Thử nghiệm dùng hormon đực ở giáp xác thuộc bộ mười chân decapoda để đực

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC CHUNG QUANG TRÍ THỬ NGHIỆM DÙNG HORMON ĐỰC Ở GIÁP XÁC THUỘC BỘ MƯỜI CHÂN DECAPODA ĐỂ ĐỰC HOÁ HẬU ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH Macrobrachium rosenbergii de Man KHOÁ LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH: SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN TƯỜNG ANH TP.HỒ CHÍ MINH – NĂM 2006 2 Lời Cảm Tạ Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Tường Anh, người đã cung cấp nhiều kiến thức quí báu cũng như tài liệu giúp em làm cơ sở khoa học, để em thực hiện đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn thầy Phan Kim Ngọc đã giúp đỡ em nhiều trong quá trình em thực hiện đề tài. Thầy đã gợi ý cho em nhiều khúc mắc trong quá trình em thực hiện đề tài. Em cũng xin chuyển lời cảm ơn đến anh An người đã cung cấp những tài liệu quan trọng cho đề tài, cũng như nguồn tôm để em tiến hành những thí nghiệm. Rất cảm ơn bạn Quân người đã cùng tôi thực hiện đề tài này cùng các bạn khoa sinh đã giúp đỡ tôi trong lúc thực hiện đề tài. Cuối cùng con xin cám ơn ba mẹ đã luôn động viên chia sẻ, và tạo điều kiện thuận lợi để con có thể hoàn thành chương trình học. Xin cảm ơn! 3 Mục Lục Trang phụ bìa ...................................................................................................................................................... i Lời cảm tạ............................................................................................................................................................. ii Mục luc................................................................................................................................................................. iii Mở đầu.................................................................................................................................................................. 1 Chương I: tổng quan tài liệu ................................................................................................................................ 3 1.1 Phân loại và phân bố tôm càng xanh ........................................................................................................... 4 1.2 Đặc điểm hình thái sinh học, và chu kỳ sống của tôm càng xanh ................................................................ 5 1.3 Đặc điểm sinh sản của tôm càng xanh .......................................................................................................... 8 1.4 Phụ bộ đực ..................................................................................................................................................... 13 1.5 Tuyến đực ...................................................................................................................................................... 13 1.6 Hormon tuyến đực ........................................................................................................................................ 15 1.7 Một số thí nghiệm liên quan đến tuyến đực .................................................................................................. 16 1.7.1 Hiệu ứng của việt cắt bỏ tuyến đực ............................................................................................................ 16 1.7.2 Hiệu ứng của việc cấy tuyến đực cho tôm cái ........................................................................................... 18 1.8 Một số giải pháp công nghệ có triển vọng ứng dụng ................................................................................... 19 1.8.1 Kỹ thuật chuyển giới tính .......................................................................................................................... 19 1.8.2 Tạo tôm cái giả ZZ bằng hormon .............................................................................................................. 19 1.8.3 Kỹ thuật cắt tuyến androgenic tạo tôm cái giả ZZ .................................................................................... 19 1.8.4 Kết quả nghiên cứu ở nước ta .................................................................................................................... 20 1.13 Kỹ thuật dùng siêu âm đưa hơp chất vào trong động vật dưới nước.......................................................... 22 Chương II: PHƯƠNG PHÁP VÀ THÍ NGHIỆM............................................................................................... 2.1 Địa điểm thí nghiệm ...................................................................................................................................... 24 2.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................................................................ 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................................................. 26 2.3.1 Thu nhận hormon từ tuyến đực .................................................................................................................. 26 2.3.2 Thử nghiệm trên tôm càng xanh ................................................................................................................ 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3. Tỷ lệ đực cái ..................................................................................................................................................... 30 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Kết luận.............................................................................................................................................................. 35 - Kiến nghị............................................................................................................................................................ 35 4 Danh Sách Bảng Báng 1: Bảng phân biệt tôm càng xanh đực và cái ............................................................................................. 5 Bảng 2: Bảng phân biệt các giai đoạn ấu trùng tôm càng xanh ......................................................................... 11 Bảng 3: Tính xác xuất ở bể 1 ............................................................................................................................... 30 Bảng 4: Tính xác xuất ở bể 2 ............................................................................................................................... 30 Bảng 5: Tính xác xuất ở bể 3 ............................................................................................................................... 31 Bảng 6: Tính xác xuất ở bể A .............................................................................................................................. 31 Bảng 7: Tính xác xuất ở bể B .............................................................................................................................. 31 Bảng 8: Tính xác xuất ở bể C .............................................................................................................................. 32 Biểu đồ 1: so sánh tỷ lệ đực cái ở 3 bể nuôi (Lô thí nghiệm) ............................................................................. 32 Biểu đồ 1: so sánh tỷ lệ đực cái ở 3 bể nuôi (Lô đối chứng) .............................................................................. 33 Danh Sách Hình Hình 1: Ba kiểu hình ở tôm càng xanh đực ........................................................................................................ 6 Hình 2: Hình thái bên ngoài tôm càng xanh ....................................................................................................... 7 Hình 3: Vòng đời tôm càng xanh......................................................................................................................... 8 Hình 4: Ảnh đặc điểm các giai đoạn của ấu trùng tôm càng xanh ..................................................................... 12 Hình 5: Chân bơi thứ 2 ở con tôm càng xanh đực............................................................................................... 13 Hình 6: Tuyến đực ở tôm càng xanh có hình kim tự tháp ở cuối ống dẫn tinh .................................................. 14 Hình 7: Tuyến đực ở Cherax quadricarinatus trước khi cắt cuống mắt ............................................................ 15 Hình 8: Tuyến đực ở Cherax quadricarinatus sau khi cắt cuống mắt................................................................ 15 Hình 9: Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực ....................................................................................................... 16 Hình 10: Buồng trứng ở tôm càng xanh cái bình thường.................................................................................... 17 Hình 11: Buồng trứng của tôm càng xanh đực bị cắt tuyến đực......................................................................... 18 Hình 12: Tôm càng xanh dùng trong thí nghiệm ................................................................................................ 24 Hình 13: Cua đồng dùng trong thí nghiệm.......................................................................................................... 25 5 MỞ ĐẦU Tôm càng xanh có thịt ngon, giá trị xuất khẩu cao, có kích thước lớn nhất trong 100 loài thuộc giống Macrobrachium (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Con tôm càng xanh đóng vai trò rất quan trọng, đối với sự phát triển thuỷ sản ở khu vực nước ngọt. Năm 2005, vùng ĐBSCL có diện tích nuôi tôm càng xanh trên 6.000ha, sản lượng ước đạt 1.400 tấn/năm.Theo ngành thuỷ sản, đến năm 2010, diện tích nuôi tôm càng xanh trong vùng sẽ lên đến 32.000ha, ước sản lượng sẽ đạt khoảng 60.000 tấn. Chính vì vậy, ngày 8 tháng 12 năm 1999. Thủ tướng chính phủ có quyết định số 224/1999/QĐ phê duyệt chương trình phát triển nuôi thuỷ sản thời kỳ 1999 – 2010, phấn đấu đến năm 2010 tổng sản lượng nuôi thuỷ sản đạt trên 2.000.000 tấn, giá trị kim nghạch xuất khẩu đạt trên đạt trên 4,5 tỷ USD, trong đó diện tích nuôi tôm càng xanh 32.000 ha, nhu cầu về giống 1,5 – 2 tỷ con và sản lượng đạt khoảng 60.000 tấn. Để đạt được mục đích này, giải pháp về giống là khâu đột phá quan trọng và vì thế kỹ thuật sản xuất giống phải càng hoàn thiện, bảo đảm cung cấp giống, không chỉ đạt về số lượng mà cả về chất lượng. Để chất lượng giống cũng như việc sản xuất tôm được phát triển người ta chú ý đến việc đánh giá chất lượng tôm giống, đặc điểm sinh học giữa tôm đực và tôm cái.Trong đặc điểm sinh học tôm càng xanh, người ta nhận thấy rằng tôm đực có tốc độ phát triển cao hơn nhiều so với tôm cái cùng lứa. Tôm đực có thể đạt trọng lượng 450g, trong khi tôm cái nhỏ hơn nhiều chỉ vào khoảng 60g. Hiện nay ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long giá tôm nguyên liệu khoảng 80.000- 90.000 đồng /kg. Các nhà nghiên cứu Arập Xêut đã so sánh việc nuôi tôm càng xanh toàn đực, nuôi chung đực cái và nuôi toàn cái (Siddiqui et al., 1997). Tôm được nuôi trong bể ximănga mật độ 5 con/m2. Sau 112 ngày nuôi, bể nuôi toàn đực cho năng suất 159g/m2, bể nuôi chung đực cái cho 132g /m2 và bể toàn cái cho năng suất 108g/m2. Tỷ lệ tôm thương phẩm (> 20g) ở bể nuôi toàn đực chiếm 99%, 90% bể chung đực cái, 75% ở bể toàn cái. Ngoài ra ở bể nuôi toàn đực hệ số thức ăn là thấp nhất. Các vấn đề liên quan đến điều khiển giới tính ở tôm càng xanh luôn là đề tài được nhiều tác giả quan tâm, hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu, nhưng chưa mang lại kết quả khả quan hay chưa phù hợp với thực tế sản xuất, nếu thành công và đưa vào sản xuất đại trà được thì nó sẽ mang lại lợi ích kinh tế rất lớn giúp cải thiện đời sống của nhiều hộ dân. Hiện nay việc sử dụng hormon để điều khiển sự sinh sản ở cá đã được thực hiện nhiều nơi trên thế giới và Việt Nam, mang lại nhiều lợi ích kinh tế to lớn. Nhằm tìm một cách khả thi để đực hoá tôm càng xanh. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm dùng hormon đực ở giáp xác thuộc bộ mười chân Decapoda để đực hoá hậu ấu trùng tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de Man” 6 Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2. Phân loại và phân bố Tôm càng xanh có tên khoa học là Macrobrachium rosenbergii được de Man đặt tên vào năm 1897, có vị trí phân loại sau: Nghành tiết túc: Arthopoda Lớp gíap xác: Crustacea Lớp phụ giáp xác bậc cao: Malacostraca Bộ mười chân: Decapoda Bộ phụ chân bơi: Natantia Phân bộ: Caridea Họ: Palaemonidae Họ phụ: Palaemoninae Giống: Macrobrachium Loài: Macrobrachium rosenbergii de Man (1879) Tôm càng xanh phân bố rộng ở khu vực Nam Á, Trung và Nam Mỹ, Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương, Bắc châu Úc, Nam Trung Quốc, Đài Loan, từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, tôm càng xanh phân bố ở các vùng nước ngọt lẫn nước lợ. Chúng phân bố hầu hết các thuỷ vực như sông, hồ, kênh, rạch, ao…và vùng ở gần cửa sông. Ở Việt Nam tôm càng xanh phân bố từ Khánh Hoà trở vào, tập trung chủ yếu ở vùng Đồng Bằng Song Cửu Long, mặc dù hiện nay tôm càng xanh đã được di giống ở nhiều nơi ở Việt Nam, đặt biệt là ở các tỉnh phía Bắc. (Nguyễn Thị Thanh Thuỷ. Kỹ thuật sản xuất giống Tôm Càng Xanh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp). 1.2 Đặc điểm hình thái sinh học, và chu kỳ sống của tôm càng xanh Ấu trùng tôm càng xanh có tập tính sống trôi nổi, bơi lội tích cực, đuôi hướng về phía trước, bụng ngữa lên trên. Ấu trùng sống ở nước lợ từ 1 – 2 tháng, khi trưởng thành sống trong nước ngọt. Tôm bột vừa mới biến thái có đặc điểm tương tự như tôm trưởng thành về cách di chuyển và bơi lội (New và Singhlka, 1985). Báng 1: Phân biệt tôm càng xanh đực và cái: Cơ quan Tôm đực Tôm cái Lỗ sinh dục Nằm ở gốc chân bò thứ 5 Tại gốc chân bò thứ 3 Phần phụ sinh dục (Appendage masculina) Ở chân bơi thứ 2 Không có Tôm càng xanh trưởng thành có màu xanh ở thân, con đực có đôi càng to màu xanh đậm, con cái có đôi càng nhỏ hơn. Tôm càng xanh trưởng thành không những dễ dàng phân biệt đực và cái qua đôi chân bò thứ hai (càng) mà 7 còn qua cơ quan sinh dục như lỗ sinh dục đực nằm ở gốc đôi chân bò 5, lổ sinh dục cái nằm ở gốc đôi chân bò 3 (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Con đực trưởng thành, có thể có ba kiểu hình (morphotype) là kiểu đực nhỏ, kiểu có càng màu cam và kiểu có càng màu xanh dương. Tôm đực nhỏ có thể phát triển thành tôm đực có càng màu cam và tôm càng màu cam phát triển trội thành tôm có càng màu xanh dương. Mỗi một kiểu trong số ba kiểu hình nói trên có tập tính sinh sản và đặc điểm sinh dục thứ cấp nổi bật. Hình 1: Ba kiểu hình ở tôm càng xanh đực. Theo Ling (1962) con cái tiết ra chất kích thích con đực sau khi lột xác tiền giao vĩ. Sự giao vĩ xảy ra giữa tôm đực có vỏ cứng và tôm cái thành thục vừa mới lột xác tiền giao vĩ (pre- moult). Quá trình đẻ trứng xảy ra vài giờ sau khi giao vĩ, trứng đi ngang túi tinh và xảy ra sự thụ tinh. Các trứng thụ tinh được giữ ở bụng tôm mẹ và được giữ lại nhờ các tuyến tiết chất dính ở các phụ bộ chân bơi. Nó được giữ ở đây cho đến khi nở. Thời gian ấp trứng có thể thay đổi nhưng thường không quá 3 tuần. Các trứng được cung cấp oxy nhờ sự hoạt động tích cực của chân bụng và được vệ sinh nhờ đôi chân ngực thứ nhất (New và Singlka, 1985). Con cái di cư ra cửa sông nơi có nồng độ muối từ 6 – 18%0 để trứng nở thành ấu trùng bơi lội phù du trong nước. Giai đoạn ấu trùng thường kéo dài 4 – 6 tuần, tuỳ thuộc nhiệt độ nước, chất lượng nước và thức ăn (Aquacop, 1977). Hậu ấu trùng có tập tính bám, chuyển sang sống ở tầng đáy và bắt đầu di cư ngược dòng vào khu vực nước ngọt. Đốt bụng thứ 2 Chân ngực III - V Chân ngực I,II Vùng mang của giáp đầu ngực Các tấm vỏ bên Telson chuỳ Chân bụng Râu Mắt Hình 2: Hình thái bên ngoài tôm càng xanh. 8 1.3 Đặc điểm sinh sản của tôm càng xanh Giao vĩ Con đực thành thục có thể trạng khoẻ mạnh (vỏ cứng) có thể giao vĩ, trong khi con cái chỉ tiến hành giao vĩ ngay sau khi lột xác (premounting – moult) (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Đẻ trứng Sau khi giao vĩ từ 6 – 20 giờ, con cái bắt đầu đẻ trứng, ở những con cái thành thục nhưng không giao vĩ vẫn đẻ trứng sau khoảng 24 giờ sau khi lột xác, tuy nhiên trứng không được thụ tinh sẽ thoái hoá sau 2 – 3 ngày (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Trong điều kiện nuôi tốt, trứng vẫn phát triển trong buồn trứng, trong khi con cái vẫn mang trứng (O’Donovan et al., 1984). Ấp trứng Quá trình ấp trứng kéo dài 19 – 23 ngày ở nhiệt độ 25 – 310C (Ling, 1962). Trong thời gian ấp trứng, màu trứng sẽ chuyển dần từ vàng sang cam, rồi xám hay nâu đậm khi nở. Sự ấp trứng liên quan trực tiếp đến nhiệt độ và tôm cái rất nhạy cảm với những biến động trong thời gian mang trứng. Khi gặp trong những biến động trong lúc ấp trứng, hoạt động chân bụng thường giảm, làm trở ngại đến nở trứng và tỷ lệ sống của ấu trùng. Đặc điểm của các giai đoạn phát triển trứng tôm càng xanh có thể chia thành bốn giai đoạn sau: - Giai đoạn I: Trứng chưa chín. Buồng trứng nhỏ, trong suốt, nằm ở vùng chót sau của khoang giáp đầu ngực. Trứng có hình cầu với nhân rõ ràng và nguyên sinh chất trong suốt. Đường kính trứng đạt 0,0064 – 0,128 mm. - Giai đoạn II: Chớm chín. Buồng trứng chiếm khoảng ¼ - ½, chiều dài của khoang giáp đầu ngực và có màu vàng. Trứng hơi ngà do có noãn hoàng trong nguyên sinh chất. Nhân không thấy rõ. Đường kính trứng từ 0,191- 0,447 mm. - Giai đoạn III: Trứng chín. Buồng trứng phát triển hơn và chiếm hơn ¾ chiều dài khoang giáp đầu ngực, có màu vàng cam. Trứng hơi đục, nhân không thấy được do hình thành noãn hoàng. Đường kính trứng 0,3192 – 0,545 mm . Hình 3: Vòng đời tôm càng xanh (Arrignon, 1994). Nöôùc ngoït (1 naêm) Giao vó vaø sinh saûn Tröôûng thaønh Tröùng Aáu truøng Stage 1 Nöôùc lôï (1 – 2 thaùng) Aáu truøng Stage II Postlarva Gioáng 9 - Giai đoạn IV: Chín muồi. Buồng trứng chiếm toàn bộ chiều dài khoang giáp đầu ngực, màu vàng sậm. Trứng có hình cầu, đục do noãn hoàng tích tụ nhiều. Đường kính trứng đạt 0,4468 - 0,7661 mm. Mùa vụ sinh sản Tôm càng xanh sinh sản quanh năm ở hồ Balgoda (Sri Lanka) với 2 mùa vụ sinh sản cao điểm rộ nhất từ tháng 5 – 7 sau đó tháng 11 – 1 (Jinadasa, 1985). Theo Phan Hữu Đức (1988), tôm càng xanh sinh sản tập trung vào tháng 4 – 6 và tháng 8 – 10. Tôm cái đẻ 4 – 6 lần trên năm, mỗi lần cách nhau từ 19 – 45 ngày tùy điều kiện nhiệt độ và dinh dưỡng (Nguyễn Việt Thắng, 1995). Sức sinh sản Sức sinh sản tuyệt đối của tôm càng xanh là số trứng trên khối lượng cơ thể con cái, số lượng trứng thường phụ thuộc vào kích thước tôm cái, tôm cái càng lớn số trứng càng nhiều (Nguyễn Việt Thắng, 1995). Sức sinh sản của tôm tự nhiên dao động 60.000 – 130.000 trứng / con cái (Patra, 1976). Sự phát triển của ấu trùng Ấu trùng trải qua 11 giai đoạn khác nhau, và giai đoạn sau rất khác giai đoạn trước khi biến thái (Uno và Soo, 1968). Mỗi giai đoạn có những đặc điểm khác nhau. Ấu trùng giai đoạn I dài không quá 2mm, trong khi giai đoạn XI chúng đạt chiều dài 7mm. Bảng 2: Bảng phân biệt các giai đoạn ấu trùng tôm càng xanh (Uno và Soo, 1969) Giai đoạn ấu trùng Đặc điểm lưu ý I II III IV V VI VII VIII IX X XI Postlarve Mắt chưa có cuống Mắt có cuống Chân đuôi xuất hiện Chủy có hai răng ở cạnh trên Đốt đuôi dẹp và dài Mầm chân bụng xuất hiện Chân bụng có hai nhánh và chưa có lông tơ Chân bụng có lông tơ Nhánh trong của chân bụng có nhánh phụ trong Chủy có 3 - 4 răng ở đầu cạnh trên Chủy có nhiều răng ở cạnh trên Chủy có răng ở cạnh trên và dưới 10 Hình 4: Ảnh đặc điểm các giai đoạn của ấu trùng tôm càng xanh (Uno và Soo, 1969). 1.4 Phụ bộ đực Phụ bộ đực là cơ quan giao cấu ở tôm càng xanh đực nó xuất hiện ở chân bơi thứ 2. Chồi của phụ bộ đực bắt đầu xuất hiện vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38 g, tổng chiều dài 3,7cm) đến giai đoạn 94 ngày tuổi thì phụ bộ đực phát triển đầy đủ. Tơ Phụ bộ đực Nhánh chân trong Nhánh chân ngoài Hình 5: Chân bơi thứ 2 ở con tôm càng xanh đực. 11 1.5 Tuyến đực Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong tôm nước ngọt Cambarus montanus. Tuyến hormon đã được xác định sau đó ở giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953, và mô đó được gọi là tuyến đực (Charniaux- Cotton, 1953). Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn về tuyến đực, nó là một lớp mô mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước ngọt Procambarus blandingii, P. viae – viridis, Camb.bartonni and Camb.diogenes (Puckett, 1964), có chiều dài vài milimet (Warnock, 1975). Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua (King, 1964; Thampy and John, 1970; Andiyodi, 1984;Joshi and Khanoh, 1987; Minagawa et al., 1994 ) tôm pan đan (Carlish, 1959; Hoffman ,1968,1969,…). Theo Sagi ở giáp xác tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormon là tuyến đực. Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục (tinh sào) có hai chức năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở tôm càng xanh (và có thể ở nhiều động vật giáp xác thuộc bộ mười chân Decapoda khác) hai chức năng này thực hiện bởi hai cơ quan riêng rẽ. Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo tinh, còn tuyến đực (androgenic gland) - một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra hormon, tham gia vào sự biệt hoá giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng. Ở những tôm đực lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ. Đó là một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh. Cũng như tuyến sinh dục và ống dẫn tinh, tuyến đực chịu sự ức chế của một tuyến nội tiết nằm ở cuống mắt tôm. Hình 6: Tuyến đực ở tôm càng xanh có hình kim tự tháp ở cuối ống dẫn tinh Hình 7: Tuyến đực ở Cherax quadricarinatus trước khi cắt cuống mắt Tuyến đực (AG) Ống dẫn tinh chính 12 Hình 8: Tuyến đực ở Cherax quadricarinatus sau khi cắt cuống mắt 1.6 Hormon tuyến đực Hormon tuyến đực tinh chế đã được Martin và cộng sự tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều Armadilidium vulgare là một protein gồm có ba chuỗi peptid A (chứa 29aa), B (44aa), và C (45aa), ngoài ra trên chuỗi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm carboxyl. Trọng lượng phân tử hormonkhoảng 16.570 Da Khi tiến hành tiêm hormon tuyến đực cho con cái còn nhỏ, sau này con cái này phát triển thành con đực, khi cho giao vĩ với con cái thì đã cho ra thế hệ con. Hình 9: Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực. (Maetin et al.,). 1.7 Một số thí nghiệm liên quan đến tuyến đực 1.7.1 Hiệu ứng của việc cắt bỏ tuyến đực Hiệu ứng của việc cắt bỏ tuyến đực phụ thuộc vào tuổi của tôm. Các nhà khoa học ở Israel (Sagi& Cohen, 1990) đã nghiên cứu và tìm hiểu vai trò của tuyến đực đối với sự biến dạng của các kiểu hình của càng đã nói ở trên ở những tôm càng xanh trưởng thành. Khi cắt bỏ tuyến đực từ cả hai bên ở tôm đực nhỏ thì sự biến dạng thành tôm càng màu cam đã xảy nhưng sự biến dạng thành tôm càng màu xanh dương bị phong tỏa. Việc cắt tuyến đực ở tôm càng màu cam không cản trở việc biến dạng thành tôm càng màu xanh dương. Khi cắt bỏ tuyến đực ở tôm đực nhỏ và tôm càng màu cam thì cơ quan sinh dục ngoài biến mất cùng với sự tiêu biến ống dẫn tinh cũng như tinh sao (Sagi et al., 1990). Sau giải phẩu một thời gian, những cá thể bị cắt tuyến đực thì có càng nhỏ hơn và lớn chậm rõ rệt so với đối chứng không bị cắt và giả cắt. 13 Nếu cắt bỏ tuyến đực ở những tôm chưa trưởng thành nhưng vừa mới xuất hiện cơ quan sinh dục ngoài rồi nuôi riêng đến khi trưởng thành thì cũng không phát triển những chiếc càng có gai màu xanh dương và cơ quan sinh dục ngoài - đặc trưng của tôm đực bình thường và những con vật thí nghiệm này đã lớn chậm hẳn lại, 84% những con đực bị cắt tuyến đực như thế đã phát triển tuyến sinh dục cái, trong đó, 44% đã đẻ trứng và về hình dáng thì không thể phân biệt được với tôm cái bình thường. Khi đem phối những tôm cái đã chuyển giới (từ đực) với tôm đực bình thường, người ta đã thu được trứng thụ tinh, ấu trùng đã nở và biến thái thành hậu ấu trùng. Việc kiểm tra tỷ lệ giới tính ở hai quần thể hậu ấu trùng cho thấy quần thể thứ nhất gồm 100% đực và trong quần thể 2 có 1 cái duy nhất ( Sagi & Cohen, 1990). Hình 10: Buồng trứng ở tôm càng xanh cái bình thường Hình 11: Buồng trứng của tôm càng xanh đực bị cắt tuyến đực 1.7.2 Hiệu ứng của việc cấy tuyến đực cho tôm cái Trong một thí nghiệm khác người ta cấy mô của tuyến đực từ tôm càng xanh đực trưởng thành cho những tôm trưởng thành cho những tôm giả định là cái còn non. Nếu những tôm cái được cấy có kích thước vỏ đầu ức (carapace) từ 8 – 10,3 mm thì thí nghiệm không có kết quả. Còn những tôm cái được cấy ở kích thước vỏ đầu ức 6,5 – 7,5 mm và được 30 ngày tuổi sau hậu ấu trùng đã đổi giới tính thành đực 100%. Người ta đã phối giống những con đực chuyển giới từ cái như thế với những con cái bình thường thì trong thế hệ con thu được tỷ lệ giới tính là 1 đực / 3,2 cái. Điều này phù hợp với giả thuyết là cơ chế nhiễm sắt thể định đoạt giới tính ở tôm càng xanh là ZW (số lượng nhiễm sắt thể 2n=118, con đực có cặp NST giới tính: ZZ, con cái : ZW ) mặc dù đến nay người ta người ta vẫn chưa xác định được các nhiễm sắc thể tôm càng xanh một cách trực tiếp. Tuy nhiên những thí nghiệm cùng loạt cho thấy sự định đoạt giới tính ở tôm càng xanh là phức tạp hơn ngoài các nhiễm sắc thể giới tính còn có vai trò của các yếu tố môi trường. 1.8 Một số giải pháp công nghệ có triển vọng ứng dụng 1.8.1 Kỹ thuật chuyển giới tính 14 Sử dụng hormon đực hoá trộn vào thức ăn cho tôm ăn, hoặc hoà tan thành dung dịch để ngâm, tắm tôm trong những khoảng thời gian nhất định. Ðàn tôm toàn đực kiểu hình được tạo ra gồm các cá thể tôm đực có kiểu di truyền ZZ và tôm đực có kiểu di truyền WZ chuyển giới tính. Kết quả sử dụng hormon chuyển giới tính tôm phụ thuộc vào một số yếu tố, như loại hormon, thời gian, liều lượng sử dụng, giai đoạn phát triển của tôm khi đưa vào xử lý. 1.8.2 Tạo tôm cái giả ZZ bằng hormon Khi cho tôm cái giả ZZ cho sinh sản với tôm đực thường ZZ sẽ có đàn tôm con toàn đực ZZ. Có thể tạo tôm cái giả có kiểu di truyền ZZ bằng kỹ thuật chuyển giới tính cái sử dụng hormon điều khiển cái hoá. 1.8.3 Kỹ thuật cắt tuyến androgenic tạo tôm cái giả ZZ Tuyến androgenic ở tôm càng xanh chi phối quá trình biệt hoá giới tính đực. Một số nhà nghiên cứu cho thấy tôm càng xanh ở giai đoạn 30 – 60 ngày tuổi khi được cắt bỏ tuyến androgenic sẽ chuyển giới tính thành tôm cái, tôm cái chuyển gới tính (ZZ) do cắt bỏ tuyến androgenic khi sinh sản với tôm đực thường (ZZ) cho đàn tôm có tỷ lệ đực từ 98 – 100%. 1.8.4 Kết quả nghiên cứu ở nước ta Từ năm 1999 đến nay Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I đã kết hợp với Ðại học quốc gia Hà Nội, Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản III và trường Trung học thuỷ sản IV tiến hành một số nghiên cứu nhằm điều khiển giới tính, tạo tôm càng xanh toàn đực. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm điều khiển giới tính ở tôm càng xanh theo 3 giải pháp công nghệ nêu trên. Nghiên cứu chuyển giới tính: Ðược tiến hành trong 2 năm 1999 và 2000. Ðã tiến hành nghiên cứu thăm dò dùng hormon 17α - methyltestosterone (MT) với 2 phương pháp xử lý: trộn hormon vào thức ăn và hoà tan thành dung dịch để tắm tôm. Ðã thí nghiệm trộn với các hàm lượng 30, 40 và 50 mg MT/kg thức ăn, cho tôm giai đoạn PL5 và PL10 ăn thức ăn trộn hormon trong thời gian 30 ngày và 45 ngày ở các nồng độ 3ppm, 5ppm và 10ppm MT. Cũng đã thí nghiệm tắm tôm giai đoạn PL5 và PL10 trong thời gian 9 ngày và 15 ngày. Sau 6 đợt thí nghiệm, tỷ lệ tôm đực ở các lô thí nghiệm cho ăn thức ăn trộn hormon dao động từ 42,1 - 76,5%, ở các lô thí nghiệm tắm trong dung dịch hormon là 29,7 -72,7%, không đạt tỷ lệ giới tính như mong muốn. Nghiên cứu tạo tôm cái ZZ bằng sử dụng hormon: Ðã thí ngiệm sử dụng 2 loại hormon nhóm estrogen là Diethynylstibestrol (DES) và Ethynylestradiol (EE). Mỗi loại hormon đều thí nghiệm với tôm giai đoạn PL5 và PL10 ăn thức ăn trộn 100 và 200 mg/kg thức ăn trong thời gian 30 và 45 ngày, tỷ lệ tôm cái ở các lô thí nghiệm đạt từ 10 - 54,6% không sai khác tỷ lệ giới tính ở các lô đối chứng. Các lô thí nghiệm tắm tôm giai đoạn PL5 ở nồng độ 5ppm trong thời gian 9 và 15 ngày cho tỷ lệ tôm cái 28,6 - 50%. Các thí nghiệm chuyển giới tính và tạo tôm cái giả ZZ bằng sử dụng hormon nói trên đều không đạt kết quả như mong muốn mặc dù chúng tôi đã cố gắng tìm kiếm thông tin từ các nghiên cứu nước ngoài về loại hormonsử dụng, liều lượng, thời điểm, giai đoạn tôm xử lý để ứng dụng vào nghiên cứu ở nước ta. Tỷ lệ chuyển giới tính tôm trong các lô thí nghiệm của chúng tôi đều thấp cho thấy có thể các loại hormon sử dụng hoàn toàn không có tác dụng, hoặc tác dụng rất ít đến quá trình biệt hoá giới tính ở tôm càng xanh. Hormon chuyển giới tính đực 17α - methyltestosterone có bản chất steroid. Ngoài ra do chưa xác định chính xác tuổi của tôm bắt đầu biệt hoá giới tính, do vậy không thể loại trừ khả năng tôm được đưa vào thí nghiệm ở giai đoạn phát triển (PL5 và PL10), với những thời gian 30 – 45 ngày ở hình thức cho ăn và 9 – 15 ngày ở hình thức tắm là chưa thích hợp. . (Theo Phạm Anh Tuấn - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I). 15 Trung tâm Nghiên cứu và sản xuất giống thuỷ sản Ang Giang đã chuyển thành công 2.000 tôm cái giả. Viện đã chuyển 200.000 con tôm post toàn đực nuôi thử tại Thoại Sơn. (Ths.Nhuyễn Nhứt - Trưởng bộ môn sinh lý sinh sản - Phòng Sinh Học thực nghiệm). Những công trình nghiên cứu trong việc tạo tôm cái giả bằng cách cắt tuyến androgenic, cho trứng thụ tinh ở tôm đực thường cho kết quả tỷ lệ đực ở thế hệ con từ 98 – 100% nhưng việc tạo tôm cái giả ZZ đòi hỏi nhiều thiết bị kỹ thuật và nhiều rủi ro không phù hợp với vi mô sản xuất. 1.13 Kỹ thuật dùng siêu âm đưa hoạt chất vào trong động vật dưới nước (Kost et al.,) Đây là phương pháp phân tán các hợp chất bao gồm protein, thuốc không có bản chất là protein và nucleic acid vào trong vào các động vật dưới nước, đặc biệt là cá, trong môi trường nước. Hợp chất được đưa vào môi trường và siêu âm đã được ứng dụng vào trong môi trường để tăng hiệu quả hấp thu các chất bởi các loài động vật trong nước. Trong một thí nghiệm hormon GnRHa đã được đưa vào cá theo đường nước với sự có mặt của sóng siêu âm đưa vào thời gian là 10 đến 15 phút 1,7 W /cm2. Cá sử lý với siêu âm có lượng hormon trong máu tăng 3,29 + 1,0 ng /ml máu, không có xử lý với siêu âm lượng hormon tăng 0,05 + 0,23 ng/ml. Siêu âm đã được đề nghị như là một phương pháp cung cấp thuốc xuyên qua da. Siêu âm làm tăng thẩm thấu của thuốc xuyên qua da. Thuận lợi của kỹ thuật này tăng khả năng xâm nhập của thuốc qua da, tuy nhiên có sự khác biệt lớn giữa cá da trơn và cá có vảy. Siêu âm đã được sử dụng để đưa DNA vào trong phôi của các loài động vật trong điều kiện phòng thí nghiệm. Phương pháp cung cấp các chất bao gồm: protein, thuốc không phải là protein, acid nucleic cho các động vật thuỷ sinh đặc biệt là cá, trong môi trường nước có siêu âm và chứa các hợp chất làm tăng hiệu quả hấp thu các hợp chất trên từ môi trường nước. 16 Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm thí nghiệm Phòng thí nghiệm động vật, phòng Sinh Hoá trường KHTN. Nhà anh Trần Đông Phương An số 149 đường Phạm Ngũ Lão Thành Phố Cần Thơ. Trại cá kèo của cô Thuỷ. Phòng thực tập động vật không xương. 2.2 Vật liệu thí nghiệm Tôm càng xanh Nguồn tôm thí nghiệm - Được cung cấp từ anh Trần Đông Phương An nhà ở đường Phạm Ngũ Lão Tp.Cần Thơ. - Tuổi tôm bắt đầu tiến hành thí nghiệm 50 ngày tuổi sau giai đoạn biến thái . Hình 14: Tôm càng xanh dùng trong thí nghiệm Nguồn hormon dùng trong thí nghiệm - Thu nhận từ cua đồng (Somanniathelphusa) được mua từ các chợ. Hình 15: Cua đồng dùng trong thí nghiệm Dụng cụ - Bể trữ tôm thí nghiệm: 3 bể thuỷ tinh có kích thước 50 x 30x 50 cm. - Ca nhựa 1 cái. - Vợt lưới: 1 cái - Cân điện tử: 1 cái. - Máy vortex: 1 cái (Heidolph Reax 2000) - Máy sục khí, ống dẫn khí - Kính lúp - Một bộ: kéo, kẹp. - Ống nghiệm: 10 cái, đường kính 2cm. - Giá để ống nghiệm: 1 cái - Máy ly tâm Hoá chất - Aceton - Acid clohydric 5 - Ethanol 5% 2.3 Phương pháp nghiên cứu Thu nhận hormon từ tuyến đực của cua đồng (Somanniathelphusa). Sau đó dùng các kích thích như sốc nhiệt, vortex, siêu âm, để tăng cường sự xâm nhập của hormon vào tôm. 2.3.1 Thu nhận hormon từ tuyến đực Vì hormon của tuyến đực ở giáp xác có bản chất là một protein, nên quá trình thu nhận cần quan tâm đến yếu tố protein. Chọn những con cua đồng đực thu toàn bộ vùng có tuyến đực và vùng phụ cận đem bảo quản trong aceton. Sau đó tiến hành theo quy trình sau: Nghiền 10g mẫu Lọc qua giấy lọc(trong 20ml dd ethanol+acid clohydric) Ly tâm 20.000 vòng/phút trong 5’ Thu dịch nổi 2.3.2 Thử nghiệm trên tôm càng xanh Theo dự kiến ban đầu chúng tôi dự định dùng siêu âm để kích kích sự xâm nhập của hormon vào tôm, nhưng thiết bị phòng thí nghiệm không cho phép dùng phương pháp trên nên chúng tôi chuyển sang dùng phương pháp vortex để tăng khả năng xâm nhập của hormon. Thí nghiệm - Bố trí 3 bể kính mỗi bể có số lượng khỏang 30 con. - Dùng ống nghiệm có đường kính 2cm chứa 20ml nước và 1ml dung dịch thu được từ ly tâm. Sau đó thả 3 con tôm vào, vortex 10 phút, ở mức 8. Mỗi ống nghiệm được thực hiện hai lần. - Số lượng tôm dùng trong vortex 30 con trong một bể. - Thử nghiệm trong 3 bể với số lượng 90 con. 18 Tóm tắt quá trình thí nghịêm: Dùng vợt vớt 3 con tôm (1) Cho vào ống nghiệm chứa 20ml nước (2) Cho 1ml dung dịch ly tâm vào ống nghiệm (3) Vortex tôm ở mức 8 trong vòng 10’ (4) Dừng 5’, cho vào tiếp 1ml l dd ly tâm (5) Lập lại bước (3) Sau khi vortex xong cho tôm vào ngay bể nuôi. 19 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3. Tỷ lệ đực và cái - Thu mẫu tôm quan sát dưới kính lúp lúc tôm càng xanh vào khoảng 100 ngày tuổi - Sau thời gian nuôi ta thu nhận được kết quả sau: 3.1 Lô thí nghiệm Bảng 3: Tính xác xuất ở bể 1 Giới tính Quan sát (x) Lý thuyết (e) Bình phương độ lệch (d2) d2/e ♂ 10 14 16 1,142 ♀ 18 14 16 1,142 28x =∑ 2χ =2,284 ⇒ P >20% Bảng 4: Tính xác xuất ở bể 2 Giới tính Quan sát (x) Lý thuyết (e) Bình phương độ lệch (d2) d2/e ♂ 16 15 1 0,0666 ♀ 14 15 1 0,0666 30x =∑ 2χ = 0,133 ⇒ P >20% Bảng 5: Tính xác xuất ở bể 3 Giới tính Quan sát (x) Lý thuyết (e) Bình phương độ lệch (d2) d2/e ♂ 13 15 4 0,266 ♀ 17 15 4 0,266 30x =∑ 2χ = 0,533 ⇒ P >20% 3.2 Lô đối chứng Bảng 6: Tính xác xuất ở bể A Giới tính Quan sát (x) Lý thuyết (e) Bình phương độ lệch (d2) d2/e ♂ 46 50 4 0,08 ♀ 54 50 4 0,08 20 100x =∑ 2χ =0,16 ⇒ P >20% Bang 7: Tính xác xuất ở bể B Giới tính Quan sát (x) Lý thuyết (e) Bình phương độ lệch (d2) d2/e ♂ 10 50 40 0,8 ♀ 90 50 40 0,8 100x =∑ 2χ =1,6 ⇒ P >20% Bang 8: Tính xác xuất ở bể C Giới tính Quan sát (x) Lý thuyết (e) Bình phương độ lệch (d2) d2/e ♂ 20 50 30 0,6 ♀ 80 50 30 0,6 100x =∑ 2χ =1,2 ⇒ P >20% 3.4 Bình luận -Tỷ lệ chết ở các thí nghiệm là 2%. - Ở lô thí nghiệm và lô đối chứng ta nhận thấy ràng kết quả tính xác xuất đều phù hợp với giả thuyế đưa ra. - Mục đích thí nghiệm là làm tăng tỷ lệ đực trong quần thể. Làm sai giả thuyết. Biểu đồ so sánh tỷ lệ đực cái ở 3 bể nuôi (Lô thí nghiệm) 100% 50% 0,0% TÔM ĐỰC T TÔM CÁI 21 1 2 3 TÔM ĐỰC TÔM CÁI Biểu đồ so sánh tỷ lệ đực cái ở 3 bể nuôi (Lô đối chứng) 100% 50% 0,0% 22 Chương IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Qua kết quả thí nghiệm trên ta thấy kết quả không như mong đợi - Tỷ lệ Tôm càng xanh đực chiếm tỷ lệ thấp trong bể nuôi thí nghiệm. Tỷ lệ tôm càng xanh đực cao nhất cũng chỉ 53,3%. Không đạt kết quả như mong đợi. - Kết quả trên phản ánh trong phương pháp thực hiện chưa hoàn thiện. Có thể do cách xử lý hoạt chất , nồng độ hoạt chất (g/ml) chưa hợp lý, hay phương pháp vortex chưa tác động hiệu quả. - Có thể trong quá trình thu nhận hormon bị thất thoát, hay hormon bị những tác động khác nên bị biến tính. KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu quá trình chuyển đổi giới tính ở tôm càng xanh là một đề tài tương đối mới mẻ, chúng ta chưa có nhiều những tài liệu liên quan đến đề tài. Cần tiếp tục thu thập thêm các tài liệu khác. - Do thời gian thí nghiệm không cho phép nên số lượng tôm thí nghiệm tương đối ít, cần tăng cường số lượng tôm thí nghiệm - Cần xác định xem trong mẫu thu của chúng ta có hormon mà ta quan tâm hay không. Sau đó mới tiếp tục thí nghiệm với phương pháp khác như siêu âm, sốc nhiệt,…Để có sự so sánh giữa các phương pháp với nhau. 23 Tài Liệu Tham Khảo 1. Bộ Thuỷ Sản (1999). Chương trình phát triển nuôi Thuỷ Sản thời kỳ 1999 – 2010. 2. Phan Hữu Đức (1988). Đặc điểm sinh học và khả năng nguồn lợi từ Tôm Càng Xanh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Sinh học và kỹ thuật nuôi tôm ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Nguyễn Việt Thắng (1993). Một số đặc điểm sinh học và sản xuất giống Tôm Càng Xanh. 4. Nguyễn Việt Thắng (1995) Kỹ thuật nuôi Tôm Càng Xanh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 5. Phạm Anh Tuấn - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I 6. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ. Kỹ thuật sản xuất giống Tôm Càng Xanh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 7. Trang web: - www.ctu.edu.vn/ -www.angiang.gov.vn/ -www.vinhlong.gov.vn/ - www.vietlinh.com.vn/tech/shrimp/ 8. Kết quả tìm kiếm từ google: - BRIEF NOTES ON THE GIANT FRESHWATER PRAWNS AS AN OBJECT OF FARMING. - Key to larval stages of freshwater prawns (Macrobrachium rosenbergii). - Nội Tiết Học Giáp Xác. -Hệ Nội Tiết Ở Động Vật Hữu Nhũ (Gs. Bùi Tấn Anh - Võ Văn Bé - Phạm Thị Nga). 9. Ling (1962). Studies on the rearing of larvae and juveniles and culturing of adults of Macrobrachium rosenbergii (de Man). 10. New, M.B., and S.Singholka (1985). Freswater prawn Farming: A manual for culture of Macrobrachium rosenbergii. 11. Aquacop (1977) Macrobrachium rosenbergii (de Man) culture in Polynesia: Progess in developing a mass intensive larval rearing technique in clear water. Proceedings of the eight Annual Meeting World Mariculture Society: 311 – 319. 12. Jinadasa, J. (1985). On the biology and fishery of the giant freswater prawn Macrobrachium rosenbergii in the Northern Bolgota Lake Sri – Lanka Indian Journal of Fifheries 32, 288- 295. 13. Patra, (1976). The fecundity of Macrobrachium rosenbergii.Bangladesh Journal of Zoology 4, 63 – 72. 14. New, M. B. (1982). Giant prawn Farming: Development in aquaculture and fisheries science 10. Amsterdam, the Netherlands. 15. Robin J.powler, Brinn V, Leonard. The structure and function of the androgenic gland in Cherax Destructor (Decapoda: Parastacidae) 16. Isam Khalaila, Tal Katz, Uri Abdu, Galit Yehezkel and Amir Sagi. Effects of Implantation of Hypertrophied Androgenic Glands on Sexual Characters and Physiology of The Reproductive System in Female Red Claw Crayfish Cherax quadricarinatus. 17. J.A.J. Janssen. The sexdifferentiation of the giant fresh water prawn: Macrobrachium rosenbergii. 18. G. MARTIN,A O. SOROKINE,B M. MONIATTE,B AND A. VANDORSSELAERB.The Androgenic Hormone of the Crustacean Isopod Armadillidium vulgare.