Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

sáng trực tiếp. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 3.1.1. Chọn bước sĩng phát hiện chất Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-Vis. Do các β-Lactam đều là những hợp chất khơng cĩ mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tơi sử dụng máy quang phổ UV – 1601PC với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm dùng cuvet thạch anh để xác định các bước sĩng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 10 mg/l trong 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH=9. Phổ thu được thể hiện hình 3.1 Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10 mg/l ) Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ cĩ nhược điểm là cĩ hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khĩ khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sĩng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng Kết quả quét phổ cho ta thấy: các β-Lactam cĩ phổ hấp thụ quang cao nhất ở 198 nm. Chúng tơi chọn bước sĩng làm việc là 198 nm cho pic cao và đẹp nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu cĩ hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản cĩ đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản cĩ đường kính trong từ 25- 75 µm. Vì mao quản cĩ ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khĩ khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phịng thí nghiệm loại mao quản chúng tơi sử dụng trong nghiên cứu này cĩ đường kính trong là 50 µm Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thơng thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản chỉ cĩ tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng tơi sử dụng là loại mao quản trần, cĩ tổng chiều dài là 64.5cm, chiều dài hiệu lực là 58cm, loại bubble cell (cĩ độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thơng thường) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 58cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nĩng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đĩ dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di. Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút. Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hĩa lại cột, rửa với NaOH 0.1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút. 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu Trong kỹ thuật điện di mao quản cĩ thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đĩ phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đĩ hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nĩi trên. Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào cĩ kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu cĩ hai chất phân tích cĩ cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này khơng đáng ngại vì người ta cĩ thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngồi ra lượng mẫu bơm cịn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu cĩ nồng độ muối cao mà ta khơng thể biết trước được như những mẫu nước tiểu. Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt cao thấp khác nhau một khoảng DH, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khĩ chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng. Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân khơng phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay được dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu được bơm vào sẽ cĩ nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng tơi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen cĩ vai trị rất quan trọng, nĩ quyết định đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đĩng vai trị như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS. Theo lý thuyết, độ điện di [7,8] mtot(i) = ( mef + mEOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14) Thời gian lưu của chất tan i là: ti = (L.l)/(mtot(i) .V) (15) Trong đĩ: mtot(i) = (mef + mEOF ): Độ điện di tổng cộng (tồn phần) của chất tan. V: Điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV. l: Chiều dài hiệu dụng (56cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản (64.5cm). E: Điện trường trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trường E này do thế V (kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nĩ là lực chính điều khiển quá trình điện di của các chất và cả dịng EOF trong ống mao quản. Độ điện di hiệu dụng riêng µef của chất tan được tính theo cơng thức sau: µef = mtot - mEOF µtot = (L. l)/ ti .V = 64.5 . 56/ ti .V mEOF = (L.l)/ t0 . V = 64.5 . 56/ t0 . V Thời gian t0 được đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất tan này trong từng điều kiện nĩ nằm trong dịng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di chuyển của dịng EOF. Thời gian t0 được xác định bằng cách điện di metanol tinh khiết. Thực tế trong mỗi thí nghiệm chúng tơi quan sát thấy t0 trùng với tín hiệu nhiễu trên đường nền gây ra bởi dung địch đệm điện di. Vì thế trong các thí nghiệm chúng tơi đã sử dụng thời gian xuất hiện của tín hiệu này như thời gian t0 3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di chứa: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Gía trị pH thay đổi tại pH = 8.25; 8.0; 7.75; 7.5. Hình 3.2 Sắc đồ điện di của β-Lactam ở pH 8.25; 8.0; 7.75; 7.5 Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam pH Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 8.25 5.47 8.38 9.37 9.48 10.83 11.78 12.404 13.44 8.0 5.58 8.35 9.95 10.12 11.11 12.09 12.74 13.08 7.75 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 7.5 5.83 8.41 11.43 11.87 12.36 13.05 14.11 14.43 Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic khơng phủ tiếp xúc với dung dịch đệm cĩ pH từ 7.5 đến 8.25 (>4), bề mặt mao quản tích điện âm nguyên nhân là do các nhĩm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton, làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dịng EOF thường hướng theo phương từ anốt (cực dương) về phía catốt (cực âm). Khi cĩ thêm chất hoạt động bề mặt SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dịng EOF. Do từng tính chất riêng của các β-Lactam chúng phân bố vào Mixen khác nhau với hệ số phân bố khác nhau. Khi chất phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ Mixen, khi khơng bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dịng điện di thẩm thấu. Kết quả là trong dịng EOF về phía cực âm là các phân tử trung hịa và các ion mang điện tích âm. Mixen và dịng EOF di chuyển khác tốc độ. Do hệ số phân bố vào Mixen khác nhau dẫn tới di chuyển tới cực âm với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau. Khi điện di ở pH từ 7.5 đến 8.25 làm cho dịng EOF và độ điện di µef của chất tan bị thay đổi theo. Trong dung dịch với gía trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI ( độ ion hĩa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan. Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi chất tan bị dương điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngược lại. Kết quả sẽ làm cho dịng EOF và độ điện di µef của chất tan cũng bị thay đổi theo. Điện di ở pH cao hơn giá trị pI (pI = -log I và I: độ ion hĩa) làm cho chất tan cĩ điện tích âm và nĩ sẽ di chuyển về phía anốt (đầu cực dương) chậm hơn dịng EOF. Như vậy cùng với tác dụng làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di cũng làm thay đổi cả tốc độ của dịng EOF. Hơn nữa khi pH thay đổi nĩ cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao quản. Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro, tách ion H trong nhĩm –OH trên thành mao quản. Tức là làm thay đối lớp điện kép và thế Zêta. Qua đĩ mà tác động hay làm ảnh hưởng đến sự điện di của chất. Từ hình 3.3, ở pH =7.5 đến 8.25 độ điện di của PENG, OXA, CEF hầu như khơng bị ảnh hưởng. Đối với CLO độ điện di ko đổi pH 7.5 đến 8, đến pH 8.25 độ điện di cao hơn. Với CEP, AMP độ điện di thấp dần khi tăng dần gía trị pH, tại pH = 8.25 và 8.0 chân pic của CEP và AMP chưa tách ra được khỏi nhau. Nhận thấy càng tăng pH thì khả năng tách càng kém, thời gian di chuyển ngắn hơn và pic nhọn hơn. Ảnh hưởng này thể hiện rõ nhất ở AMP và CEP. Từ nghiên cứu, chũng tơi chọn pH =7.75 tốt nhất để tách các β-Lactam trong những nghiên cứu tiếp theo. 3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng cĩ vai trị rất quan trọng và nĩ phải cĩ nồng độ phù hợp. Trong thực tế người ta chọn chất đệm pH cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải thể hiện qua việc ổn định, duy trì dịng điện I và dịng điện thẩm EOF trong mao quản. Qua đĩ sẽ làm ảnh hưởng đến độ điện di hiệu dụng µef của chất phân tích. Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thường cĩ hiệu lực tốt hơn các hệ đệm đơn axit, đơn bazơ. Vì các đa axit, đa bazơ cĩ nhiều nấc phân ly, nên cĩ khả năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao. Các đệm dùng với nồng độ cao mà khơng gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản. Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: 25 mM đệm Photphat - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH =7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong hệ đệm photphat thì chưa xuất hiện pic trước thời gian 15 phút. Vì vậy chũng tơi quyết định chọn đệm Borat cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của sự tách vì thực chất nĩ vẫn chuyển động cùng với dịng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di cĩ ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các β-Lactam bởi nĩ liên quan đến sự hình thành hạt Mixen cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm điện di. Để khảo sát ảnh hưởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị là 75 mM; 100 mM và 125 mM. Các điều kiện khảo sát: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Hình 3.4 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ SDS = 75 mM;100 mM và 125 mM Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-Lactam Nồng độ SDS(mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 75 5.8 8.552 10.437 10.662 11.235 12.708 12.951 13.298 100 5.9 8.74 11.32 11.68 12.31 13.17 13.4 14.12 125 6.1 9.397 12.45 12.802 14.085 14.414 15.011 17.372 Thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, gây ra sự thay đổi hấp thụ lên thành mao quản qua tương tác ionic hay hiệu ứng kị nước. Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng cĩ thể tương tác với thành ống mao quản và cũng cĩ thể ảnh hưởng nhất định đến dịng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dịng EOF Chất hoạt động bề mặt là SDS là dạng anionic làm tăng dịng EOF, sẽ di chuyển về anot ( cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dịng EOF. Theo lý thuyết [7,8] Độ phân giải R cũng là một thơng số quan trọng của kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng cơng thức sau đây theo ba thành phần cơ bản. Rij = A.z.ti Trong đĩ: ________ Hiệu lực tách A: A = Ư (N/4) . Độ chọn lọc z : z = [( a - 1 )/a] với a = k2’/k1’ Thời gian lưu tr : ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tm )] / [1 + k1.( t0/tm)]} Trong đĩ: k’i : hệ số dung tích ti : Thời gian lưu của chất tan. t0 : Thời gian khơng lưu giữ của chất Theo cơng thức, độ phân giải R cĩ thể được nâng cao (làm tốt) khi tối ưu hĩa được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để cĩ độ chọn lọc α và hệ số dung tích k’i của chất tan là phù hợp. Hệ số dung tích k’i nĩi chung là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng pH nhất định. Càng tăng nồng độ thì thời gian lưu các chất β-Lactam càng tăng do ảnh hưởng của nồng độ các ion trong dung dịch càng lớn, tương tác với Mixen bền và lâu hơn sự di chuyển của nĩ, dẫn đến tốc độ di chuyển của các chất tan sẽ chậm hơn vì vậy thời gian lưu tăng, cường độ dịng cũng tăng, chiều cao pic bị thay đổi. Thời gian càng tăng thì pic sẽ càng bị kéo dãn và tù hơn. Độ điện di hiệu dụng của AMO và ClO tăng khi tăng nồng độ SDS, các chất cịn lại độ điện di hiệu dụng hầu như khơng thay đổi, khả năng tách thay đổi nhiều, các pic tách hết chân. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt lên đáng kể, nhất là với loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dịng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt làm mao quản nĩng lên. Tại nồng độ 125 mM nhận thấy tín hiệu nền xấu hơn so với nồng độ 75 mM và 100 mM, pic dãn rộng hơn. Nồng độ SDS 75mM hiệu quả tách cũng rất tốt nhưng chiều cao pic khơng bằng 100 mM, sẽ gây ảnh hưởng độ nhạy. Vì vậy chúng tơi chọn nồng độ SDS = 100 mM tối ưu để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng cĩ vai trị quan trọng và nĩ phải cĩ nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của sắc ký điện di. Như vậy, pha động sẽ khơng phức tạp, khơng gây khĩ khăn ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký. Ở đây tơi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải Chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ đệm tại bốn gía trị là 20 mM; 25 mM; 30 mM; 35 mM với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.6 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ đệm 20 mM, 25 mM, 30 mM và 35 mM Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu ( phút) Nồng độ đệm (mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 20 5.42 7.94 9.90 10.12 10.49 11.51 11.80 11.91 25 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 30 6.08 9.3 12.03 12.37 13.53 14.22 14.86 16.0 35 6.31 10.95 14.16 14.58 17.54 17.8 19.70 22.42 Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của 7 kháng sinh β-Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan tăng nhưng hiệu quả tách cũng khơng tốt. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng, thường làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh điện Culơng của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tượng sinh ra rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển khơng phẳng qua đĩ tạo ra sự dỗng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ thể nhất ở nồng độ 35 mM. Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dịng EOF và quá trình sắc ký điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luơn tốc độ của dịng EOF. Lực ion lớn, taọ ra dịng điện cao và cĩ hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nĩng lên, độ nét của pic cũng bị ảnh hưởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ đệm 30 mM và 35 mM nồng độ đệm cao nên pic đã bị dãn và tín hiệu nền xấu đi nhiều, hiệu quả tách cũng kém, pic của PENG và OXA bị dính chân vào nhau tại nồng độ 35 mM. Nồng độ đệm 20 mM, lực ion thấp hơn, giảm được cường độ dịng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém, hai pic của CEF và CLO dính chân vào nhau. Do đĩ chúng tơi chọn nồng độ 25 mM đệm Borat là điều kiện tối ưu. 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu Chúng tơi tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu tại ba gía trị là 8s, 10s và 12s với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.8 Sắc đồ điện di tại thời gian bơm mẫu 8s, 10s và 12s Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu ( phút) Thời gian bơm mẫu (s) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 8 5.74 8.48 10.76 11.03 11.63 12.63 1298 13.42 10 5.74 8.49 10.76 11.02 11.66 12.61 13.0 13.43 12 5.75 8.46 10.76 11.01 11.62 12.57 12.93 13.39 Khi nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp phải nhỏ hơn giới hạn cho phép (2% ≤ chiều dài l). Nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng của vùng mẫu sẽ xuất hiện mạnh, do hiện tượng khuếch tán. Vùng mẫu càng lớn thì sự phân tán càng lớn. Lúc này độ phân giải và hiệu suất tách (Nef ) sẽ bị khử (bị giảm mạnh) theo sự phân tán mở rộng của vũng mẫu của chất phân tích trong mao quản. Ta cĩ cơng thức [8]: (s)2 = (Winj)2/12 Với σ : Độ biến động hay độ lệch chuẩn của sự tách trong CE Winj : Độ rộng của mẫu được nạp vào đầu ống mao quản Từ cơng thức trên cho thấy, khi vùng mẫu Winj lớn, thì độ lệch chuẩn σ cũng lớn theo. Nghĩa là số đĩa lý thuyết của cột tách sẽ giảm. Hình 3.9 thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao pic và thời gian bơm mẫu, khi tăng thời gian bơm mẫu, chiều cao pic tăng lên nhưng khơng đáng kể. Trong cùng một điều kiện, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lưu các chất hầu như khơng thay đổi chỉ cĩ chiều cao các pic thay đổi. Bơm mẫu càng lâu thì chiều cao pic càng tăng, nhưng pic bị dỗng chân thể hiện ở pic của CLO cụ thể nhất. Vì vậy chũng tơi chọn thời gian bơm mẫu 10s là điều kiện tối ưu. 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di Khảo sát thế điện di tại ba gía trị 15 kV, 20 kV và 25 kV với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Bơm mẫu 10s áp suất 50 mbar, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.10 Sắc đồ điện di thế điện di 15kV, 20kV và 25kV Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu ( phút) Thế điện di (kV) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 15 7.98 11.85 15.29 15.68 16.38 17.69 18.16 18.94 20 5.91 8.55 10.77 11.02 11.72 12.68 13.15 13.51 25 4.30 6.43 7.92 8.09 8.73 9.48 9.89 10.03 Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi cĩ nguồn thế V một chiều nhất định đặt vào hai đầu của mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và dịng điện I trong mao quản, nĩ điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Thế V được dùng sao cho khơng cho dịng điện I quá lớn trong mao quản, dịng này chỉ nên nằm trong khoảng vùng từ 10-75 μA. Khi tăng thế điện từ 15kV đến 25kV, thời gian di chuyển của các β-Lactam càng giảm. Tại thế 15kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt, nhưng thời gian di chuyển của β-Lactam ở 15kV khá lớn tại 18.9 phút mới xuất hiện pic của CLO. Với thế 25kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so với 15kV, 20kV nhưng kết quả tách kém, pic CEF và CLO dính chân vào nhau. Vì khi tăng thế V, dịng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nĩng mao quản gây ra sự dỗng pic. Tức là làm giảm hiệu quả tách.. Vì vậy chúng tơi chọn thế tại 20kV là phù hợp. 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản Tiến hành khảo sát nhiệt độ của mao quản ba giá trị là 250C, 280C và 300C, với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20 kV, bơm mẫu 10s, áp suất 50 mbar. HÌnh 3.12. Sắc đồ điện di ảnh hưởng của nhiệt độ tại 250C, 280C và 300C Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian di chuyển β-Lactam Nhiệt độ (0C) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 25 5.97 8.81 11.54 11.86 12.23 13.18 13.40 14.13 28 5.91 8.55 10.77 11.02 11.72 12.68 13.15 13.51 30 5.52 8.18 10.27 10.51 11.17 12.1 12.47 12.84 Theo [7,8] lnKi = (DH0/R.T) + ( DS0/R ) Trong đĩ: DH0, DS0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản Biểu thức này cho ta thấy hằng số phân bố Ki luơn phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần, tùy thuộc vào từng chất mà hệ số này thay đổi khác nhau. Cũng giống như khi tăng điện thế V làm ảnh hưởng tới hiệu ứng nhiệt Jun làm nĩng thành mao quản. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng. Sự tăng nhiệt độ ít ảnh hưởng đến số đĩa hiệu dụng Nef, song cĩ trường hợp khi tăng nhiệt độ lại làm hỏng chất mẫu hay chất đệm nhất là làm thay đổi độ nhớt dung dịch , tạo ra gradient nhiệt độ và nồng độ chất, qua đĩ làm ảnh hưởng đến sự điện di. Song trong CE, sự gradient nhiệt độ luơn xảy ra nĩ chỉ khác nhau ở mức độ. Sự tiêu hao cơng suất điện từ trường sinh ra nhiệt càng nhiều, thì càng khơng cĩ lợi. Đồng thời sự phân tán nhiệt độ qua thành mao quản ra ngồi, lại làm cho vùng tâm của cột mao quản cĩ nhiệt độ cao hơn vùng sát thành. Sự khác nhau về nhiệt độ sẽ tạo ra sự khác nhau về độ nhớt dung dịch, chỗ nào cĩ nhiệt độ cao hơn thì sẽ cĩ độ nhớt thấp hơn và như thế cũng dẫn đến làm tăng tính khơng đồng nhất của dung dịch trong các vùng của cột mao quản. Khi nhiệt độ thay đổi 1 độ, thì dẫn đến sự thay đổi độ nhớt từ 2-3% và qua đĩ ảnh hưởng đến giá trị độ điện di μef của chất tan ( chất phân tích), chúng sẽ gây ra sự mở rộng pic. Tức là giảm hiệu quả tách, vì khi độ nhớt giảm sẽ làm giảm số đĩa hiệu dụng Nef của cột tách giảm theo. Hình 3.12, tại nhiệt độ 250C pic của OXA và CEF chưa tách hẳn, 300C pic các β-Lactam cĩ tách rõ rệt nhưng pic lạ lại trùng với pic của CEP làm chiều cao CEP tăng lên. Chúng tơi chọn nhiệt độ tại 280C là điều kiện tối ưu. 3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu Bảng 3.7 Tổng kết các điều kiện tối ưu Các yếu tố Điều kiện Detector DAD Số đo bước sĩng chung 198 nm Kích thước mao quản Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 56 cm, đường kính trong 50µm, loại bubble cell. Chất tạo mixen SDS Phương pháp bơm mẫu Thủy động hoc : 10s; 50 mbar Thế điện di 20 kV Dung dịch điện ly 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75 Nhiệt độ 280C Hình 3.14. Sắc đồ điện di của β-Lactam tại điều kiện tối ưu. 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn Từ phương trình Hi = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì chiều cao pic sắc ký cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lê đĩ chỉ đúng trong một khoảng nhất định. Vì vậy chúng tơi phải khảo sát khoảng tuyến tính của chất phân tích. Chúng tơi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính trong điều kiện tối ưu mục 3.1.12 của các β-Lactam trong khoảng nồng độ từ 1 đến 20 mg/l, mỗi nồng độ được đo lặp lại 3 lần Chúng tơi thu được kết quả như sau. Bảng 3.8 Chiều cao pic β-Lactam tại các nồng độ khác nhau. Nồng độ (mg/l) AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 1 1.37 0.97 1.1 1.1 1.3 0.61 1.22 2 3 2.1 2.1 1.9 2.4 1.1 2.1 3 4.9 3.4 3.2 2.8 3.9 2 3.7 5 8.9 6.1 5.7 5.2 7.1 3.6 6.5 7 13.8 9.6 8.7 7.9 10.8 5.7 9.9 10 20.2 15.1 14.6 11.9 16.9 8.9 15.7 12 27.9 18.76 18.56 16.78 25.53 12.57 22.6 15 32.9 22.47 23.61 21.69* 36* 16.4 27.5 20 37.43 26.33 27.35 - * .- * 18.06 30.69 * Pic bị dính chân vào nhau. Khi tăng dần nồng độ lên, chúng tơi nhận thấy từ nồng độ 15 và 20 mg/l pic của PENG và OXA càng dính vào nhau, chân pic bị dỗng rộng, pic khơng tách hết chân. Hiện tượng này được giải thích tương tự như mục 3.1.8. Hình 3.15. Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ 15ppm Do lượng mẫu thực cĩ hàm lượng thấp nên chúng tơi chọn khoảng nồng độ từ 1 đến 10mg/l nằm trong khoảng tuyến tính và khảo sát lập đường chuẩn. Dựa vào số liệu bảng 3.8 chúng tơi sử dụng phần mềm Origin Version 7.5 để xây dựng đường chuẩn. kết quả thu được như sau. Hình 3.16 Đường chuẩn của 7 loại β-Lactam nồng độ 1 -10 mg/l 3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩn (LOQ) - Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất tạo thành tín hiệu phân tích cĩ diện tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Như vậy pic sắc ký của chất phân tích phải cĩ chiều cao thoả mãn hệ thức sau: H ≥ 3σn (*) Trong đĩ: H là chiều cao pic sắc ký của chất phân tích σn là dao động của tín hiệu đường nền Giới hạn phát hiện là thơng số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân tích. Để xác định LOD của các β-lactam chúng tơi tiến hành xác định LOD dựa vào đường chuẩn Theo (*) giới hạn phát hiện được tính theo cơng thức sau: LOD = 3×Sy/b Trong đĩ: Sy : là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn b : là hệ số gĩc của phương trình hồi qui - Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) được định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95%. Theo lý thuyết thống kê thì giới hạn định lượng là nồng độ chất phân tích cĩ tín hiệu phân tích gấp 10 lần tín hiệu nhiễu của đường nền. LOQ = 10×Sy/b Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phương pháp Chất phân tích Phương trình y = a + bx Hệ số gĩc (b) Độ lệch chuẩn (Sy) LOD (mg/l) LOQ (mg/l) AMO y = 2.1228x - 1.2116 2.1228 0.383 0.54 1.8 CEP y = 1.5723x - 1.1256 1.5723 0.513 0.98 3.26 AMP y = 1.3448x - 0.6256 1.3448 0.3292 0.73 2.45 PENG y = 1.2186x - 0.5535 1.2186 0.3441 0.85 2.82 OXA y = 1.7448x - 1.0756 1.7448 0.5382 0.93 3.08 CEF y = 0.9325x - 0.7 0.9325 0.308 0.99 3.3 CLO y = 1.6192x - 1.0395 1.6192 0.5417 1.00 3.34 3.2.5. Độ chính xác của phép đo Để đánh giá sai số của phương pháp phân tích, chúng tơi tiến hành chọn ba mẫu tương ứng với khu vực: điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính đã được chọn ở trên. Các mẫu được chọn cĩ nồng độ lần lượt là 1mg/l; 5mg/l và 10 mg/l. Tiến hành đo các mẫu trên với điều kiện tương tự như các điều kiện khi khảo sát khoảng tuyến tính. Mỗi mẫu tiến hành đo 8 lần. Sai số được tính theo cơng thức sau: Trong đĩ: Hi là chiều cao pic tính từ đường chuẩn Ht là chiều cao pic đo được trên sắc đồ Kết quả phân tích được trình bày trong bảng sau Bảng 3.10 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (1mg/l) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 TB AMO Ht 1.4 1.3 1.4 1.3 1.5 1.4 1.3 1.3 1.36 Hi 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 X% 2.14 5.38 2.14 5.38 8.67 2.14 5.38 5.38 0.55 CEP Ht 1 0.97 0.99 0.98 1 0.97 0.96 0.98 0.98 Hi 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 X% 1 2.06 0 1.02 1 2.06 3.13 1.02 0.89 AMP Ht 1.1 1.1 1.06 1 1.15 1.2 1.2 1.08 1.11 Hi 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 X% 0 0 3.77 10 4.35 8.33 8.33 1.85 1.01 PENG Ht 1 1 1 1.17 1.2 1.02 0.97 1 1.05 Hi 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 X% 10 10 10 5.98 8.33 7.84 13.4 10 5.26 OXA Ht 1.3 1.2 1.23 1.31 1.4 1.25 1.3 1.27 1.28 Hi 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 X% 0 8.33 5.69 0.76 7.14 4 0 2.36 1.36 CEF Ht 0.64 0.65 0.61 0.62 0.64 0.63 0.65 0.63 0.63 Hi 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 X% 1.56 3.08 3.28 2.11 1.56 0.32 2.63 0.47 0.49 CLO Ht 1.2 1.3 1.2 1.25 1.22 1.1 1.31 1.17 1.22 Hi 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 X% 2.5 5.38 2.5 1.6 0.82 11.82 6.11 5.13 0.92 Bảng 3.11 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (5mg/l) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 TB AMO Ht 8.8 8.8 8.7 8.86 9.1 9.13 8.92 8.86 8.9 Hi 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 X% 1.14 1.14 2.3 0.45 2.2 2.52 0.22 0.45 0.04 CEP Ht 6.2 6.14 6.03 5.97 6.11 5.98 6.12 6.22 6.1 Hi 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 X% 1.61 0.65 1.16 2.18 0.16 2.01 0.33 1.93 0.06 AMP Ht 5.7 5.6 5.5 5.62 5.67 5.81 5.79 5.8 5.69 Hi 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 X% 0 1.79 3.64 1.42 0.53 1.89 1.55 1.72 0.24 PENG Ht 5.1 5 5 5.12 5.23 5.17 5.1 5.21 5.23 Hi 5.2 5 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 X% 1.96 0 4 1.56 0.57 0.58 1.96 0.19 0.57 OXA Ht 6.9 6.9 7.05 7.07 7.12 7.2 7.13 7.15 7.07 Hi 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 X% 2.9 2.9 0.71 0.42 0.28 1.39 0.42 0.7 0.5 CEF Ht 3.4 3.5 3.3 3.32 3.4 3.43 3.57 3.63 3.44 Hi 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 X% 5.88 2.86 9.09 8.43 5.88 4.96 0.84 0.83 4.54 CLO Ht 6.42 6.51 6.6 6.63 6.61 6.57 6.51 6.48 6.54 Hi 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 X% 1.25 0.15 1.52 1.96 1.66 1.07 0.15 0.31 0.63 Bảng 3.12 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (10mg/l) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 TB AMO Ht 20.1 19.8 20.3 21.1 21.8 21 21.6 20.8 20.8 Hi 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 X% 0.5 2.02 0.49 4.27 7.34 3.81 6.48 2.88 2.94 CEP Ht 15.1 14.2 14.7 14.9 15.3 15.5 14.9 14.6 14.9 Hi 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 X% 0.66 7.04 3.4 2.01 0.65 1.94 2.01 4.11 2.01 AMP Ht 14.8 14.9 14.7 14.3 13.9 14.1 14.5 15.1 14.5 Hi 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 X% 1.35 2.01 0.68 2.1 5.04 3.55 0.69 3.31 0.43 PENG Ht 12.2 11.7 12.1 11.5 11.8 11.9 12.3 12.4 12 Hi 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 X% 2.46 1.71 1.65 3.48 0.85 0 3.25 4.03 0.73 OXA Ht 17.1 17.2 17 16.7 16.7 17 17.1 16.8 17 Hi 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 X% 1.17 1.74 0.59 1.2 1.08 0.59 1.29 0.6 0.32 CEF Ht 9.3 9.4 9.2 8.92 8.97 9.23 9.15 9.21 9.17 Hi 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 X% 2.15 3.19 1.09 2.02 1.45 1.41 0.55 1.19 0.79 CLO Ht 16.2 16.3 15.9 16.2 16.4 16 15.7 16.2 16.1 Hi 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 X% 0.62 1.23 1.26 0.62 1.83 0.63 2.55 0.62 0.08 Nhận xét: Từ kết quả tính tốn ở trên, chúng tơi nhận thấy đều nằm trong giới hạn cho phép (<15%). 3.2.6. Độ lặp lại của phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngồi việc cĩ sai số nhỏ cịn yêu cầu cĩ độ lặp lại cao. Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tơi tiến hành khảo sát độ lặp lại ở 3 nồng độ trên (1; 5; 10 mg/l). Dựa vào kết quả thực nghiệm của phần trước, tiến hành tính độ lặp lại theo cơng thức sau: Độ lệch chuẩn: Hệ số biến động: Trong đĩ: Hi là giá trị chiều cao pic của tín hiệu phân tích đo ở lần thứ i Htb là giá trị chiều cao pic của n lần đo (n = 8) S là độ lệch chuẩn của phép đo V là hệ số biến động của phép đo Gía trị độ lệch chuẩn S được tính tốn trong phần mềm OriginVersion 7.5. Các kết quả tính tốn được biểu diễn ở bảng sau: Bảng 3.13: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích Nồng độ AMO CEP Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0744 1.3625 5.46 0.0146 0.9813 1.49 5 mg/l 0.1495 8.89625 1.68 0.0946 6.0963 1.55 10 mg/l 0.708 20.8125 3.4 0.4106 14.9 2.76 Nồng độ AMP PENG Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0692 1.11125 6.22 0.0878 1.045 8.4 5 mg/l 0.1108 5.68625 1.95 0.0863 5.1163 1.69 10 mg/l 0.4138 14.5375 2.85 0.3137 11.988 2.62 Nồng độ OXA CEF Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0609 1.2825 4.75 0.0141 0.6331 2.23 5 mg/l 0.1117 7.065 1.58 0.1158 3.4438 3.36 10 mg/l 0.1915 16.955 1.13 0.1598 9.1725 1.74 Nồng độ CLO Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0688 1.21875 5.64 5 mg/l 0.073 6.54125 1.12 10 mg/l 0.2295 16.1125 1.42 Qua bảng 3.13 đánh giá độ lặp lại của phép đo chúng tơi nhận thấy độ lệch chuẩn và hệ số biến động của chất phân tích tương đối nhỏ, mặc dù với nồng độ 1mg/l thì hệ số biến động lớn hơn so với nồng độ 5mg/l và 10mg/l xong các giá trị này vẫn nằm trong giới hạn. Như vậy phương pháp cĩ độ lặp lại tốt. 3.3. Phân tích mẫu thực 3.3.1. Phân tích mẫu thuốc Bảng 3.14 Thơng tin và đặc điểm từng loại thuốc Tên thuốc Đặc điểm Xuât xứ Hàm lượng Ampicillin Viên con nhộng, đĩng vỉ, 10 viên/ vỉ Cơng ty cổ phần dược phẩm VIDIPHA Mỗi viên thuốc chứa 500mg AMP, cịn lại là tá dược Cephalexin Viên con nhộng, đĩng vỉ, 10 viên/ vỉ Cơng ty cổ phần dược phẩm Trung ương 2 - DOPHARMA Mỗi viên thuốc chứa 500mg CEP, cịn lại là tá dược Br- Zaxin Viên con nhộng, đĩng vỉ, 10 viên/vỉ Cơng ty cổ phần dược phẩm Overseas Laboteries - Ấn độ VN-5254-08 Mỗi viên thuốc chứa 250mg AMO và 250mg CLO, cịn lại là tá dược Penicillin G Dạng bột Cơng ty cổ phần hĩa – dược phẩm MEKOPHAR Lọ chứa 1.000.000 IU PENG (»600mg) Bristopen Dạng viên con nhộng, 10 viên/ vỉ Nhập khẩu bởi Cơng ty CP Dược phẩm TBYT Hà Nội HAPHARCO Mỗi viên chứa 500mg OXA Cefixim Dạng viên con nhộng, 10 viên/vỉ Cơng ty Saga Laboratories, India Mỗi viên chứa 200mg CEF Các mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn đều 4 viên thuốc nén, lấy mẫu đại diện, mang đi cân một lượng chính xác m1 = 0.02g. Mẫu được hịa tan bằng nước deion, đem siêu âm 10 phút sau đĩ lọc qua giấy lọc cỡ 0.45μm và định mức bằng nước deion trong bình 20ml, ta được dung dịch A cĩ nồng độ a mg/l. Hút 2.5ml dung dịch pha lỗng 10 lần với nước deion thành dung dịch B trong bình 25 ml cĩ nồng độ b mg/l. Từ dung dịch B pha thành các dung dịch cĩ nồng độ thấp hơn cĩ nồng độ Cx, được dùng trong ngày, tiến hành đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Các dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng. Hút 100 μl vào 4 bình 2ml, sau đĩ thêm dần 20 μl, 40 μl, 80 μl từ dung dịch chuẩn 100 mg/l vào 3 bình cịn lại. Định mức bằng dung dịch điện ly chứa 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75. Tiến hành chạy lặp lai .mỗi mẫu phân tích 3 lần với các điều kiện tối ưu như chạy đường chuẩn, lấy kết quả trung bình. Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê origin 7.5 và excel. * Sau khi tính được nồng độ Cx theo phương pháp thêm chuẩn thì khối lượng của các β-Lactam tính trong khối lượng cân m1 được lấy theo các thể tích ban đầu được tính theo cơng thức sau m = V. Cx. F. 10-6 (g) Trong đĩ: m là khối lượng chất phân tích cĩ trong m1 gam mẫu V: thể tích dung dịch được pha từ m1 (g) F: hệ số pha lỗng 10-6: hệ số chuyển đổi từ μg sang g Cơng thức cuối cùng là m = 20. Cx. 200.10-6 (g) * Hàm lượng β-Lactam trong một viên thuốc được tính theo cơng thức sau % β-Lactam = (m / mthuoc) . 100% Với mthuốc = S 4 viên thuốc Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả in trên nhãn là: * Đánh giá độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn Ta cĩ Cx là nồng độ ban đầu khi chưa thêm chất chuẩn β-Lactam Cs: nồng độ được thêm vào lượng dung dịch chuẩn DC Hx và Hs là chiều cao trung bình của các dung dịch tương ứng Theo đĩ Cs = Hs. Cx/ Hx Khi đĩ tính được lượng β-Lactam thêm vào là: DC’ = Cs – Cx (mg/l) Cơng thức thu hồi là : %H = (DC’/DC).100% Bảng 3.15. Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc STT Tên hoạt chất DC Chiều cao (mAU) Thời gian lưu (phút) Cx + DC Cs %H Hiệu suất trung bình S%H/3 1 AMO 0 2.5 8.35 2.1 97.3 1 3.6 8.30 3.1 3.02 92.4 2 4.9 8.28 4.1 4.12 100.8 4 7.2 8.26 6.1 6.05 98.7 2 CLO 0 2.7 13.78 2.43 96 1 3.8 13.71 3.43 3.42 99 2 4.7 13.67 4.43 4.23 90 4 7.1 13.65 6.43 6.39 99 3 CEP 0 4.2 10.71 4.38 99.94 1 5.3 10.77 5.38 5.53 114.7 2 5.8 10.77 6.38 6.05 83.43 4 8.1 10.75 8.38 8.45 101.7 4 AMP 0 3.6 11.23 4.06 98.68 1 4.4 11.27 5.06 4.96 90.22 2 5.5 11.31 6.06 6.2 107.1 4 7.1 11.30 8.06 8.01 98.68 5 PENG 0 4.1 11.67 4.79 104.2 1 5.1 11.63 5.79 5.96 116.8 2 5.7 11.63 6.79 6.66 93.46 4 7.6 11.59 8.79 8.88 102.2 6 OXA 0 5.4 12.69 4.86 104.3 1 6.6 12.66 5.86 5.94 108 2 7.7 12.64 6.86 6.93 103.5 4 9.9 12.63 8.86 8.91 101.3 7 CEF 0 1.8 13.27 3.4 99.17 1 2.3 13.24 4.4 4.34 94.44 2 2.9 13.21 5.4 5.48 103.9 4 3.9 13.50 8.4 7.37 99.17 Bảng 3.16. Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so với kết quả in trên nhãn thuốc STT Tên hợp chất và hàm lượng ghi trên nhãn mthuốc (g) Nồng độ Cx (mg/l) Khối lượng thuốc tính theo Cx (g) %β-actamsx %β-Lactam đo Sai số S so với hàm lượng in trên nhãn 1 AMO 250mg và CLO 250 mg 2.43 AMO 2.1 CLO 2.43 AMO 0.0084 CLO 0.00972 AMO 81.97 CLO 81.97 AMO 84 CLO 97.2 AMO 0.025 CLO 0.186 2 CEP 500mg 2.3 4.38 0.018 87 87.6 0.007 3 AMP 500mg 2.43 4.06 0.016 82.3 81.2 0.013 4 PENG 600mg 0.65 4.79 0.019 92.3 95.8 0.038 5 OXA 500mg 2.45 4.86 0.024 81.6 97.2 0.191 6 CEF 200mg 1.185 3.4 0.014 67.5 68 0.007 Trong 6 loại thuốc phân tích thì thuốc chứa hoạt chất OXA cĩ nhiều hàm lượng thuốc nhất, sau đĩ đến thuốc chứa CLO, PENG, AMO và cuối cùng là CEF và CEP. Hiệu suất thu hồi cao > 97.3%, đạt yêu cầu cho phép > 95% 3.3.2 Phân tích mẫu máu [3] Mẫu máu được lấy từ 2 người tình nguyện độ tuổi từ 20 đến 25, cách 2 tuần trước khi uống thuốc khơng dùng bất kỳ loại thuốc nào khác. Mỗi người tình nguyện uống 3 viên/ngày vào các buổi sáng, trưa, tối và uống liên tiếp trong 3 ngày. Viên cuối cùng của ngày thứ 3, sau khi uống 4 giờ thì lấy mẫu máu.. Lấy từ 1.5 đến 2ml lượng mẫu vào các ống ependorf. Ly tâm 15 phút ở 10.000 rpm để tách riêng phần hồng cầu, phần huyết thanh được bảo quản trong tủ lạnh -150C. Trước khi phân tích lẫy mẫu ra khỏi ngăn đá và để ở nhiệt độ phịng cho mẫu tan đá. Hút 50 μl huyết thanh vào ống ependorf thể tích 10 ml. Lọai bỏ protein bằng cách kết tủa nĩ với etanol tuyệt đối khoảng 200-300 μl, thêm 500 μl n-hexan và ly tâm 15 phút ở 10.00 rpm tách riêng biệt 2 lớp. Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc 0.45 μm. Hút 200 μl dịch lọc làm bay hơi bằng khí N2 sạch đến hết dung mơi. Cặn được hịa tan bằng hỗn hợp 25 mM đêm Borat+100 mM SDS, pH= 7.75. Trộn đều bằng cách đặt vào bể siêu âm trong 2 phút. Dung dịch được đem đi đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Mỗi mẫu đo được bơm lặp lại 3 lần. Kết quả mẫu được xử lý bằng phần mềm thống kê origin 7.5 và excel. Bảng 3.17 Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh β-Lactam trong mẫu máu. STT Tên loại thuốc uống Khối lượng ghi trên nhãn (mg/viên) Hàm lượng thêm vào (mg/l) Thời gian lưu (phút) Chiều cao pic (mAU) Cx Cs %H Hiệu suất trung bình 1 Amoxicillin 500 mg AMO 0 9.21 2.3 1.93 102.09 1 9.17 3.5 1.93 2.94 100.69 2 9.13 4.8 1.93 4.03 104.89 3 9.11 7.1 1.93 5.96 100.7 2 Cloxacillin 500 mg CLO 0 14.6 2.7 2.46 92.63 1 14.31 3.5 2.46 3.19 72.89 2 14.23 5.1 2.46 4.65 109.3 3 14.15 6.9 2.46 6.29 95.67 Thời gian lưu của AMO và CLO thay đổi so với mẫu chuẩn và mẫu thuốc là do khi xử lý mẫu máu chưa đuổi hết được dung mơi hữu cơ là n-hexan bằng khí N2 nên thời gian lưu tăng lên. 3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) Phương pháp MEKC là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và hiệu quả tách cao. Phương pháp cĩ thể xác định được trên nhiều đối tượng khác nhau bao gồm cả chất mang điện tích và chất trung tính. Phương pháp cĩ một số đặc điểm cơ bản sau: - Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều so với kỹ thuật phân tích HPLC. Chạy một mẫu sắc ký 7 chất chỉ trong vịng 14 phút. - Dung dịch pha động cũng như mẫu phân tích thường được pha trong nước deion và sử dụng rất ít. - Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ tái sinh hơn nhiều so với phương pháp HPLC. Tuy nhiên phương pháp cũng cĩ một số nhược điểm sau: - Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phương pháp thấp hơn nhiều so với phương pháp khác. Giới hạn của nĩ khoảng cỡ mg/l đối với detector UV-VIS, DAD. Trong khi đĩ các phương pháp khác như: HPLC cĩ giới hạn nhỏ hơn nhiều. - Máy làm việc ở vùng điện áp rất cao nên phải cẩn trọng khi làm việc. - Lượng mẫu sử dụng nhỏ là một ưu điểm của phương pháp, đồng thời cũng là nhược điểm của nĩ. Khi lượng mẫu nhỏ dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng lớn do hệ số pha lỗng cao. Đối với mẫu cĩ hàm lượng nhỏ, khi tăng thời gian bơm mẫu thì gây ra hiện tượng dỗng pic, hiệu suất tách khơng cao. - Thời gian lưu của của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm, dung dịch điện ly vì vậy địi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ. 3.5. Hướng phát triển của đề tài. Trong bản luận văn này, do điều kiện cịn hạn chế nên chúng tơi chỉ xác định được hàm lượng của β_Lactam bằng phương pháp MEKC trong mẫu dược phẩm và mẫu máu. Phương pháp cịn cĩ thể được mở rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau ví dụ như: mẫu nước tiểu, mẫu sữa,… hay các mẫu mơi trường như: nước thải bệnh viện, nước thải trại chăn nuơi gia súc...Vì vậy rất cần cĩ những nghiên cứu tiếp theo để phát triển phương pháp áp dụng vào thực tiễn hơn. KẾT LUẬN Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách và xác định các kháng sinh AMO, AMP, CEP, PENG, OXA, CEF, CLO trong mẫu sinh học và dược phẩm, chúng tơi thu được kết quả như sau: Khảo sát và chọn được thơng số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký: - Detector DAD – 198 nm - Chất tạo Mixen: SDS. Dung dịch điện ly : 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20 kV - Sử dụng mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 56 cm, đường kính trong 50µm, loại bubble cell. - Nhiệt độ mao quản 280C Đánh giá phương pháp phân tích: - Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 1 – 10 mg/l, hệ số tương quan các đường chuẩn R2 > 0,99 - Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,54 mg/l đến 1 mg/l. Giới hạn định lượng LOQ từ 1,8 mg/l đến3,34 mg/l - Độ chính xác ở các nồng độ 1mg/l; 5mg/l; 10mg/l nằm trong khoảng 0 – 13.4 % - Hệ số biến động ở các nồng độ 1mg/l; 5mg/; 10mg/l nằm trong khoảng 1.12 – 8.4% 3. Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu. - Với mẫu thuốc: hiệu suất thu hồi đạt được từ 83.43%. đến 116.8%. - Với mẫu máu: hiệu suất thu hồi từ 72,89% tới 109.3%. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y Tế (2007), Hĩa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội 2. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ 3, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội 3. Lê Thị Huyền Dương (2000), Tách và phân tích đồng thời một số chất quan trọng trong nhĩm vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản, Luận án tiến sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội 4. Ngọc Phương ( 2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo laodong.com.vn, 10-10-2006. 5. Ngơ Quang Trung (2008), Xây dựng qui trình phân tích đồng thời một số kháng sinh học b_lactam và nghiên cứu sự tồn dư tại một số khu vực bệnh viện Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học,ĐHQGHN 6. Nguyễn Văn Đích (2005), "Khơng nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học và đời sống, số 27 7. Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội 8. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu năng cao, Sách chuyên đề cho sinh viên chuyên ngành hĩa phân tích, ĐH Quốc Gia Hà Nội 9. Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hĩa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội 10. Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hĩa Dược, Tài liệu lưu hành nội bộ cho sinh viên trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội TIẾNG ANH 11. A. Fernández-González, R. Badía and M. E. Díaz-Gar (2003), "Micelle-mediated spectrofluorimetric determination of ampicillin based on metal ion-catalysed hydrolysis", Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 223-231 12. Amber R. Solangi (2007), ”Development of new analytical methods for 4-quniolone antibacterials and cephalosporin antibiotics”, National Centre of Excellence in Analytical Chemistry/ University of Sindh 13. Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States", Journal Nature medicine, 9: 424 - 430 14. Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), "Application of capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins", Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239–246 15. Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008), "Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4), 1249-1253 16. C. Y. W Ang, W.H. Luo, E.B. Hansen, j.p. Freeman, H,C. Thompson (1996), "Rapid determination of ampicillin in bovine milk by liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 80(1),. 107-190 17. D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care Medicin, 29(6):1101-1108 18. F. Belal, M. M. El-Kerdawy, S. M. El-Ashry and D. R. El-Wasseef (2000), "Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686 19. J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57 20. James W.Jorgenson (1992), High performance capillary electrophoresis, Agilent Technoligies 21. L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening method for analytical control of antibiotic Residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of AnalyticaChimicaActa, 523(2004)21–28 22. M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C. Cruces-Blanco, M. del Olmo Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary electrophoresis", Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280 23 M.I Bailon-Perez,L.CuadrosRodr´ ıguez,C.Cruces-Blanco (2006), " Analysis of different -lactams antibiotics in pharmaceutical preparations Using micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752 24 Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono(2003),“Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means off luorescence, chemiluminescence and massspectrometry”, Journal of Mass Spectrometry,39(3), 329 – 340 25 Merk (1996), The Merck Index, 12th edition 26 R. Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago. Press, 23:757-762 27 Richard P. Wenzel, M.D Michael B. Edmond, M.D., M.P.H (2000), " Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine, 343:1961-1963 28 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line solid phase extraction", Analytica Chimica Acta,592(2), 187–192 29 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, 119(12), 2595-2601 PHỤ LỤC SẮC ĐỒ ĐIỆN DI VÀ ĐƯỜNG THÊM CHUẨN CỦA β-LACTAM TRONG MẪU THỰC * Mẫu thuốc: Hình 3.17. Sắc đồ điện di của β-Lactam trong mẫu thuốc Hình 3.18. Đường thêm chuẩn mẫu thuốc của β-Lactam phụ thuộc vào chiều cao pic. * Mẫu máu Hình 3.19 Sắc đồ điện di của β-Lactam trong mẫu máu. HÌnh 3.20 Đường thêm chuẩn của AMO và CLO trong mẫu máu phụ thuộc vào chiều cao pic