. S¶n phÈm PCR sau ®ã ®­îc lµm s¹ch ®Ó thu ®­îc ph©n ®o¹n ADN cã kÝch th­íc nh­ mong muèn, lo¹i bá måi vµ c¸c thµnh phÇn kh¸c trong ph¶n øng PCR. B­íc nµy nh»m t¹o ®iÒu kiÖn cho b­íc chän dßng ®­îc thùc hiÖn nhanh vµ hiÖu qu¶, tr¸nh nh÷ng plasmit t¸i tæ hîp cã kÝch th­íc kh«ng mong muèn. T¹o vect¬ t¸i tæ hîp Vect¬ t¸i tæ hîp ®­îc t¹o ra b»ng c¸ch g¾n gen quan t©m (®o¹n ADN cÇn t¹o dßng) vµo vect¬ t¸ch dßng. Th«ng th­êng, sau khi ch¹y PCR víi enzym Taq polymerase, enzym nµy sÏ g¾n thªm mét nucleotit lµ Adenin vµo ®Çu 3’ cña ®o¹n gen ®­îc nh©n lªn. Lîi dông tÝnh chÊt nµy c¸c nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu thiÕt kÕ c¸c thÕ hÖ vect¬ t¸ch dßng cã mang mét nucleotit lµ Thymin ë ®Çu 5’ cña vect¬ ®· ®­îc më vßng s½n t¹i PCS (polycloning site-vïng nh©n dßng ®a ®iÓm c¾t). HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu vect¬ t¸ch dßng cã ®Æc tÝnh nµy, nh­ pCRÒ2.1-TOPO, pGEMÒ-T... Vect¬ t¸ch dßng vµ ADN cÇn t¹o dßng ®­îc trén chung theo mét tû lÖ nhÊt ®Þnh d­íi sù xóc t¸c cña enzym T4 ligase, ADN sÏ ®­îc g¾n vµo vect¬ theo nguyªn t¾c bæ sung A-T t¹i vÞ trÝ më vßng. BiÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ Trong qu¸ tr×nh g¾n gen vµo vect¬ sÏ h×nh thµnh nªn c¸c vect¬ t¸i tæ hîp kh¸c nhau. B­íc nµy nh»m môc ®Ých sö dông bé m¸y cña tÕ bµo chñ ®Ó sao chÐp vect¬ t¸i tæ hîp thµnh mét sè l­îng lín b¶n sao. Tuú vµo môc ®Ých sö dông, ng­êi ta sÏ chän tÕ bµo chñ lµ tÕ bµo E. coli hay tÕ bµo nÊm men. Chän dßng Chän läc vi khuÈn t¸i tæ hîp theo hai c¸ch th«ng dông: chän läc theo ph­¬ng ph¸p kh¸ng sinh (kanamycin hoÆc ampicillin) nh»m lo¹i trõ c¸c tÕ bµo vi khuÈn kh«ng ®­îc biÕn n¹p vµ c¸c lo¹i vi khuÈn nhiÔm t¹p kh¸c vµ chän läc theo ph¶n øng víi c¬ chÊt (X-gal) nh»m lo¹i trõ nh÷ng vi khuÈn cã mang vect¬ nh­ng kh«ng cã ®o¹n gen ®­îc chen vµo. 1.4.5. Kü thuËt PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu ph­¬ng ph¸p ®Ó x¸c ®Þnh tÕ bµo vi khuÈn cã plasmit mang gen mong muèn, nh­ ph­¬ng ph¸p colony-PCR, c¾t plasmit b»ng c¸c enzym h¹n chÕ, hoÆc PCR tõ plasmit. Trong ®ã ph­¬ng ph¸p colony-PCR cho phÐp ph¸t hiÖn nhanh khuÈn l¹c mang plasmit t¸i tæ hîp mong muèn. Ph­¬ng ph¸p nµy cã ­u ®iÓm lµ nhanh, Ýt tèn kÐm vµ ®¬n gi¶n. HiÖn nay, kü thuËt nµy ®­îc øng dông rÊt réng r·i trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö. Nguyªn t¾c kü thuËt colony-PCR dùa trªn nguyªn t¾c kü thuËt PCR, chØ kh¸c ë chç mÉu ADN ®­îc thay b»ng ADN plasmit gi¶i phãng tõ khuÈn l¹c. ë nhiÖt ®é cao (94-950C), mµng tÕ bµo vi khuÈn bÞ ph¸ vì, gi¶i phãng plasmit t¸i tæ hîp. Plasmit t¸i tæ hîp nµy sÏ lµm khu«n cho ph¶n øng PCR nh©n gen b»ng cÆp måi ®Æc hiÖu. 1.4.6. Kü thuËt x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit Nh÷ng ph­¬ng ph¸p ®äc tr×nh tù axit nucleic ®ang ®­îc sö dông hiÖn nay ®Òu ®­îc c¶i tiÕn tõ ph­¬ng ph¸p enzym häc th«ng qua viÖc sö dông c¸c dideoxynucleotit cña Sanger vµ céng sù (1977). Ph­¬ng ph¸p nµy dùa vµo sù tæng hîp nhê enzym ADN polymerase m¹ch bæ sung cho tr×nh tù ADN m¹ch ®¬n cÇn x¸c ®Þnh. §Æc tr­ng cña ph­¬ng ph¸p lµ ngoµi bèn lo¹i nucleotit th«ng th­êng cßn sö dông thªm bèn lo¹i dideoxynucleotit lµ nh÷ng deoxynucleotit trong ®ã nhãm 3’OH ®­îc thay b»ng H. §iÒu nµy khiÕn cho c¸c dideoxynucleotit kh«ng cßn kh¶ n¨ng h×nh thµnh c¸c cÇu nèi phosphodiester vµ do ®ã ngõng qu¸ tr×nh tæng hîp. Trong kü thuËt ®äc tr×nh tù nucleotit tù ®éng, mçi dideoxynucleotit ®­îc ®¸nh dÊu b»ng mét fluochrome cã mµu kh¸c nhau. Nh­ vËy, tÊt c¶ oligonucleotit cïng chÊm døt t¹i mét lo¹i dideoxynucleotit sÏ cã cïng mét mµu. Sau khi ®iÖn di trong èng vi mao qu¶n, t¹o ra mét d·y c¸c ph©n ®o¹n ADN h¬n kÐm nhau mét nucleotit. ThiÕt bÞ ph¸t hiÖn huúnh quang (detector) ph¸t hiÖn c¸c b¨ng theo thêi gian, b¨ng nµo xa nhÊt ®­îc ph¸t hiÖn tr­íc. Detector ph¸t tÝn hiÖu lªn m¸y tÝnh. Detector lµ mét thiÕt bÞ khuÕch ®¹i tÝn hiÖu. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù sÏ ®­îc xö lý b»ng phÇn mÒm m¸y tÝnh chuyªn dông. Ch­¬ng 2. VËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. VËt liÖu 2.1.1. VËt liÖu nghiªn cøu Nghiªn cøu vÒ ®¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng cña c¸c dßng virus g©y bÖnh ®èm vßng ®u ®ñ cña ViÖt Nam th«ng qua t¸ch dßng, x¸c ®Þnh vµ so s¸nh tr×nh tù gen m· ho¸ protein vá (CP) cho thÊy 16 dßng PRSV ph©n lËp tõ c¸c khu vùc kh¸c nhau cña ViÖt Nam cã møc ®é gièng nhau tõ 89,7% ®Õn 99,8%. Trong ®ã 4 dßng virus Tuyªn Quang, Kon Tum, Sµi Gßn vµ CÇn Th¬ lµ c¸c dßng cã tÝnh ®¹i diÖn cao nhÊt cho c¸c vïng ®­îc nghiªn cøu. Tõ c¬ së trªn 4 mÉu l¸ ®u ®ñ nhiÔm PRSV ®­îc thu tõ 4 vïng trªn cña ViÖt Nam ®· ®­îc sö dông trong nghiªn cøu nµy (B¶ng 4). B¶ng 4. Danh s¸ch c¸c mÉu l¸ ®u ®ñ nhiÔm PRSV ®­îc sö dông trong nghiªn cøu STT Tªn vïng thu mÉu Ký hiÖu 1 Tuyªn Quang TQ 2 CÇn Th¬ CT 3 Kon Tum KT 4 Sµi Gßn SG B¶ng 5. M· sè c¸c tr×nh tù gen NIb trong Ng©n hµng gen quèc tÕ STT M· sè trong NCBI Vïng ph©n lËp ViÕt t¾t 1 AY162218 Th¸i Lan AY162218-TH 2 AY010722 Th¸i Lan AY010722-TH 3 AF405532 Th¸i Lan AF405532-TH 4 AF405531 Th¸i Lan AF405531-TH 5 AF405530 Th¸i Lan AF405530-TH 6 AF405529 Th¸i Lan AF405529-TH 7 AF469604 Trung Quèc AF469604-China 8 X96538 Trung Quèc X96538-China-SM 9 X78557 §µi Loan X78557-Taiwan 10 X67673 Hawaii X67673-HA 11 S46722 Hawaii S46722-HA 2.1.2. Ho¸ chÊt, thiÕt bÞ + Ho¸ chÊt Thang ADN 1 kb (Fermentas) Kit t¸ch chiÕt ARN (Trizol Regents Kit), bé ho¸ chÊt sö dông cho RT-PCR (Cloned AMV Reverse Transcriptase Kit) cña h·ng Invitrogen (Mü). Kit tinh s¹ch ADN (QIAquick Gel Extraction Kit), vµ t¸ch chiÕt plasmit (QIAprep Spin Miniprep Kit) cña h·ng QIAGEN (§øc). Kit g¾n gen vµo vect¬ pGEMÒ-T cña h·ng Promega C¸c ho¸ chÊt th«ng dông kh¸c (Ampicillin, IPTG, X-gal, Agarose,…) cña h·ng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech. + ThiÕt bÞ M¸y ly t©m, m¸y soi gel, bé ®iÖn di, tñ cÊy v« trïng, m¸y chôp ¶nh, pipet man, m¸y lµm kh« ADN (Speed Vac), m¸y PCR, m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit tù ®éng vµ c¸c trang thiÕt bÞ kh¸c. 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu Thu thËp mÉu PRSV H×nh 7. S¬ ®å thÝ nghiÖm T¸ch ARN tæng sè Nh©n gen NIb b»ng RT-PCR Khai th¸c tr×nh tù trong NCBI ThiÕt kÕ måi T¸ch dßng gen X¸c ®Þnh vµ so s¸nh tr×nh tù 2.2.1. Ph­¬ng ph¸p thiÕt kÕ måi Khai th¸c d÷ liÖu trong Ng©n hµng gen Quèc tÕ ®Ó t×m ra tÊt c¶ c¸c tr×nh tù gen NIb cña PRSV. Sö dông ch­¬ng tr×nh phÇn mÒm DNAstar, BioEdit ®Ó so s¸nh c¸c tr×nh tù cña c¸c gen NIb víi nhau. §Ó nh©n ®­îc toµn bé gen NIb th× cÇn ph¶i thiÕt kÕ måi xu«i n»m trong gen NIa vµ måi ng­îc n»m trong gen CP. ViÖc thiÕt kÕ måi ®­îc thùc hiÖn t¹i c¸c vïng cã ®é b¶o thñ cao nhÊt. Trªn s¬ së ®ã, c¸c måi ®Æc hiÖu NIb-F1 vµ CP- R3 ®­îc thiÕt kÕ ®Ó nh©n gen NIb. 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ARN tæng sè Sö dông bé Kit Trizol Regents (cña h·ng Invitrogen) ®Ó t¸ch chiÕt ARN tæng sè tõ c¸c mÉu l¸ ®u ®ñ nhiÔm PRSV theo chØ dÉn cña nhµ s¶n xuÊt. Quy tr×nh: - C©n 100mg l¸ ®u ®ñ nhiÔm PRSV, nghiÒn nhanh trong nit¬ láng, ®¶m b¶o mÉu ph¶i ®­îc nghiÒn triÖt ®Ó vµ tr¸nh enzym Rnase c¾t ARN. - Sau ®ã chuyÓn ngay mÉu vµo èng eppendorf 2ml. - Bæ sung 1ml Trizol regents, ®¶o ®Òu ë nhiÖt ®é phßng (15-300C) trong 5 phót. - Bæ sung 200ml Chloroform : Isoamyl (24:1), ®¶o ®Òu ë nhiÖt ®é phßng trong 5 phót. - Ly t©m 10.000 v/p trong 15 phót. - Hót 500ml dÞch næi, chuyÓn sang èng eppendorf 1,5ml. - Bæ sung 500ml isopropanol (40C), l¾c nhÑ èng ®Ó ARN kÕt tña. - §Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 10 phót. Ly t©m 10.000 v/p trong 15 phót. - Lo¹i bá dÞch næi, röa tña ARN b»ng ethanol 70% pha trong DEPC 0,01%. - Ly t©m 6000 v/p trong 5 phót. - Lµm kh« ARN b»ng m¸y Speed Vac trong kho¶ng 3 phót. - Pha lo·ng ARN trong 40ml n­íc ®· xö lý b»ng DEPC 0,01%. - ñ ë nhiÖt ®é 550C trong 5 phót ®Ó ARN tan hÕt. - LÊy 1ml ARN tæng sè ®iÖn di kiÓm tra chÊt l­îng trªn gel agarose 1%. Chó ý: Do ARN dÔ bÞ RNase c¾t, nªn tÊt c¶ c¸c dông cô ®Òu ph¶i xö lý DEPC tr­íc khi sö dông. 2.2.3. Ph­¬ng ph¸p RT-PCR ARN tæng sè ®­îc sö dông ®Ó nh©n gen NIb b»ng kü thuËt RT-PCR hai b­íc (RT-PCR two steps): + Tæng hîp cADN - Bæ sung c¸c thµnh phÇn sau ®©y vµo èng PCR 0,5ml ®· ®­îc xö lý DEPC hoÆc èng free ARN: 100ng måi ngÉu nhiªn (2ml), 10pg - 5mg ARN tæng sè (2ml), 2ml dNTPs 10mM (10mM mçi lo¹i dATP, dGTP, dTTP vµ dCTP, ë pH trung tÝnh), tiÕp theo bæ sung n­íc khö ion, khö trïng tíi thÓ tÝch 13ml. - ñ ë 650C trong 5 phót, sau ®ã ®Æt vµo ®¸. - TiÕp tôc bæ sung c¸c thµnh phÇn sau vµo èng ph¶n øng trªn: 4ml buffer 5X, 1ml DTT 0,1M, 1ml chÊt øc chÕ Ribonuclease t¸i tæ hîp RNase OUTTM (40 ®¬n vÞ/ml), 1ml Cloned AMV RT (15 ®¬n vÞ/ml). - Trén mÉu nhÑ nhµng, sau ®ã thùc hiÖn 1 chu kú nhiÖt nh­ sau: B¶ng 6. Chu kú nhiÖt cho ph¶n øng tæng hîp cADN B­íc NhiÖt ®é (0C) Thêi gian (phót) 1 25 10 2 45 55 3 85 5 4 4 ¥ +Ph¶n øng PCR Sau khi tæng hîp cADN, tiÕn hµnh ch¹y PCR víi cÆp måi ®Æc hiÖu NIb-F1 vµ CP-R3 ®Ó khuÕch ®¹i gen NIb. B¶ng 7. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR STT Thµnh phÇn ThÓ tÝch (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 N­íc cÊt khö ion, khö trïng Dung dÞch ®Öm (10X) MgCl2 dNTPs NIb-F1 CP-R3 Taq polymerase cADN 28,6 5 5 4 2 2 0,4 3 Tæng 50 B¶ng 8. Chu kú nhiÖt cho ph¶n øng PCR B­íc Ph¶n øng NhiÖt ®é (0C) Thêi gian Chu kú 1 2 3 4 5 6 BiÕn tÝnh BiÕn tÝnh G¾n måi KÐo dµi chuçi Hoµn tÊt kÐo dµi KÕt thóc ph¶n øng 94 94 52 72 72 4 3 phót 1 phót 30 gi©y 2 phót 10 phót ¥ 1 32 1 2.2.4. Ph­¬ng ph¸p t¹o plasmit t¸i tæ hîp mang gen NIb S¶n phÈm PCR cña gen NIb ®­îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel agarose 1%. Sau ®ã ®­îc lµm s¹ch (th«i gel) theo bé Kit QIAquick Gel Extraction vµ g¾n vµo vect¬ t¸ch dßng pGEMÒ-T cña h·ng Promega. C¸c b­íc tiÕn hµnh nh­ sau: + Th«i gel s¶n phÈm PCR: - §iÖn di s¶n phÈm PCR trªn gel agarose 1% vµ c¾t lÊy b¨ng quan t©m, cã kÝch th­íc kho¶ng 2kb. - Bæ sung dung dÞch QG theo tû lÖ: VmÉu : VQG = 1 : 3 (1ml t­¬ng øng víi 1mg mÉu). - ñ ë 500C trong 15 phót, 3 phót trén mÉu nhÑ mét lÇn, sau khi gel tan hÕt ñ thªm 5 phót cho gel tan hoµn toµn. - ChuyÓn hçn hîp dung dÞch lªn cét th«i gel, ly t©m 13.000 v/p trong 1 phót. Lo¹i bá dÞch ch¶y qua cét. - Bæ sung 500ml dung dÞch QG, ly t©m 13.000 v/p 1 phót. - Thªm 750ml dung dÞch PE vµo cét, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 5 phót. - Ly t©m 13.000 v/p trong 1 phót, ®æ dÞch ch¶y qua cét, ly t©m bæ sung 1 phót ®Ó lo¹i bá hÕt dung dÞch PE. - Hoµ tan ADN trong 30 – 50ml n­íc cÊt hoÆc dung dÞch EB, ®· ®­îc lµm Êm ®Õn 500C, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 1 phót, sau ®ã ly t©m 13.000 v/p trong 1 phót. + G¾n gen vµo vect¬ t¸ch dßng pGEMÒ-T S¶n phÈm th«i gel ®­îc g¾n vµo vect¬ t¸ch dßng pGEMÒ-T theo bé Kit pGEMÒ-T System cña h·ng Promega. B¶ng 9. Thµnh phÇn ph¶n øng g¾n gen vµo vect¬ STT Thµnh phÇn ThÓ tÝch (ml) 1 2 3 4 5 §Öm g¾n gen vµo vect¬ 2X ADN Vect¬ pGEMÒ-T rATP T4 ligase 10 7,5 1 0,5 1 Tæng 20 Hçn hîp ®­îc ñ ë nhiÖt ®é phßng trong 2 giê vµ sau ®ã ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a. 2.2.5. BiÕn n¹p vect¬ t¸i tæi hîp vµo tÕ bµo E.coli DH5a + ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn: TÕ bµo E.coli DH5a ®­îc cÊy ria trªn m«i tr­êng LB ®Æc vµ nu«i qua ®ªm ë 370C. Chän mét khuÈn l¹c nu«i cÊy trong 5ml LB láng, l¾c 200 v/p, ë 370C, qua ®ªm. Hót 1% dÞch khuÈn ë trªn cho vµo 50ml LB láng, l¾c 200 v/p, ë 370C, trong 2-3 giê, ®o OD600nm ®¹t 0,4 - 0,6 th× chuyÓn dÞch nu«i cÊy sang èng ly t©m, ®Ó 15 phót ë trong ®¸ (hoÆc ë 40C). Ly t©m 4000 v/p, ë 40C, trong 5 phót. Thu cÆn vµ hoµ tan trong 30ml CaCl2 0,1M, ®Ó trong ®¸ 15 phót, sau ®ã ly t©m 4000 v/p, ë 40C, trong 5 phót (lÆp l¹i ba lÇn, ®Ó trong ®¸ lÇn thø hai 30 phót, lÇn thø ba 60 phót). §æ dÞch CaCl2, hßa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban ®Çu. Bæ sung 15-20% Glycerol. Chia 50ml dÞch tÕ bµo kh¶ biÕn vµo mçi èng eppendorf 1,5ml. B¶o qu¶n tÕ bµo kh¶ biÕn trong tñ l¹nh -840C. + BiÕn n¹p: Bæ sung 20ml vect¬ ®· g¾n gen vµo èng ®ùng tÕ bµo kh¶ biÕn vµ trén nhÑ. Hçn hîp ®­îc ®Æt trong ®¸ 30 phót, råi ñ ë 420C chÝnh x¸c 1 phót vµ sau ®ã ®Æt vµo ®¸ 5 phót. Bæ sung 300ml m«i tr­êng LB láng, hçn hîp ®­îc nu«i ë 370C, l¾c 200 v/p trong 1 giê. Sö dông que cÊy tr¶i, tr¶i 150-250ml dÞch khuÈn lªn ®Üa m«i tr­êng LB ®Æc cã chøa 100mg/l Ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100mM. ñ ®Üa ë 370C trong 16 giê. 2.2.6. Ph­¬ng ph¸p PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) Sau khi nu«i khuÈn ®· biÕn n¹p trªn m«i tr­êng chän läc, thu ®­îc nh÷ng khuÈn l¹c xanh tr¾ng, tiÕn hµnh chän ra 5 khuÈn l¹c tr¾ng cña mçi mÉu ®Ó ch¹y colony-PCR víi cÆp måi pUC18-F1 vµ pUC18-R1 n»m trªn vect¬, ®Ó x¸c ®Þnh khuÈn l¹c cã plasmit mang gen NIb. Thµnh phÇn ph¶n øng colony-PCR t­¬ng tù PCR nh­ng chØ thay mÉu ADN b»ng khuÈn l¹c. §iÖn di kiÓm tra s¶n phÈm colony-PCR trªn gel agarose 1% ®Ó chän ra c¸c khuÈn l¹c mang gen cã kÝch th­íc nh­ mong muèn. §ång thêi, nu«i nh÷ng khuÈn l¹c nµy vµo 3ml LB láng cã bæ sung Ampicillin 100mg/l ®Ó t¸ch plasmit. 2.2.7. T¸ch chiÕt plasmit Sö dông Kit QIAprep Spin Miniprep (cña h·ng QIAGEN) vµ chØ dÉn cña nhµ s¶n xuÊt ®Ó t¸ch chiÕt plasmit. §©y lµ ph­¬ng ph¸p t¸ch plasmid l­îng bÐ tõ 1-1,5 ml dÞch khuÈn E. coli, cã sè b¶n copy plasmit cao. Quy tr×nh: - Hót 1,5 ml dÞch khuÈn E.coli ®· nu«i qua ®ªm trong m«i tr­êng LB láng cho vµo èng eppendorf 1,5 ml. Ly t©m 7000 v/p trong 5 phót ®Ó thu tÕ bµo. - Hßa tan tÕ bµo trong 250ml buffer P1. Ch¾c ch¾n r»ng RNase ®· ®­îc bæ sung vµo buffer P1. - Bæ sung 250ml buffer P2, ®¶o èng nhÑ nhµng 4 – 6 lÇn ®Ó trén ®Òu. Kh«ng votex, v× sÏ lµm lÉn víi ADN genom. CÇn thiÕt cã thÓ ®¶o èng cho ®Õn khi nh×n thÊy dÞch tr¾ng s÷a. Kh«ng ®Ó ph¶n øng ph©n gi¶i qu¸ 5 phót. - Bæ sung 350ml buffer N3, ®¶o èng ngay lËp tøc nh­ng nhÑ nhµng 4-6 lÇn. Tr¸nh kÕt tña côc bé, ®¶o ®Òu dung dÞch nhÑ nhµng nh­ng liªn tôc ngay sau khi bæ sung buffer N3. Dung dÞch trë nªn cã mµu tr¾ng s÷a. - Ly t©m ë 13.000 v/p trong 10 phót. Hót dÞch næi cho vµo cét QIAprep Spin Miniprep. - Ly t©m ë 13.000 v/p trong 30-60 gi©y, lo¹i bá dÞch ch¶y qua cét. - Röa cét QIAprep Spin Miniprep b»ng c¸ch bæ sung 0,5ml buffer PB vµ ly t©m ë 13.000 v/p trong 30-60 gi©y. Lo¹i bá dÞch ch¶y qua cét. - B­íc nµy lµ rÊt cÇn thiÕt ®Ó lo¹i bá ho¹t tÝnh cña nuclease khi sö dông chñng endA+ nh­ JM, HB101 hoÆc c¸c thÕ hÖ kh¸c cña nã còng nh­ c¸c chñng d¹i mµ cã møc ®é ho¹t tÝnh cao cña nuclease hoÆc nång ®é carbonhydrate cao. Chñng tÕ bµo chñ nh­ XL-1 vµ DH5a kh«ng cÇn thiÕt ph¶i sö dông b­íc röa nµy. - Röa cét QIAprep Spin Miniprrep b»ng c¸ch bæ sung 0,75ml buffer PE vµ ly t©m ë 13.000 v/p trong 30-60 gi©y. - Lo¹i bá dÞch ch¶y qua cét, vµ ly t©m bæ sung ë 13.000 v/p trong 1 phót ®Ó lo¹i bá hÕt buffer röa. Chó ý: Buffer röa sãt l¹i kh«ng ®­îc lo¹i bá hoµn toµn trõ khi dÞch ch¶y qua cét ®­îc lo¹i bá tr­íc khi thùc hiÖn b­íc ly t©m bæ sung. Ethanol sãt l¹i tõ buffer PE cã thÓ øc chÕ c¸c ph¶n øng enzym tiÕp theo. - §Æt cét trong mét èng eppendorf 1,5ml. Hßa tan ADN, bæ sung 50ml EB hoÆc n­íc cÊt tíi t©m cña mçi cét QIAprep Spin Miniprrep, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 1 phót vµ ly t©m ë 13.000 v/p trong 1 phót. - TiÕn hµnh ®iÖn di kiÓm tra s¶n phÈm tich s¹ch plasmit trªn gel agarose 1%. 2.2.8. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit Gen NIb ®­îc x¸c ®Þnh tr×nh tù trªn m¸y ®äc tù ®éng ABI PRIMÒ 3100 Avant Genetic Analyzer b»ng c¸ch sö dông bé ho¸ chÊt sinh chuÈn bigDyeÒ Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Thµnh phÇn vµ chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng PCR ®äc tr×nh tù trªn m¸y lu©n nhiÖt GeneAmpâ PCR System 9700 nh­ sau: B¶ng 10. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR STT Thµnh phÇn ThÓ tÝch (ml) 1 2 3 4 Dung dÞch ®Öm (5X) Måi ADN mÉu (~200 ng) BigDye 3 1,275 7,725 3 Tæng 15 B¶ng 11. Chu kú nhiÖt cho ph¶n øng PCR B­íc Ph¶n øng NhiÖt ®é (0C) Thêi gian Chu kú 1 2 3 4 5 6 BiÕn tÝnh BiÕn tÝnh G¾n måi KÐo dµi chuçi Hoµn tÊt kÐo dµi KÕt thóc ph¶n øng 96 96 55 60 72 4 1 phót 10 gi©y 5 gi©y 4 phót 8 phót 30 phót 1 25 1 S¶n phÈm PCR ®­îc tinh s¹ch b»ng c¸ch bæ sung 5ml EDTA 125mM, 60ml cån 100% vµ ñ ë nhiÖt ®é phßng trong 15 phót. TiÕp ®ã ly t©m 12.000 v/p, trong 15 phót ®Ó kÕt tña c¸c ®o¹n ADN, sau ®ã lo¹i bá cån. Bæ sung 60ml ethanol 70% vµ ly t©m 10.000 v/p trong 10 phót. Lµm kh« kÕt tña ADN, bæ sung 10ml Hi-DiTM Formamide vµ biÕn tÝnh ë 950C trong 5 phót. C¸c mÉu ®­îc tra vµo c¸c giÕng cña khay ®ùng mÉu, sau ®ã ®iÖn di trong èng mao qu¶n 80cm x 50ml víi polymer POP-4TMcña h·ng ABI, Mü. KÕt qu¶ ®­îc xö lý b»ng phÇn mÒm ADNstar. 2.2.9. Ph­¬ng ph¸p subclone (t¸ch d­íi dßng) §o¹n gen cÇn x¸c ®Þnh tr×nh tù cã chiÒu dµi kho¶ng 2000bp, nÕu ®äc hai chiÒu th× chØ ®­îc 1500-1600bp. Mét ®o¹n kho¶ng 400-500bp vÉn kh«ng x¸c ®Þnh ®­îc tr×nh tù. Do ®ã, cÇn ph¶i tiÕn hµnh subclone th× míi x¸c ®×nh ®Çy ®ñ tr×nh tù ®o¹n gen nµy. Muèn tiÕn hµnh subclone tr­íc hÕt ph¶i x¸c ®Þnh tr×nh tù mét chiÒu nµo ®ã cña tr×nh tù gen, sau ®ã x¸c ®Þnh c¸c vÞ trÝ c¾t cña c¸c enzym giíi h¹n. Chän c¸c vÞ trÝ c¾t enzym giíi h¹n trªn gen vµ t¹i PCS ph¶i kh¸c nhau. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i chän enzym SphII t¹i PCS vµ PglII n»m trªn gen c¸ch ®Çu 5’ cña gen kho¶ng 600bp. Enzym giíi h¹n SphI c¾t tèt nhÊt trong buffer II, BglII c¾t tèt nhÊt trong buffer III, chØ c¾t ®­îc 75% trong bufffer II. §Ó c¾t ®ång thêi 2 enzym nµy th× cÇn sö dông buffer II vµ t¨ng l­îng enzym còng nh­ thêi gian c¾t. C¸c b­íc ®­îc tiÕn hµnh nh­ sau. 1) C¾t plasmit b»ng 2 enzym h¹n chÕ Sph I vµ Bgl II. B¶ng 12. Thµnh phÇn ph¶n øng c¾t enzym STT Thµnh phÇn ThÓ tÝch (ml) 1 2 3 4 Plasmit Buffer II Sph I Bgl II 7 1 1 1 Tæng 10 Hçn hîp ph¶n øng ®­îc ñ ë 370C trong 5 giê. Sau ®ã, ®iÖn di s¶n phÈm c¾t enzym trªn gel agarose 1%. Th«i gel vµ tinh s¹ch s¶n phÈm c¾t enzym b¨ng plasmit cã kÝch th­íc kho¶ng 4400bp. 2) Xö lý s¶n phÈm c¾t enzym b»ng enzym klenow trong 15 phót ë nhiÖt ®é phßng vµ tinh s¹ch. 3) TiÕp tôc thùc tiÖn ph¶n øng ghÐp nèi plasmit (ph¶n øng tù ®ãng vßng). 4) BiÕn n¹p plasmit vµo tÕ bµo E.coli DH5a. 5) T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù. 2.2.10. Ph­¬ng ph¸p xö lý tr×nh tù gen thu ®­îc Sö dông ch­¬ng tr×nh phÇn mÒm DNAstar ®Ó ph©n tÝch, so s¸nh tr×nh tù gen thu ®­îc. C¸c b­íc tiÕn hµnh nh­ sau: + So s¸nh tr×nh tù gen ®­îc ®äc tõ hai ®Çu xu«i vµ ®Çu ng­îc ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù ®Çy ®ñ vµ ®óng cña gen. + X¸c ®Þnh ®­îc vÞ trÝ, sè l­îng c¸c enzym h¹n chÕ trªn tr×nh tù ADN. + Gi¶i m· tr×nh tù nucleotit sang tr×nh tù axit amin theo mét trong c¸c khung ®äc më, x¸c ®Þnh vÞ trÝ më ®Çu vµ kÕt thóc dÞch m·. + LËp c©y ph©n lo¹i vµ b¶ng hÖ sè ®ång d¹ng so s¸nh møc ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña 4 tr×nh tù nucleotit cña 4 dßng gen NIb thu ®­îc víi nhau vµ víi tr×nh tù gen NIb cña c¸c PRSV tõ nhiÒu khu vùc kh¸c nhau trªn thÕ giíi ®· ®­îc c«ng bè trong ng©n hµng d÷ liÖu gen (NCBI) (b¶ng 5). Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. kÕt qu¶ ThiÕt kÕ måi §Ó nh©n ®­îc ®o¹n gen NIb b»ng kü thuËt RT-PCR ®iÒu quan träng lµ ph¶i cã cÆp måi ®Æc hiÖu cho ®o¹n gen nµy. 16 tr×nh tù cña gen Nib ®· ®­îc khai th¸c trong NCBI. C¸c tr×nh tù nµy ®­îc so s¸nh víi nhau nhê ch­¬ng tr×nh phÇn mÒm DNAstar. Víi môc ®Ých chØ sö dông 1 cÆp måi cã thÓ nh©n ®­îc nhiÒu dßng virus kh¸c nhau, chóng t«i ®· chän nh÷ng vïng tr×nh tù cã ®é b¶o thñ cao nhÊt vµ kÕt qu¶ ®· thiÕt kÕ ®­îc cÆp måi NIb-F1 vµ CP-R3. B¶ng 9. Tr×nh tù vµ c¸c th«ng sè cÇn thiÕt hai måi NIb-F1 vµ CP-R3 Måi Tr×nh tù måi Tm (0C) % GC NIb-F1 5’-GAGCTCTCAAAGTGTGGGA-3’ 58 52 CP-R3 5’-GCGGATTATACTGAAGAAGAT-3’ 58 38,1 NIb-F1 CP CP-R3 NIb 2000bp 1500bp NIa H×nh 4. VÞ trÝ g¾n c¸c primer ®Ó nh©n gen NIb Theo tÝnh to¸n ®o¹n gen ®­îc nh©n lªn cã kÝch th­íc kho¶ng 2000 bp, gåm gen NIb vµ mét phÇn gen CP. 3.2. KÕt qu¶ t¸ch arn tæng sè Yªu cÇu ®Çu tiªn trong nghiªn cøu nµy lµ ph¶i t¸ch chiÕt ®­îc ARN tæng sè cã chÊt l­îng tèt. §Õn nay cã kh¸ nhiÒu ph­¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ARN tæng sè cña thùc vËt ®· ®­îc nghiªn cøu, c¶i tiÕn vµ øng dông cho phï hîp víi tõng ®èi t­îng vµ ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm kh¸c nhau nh­ ph­¬ng ph¸p cña Napoli vµ céng sù (1990), Sambrook vµ céng sù (2001)... Trong thÝ nghiÖm nµy, ®Ó t¸ch chiÕt ARN tæng sè tõ mÉu l¸ ®u ®ñ nhiÔm PRSV cã chÊt l­îng tèt, chóng t«i ®· sö dông bé kit Trizol Regents cña h·ng Invitrogen (Mü). H×nh 5. KÕt qu¶ ®iÖn di ARN tæng sè trªn gel agarose 1% M. ThangADN 100 bp; 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG 300 bp Kh¸c víi ph©n tö ADN, ARN lµ ph©n tö kh«ng bÒn, dÔ bÞ ph©n huû bëi c¸c ribonuclease (RNase). H¬n n÷a c¸c RNase l¹i cã mÆt kh¾p n¬i, cã ho¹t tÝnh rÊt m¹nh vµ rÊt bÒn (thËm chÝ viÖc xö lý nhiÖt ë 1000C trong 1 giê còng kh«ng lµm mÊt ho¹t tÝnh RNase). Tõ nh÷ng lý do ®ã, viÖc t¸ch chiÕt ARN ®ßi hái nhiÒu biÖn ph¸p thËn träng ®Ó tr¸nh mäi t¹p nhiÔm chøa RNase tõ m«i tr­êng. TÊt c¶ c¸c dông cô ph¶i ®­îc xö lý cÈn thËn tr­íc khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm: cèi chµy s­ ®­îc xö lý 2000C trong 3 giê, èng eppendorf, ®Çu tip...®Òu ®­îc xö lý trong DEPC 0,1%. C¸c ho¸ chÊt kh¸c ®­îc pha trong n­íc DEPC 0,01%. B­íc ®Çu tiªn trong qua tr×nh t¸ch chiÕt ARN lµ nghiÒn mÉu thùc vËt trong nit¬ láng. B­íc nµy gióp ph¸ vë tÕ bµo vµ gi¶i phãng c¸c thµnh phÇn trong tÕ bµo, ®ßi hái ph¶i thao t¸c nhanh. Sau khi nghiÒn nhanh thµnh d¹ng bét mÞn ph¶i bæ sung ngay Trizol regents v× nÕu kh«ng nuclease néi bµo ®­îc gi¶i phãng sÏ ph©n c¾t ARN. C¸c thµnh phÇn trong Trizol regents nh­: phenol, guanidine isothiocyanate sÏ nhanh chãng kÕt tña protein, polysaccarit cã trong hçn hîp. ViÖc bæ sung thªm chloroform : isoamyl (24:1) còng cã t¸c dông kÕt tña c¸c hîp chÊt trªn vµ t¸ch pha tèt trong qu¸ tr×nh ly t©m. S¶n phÈm ARN tæng sè ®­îc hoµ tan trong n­íc DEPC 0,01% cã t¸c dông ng¨n c¶n qu¸ tr×nh RNase ph©n gi¶i ARN. ¶nh ®iÖn di ARN tæng sè ®­îc tr×nh bµy trªn h×nh 5 cho thÊy ARN tæng sè ®­îc t¸ch cã hµm l­îng lín, tuy nhiªn chóng t«i kh«ng sö dông ®iÖn di ®å rARN nªn kh«ng thÓ ph©n t¸ch c¸c b¨ng cña rARN tèt. Chóng t«i kÕt luËn ®· t¸ch chiÕt thµnh c«ng ARN tæng sè. §Ó kh¼ng ®Þnh chÊt l­îng vµ hµm l­îng ARN cña virus cã ®­îc t¸ch chiÕt trong ARN tæng sè hay kh«ng chØ cã thÓ thùc hiÖn ph¶n øng RT-PCR. 3.3. KÕt qu¶ RT-PCR ARN tæng sè sau khi t¸ch chiÕt ®­îc sö dông cho ph¶n øng RT-PCR ®Ó nh©n gen NIb víi cÆp måi ®· ®­îc thiÕt kÕ ë trªn. NÕu ph¶n øng RT-PCR x¶y ra ®Æc hiÖu, theo lý thuyÕt mét b¨ng ADN duy nhÊt cã kÝch th­íc kho¶ng 2000 bp sÏ ®­îc nh©n lªn. HiÖu qu¶ cña ph¶n øng RT-PCR cã thÓ gi¶m do nh÷ng nguyªn nh©n nh­: l­îng ARN virus qu¸ Ýt hoÆc qu¸ nhiÒu, nång ®é måi qu¸ cao hoÆc qu¸ thÊp hoÆc nhiÖt ®é b¾t cÆp måi ch­a phï hîp… V× vËy, trong qu¸ tr×nh tiÕn hµnh ph¶n øng chóng t«i tiÕn hµnh ®iÒu chØnh l­îng mÉu, nång ®é måi, Mg2+, nhiÖt ®é b¾t cÆp måi…®Ó ®¶m b¶o cho ph¶n øng RT-PCR x¶y ra ®Æc hiÖu nhÊt. Thµnh phÇn hçn hîp ph¶n øng vµ chu kú nhiÖt cña ph¶n øng ®· ®­îc tèi ­u ho¸ ®­îc tr×nh bµy ë môc 2.2.3. KÕt qu¶ RT-PCR ®­îc ®iÖn di kiÓm tra trªn gel agagaarose 1% (h×nh 6) cho thÊy chóng t«i ®· nh©n ®­îc 1 ph©n ®o¹n ADN ®Æc hiÖu cã kÝch th­íc kho¶ng 2000pb so víi thang ADN 1kb, kÝch th­íc ph©n ®o¹n ADN nµy phï hîp víi kÝch th­íc ph©n ®o¹n ADN khi thiÕt kÕ måi. Hµm l­îng cña s¶n phÈm RT-PCR ®ñ lín cho môc ®Ých t¸ch dßng gen. Chóng t«i s¬ bé kÕt luËn ®· nh©n b¶n thµnh c«ng gen NIb b»ng kü thuËt RT-PCR. Tuy nhiªn, ch­a thÓ kÕt luËn chÝnh x¸c ®ã lµ gen NIb, muèn vËy ph¶i tiÕn hµnh t¸ch dßng gen vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù. 2 Kb H×nh 6. KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra s¶n phÈm RT-PCR trªn gel agarose 1% M. Thang ADN 1 Kb; 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG 3.4. KÕt qu¶ t¸ch dßng 3.4.1. KÕt qu¶ th«i gel Qu¸ tr×nh t¸ch dßng ®­îc thùc hiÖn b»ng c¸ch g¾n s¶n phÈm PCR vµo vect¬ t¸ch dßng pGEMÒ-T cña h·ng Promega. §Ó viÖc g¾n hiÖu qu¶, s¶n phÈm PCR ph¶i ®­îc lµm s¹ch, chØ thu duy nhÊt mét b¨ng ®Æc hiÖu vµ lo¹i bá c¸c thµnh phÇn t¹p chÊt trong s¶n phÈm PCR nh­: måi, ®Öm, enzym... Qu¸ tr×nh lµm s¹ch ADN (th«i gel) ®­îc thùc hiÖn theo sù h­íng dÉn cña bé kit QIAquick Gel Extraction nh­ ®· m« t¶ ë môc 2.2.4. Khi n©ng nhiÖt ®é dÞch ®Öm QG lªn nhiÖt ®é 500C th× l­îng ADN ®­îc hoµ vµo dung dÞch vµ t¸ch khái agarose. Sau ®ã, ADN ®­îc g¾n vµo c¸c ph©n tö cã ¸i lùc cao víi ADN cè ®Þnh trªn mµng läc cña cét läc QIAquick spin column, dÞch ®Öm QG ®­îc lo¹i ®i nhê ly t©m nhanh víi tèc ®é cao (13.000 v/p, 1 phót). §Ó lo¹i bá hÕt agarose cßn b¸m trªn mµng läc, dung dÞch QG ®· ®­îc bæ sung vµo cét lÇn 2. Dung dÞch QG ®­îc lµm s¹ch víi ®Öm röa PE chøa 80% ethanol vµ ®­îc lo¹i bá nhê ly t©m. Cuèi cïng ADN n»m l¹i trªn mµng läc ®­îc hoµ tan trong dÞch ®Öm EB hoÆc n­íc. B»ng ph­¬ng ph¸p nµy ADN ®· ®­îc thu l¹i víi hiÖu suÊt tõ 85% trë lªn. KÕt qu¶ ®­îc kiÓm tra trªn gel agarose 1%. 2 Kb H×nh 7. KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra s¶n phÈm th«i gel trªn gel agarose 1% M. Thang ADN 1 Kb; 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG KÕt qu¶ nhËn ®­îc trªn h×nh 7 cho thÊy, s¶n phÈm th«i gel cã hµm l­îng cao, kh«ng bÞ døt gÉy ®¶m b¶o cho viÖc tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. 3.4.2. KÕt qu¶ biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a H×nh 8. KÕt qu¶ biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a S¶n phÈm th«i gel, sau ®ã ®­îc g¾n vµo vect¬ pGEMÒ-T d­íi sù xóc t¸c cña T4 ligase. Ph¶n øng g¾n (ligation) dùa vµo sù h×nh thµnh mèi liªn kÕt photphodieste gi÷a nucleotit Adenine cña s¶n phÈm PCR vµ nucleotit Thymine cña vect¬. C¸c thµnh phÇn cña vect¬ pGEMÒ-T ®­îc thÓ hiÖn trong phô lôc 2. Hçn hîp ph¶n øng ®­îc ñ ë nhiÖt ®é phßng trong 2 giê ®Ó ph¶n øng x¶y ra hoµn toµn. Vect¬ t¸i tæ hîp sau ®ã ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5a vµ ®­îc cÊy tr¶i trªn m«i tr­êng LB ®Æc cã bæ sung Ampicillin 100mg/l, X-gal 0,004‰, vµ IPTG 100mM. ñ ®Üa petri ë 370C trong 16 giê. Thµnh c«ng cña thÝ nghiÖm nµy phô thuéc vµo hai yÕu tè: thø nhÊt lµ s¶n phÈm PCR ph¶i ®Æc hiÖu th× qu¸ tr×nh g¾n vµo vect¬ míi ®¹t hiÖu suÊt cao. Thø hai lµ tÕ bµo kh¶ biÕn ph¶i ®­îc chuÈn bÞ tèt, ®óng quy tr×nh míi t¨ng ®­îc hiÖu suÊt biÕn n¹p. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy trªn h×nh 8. KÕt qu¶, chóng t«i ®· thu ®­îc mét l­îng lín c¶ khuÈn l¹c xanh vµ tr¾ng. Toµn bé khuÈn l¹c ph¸t triÓn trªn m«i tr­êng cã Ampicillin ®Òu lµ khuÈn l¹c mang plasmit. V× sù cã mÆt cña gen kh¸ng Ampicillin trong plasmit mang ®Õn cho vi khuÈn tÝnh kh¸ng Ampicillin. Nh÷ng khuÈn l¹c xanh xuÊt hiÖn lµ do trong vect¬ pGEMÒ-T mang lac-operon ho¹t ®éng b×nh th­êng, kh«ng cã ®o¹n gen ®­îc chÌn vµo, khi cã chÊt c¶m øng cña IPTG sÏ tæng hîp enzym b-galactosidase, enzym nµy sÏ chuyÓn ho¸ c¬ chÊt X-gal thµnh hîp chÊt cã mµu xanh. Cßn nh÷ng khuÈn l¹c tr¾ng cã thÓ lµ do nhËn ®­îc plasmit mang lac-operon kh«ng ho¹t ®éng, chÝnh v× vËy, khi cã chÊt c¶m øng IPTG th× gen kh«ng tæng hîp enzym b-galactosidase vµ kh«ng x¶y ra sù chuyÓn ho¸ X-gal. Lac-operon bÞ bÊt ho¹t lµ do ®o¹n ADN ngo¹i lai xen vµo gi÷a promoter cña operon gen lacZ. ChÝnh v× vËy lac-promoter kh«ng thÓ ®iÒu khiÓn gen cÊu tróc phiªn m·, nªn kh«ng cã sù dÞch m· thµnh enzym. Tuy nhiªn kh«ng ph¶i tÊt c¶ c¸c khuÈn l¹c tr¾ng ®Òu mang plasmit t¸i tæ hîp chøa ®o¹n ADN thuéc gen NIb. MÆc dï vËy, viÖc chän c¸c khuÈn l¹c tr¾ng ®Ó tiÕn hµnh nghiªn cøu tiÕp ®· lo¹i bá ®­îc phÇn lín c¸c tr­êng hîp kh«ng mong muèn. §Ó hiÖu qu¶ h¬n, chóng t«i tiÕp tôc tiÕn hµnh ch¹y ph¶n øng colony PCR. 3.4.3. KÕt qu¶ colony PCR Chóng t«i chän 5 khuÈn l¹c tr¾ng cña mçi mÉu ch¹y ph¶n øng colony PCR víi cÆp måi pUC18-F1 vµ pUC18-R1 ®Ó x¸c ®Þnh khuÈn l¹c cã plasmit mang gen NIb. V× hai måi nµy n»m trªn vect¬, nªn nÕu khuÈn l¹c cã plasmit mang gen NIb, th× s¶n phÈm PCR sÏ cho mét b¨ng cã kÝch th­íc kho¶ng 2250 bp. Mét c©u hái ®­îc ®Æt ra lµ t¹i sao kh«ng ch¹y colony PCR víi måi ®Æc hiÖu n»m trong gen. Lµ do, khi g¾n gen vµo vect¬ mét l­îng lín ADN kh«ng ®­îc g¾n vµo vect¬ vÉn tån t¹i trong hçn hîp ph¶n øng, do ®ã khi cÊy tr¶i lªn ®Üa th¹ch xung quanh khuÈn l¹c vÉn cßn mét l­îng s¶n phÈm PCR nhÊt ®Þnh. Do ®ã ta cã thÓ chän nhÇm khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh. S¶n phÈm colony PCR ®­îc ®iÖn di kiÓm tra trªn gel agarose 1% (h×nh 9). §ång thêi, nu«i nh÷ng khuÈn l¹c nµy vµo 3ml LB láng cã bæ sung Ampicillin 100mg/l ®Ó t¸ch plasmit phôc vô cho viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù. H×nh 9. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm colony PCR trªn gel agarose 1% M. Thang AND 1 Kb; 1-5.TQ; 6-10. CT; 11-15. KT, 16-20. SG Tõ kÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 9 cho thÊy s¶n phÈm colony PCR tõ nh÷ng khuÈn l¹c ë c¸c ®­êng ch¹y sè 1, 7, 14 cho kÕt qu¶ ©m tÝnh cã thÓ do trong qu¸ tr×nh colony-PCR l­îng mÉu (khuÈn l¹c qu¸ Ýt hoÆc qu¸ nhiÒu) dÉn ®Õn PCR kh«ng nh©n lªn ®­îc ®o¹n gen mong muèn mÆc dÇu khuÈn l¹c cã mµu tr¾ng. Cßn nh÷ng ®­êng ch¹y cßn l¹i cã kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh. Tuy nhiªn cã nh÷ng ®­êng ch¹y sè 4, 8, 12, 15, 18 cho lªn b¨ng thÊp h¬n 2000bp; ®­êng ch¹y sè 4 cho b¨ng cã kÝch th­íc kho¶ng 250bp, ®iÒu nµy cã thÓ do vect¬ tù ®ãng vßng vµ t¹i PCS bÞ døt gÉy mét vµi nucleotit lµm dÞch chuyÓn khung ®äc, do ®ã operon lac bÞ øc chÕ ho¹t ®éng, tÕ bµo kh«ng tæng hîp ra enzym b-galactosidase; ®­êng ch¹y sè 8, 12, 15 vµ 18 do trong qu¸ tr×nh thao t¸c lµm thÝ nghiÖm, s¶n phÈm ADN bÞ g·y thµnh nh÷ng ®o¹n cã kÝch th­íc bÐ h¬n 2000bp, nh÷ng ®o¹n nµy g¾n vµo vect¬ th× s¶n phÈm colony-PCR sÏ cho nh÷ng b¨ng cã kÝch th­íc n»m gi÷a 250bp vµ 2000bp. Nh÷ng ®­êng ch¹y cßn l¹i lªn mét b¨ng duy nhÊt cã kÝch th­íc kho¶ng 2250bp, phï hîp víi kÝch th­íc mµ chóng t«i dù tÝnh. Ph­¬ng ph¸p nµy còng ®· lo¹i ®­îc nhiÒu khuÈn l¹c mang plasmit kh«ng mong muèn. §Ó kh¼ng ®Þnh mét c¸ch ch¾c ch¾n kÕt qu¶ cuèi cïng, chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch plasmit cña nh÷ng khuÈn l¹c cã kÕt qu¶ colony mong muèn, sau ®ã gi¶i tr×nh tù cña ®o¹n ADN ®· g¾n vµo vect¬. 3.4.4. KÕt qu¶ t¸ch plasmit H×nh 10. KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra plasmit 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG TiÕn hµnh chän 4 khuÈn l¹c tr¾ng cã s¶n phÈm colony PCR nh­ mong muèn (®· ®­îc nu«i trong 3ml LB láng) t¸ch plasmit theo bé kit QIAprep Spin Miniprep nh­ ®· tr×nh bµy ë môc 2.2.7. KhuÈn l¹c ®­îc thu b»ng c¸ch ly t©m, råi hoµ tan trong ®Öm P1. Do ®· ®­îc bæ sung RNase vµo trong dung dÞch P1 nªn s¶n phÈm t¸ch plasmid sÏ kh«ng cßn ARN. C¸c dung dÞch P1 vµ P2 cã t¸c dông ph¸ vë thµnh tÕ bµo, mµng tÕ bµo…vµ gi¶i phãng c¸c thµnh phÇn trong tÕ bµo. Dung dÞch N3 cã t¸c dông kÕt tña protein, polysaccarit…vµ t¹o líp trong qu¸ tr×nh ly t©m.. §©y lµ ph­¬ng ph¸p t¸ch plasmit b»ng ly t©m nªn thu ®­îc l­îng lín plasmit trong thêi gian ng¾n (kho¶ng 30 phót). S¶n phÈm t¸ch plasmid cã nång ®é kho¶ng 100-500 ng/ml sÏ ®¹t yªu cÇu cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë h×nh 10. KÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 10 cho thÊy s¶n phÈm t¸ch plasmit rÊt s¹ch, ®¶m b¶o chÊt l­îng vµ sè l­îng ®Ó tiÕn hµnh ®äc tr×nh tù vµ subclone. 3.4.5. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh chiÒu ®o¹n gen g¾n vµo vect¬ §Ó ®äc tr×nh tù chÝnh x¸c, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh chiÒu cña ®o¹n gen g¾n vµo vect¬ nh­ ®­îc tr×nh bµy ë môc 2.2.7. NÕu ®o¹n gen g¾n vµo cïng chiÒu, th× s¶n phÈm PCR víi cÆp måi pUC18-F1 vµ CP-R3 sÏ nh©n ®­îc mét b¨ng cã kÝch th­íc kho¶ng 2100 bp, cßn víi cÆp måi pUC18-F1 vµ Nib-F1 sÏ kh«ng nh©n ®­îc b¨ng nµo. NÕu ng­îc l¹i th× ®o¹n gen g¾n vµo sÏ ng­îc chiÒu. S¶n phÈm PCR ®­îc ®iÖn di kiÓm tra trªn gel agarose 1%. H×nh 10. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR kiÓm tra chiÒu cña gen g¾n vµo vect¬. M. Thang ADN 1 Kb; Sè 1 vµ 5: TQ; Sè 2 vµ 6: CT; 3 vµ 7. KT; 4 vµ 8. SG KÕt qu¶, chóng t«i thu ®­îc tÊt c¶ c¸c mÉu ch¹y víi cÆp måi cÆp måi pUC18-F1 vµ CP-R3 lªn mét b¨ng duy nhÊt cã kÝch th­íc kho¶ng 2100 bp nh­ dù tÝnh, cßn víi cÆp måi pUC18-F1 vµ Nib-F1 cho kÕt qu¶ ©m tÝnh. Nh­ vËy chiÒu cña ®o¹n gen g¾n vµo vect¬ cña nh÷ng mÉu nµy ®Òu cïng chiÒu. 3.4.6. KÕt qu¶ subclone 1) KÕt qu¶ c¾t plasmit t¸i tæ hîp b»ng hai enzym giíi h¹n SphI vµ BglII Sau khi x¸c ®Þnh tr×nh tù theo chiÒu xu«i cña ®o¹n gen ®­îc t¸ch dßng, chóng t«i ®· t×m ®­îc vÞ trÝ c¾t cña enzym BglII c¸ch ®Çu 5’ cña gen kho¶ng 600bp vµ t¹i vÞ trÝ PCS ®Çu 5’cña vect¬ pGEM-T cã vÞ trÝ c¾t cña enzym h¹n chÕ SphI. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh c¾t plasmit b»ng hai enzym h¹n chÕ BglII vµ SphI. Theo lý thuyÕt, nÕu ph¶n øng c¾t enzym x¶y ra thµnh c«ng th× chóng t«i sÏ thu ®­îc hai ph©n ®o¹n ADN cã kÝch th­íc kho¶ng 4400bp vµ 600bp. Trong ®ã ph©n ®o¹n ADN cã kÝch th­íc kho¶ng 4400bp lµ vect¬ pGEM-T vµ phÇn cßn l¹i cña gen NIb (kho¶ng 1400bp) cÇn subclone. H×nh 11. KÕt qu¶ c¾t plasmit b»ng enzym h¹n chÕ SphI vµ BglII M: Thang ADN 1Kb; 1. TQ; 2. CT; 3. KT; 4. SG 4400bp 600bp Enzym giíi h¹n SphI cã hiÖu suÊt c¾t 100% trong buffer II, BglII c¾t 100% trong buffer III, chØ c¾t ®­îc 75% trong bufffer II. Do ®ã, ®Ó c¾t ®ång thêi 2 enzym nµy th× cÇn sö dông buffer II vµ t¨ng l­îng enzym còng nh­ thêi gian c¾t. S¶n phÈm c¾t enzym ®­îc ®iÖn di trªn gel agarose 1% ®Ó thu b¨ng quan t©m (b¨ng cã kÝch th­íc kho¶ng 4400bp). Do ph¶n øng c¾t cã thÓ x¶y ra kh«ng hoµn toµn, nªn khi ®iÖn di chØ ch¹y víi hiÖu ®iÖn thÕ kho¶ng 50 vol, v× ch¹y ®iÖn di víi hiÖu ®iÖn thÕ nµy cã thÓ ph©n t¸ch c¸c b¨ng ADN tèt h¬n, phÇn plasmit kh«ng ®­îc c¾t trong hçn hîp ph¶n øng cã thÓ t¸ch khái b¨ng ADN 4400bp. §iÒu nµy gióp lo¹i bá c¸c plasmit kh«ng ®­îc c¾t v× nÕu kh«ng trong qu¸ tr×nh biÕn n¹p c¸c plasmit nµy dÔ dµng ®­îc biÕn n¹p vµo E. Coli vµ g©y khã kh¨n trong qu¸ tr×nh chän dßng KÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 11, chóng t«i thu ®­îc hai b¨ng cã kÝch th­íc nh­ dù tÝnh. Nh­ vËy ph¶n øng c¾t enzym ®· thùc hiÖn thµnh c«ng. S¶n phÈm c¾t enzym (b¨ng ADN 4400bp) sau ®ã ®­îc th«i gel vµ tinh s¹ch theo bé kit QIAquick Spin Miniprep (nh­ m« t¶ trong phÇn ph­¬ng ph¸p 2.2.4). 2) KÕt qu¶ biÕn n¹p plasmit vµo tÕ bµo E. coli DH5a Muèn subclone ®o¹n gen quan t©m th× cÇn ph¶i g¾n hai ®Çu plasmit ®· ®­îc c¾t l¹i víi nhau (hay plasmit tù ®ãng vßng). Nh­ng do viÖc c¾t plasmit b»ng hai enzym giíi h¹n SphI vµ BglII ®· t¹o ra c¸c ®Çu dÝnh kh¸c nhau, nªn hai ®Çu vect¬ kh«ng thÓ ghÐp nèi l¹i víi nhau. V× vËy, ®o¹n gen cã kÝch th­íc 4400bp sau khi th«i gel, ®­îc xö b»ng enzym Klenow. D­íi sù cã mÆt cña dNTPs tù do, enzym nµy sÏ xóc t¸c tæng hîp bæ sung c¸c nucleotit vµo c¸c ®Çu dÝnh ®Ó t¹o ra hai ®Çu b»ng cho vect¬. S¶n phÈm plasmit sau ®ã ®­îc tinh s¹ch ®Ó lo¹i bá nh÷ng thµnh ph©n d­ thõa nh­ dNTPs, ®Öm, enzym Klenow; råi ®­îc g¾n l¹i nhê enzyme T4 ligase. Plasmit sau khi g¾n ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli DH5a. H×nh 12. KÕt qu¶ biÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo E.coli DH5a KÕt qu¶ biÕn n¹p (®­îc tr×nh bµy trªn h×nh 12) cho thÊy ®· thu ®­îc mét l­îng lín c¸c khuÈn l¹c kh¸ng Ampicillin. Chøng tá vect¬ t¸i tæ hîp ®· ®­îc biÕn n¹p thµnh c«ng vµo E. coli. Tuy nhiªn, ®Ó biÕt chÝnh x¸c khuÈn l¹c nµo mang vect¬ t¸i tæ hîp nh­ mong muèn th× cÇn ph¶i chän dßng tÕ bµo b»ng colony PCR. 3) KÕt qu¶ chän dßng tÕ bµo 5 khuÈn l¹c tr¾ng cña mçi mÉu ®· ®­îc chän ®Ó ch¹y colony PCR víi cÆp måi pUC18-F1 vµ CP-R3 vµ ®ång thêi c¸c khuÈn l¹c nµy ®­îc nu«i trong m«i tr­¬ng LB láng cã bæ sung Ampicilin ®Ó t¸ch plasmit. KÕt qu¶ colony PCR ®­îc tr×nh bµy trªn h×nh 13. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm colony PCR (h×nh 13) cho thÊy nh÷ng ®­êng ch¹y sè 3, 7, 10 vµ 16 cho kÕt qu¶ ©m tÝnh, ®iÒu nµy cã thÓ do khuÈn l¹c qu¸ bÐ hoÆc qu¸ to nªn l­îng ADN mÉu cho ph¶n øng colony PCR qu¸ Ýt hoÆc qu¸ nhiÒu, lµm cho ph¶n øng kh«ng x¶y ra. Nh÷ng ®­êng ch¹y cßn l¹i ®Òu cho lªn mét b¨ng cã kÝch th­íc kho¶ng 1500bp nh­ mong muèn, lµ do vect¬ cã chøa ®o¹n gen g¾n vµo cã kÝch th­íc kho¶ng 1400bp. Chóng t«i s¬ bé kÕt luËn ®· c¾t enzym, biÕn n¹p vµ chän dßng thµnh c«ng ®o¹n gen NIb cã kÝch th­íc kho¶ng 1500pb. Tuy nhiªn, ®Ó cã kÕt luËn cô thÓ th× ph¶i tiÕn hµnh t¸ch plasmit vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n gen subclone. H×nh 13. KÕt qu¶ colony PCR víi cÆp måi pUC18-F1 vµ CP-R3 M: Thang ADN 1Kb; Sè 1-5: TQ; Sè 6-10: KT; Sè 11-15: CT; Sè 16-20: SG 3.4. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit S¶n phÈm plasmit ®· tinh s¹ch ®­îc x¸c ®Þnh tr×nh tù trªn m¸y ®äc tù ®éng ABI PRIMSÒ 3100 Avant Genetic Analyzer. KÕt qu¶ ®äc c¶ hai chiÒu foward 3.5. kÕt qu¶ so s¸nh tr×nh tù 3.4.1 So s¸nh sù gièng nhau cña gen NIb ë møc ®é nucleotit 3.4.2 So s¸nh sù gièng nhau cña gen NIb ë møc ®é axit amin Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu tiÕng viÖt Lª TrÇn B×nh, Phan V¨n Chi, N«ng V¨n H¶i, Tr­¬ng Nam H¶i, Lª Quang HuÊn (2003), ¸p dông c¸c kü thuËt ph©n tö trong nghiªn cøu tµi nguyªn sinh vËt ViÖt Nam, NXB Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi. Vâ V¨n Chi, TrÇn Hîp (2002), C©y cá cã Ých ë ViÖt Nam, tËp 2, NXBGD, TP. Hå ChÝ Minh. Hå Huúnh Thuú D­¬ng (2003), Sinh häc ph©n tö, NXB Gi¸o dôc, TP. Hå ChÝ Minh. Chu Hoµng Hµ, NguyÔn Minh Hïng, Bïi Chi L¨ng, Lª TrÇn B×nh (2004), “§¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng cña c¸c dßng virus g©y bÖnh ®èm vßng ®u ®ñ cña ViÖt Nam th«ng qua t¸ch dßng, x¸c ®Þnh vµ so s¸nh tr×nh tù gen m· ho¸ protein vá (CP)”, T¹p chÝ C«ng nghÖ sinh häc, 2(4), pp. 451-459. NguyÔn Thµnh Hèi, D­¬ng Minh (2003), Kü thuËt trång ®u ®ñ, NXB N«ng nghiÖp. Vò C«ng HËu (1996), Trång c©y ¨n qu¶ ë ViÖt Nam, NXB N«ng nghiÖp, TP. Hå ChÝ Minh. Lª §×nh L­¬ng, Phan Cù Nh©n (1997), C¬ së di truyÒn häc, NXB Gi¸o dôc, Hµ Néi. Lª §×nh L­¬ng (2001), Nguyªn lý kü thuËt di truyÒn, NXB Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi. L©m §¹i Nh©n (2000), Ph©n lËp vµ thiÕt kÕ gen m· ho¸ protein vá cña virus g©y bÖng ®èm vßng ®u ®ñ ë ViÖt Nam, LuËn v¨n Th¹c sü C«ng nghÖ sinh häc, §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn , §¹i häc Quèc gia Hµ Néi. NhiÒu t¸c gi¶ (2002), Kü thuËt trång vµ ch¨m sãc c©y ¨n qu¶, NXB Thanh Ho¸. NguyÔn NghÜa Th×n, §Æng ThÞ Sy (2004), HÖ thèng häc thùc vËt, NXB §¹i häc Quèc gia, Hµ Néi. TrÇn ThÕ Tôc, §oµn ThÕ L­ (2004), C©y ®u ®ñ vµ Kü thuËt trång, NXB Lao ®éng vµ X· héi. Trung t©m th«ng tin Khoa häc C«ng nghÖ Quèc gia (2004), “Ch÷a bÖnh xo¨n l¸ ®u ®ñ”, Tµi liÖu tiÕng anh Baddillo V.M. (1971), Monografia de la familie Caricaceae, Addocciation de Profesores, Universidad Central de Venezuela, Maracay, Venezuela. Baddillo V.M. (2002), “Carica L. vs. Vasconcella St. (Caricaceae) con la Rehabilitaction de este Ultimo", Ernstia, 10, pp. 74-79. Bateson M.F., Lines R.E., Peter R., Worawan C., Ha C.V., Gibbs A.J., Dale J.L. (2002), “On the evolution and molecular epidemiology of the potyvirus Papaya ringspot virus”, J Gen Virol, 83, pp. 2575-2585. Bruenn J.A. (1991), “Relationships among the positive strand and double-strand RNA viruses as viewed through their RNA-dependent RNA polymerases”, Nucleic acids Res, 19, pp. 217-226. Schubert J., Matousek J., Mattern D. (2004), “Pathogen-derived resistance in potato to Potato virus Y- aspects of stability and biosafety under field conditions”, Virus Res, 100(1), pp. 41-50. Chiang C.H., Yeh S.D. (1997), “Infectivity assays of in vitro and in vivo transcripts of papaya ringspot potyvirus”, Bot Bull Acad Sin, 38, pp. 153-163. Deiman B.A., Seron K., Jaspars E.M., Pleij C.W. (1997), “Efficient transcription of the tRNA-like structure of turnip yellow mosaic virus by a template-dependent and specific viral RNA polymerase obtained by a new procedure”, J Virol Methods, 64(2), pp. 181-195. Ehrenfeld N., Romano E., Serrano C., Arce-Johnson P. (2004), “Replicase mediated resistance against potato leafroll virus in potato Desiree plants”, Biol Res, 37(1), pp. 71-82. Fellers J., Collins G.B., Hunt A.G. (1998a), “The NIa-proteinase of different plant potyviruses provides specific resistance to viral infection”, Crop Sci, 38, pp. 1309-1319. Fellers J., Wan J., Hong Y., Collins G.B., Hunt A.G. (1998b) “In vitro interactions between a potyvirus-encoded, genome-linked protein and RNA-dependent RNA polymerase”, J Gen Virol, 79, pp. 2043-2049. Garrett A. (1995), The pollination Biology of Papaw (Carica papaya L.) in Central Queensland, PhD Thesis, Central Queensland University, Rockhampton. Gonsalves D. (1998), “Control of papaya ringspot virus: A case study”, Ann Rev Phytopath, 36, pp. 415-437. Holger J., Thomas F. (1999), Monoclonal and Recombinant Antibodies to Potyviral Proteins and Their Appilication, Vorgelegt von Fangbing Liu aus Jiangxi, China. Hong Y., Levay K., Murphy J.F., Klei P.G., Shaw J.G., Hunt A.G. (1995), “A potyvirus polymerase interacts with the viral coat protein and VPg in yeast cells”, Virol, 241, pp. 159-166. Hong Y., Hunt A.G. (1996), “RNA polymerase activity catalyzed by a potyvirus encoded RNA-dependent RNA polymerase”, Virol, 226, pp. 146-151. ICTV, ICTVdB Virus Descriptions (2002), 00.057.0.01.045 Papaya ringspot virus, Jensen D. (1949), “Papaya virus diseases with special reference to papaya ringspot”, Phytopath, 39, pp. 191-211. Jones AL., Johansen I.E., Bean S.J., Bach I., Maule A.J. (1998), “Specificity of resistance to pea seed-borne mosaic potyvirus in transgenic peas expressing the viral replicase (NIb) gene”, J Gen Virol, (790), pp. 3129-3137. Koonin E.V. (1991), “The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerase of possitive-strand RNA viruses”, J Gen Virol, 72, pp. 2197-2206. Koonin E.V., Dolja V.V. (1993), “Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences”, Crit Rev Biochem Mol Biol, 28, pp. 375-430. Le B.T., Tran Y.T.O. (1999), “Papaya research and development in Vietnam”, ISAAA Briefs, (11), pp. 101-104. Li X.H., Carrington J.C. (1993), “Nuclear transport of tobacco etch potyviral RNA-dependent RNA polymerase is highly sensitive to sequence alteration”, Virol, 193, pp. 951-958. Li X.H., Valdez P., Olvera R.E., Carrington J.C. (1993), “Function of the tobacco etch virus RNA polymerase (Nib): subcellular transport and protein-protein interaction with VPg/proteinase (NIa)”, J Virol, 71, pp. 1589-1607. Linder R.C., Jensen D.D., Ikeda W. (1945), “Ringspot: new papaya plunder”, Hawaii Farm and Home, 8(10), pp. 10-14. Nakasone H.Y., Paull R.E. (1998), Tropical fruit, CAB International, Wallingford. Office of the Gene Technology Regulator (2003), The Biology and Ecology of Papaya (paw paw), Carica papaya L., in Australia. Poonpipit R., Chatchawankanpanich O., Kositratana W. (2000), Comparison of the nuclear inclusion b (Nib) gene of four different papaya ringspot virus isolates in Thailand, In Abstracts for The International Conference on Tropical Agriculture Technology for Better Health and Environment, Kasetsart University, Thailand. Suzuki M., Masuta C., Takanami Y., Kuwata S. (1996), “Resisitance against cucumber mosaic virus in plants expressing the viral replicon”, FEBS Lett, 379(1), pp. 26-30. Swain S., Powell D.A. (2004), Papaya Ringspot Virus Resistant Papaya: A Case Study, Tee F.S., Mohd I.N., Mohd N.A., Khaitijah I. (1988), Nutrient composition of Malaysian foods, ASEAN food habits project. Villegas V.N. (1997), Edible fruits and nuts - Carica papaya L. In EWM Verheij, RE Coronel, eds, volume 2, Wageningen University, The Netherlands. Wang H.L., Xang C.C., Chiu R.J., Sun M.H., (1978), “Preliminary study on papaya ringspot virrus in Taiwan”, Plant Protection Bull, Taiwan, 20, pp. 133-140. Winchai K., Orawan C., Kanokwaree, Watchareewan J., Chalongchai B. (1999), “Papaya production in Thailand”, ISAAA Briefs, (11), pp. 94-97. Ye C., Chen G., Huang J., Yu M., Li B. (1996), “Cloning and sequencing of replicase gene of Papaya Ringspot Virus”, Zhongshan Daxue Xuebao, Ziran Kexueban, 35, pp. 125-127. Yeh S.D., Jan F.J., Chiang C.H., Doong T.J., Chen C.M., Chung P.H., Bau H.J. (1992), “Complete nucleotide sequence and genetic organization of papaya ringspot virus RNA”, J Gen Virol, 73, pp. 2531-2541.