Thu nhận probiotic và ứng dụng trong các sản phẩm từ sữa

gram dương. Streptococcus thermophilus: Streptococcus thermophilus được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm từ sữa. Nó là một probiotic dùng trong sản xuất sữa chua. Có khả năng giúp đỡ việc hồi phục lại việc hấp thu kém bằng cách sinh ra enzyme lactase dễ dàng cho việc tiêu hóa các lactose trong sữa Streptococcus thermophilus có hoạt tính oxy mạnh, bảo vệ cơ thể thoát khỏi các gốc tự do nguy hiểm. S. thermophilus còn có thể hoạt động như một số chất chống ung thư, đặc biệt chống lại các tế bào gây ung thư đường ruột, điều trị tiêu chảy, cũng như sự viêm nhiễm đường ruột hay viêm nhiễm âm đạo. Leuconostoc Được sử dụng rộng rãi trong việc lên men các sản phẩm, tăng chất lượng dinh dưỡng. Một số chủng sinh ra hương vi đặc trưng trong các sản phẩm sữa và rau quả lên men. L. mensenteroides là vi sinh vật thường sử dụng để lên men rau quả, đặc biệt làm dưa chua. Nó cũng được sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men. Các loài vi sinh vật khác Enterococcus faecium: Enterococcus faecium là loại cầu khuẩn, kị khí tùy tiện, gram dương thuộc họ streptococcaceae. Lên men các carbohydrate sinh ra acid lactic làm giảm pH đường ruột và ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Sinh ra hydroperoxide, bacteriocin, các chất kháng độc tố chống lại vi sinh vật gây bệnh, vô hoạt các vi khuẩn gây thoái hóa đường ruột Giảm tính nhạy cảm với hầu hết thuốc kháng sinh nói chung. Bacillus subtilis Một số chủng được làm thuốc kháng sinh, một số làm thuốc trừ sâu. B.subtilis là một trong số vi sinh vật quan trọng nhất trong việc kích thích hệ thống miễn dịch, là vi sinh vật chỉ có tính cư trú tạm thời trong hệ thống ruột Ứng dụng: sản xuất các men tiêu hóa sinh học Escherichia coli ( E.coli): E.coli được tìm thấy ở mọi nơi, trong cả cơ thể con người. Các chủng thuộc E.coli thường không có hại, tuy nhiên một số chủng gây bệnh tiêu chảy và có thể gây chết người. Sự có mặt của chúng trong ruột người là cần thiết cho việc duy trì sức khỏe cân đối. Một số chủng giúp tổng hợp vitamin B, vitamin K Nấm men Loại nấm men có lợi cho đường ruột là Saccharomyces boulardii Chúng được sử dụng để chữa trị tiêu chảy lên quan đến việc sử dụng thuốc kháng sinh. Giữ cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, chúng được dùng điều trị các bệnh rối loạn tiêu hóa Ngoài ra, Saccharomyces boulardii rất hữu ích trong việc điều trị bệnh do nấm Candida gây ra bằng cách như sau: S. Boulardii hiệu quả hơn Candida và các vi sinh vật khác trong việc đấu tranh giành chỗ cư trú trong ruột, ngăn cản Candida và các sinh vật lây nhiễm khác kết hợp với tế bào ruột Tăng số protein miễn dịch chống lại các vi sinh vật có hại xâm chiếm đường ruột TÁC DỤNG CỦA PROBIOTIC ĐẾN SỨC KHỎE CON NGƯỜI Thuỷ phân lactose, tăng sự hấp thu lactose Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme lactase thủy phân lactose thành glucose và galactose. Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hoá hầu hết lượng lactose không được hấp thu ở ruột non. Làm giảm một số bệnh đường tiêu hoá Bệnh ung loét: Bệnh loét trong hệ thống tiêu hoá (do vi khuẩn Helicobacter Pylori gây ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày do ít sử dụng các sản phẩm sữa lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột. Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh và làm giảm hoạt tính của enzyme urease – enzyme cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh lưu trú trong môi trường acid của dạ dày. Bệnh tiêu chảy do vi sinh vật Kích thích hệ thống miễn dịch tăng lên hơn nữa đáp ứng miễn dịch IgA đặc hiệu chống lại sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh. Ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh đường ruột như Samonella, E.coli, Shingela. Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh Sinh các acid acetic, acid lactic, và các acid hữu cơ khác, làm giảm pH môi trường ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tính acid. Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin) Bacteriocin là các peptide, polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen của protein và được cấu tạo từ các amino acid, cũng có thể bao gồm các amino acid hiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine. Bacteriocin của các vi khuẩn lactic được chia làm 4 nhóm sau: Nhóm 1 chứa lanthibiotic: đây là những peptic nhỏ và có khả năng chịu nhiệt, chứa amino acid như lanthionine. Nhóm 2 chia thành 3 nhóm nhỏ trong đó nhóm 2a thường gặp nhất bao gồm các bacteriocin như pediocin có khả năng chống Listeria. Nhóm 3 là những nhóm protein không bền nhiệt. Nhóm 4 là phức hợp của protein, lipid và glucid. Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bênh. Tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Chống dị ứng thức ăn. Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch. Qua các nghiên cứu, người ta thấy rằng ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và Clostridia ít hơn so với ở những người thường bị dị ứng. Tổng hợp một số vitamin: Các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh nhiều vitamin khác nhau. Việc hấp thu các vitamin trong đường ruột khá kém, do đó việc các vi khuẩn có khả năng sinh vitamin rất quan trọng. Các vi khuẩn này sinh tất cả các loại vitamin B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K. Theo các nghiên cứu, L.Brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum và L.acidophillus tổng hợp được các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K. Giảm cholesterol Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột. Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế làm cho cholesterol khó hấp thu được vào máu thông qua các cơ chế chủ yếu sau: Hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong hệ thống ruột Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chất này vào cơ thể. Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân. Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ. Nếu hàm lượng chất béo cao trong các bữa ăn, gây ra sự tăng cholesterol, việc sử dụng bổ sung các vi khuẩn có lợi này là một phương pháp giúp cân bằng mức lipid và chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe. Tăng cường hệ thống miễn dịch: Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể sống chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, các độc tố của vi sinh vật, các phân tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Kháng thể là các globulin trong máu của động vật, có khả năng liên kết đặt hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó, hay còn gọi là kháng thể miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu. Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh. IgA được tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiên chức năng chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc ruột. Các vi khuẩn có làm tăng hệ miễn dịch bằng cách: Tăng cường chức năng chống virus của hệ miễn dịch. Tăng hoạt động của tế bào NK ( natural killer) nhằm diệt trực tiếp tế bào bị nhiễm khuẩn bằng cách tiết những chất độc để phân giải chúng hoặc bằng cách tiết IFN – gamma ( một loại ctokine). Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiển đáp ứng miễn dịch tế bào Sinh nitric oxide NO, có vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thông tin ở hệ thần kinh và đặc biệt có tác dụng làm thư giãn. Tăng khả năng đề kháng chống lại một số quá trình tự miễn. Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated responses) Gián tiếp chống lại hiện tượng radiation-included depression in white blood cells: đây là hiện tượng các tế bào bạch cầu bị ức chế và tiêu diệt khi chiếu xạ. Hiện tượng này thường xảy ra trong khi điều trị bệnh ung thư bằng chiếu xạ. Ngăn chặn ung thư Cơ chế chung: Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư. Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm móng gây ung thư. Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u. Đa số ung thư ở người liên quan đến thói quen ăn uống. Một số chủng của vi khuẩn lactic (L.bulgaricus, S.thermophilus hay L.acidophilus và Bifidobacteria) sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men có thể xem như là một chất chống ung thư và chống gây đột biến. Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân gây ung thư (ß-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và ß-glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. Bifidobacteria ngăn chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrate và nitrosamines thông qua cơ chế nội bào và non – enzymatic. Chúng cũng có thể kết hợp với các heterocyclic amines (các chất gây ung thư trong quá trình nấu thịt) sau đó được bài tiết theo phân. Chống viêm nhiễm hệ thống niệu sinh dục – chống nấm Candida: Bình thường việc viêm nhiễm đường sinh dục là do sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, do sử dụng thuốc kháng sinh, các chất khử trùng, hormones, và các yếu tố khác. Các vi khuẩn probiotic hiệu quả trong quá trình giành chỗ cư trú và ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Một số chủng thuộc Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển và bám chặt của nấm Candida albicans và các chủng Candida khác. Việc sử dụng Lactobacillus giảm nguy cơ nhiễm nấm trở lại, giảm nhiễm nấm âm đạo. Ngoài ra một số chủng Lactobacillus GR-1 và RC-14 ngăn chặn sự nhiễm đường tiết niệu do Escheriachia coli gây ra. THU NHẬN PROBIOTIC CÁC CHỈ TIÊU ĐỂ CHỌN MỘT VI SINH VẬT LÀM PROBIOTIC Về mặt sản xuất Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn giản và rẻ. Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà không mất số lượng đáng kể. Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng. Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến thực phẩm bao gồm cả các quá trình nhiệt độ cao trên 450C cũng như chịu đựng được nồng độ ethanol và sodium cloride cao. Khả năng sống sót trong ruột Khả năng chịu được các dịch tiêu hoá Acid dạ dày và muối mật ảnh hưởng mạnh đến sự sống sót của vi sinh vật. Các chủng có khả năng phát triển và thực hiện quá trình trao đổi chất dưới sự có mặt của lượng mật sinh lý (lượng mật bình thường trong cơ thể người) thì có khả năng sống sót tốt hơn trong suốt quá trình ở trong đường ruột. Khả năng cư trú trong ruột Khi các vi khuẩn có lợi có khả năng bám chặt vào các tế bào bên trong đường ruột, chúng mới có khả năng cư trú tạm thời khoảng một thời gian trong hệ thống ruột. Những chỗ cư trú gần các mô bào và màng nhầy khá giàu chất dinh dưỡng, đối với một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột thì khả năng bám chặt được xem là điều kiện trước hết đối với việc xâm chiếm và lây nhiễm. Đặc tính riêng Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để phát triển. Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K) Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonella typhimurium, Clostridium perfringens,  Clostridium difficile, Escherichia coli, Candida albicans… Có hoạt tính beta – galactosidase Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin Khả năng sinh D-lactic acid Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác Tính an toàn Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe Kiểm tra bằng liều gây chết trên động vật KHỬ NƯỚC (Anhydrobiotics) Kỹ thuật sấy Sự khử nước thường sử dụng với ý nghĩa làm ổn định probiotic, thuận lợi cho vấn đề bảo quản, mua bán, vận chuyển. Freeze – drying được sử dụng phổ biến cho quá trình khử nước ở canh trường probiotic và sản sản phẩm từ sữa, trong khi đó sấy phun chỉ được ứng dụng cho vài quá trình khử nước ở canh trường probiotic. Freeze – drying Freeze – drying đã được sử dụng để sản xuất probitic dạng bột qua nhiều thập niên, dựa trên cơ sở của sự thăng hoa, xảy ra ba giai đoạn: freezing, primary và secondary drying. Tế bào được làm lạnh ở –1960C, sau đó sấy thăng hoa dưới áp suất chân không (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2007). Do điều kiện nhẹ nhàng hơn spray – drying nên tỷ lệ sống sót của probiotic cao hơn trong freeze-dried powders Trong quá trình làm lạnh tế bào sẽ bị vô hoạt (Tsvetkov & Brankova, 1983). To và Etzel (1997) đã chứng minh rằng 60 – 70% tế bào sống sót qua bước làm lạnh sẽ vượt qua được giai đoạn dehydrate hóa. Trong suốt quá trình làm lạnh, sự hình thành lớp băng ngoài tế bào làm tăng hơn áp suất thẩm thấu và tế bào bắt đầu mất nước. Nồng độ dung dịch nội bào và ngoại bào sẽ tăng lên khi nhiệt độ giảm dưới điểm eutectic. Có hai cách thức làm lạnh là làm lạnh chậm và làm lạnh nhanh. Làm lạnh chậm, quá trình khử nước tế bào diễn ra từ từ khi sự đóng băng xảy ra chậm ngoài tế bào ảnh hưởng lớn đến tế bào Làm lạnh nhanh có thể tránh ảnh hưởng đến chất tan và sự co tế bào quá mức (Fowler & Toner, 2005). Các báo cáo cũng chỉ ra rằng diện tích màng tế bào càng lớn thì càng nguy hiểm hơn khi hình thành tinh thể băng bên ngoài tế bào trong quá trình làm lạnh (Fonseca, Beal, & Corrieu, 2000). Do đó, kích thước tế bào có ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại probiotic trong freeze – drying, với tế bào hình cầu có kích thước nhỏ chống chịu freezing và freeze-drying tốt hơn tế bào hình que có kích thước lớn hơn (Fonseca et al., 2000). Nước mất đi từ tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy sẽ gây hư hại bề mặt protein, thành tế bào, màng tế bào. Nước tại bề mặt có vai trò quan trọng trong việc tạo ổn định cấu trúc và nguyên vẹn các chức năng của đại phân tử vi sinh. Do đó, nước mất đi trong sấy khô có thể làm mất sự ổn định cấu trúc, tính toàn vẹn các thành phần tế bào làm giảm hoặc mất đi các chức năng (Brennan, Wanismail, Johnson, & Ray, 1986). Người ta dự đoán rằng trong quá trình sấy vị trí các phân tử lipid trên màng tế bào là nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất do các phân tử lipid rất dễ bị oxy hóa. Thêm vào đó, cấu trúc của RNA và DNA mất ổn định, dẫn tới giảm hiệu quả sự sao chép của DNA, phiên mã, giải mã. Vì thế, để đạt được kết quả tốt nhất trong việc làm khô probiotic, phải tập trung chú ý đến phương pháp để giảm đến mức tối thiểu hư hại thành phần tế bào. Sản phẩm thương mại từ canh trường freeze-dried là kết quả của quá trình tốn kém nhiều chi phí nhưng thu lợi thấp. Sấy phun Quá trình sấy phun đòi hỏi sự phun với tốc độ cao tại nhiệt độ trên 2000C, mà sau đó luồng hơi xuyên qua bộ phận tạo thành dạng bột. Do đó kết quả của quá trình này dễ nhận thấy rằng: trong môi trường sấy ở nhiệt độ cao với thời gian ngắn, nó có thể bất lợi tế bào vi khuẩn sống. Trong quá trình sấy phun, tế bào vi khuẩn chịu tác dụng của nhiệt, sự mất nước, áp suất thẩm thấu,... (Brennan et al., 1986; Teixeira, Castro, Mohacsi-Farkas, & Kirby, 1997). Sấy phun có thể làm màng tế bào bị biến đổi, và có thể làm lọt vài thành phần nội bào từ tế bào ra môi trường xung quanh (Teixeira, Castro, & Kirby, 1995a). Màng tế bào chất là phần nhạy cảm nhất trong tế bào vi khuẩn khi sấy phun, trong khi đó thành tế bào, DNA và ARN cũng dễ bị ảnh hưởng, giảm hoạt động trao đổi chất. Việc mất đi các liên kết hydro với nước, làm gia tăng liên kết nội phân tử các nhóm phospholipid và xúc tiến các liên kết đóng vòng. Thành phần lipid có thể bị chuyển từ trạng thái lamellar (màng mỏng) sang trạng thái gel phase (khối bán rắn), có thể xem như là sự dehydrate lamellar phase trong đó các chuỗi trở nên cứng và mở rộng hoàn. Hơn nữa, các phân tử phospholipid sẽ có sự biến đổi lớn từ dạng lamellar sang dạng hexagonal phase ngay khi nước mất đi (Crowe et al., 1988; Leslie, Israeli, Lighthart, Crowe, & Crowe, 1995). Vài nghiên cứu cho rằng vài giống probiotic trong sấy phun, tỉ lệ sống sót phụ thuộc vào chủng vi khuẩn được sử dụng, nhiệt độ ra và môi trường sấy. Sử dụng giống Lactobacillus paracasei NFBC 338 chịu được rifampicin có thể đạt được tỉ lệ sống sót hơn 80% ở quá trình sấy phun trong RSM (Reconstituted Skim Milk), với nhiệt độ ra từ 85 – 900C (Gardiner et al., 2002), trong khi đó ở cùng điều kiện (nhiệt độ ra 850C) Ananta and Knorr (2003) cho rằng loài L. rhamnosus GG tỉ lệ sống sót khoảng 60%. Nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn khác nhau biến đổi khác nhau với điều kiện quá trình sấy phun, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc chọn giống, như L. paracasei NFBC 338 tồn tại tốt hơn L. salivarius UCC 118 trong cùng điều kiện sấy phun (Gardiner et al., 2000), có thể cho là sức chịu đựng giống L. paracasei NFBC 338 tốt hơn khi so sánh với L. salivarius UCC 118 (Gardiner et al., 2000). Nhiệt và sức chịu đựng khí oxy của vài loài Bifidobacterium liên quan đến việc tuyển chọn chủng vi khuẩn sử dụng sấy phun được so sánh, tìm ra loài tốt nhất, đáng chú ý Bifidobacterium animalis subsp. Lactis có thể tồn tại hơn 70% trong quá trình sấy phun với RSM (20% w/v) với nhiệt độ ra khoảng 85-900C (Simpson, Stanton, Fitzgerald, & Ross, 2005). Trong sấy phun, nhiệt độ dòng khí ra là một thông số quan trọng, ảnh hưởng đến sự sống sót của vi khuẩn. Kim and Bhowmik (1990) cho rằng số lượng vi khuẩn Streptococcus salivarius subsp. thermophilus và L. debrueckii subsp. Bulgaricus ngày càng giảm dần khi nhiệt độ dòng khí vào, ra tăng lên và phun dưới áp suất cao; trong bản báo cáo của Gardiner et al., 2000 với hai loài L. paracasei NFBC 338 and L. salivarius UCC 118 cũng giống nhận xét trên. Do đó việc cải thiện khả năng tồn tại của vi khuẩn rất quan trọng bằng cách giảm nhiệt độ ra trong quá trình sấy phun, nhưng không vượt quá khả năng tồn tại của probiotic, chất lượng phụ thuộc vào các thông số, độ ẩm 3-5% hay sử dụng để sản phẩm ổn định (Zayed & Roos, 2004). Hình 1 Tương quan nhiệt độ ra và tỉ lệ sống sót của vi sinh vật trong sấy phun Protectant (Chất bảo vệ) Chất bảo vệ ở những dạng khác nhau được thêm vào trước khi freeze-drying hoặc sấy phun để bảo vệ probiotic trong quá trình khử nước, bao gồm skim milk powder, whey protein, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose, glucose, lactose và polymers như dextran and polyethylene glycol (Hubalek, 2003; Morgan, Herman, White, & Vesey, 2006). Các cryoprotectants thích hợp được thêm vào môi trường trước khi lên men làm tăng sự thích nghi của probiotic với điều kiện xung quanh (Capela, Hay, & Shah, 2006). Vì các cryoprotectants thích hợp tích lũy trong tế bào và sự thẩm thấu giữa môi trường trong và ngoài tế bào giảm xuống (Kets, Teunissen, & de Bont, 1996a). Sử dụng gum acacia trong môi trường sấy phun, kết quả nâng cao khả năng sống sót probiotic L. paracasei NFBC 338; khi phát triển trong hỗn hợp RSM (10% w/v) và gum acacia (10% w/v) trước khi sấy phun với nhiệt độ dòng khí ra 100 – 105oC thì khả năng sống sót tăng 10 lần so với tế bào kiểm tra (20% RSM) (Desmond, Ross, O’Callaghan, Fitzgerald, & Stanton, 2002). RSM là môi trường thích hợp để việc sấy phun canh trường probiotic hiệu quả (Ananta,Volkert, & Knorr, 2005). Protein trong sữa nguyên kem có thể bảo vệ tế bào khỏi tổn thương các thành phần của màng tế bào (Castro, Teixeira, & Kirby, 1995). Cách thức là phủ lớp protein ngoài thành tế bào, cùng với đó calci trong sữa làm tăng khả năng sống sót vi khuẩn sau khi khử nước (King & Su, 1993). Theo Corcoran et al. (2004) cho rằng khi có mặt của prebiotics polydextrose và inulin trong môi trường sấy phun (RSM) không nâng cao khả năng tồn tại vi khuẩn hoặc bảo quản. Khả năng sống sót của L. helveticus trong quá trình sấy phun được cải thiện bằng cách thêm 1% sorbitol (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2006). Các nghiên cứu chứng minh rằng carbohydrates có thể bảo vệ hiệu quả vi khuẩn probiotic trong suốt quá trình freeze-drying, Nghiên cứu chỉ ra rằng các cryprotectants có thể tạo ra các lớp glass-phase có nhiệt độ trung gian và do đó các tế bào có thể sống sót dựa trên glass-phase mà không có sự kết tinh đá trong nội bào (Fowler & Toner, 2005). Nó cũng giải thích rằng trehalose là một cryoprotectant có hiệu quả trong quá trình freezing and freeze-drying, có thể nâng cao khả năng sống sót của L. acidophilus (Conrad, Miller, Cielenski, & de Pablo, 2000), nhờ khả năng tạo high glass transition temperature (Tg) của trehalose, và tương tác mạnh mẽ ion lưỡng cực và liên kết hydro, giữa trehalose và biomolecule (Patist & Zoerb, 2005). Trong nghiên cứu gần đây nhất trong phòng thí nghiệm, đã so sánh hiệu quả bảo vệ của một loạt các disaccharides với khả năng tồn tại của vi khuẩn L. rhamnosus GG trong quá trình freeze-drying và bảo quản, và đã tìm thấy trehalose, trehalose/lactose and lactose/ maltose hầu hết các disaccharides có hiệu quả trong cả hai quá trình freezing and freeze-drying (chưa công bố). Các chất tan đã được chứng minh có lợi cho probiotic, hiệu quả trong môi trường acid. Ví dụ, sự hiện diện của 19.4 mMol glucose kết quả tăng lên 6log10 khả năng tồn tại vi khuẩn sau 90 phút bằng mô hình giống dịch ruột với pH 2.0 so sánh với control (Corcoran, Stanton, Fitzgerald, & Ross, 2005). Trong công trình nghiên cứu này, sự hiện diện của glucose do kết quả sự cung cấp ATP theo đường thủy giải F0F1-ATPase, có thể ngăn chặn proton vào tế bào và vì thế làm tăng khả năng sống sót vi khuẩn trong điều kiện mô hình dạ dày. Chức năng sinh lý của tế bào. Tầm quan trọng các hoạt động của tế bào đối với sự thành công trong việc sấy probiotic đã được chứng minh ở trên, khía cạnh này vài nhân tố được đề xuất là có hiệu quả đối với khả năng tồn tại của probiotic trong quá trình khử nước, như stress treatment, sự phát triển các pha của canh trường probiotic trước khi khử nước, growth media và sự biến đổi gen. Application of mild stress prior to dehydration (Sự ứng dụng tác nhân nhẹ trước khi khử nước) Sử dụng các yếu tố stress dưới mức gây chết nhằm nâng cao khả năng đáp lại stress trước khi khử nước đã được chứng minh là một phương pháp khả thi, bảo đảm có hiệu quả với canh trường vi sinh vật và duy trì các hoạt động sinh lý trong suốt quá trình khử nước (de Urraza & de Antoni, 1997; Desmond et al., 2002; Kim, Khunajakr, & Dunn, 1998; Lorca & de Valdez, 1998; Teixeira et al., 1995a). Nó cũng giải thích là vi khuẩn phản ứng lại để thay đổi môi trường xung quanh bằng cách biến đổi quá trình trao đổi chất nhằm nâng cao sức đề kháng (Pichereau, Hartke, & Auffray, 2000). Sức đề kháng mã hóa bằng hệ thống bảo vệ có thể chia ra thành hai cấp Loại đầu tiên gồm có một hệ thống đặc biệt để cảm ứng giới hạn tối đa bởi các yếu tố stress hóa học hoặc vật lý (như heat shock), cho phép các phần tử sống sót thay đổi liều lượng gây chết khi gặp cùng tác nhân (Desmond, Stanton, Fitzgerald, Collins, & Ross, 2001; Gouesbet, Jan, & Boyaval, 2001; Pichereau et al., 2000). Loại đề kháng thứ hai bao gồm nhiều hệ thống chuẩn bị cho tế bào chịu đựng các yếu tố thay đổi khác nhau của môi trường mà không cần đã trãi qua quá trình chuẩn bị trước (Desmond et al., 2001; Gouesbet et al., 2001; Pichereau et al., 2000). Cơ chế này được biết đến như là cross-protection (Kim, Perl, Park, Tandianus, & Dunn, 2001). Thực tế là sự thích nghi trước (pre-adaptation) với nhiệt hoặc dung dịch muối để cải thiện sức chịu đựng nhiệt của probiotic trong quá trình sấy phun. Ví dụ, L. paracasei NFBC 338, thích nghi trước bằng cách thêm 0.3M NaCl, thì có ý nghĩa đặc biệt với sức chống chịu tác nhân nhiệt khi sấy phun (nhiệt độ dòng ra giữa 95-100oC) hơn tế bào kiểm chứng không làm thích nghi trước (33.46 ± 2.3% so với 8.27 ± 4.42% sống sót, theo thứ tự) (Desmond et al., 2001). Mặc dù không hiệu quả bằng homologous stress, mức độ crossprotection theo thứ tự heat ~ salt > hydrogen peroxide > bile (Stanton et al., 2002). Growth phase Sự phát triển canh trường vi khuẩn thể hiện ở 4 pha: lag, log, stationary (ổn định) và death phases (suy vong). Sự phản ứng lại các tác nhân của canh trường vi khuẩn biến đổi phụ thuộc vào pha phát triển. Thật vậy, vi khuẩn đang ở trong stationary phase tăng khả năng chống cự tác nhân và chịu được nhiều kiểu tác nhân khác nhau, hơn vi khuẩn trong pha log, vì thiếu carbon và tình trạng kiệt quệ nguồn thức ăn gây ra sự phản ứng lại các tác nhân để tế bào sống sót (Brashears & Gilliland, 1995; Lorca & de Valdez, 1999; Morgan et al., 2006; van de Guchte et al., 2002). Vì thế pha phát triển tối ưu cho sự tồn tại vi khuẩn qua việc khử nước là stationary phase. Tỷ lệ số lượng tế bào vi khuẩn L. rhamnosus ở pha stationary phục hồi là cao nhất sau quá trình sấy (31-50% sống sót), trong khi đó tế bào vi khuẩn pha log chỉ 14% sống sót, và pha lag cao nhất đạt được chỉ 2% tế bào sống sót đưới cùng điều kiện sấy (Corcoran et al., 2004). Tuy nhiên theo những nghiên cứu mới đây, trong freeze-drying vi khuẩn acid lactic, thường sử dụng các tế bào cuối pha log (Champagne, Mondou, Raymond, & Roy, 1996) hoặc đầu pha ổn định (Carvalho et al., 2004a;Wang et al., 2004; Zayed & Roos, 2004). Theo nguồn khác Saarela et al. (2004) cho rằng không có sự khác nhau về mức độ ổn định giữa freeze – drying và bảo quản của tế bào B. animalis subsp. lactis phát triển ở cuối pha log (15 h) hay đầu pha ổn định (22 h). Thú vị là Carvalho et al. (2003a) cho rằng sự thiếu dinh dưỡng trong stationary phase của canh trường L. bulgaricus lại cải thiện sức đề kháng trong quá trình bảo quản dưới dạng khô. pH của môi trường phát triển của canh trường probiotic cũng ảnh hưởng sự sống sót trong quá trình sấy khô. Tỉ lệ sống sót cao nhất (khoảng 80%) đạt được trong freeze-drying khi tế bào L. reuteri phát triển ở pH=5, và được thu hoạch sau 2.5h ở stationary phase (Palmfeldt & Hahn-Hagerdal, 2000). Hơn nữa, tế bào thu được ở điều kiện pH không điều chỉnh (4.5) có sức chịu đựng tác nhân nhiệt, sấy phun, bảo quản dạng khô tốt hơn so ở điều kiện pH đã điều chỉnh (6.5) (Silva et al., 2005). Hiện tượng này có thể có liên quan đến sự thích nghi môi trường acid, có thể biến đổi chức năng tế bào để nâng cao việc tổng hợp heat shock protein, từ đó cải thiện sức chịu đựng quá trình sấy như mô tả ở trên. Silva et al. (2005) thừa nhận rằng sức đề kháng cao hơn với vi khuẩn L. delbrueckii subsp. bulgaricu khi phát triển dưới điều kiện pH không điều chỉnh có liên quan đến việc tạo ra heat shock protein. Tuy nhiên, Linders et al. (1997a) cho rằng điều chỉnh pH trong suốt quá trình phát triển vi khuẩn L. plantarum kết quả vi khuẩn hoạt động còn lại cao hơn sau khi sấy (37% survival) so với điều kiện phát triển không điều chỉnh pH (19% survival). Growth media( Môi trường phát triển) Thành phần môi trường phát triển là một nhân tố góp phần tăng tỷ lệ tồn tại canh trường probiotic trong quá trình sấy, ở khía cạnh này tầm quan trọng của sự hiện diện carbonhydrate đã được chứng minh. Ví dụ, sự phát triển của L. delbrueckii subsp. Bulgaricus với sự có mặt đường như lactose, sucrose và trehalose hoặc cryoprotectants hóa học như glycerol để tế bào có thể thích nghi với áp suất thấm thấu của quá trình đông lạnh, hoặc làm tan (Panoff, Thammavongs, & Gueguen, 2000). Tỉ lệ sống sót của L. sakei sau khi sấy phun được nâng lên, khi tế bào phát triển có sự hiện diện của sucrose (Ferreira et al., 2005). Tymczyszyn, Gomez-Zavaglia, and Disalvo (2007) cho rằng có sự khác nhau hiệu quả phục hồi giữa lactose, sucrose and trehalose của L. delbrueckii subsp. Bulgaricus sau khi sấy, khi phát triển ở hoạt độ nước khác nhau. Người ta đã được chứng minh rằng bảo quản vi khuẩn đã khử nước với sucrose, sau khi phát triển chúng ở môi trường có hoạt độ nước thấp (MRSsucrose) có hiệu quả bằng với sự khử nước có trehalose. Lý do cho điều này là tế bào vi khuẩn thích nghi với môi trường có hoạt độ nước thấp. Khả năng sống sót giảm bớt thấp nhất sau khi freeze-drying thu được khi L. bulgaricus phát triển trong môi trường có sự hiện diện của mannose, so với fructose, lactose hay glucose (Carvalho et al., 2003b; Carvalho et al., 2004a). Các loại đường khác như fructose, sorbitol cũng được thêm bảo vệ tốt hơn glucose, môi trường phát triển chuẩn có carbohydrate (Carvalho et al., 2004a). Cơ chế bảo vệ của đường trong môi trường phát triển có khả năng là sự phát triển trong chất nền các loại đường khác nhau tạo ra tế bào với các đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau, vì vậy mang lại sức kháng cự khác nhau với các tác nhân khác nhau (thus reflecting distinct resistances to the various stress treatments tested (Carvalho et al., 2004b). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất chuyển hóa như mannitol, sorbitol and glutamate còn trong tế bào chịu trách nhiệm hoạt động tồn tại riêng biệt trong quá trình khử nước (Wisselink, Weusthuis, Eggink, Hugenholtz, & Grobben, 2002), và sự hình thành những chất chuyển hóa này phụ thuộc vào nguồn carbon trong môi trường phát triển (Kets, Galinski, de Wit, de Bont, & Heipieper, 1996b). Vài tác nhân khác, bao gồm sự hiện diện của sodium chloride trong môi trường phát triển và sự cô đặc môi trường cũng tác động đến sự sống sót của probiotic sau quá trình khử nước. Linders et al. (1997a) chứng minh rằng sự có mặt của 1mol hoặc 1.25mol NaCl trong quá trình phát triển của L. plantarum giảm bớt độ hoạt động còn lại sau khi sấy tầng sôi (decreased residual activity after drying in the fluidized bed) Hoạt độ nước còn lại sau khi sấy thường cao hơn cho tế bào phát triển trong MRS loãng với tế bào phát triển trong MRS cao. Tuy nhiên ảnh hưởng không đáng kể. VI BAO Nguyên liệu và phương pháp Microencapsulated bacteria Bifidobacterium lactis (Bb-12, Chr. Hansen, Denmark) đã được bao bọc thành công trong các vi bao (microcapsules) với 1ml của bead slurry chứa khoảng 108 cfu. Trước khi bao bọc, vi khuẩn đã được cấy trong nước thịt MRS (Oxoid Inc., Nepean, ON, Canada) thêm L-cysteine đã khử trùng 0.5g/L (Sigma,Oakville, ON, Canada) tại 370C trong 24h. Môi trường dự trữ đã được kiểm soát tinh khiết và duy trì trên MRS agar với cysteine 0.5g/L ủ trong điều kiện kị khí sử dụng hệ thống GasPak Plus (gas generator envelopes and anaerobic jars) từ BBL (Fisher Scientific, Nepean, ON). Tế bào để bao bọc được thu bằng ly tâm 3000 x g trong 10 phút tại 50C, rửa với dung dịch đệm phosphate đẳng trương (PBS, 0.01M NaH2PO4, 0.137M NaCl, 2.68mM KCl, pH 7.0, Fisher Scientific), và chứa lại trong peptone saline (dung dịch muối đẳng trương) (PS, 8.5 gL_1 NaCl, 1.0 gL_1 peptone (Difco, Fisher Scientific), pH 7.0). Hàm lượng tế bào đã rửa được đếm sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường kị khí tại 370C. Tế bào sau khi rửa được đem đi vi bao (microencapsulation). Sự sản xuất calcium alginate microcapsules Calcium alginate microcapsules được tạo có hoặc không có B. lactis Bb-12 sử dụng kỹ thuật đông lại bên ngoài (external gelation technique) theo Sheu and Marshall (1993) và được mô tả bởi Hansen et al. (2002). Trong thời gian ngắn calcium alginate microcapsules với đường kính trung bình 20µm được tạo ra bằng trộn 18g alginate solution (10g/L, môi trường có tính nhớt và high mannuronic acid, A2033, Sigma, Oakville ON), với 1g washed bacteria suspension hoặc 1g PS. Hỗn hợp trên chuyển thành thể sữa trong 100g dầu thực vật chứa 5g/L Tween 80 (P8074, Sigma), sử dụng thìa khuấy có từ tính đặt chế độ 300rpm trong 20 phút. Sự đông đặc bắt đầu khi thêm 32ml Ca2+, hệ nhũ tương bao gồm 60g dầu thực vật, 5g/L Eween 80 và 62.5mMol CaCl2. Alginate microcapsules thành hình trong quá trình khuấy 20 phút. 40 ml PS+ CaCl2 (0.05M) đã được thêm vào và the alginate microcapsules được tách bằng phễu. Hỗn hợp lỏng được điều chỉnh theo tỉ lệ 1:1 (v/v) giữa alginate microcapsules và lipid Phân tích cấu trúc mẫu vi bao Bước tiếp theo được kết hợp trong giai đoạn chuẩn bị mẫu để có được số lượng vi bao lớn nhất để có thể được quan sát bằng kính hiển vi. Để bảo đảm quan sát thấy được tập hợp các đặc trưng, polylysine hydrobromide được dùng như một xúc tác gắn kết, để duy trì lượng vi bao ở dạng thể nền, và phủ lớp kính cho sự quét electron của kính hiển vi (CSEM) hoặc một bộ lọc bằng polycarbonate (SPI-PORE màng polycarbonate, kích thức lổ 0.2µm) cho TEM. Để đạt lượng thấp nhất bead trong suốt quá trình chuẩn bị cho TEM, các bead được giữ lại trên bộ lọc polycarbonate được dùng với bộ phận lọc. Bước cố định đầu tiên được điều khiển bằng dùng bộ lọc để bảo đảm duy trì cao nhất lượng mẫu khi chúng được nhuộm và rữa đệm. Microencapsulation of probiotic organism using the emulsion technique (Vi bao vi khuẩn probiotic bằng kỹ thuật nhũ hóa) Kỹ thuật nhũ hóa đã được sử dụng để vi bao probiotic (Sheu & Marshall, 1993). Trước tiên 120ml sodium alginate vô trùng 3% (v/w) được trộn lẫn với 30ml chứa 9.0–10.0 log10cfu/g kết hợp L. acidophilus 33200, L. casei 279 B. longum 536 and L. rhamnosus GG. 50ml hỗn hợp sodium alginate và vi khuẩn probiotic trên được pha trộn cẩn thận cho vào beaker 200ml có chứa dầu thực vật đã vô trùng (Eta Blended Vegetable Oil, Goodman Fielder Pty. Ltd., Melbourne, Australia), và khuấy trộn 200 vòng/phút sử dụng thìa khuấy từ tính (IEC Industrial Equipment & Control Pty. Ltd., Melbourne, Australia). Calcium chloride (0.1 M) được thêm vào cẩn thận phía bên beaker trong khi nhũ tương bị phá hủy. Microencapsulation of L. acidophilus 33200, L. casei 279, B. longum 536 and L. rhamnosus GG using homogenisation (Ultra-Turrax benchtop, Avestin Inc. piston or Silverson mixer) Sự hòa tan sodium alginate và vi khuẩn probiotic kết hợp với dầu thực vật đã được mô tả ở phần trên. Hệ nhũ tương được tạo thành bằng cách đồng nhất hồn hợp tại các tốc độ, áp suất, thời gian khác nhau sử dụng Ultra-Turrax benchtop (Ika Laboratory and Analytical Equipment, Staufen, Germany), Avestin Inc. piston homogeniser (Avestin, Ottawa, Canada) or Silverson mixer (Silverson Machine Ltd., Waterside, Chesham Bucks, England) được mô tả dưới đây. Chuẩn bị alginate beads dùng máy đồng nhất Ultra-Turrax benchtop, hệ nhũ tương được chuẩn bị bằng cách đồng nhất hỗn hợp 200ml ( được nói đến phần 2.2) tại 8000rpm và 13500rpm với thời gian tương ứng 2 hoặc 4 phút. Để chuẩn bị alginate beads sử dụng máy đồng nhất the Avestin Inc. piston, hệ nhũ tương bằng cách chuyển hỗn hợp ( đã nói phần 2.2) đi qua máy đồng nhất 2 hoặc 3 lần với áp suất tương ứng 5 hoặc 10 Mpa. Calcium alginate beads được tạo thành bằng cách đồng nhất 200ml hỗn hợp sử dụng máy trộn 2 hoặc 4 phút . Nhiệt độ đồng nhất sử dụng trong mỗi quá trình xử lý ở 21oC. Sau mỗi quá trình xử lý đồng nhất, mỗi hệ nhũ tương được chuyển vào beaker. Calcium chloride (0.1 M) được thêm vào cẩn thận phía bên cạnh beaker trong khi khuấy trộn sử dụng thìa khuấy từ tính với tốc độ 200rpm. Hỗn hợp đã khuấy trộn ít nhất 10 phút để đảm bảo hệ nhũ tương bị phá hủy hoàn toàn. Những calcium alginate nhỏ hình cầu được tạo thành và subsequently measured using a Mastersizer (Hydro-2000G Malvern Instruments Limited, Worcester, UK). Measurement of particle size of calcium alginate beads (Phân loại kích thước hạt calcium alginate beads) Dung dịch Calcium chloride 0.1M có chứa 1-5g của calcium alginate beads được cho đi qua Mastersizer_Hydro-2000G để đo kích thước các bead (giọt). Mẫu được thêm nước cất đến khi anh sáng laser mờ đi quá 10%. Kích thước trung bình dược kí hiệu là d32, tương ứng với đường kính trung bình của area-volume. Kích thước của bead có thể chấp nhận được quyết định bằng giá trị nghiên cứu d (0.9) (the diameter of bead for an observation at 0.9 of the distribution). Công thức tính toán (equations used) Đường kính hạt được xác định theo công thức sau, với d là đường kính giọt nhỏ, n là số lượng giọt nhỏ trong một lớp. (d represented the droplet diameter, n represented the number of droplets in a class). Công thức sau được sử dụng để tính phần trăm sống sót của vi khuẩn probiotic trong quá trình đồng nhất (homogenisation) Với: x là số vi khuẩn probiotic ban đầu trước khi đồng nhất (homogenisation) y là số vi khuẩn probiotic được vi bao trong calcium alginate beads z là số vi khuẩn probiotic ở bên ngoài môi trường lỏng the calcium alginate beads Công thức sau được sử dụng để tính hiệu suất quá trình xử lý đồng nhất (homogenisation treatments) Với H là hiệu suất quá trình X là số vi khuẩn probiotic ban đầu trước khi đồng nhất (homogenisation) Y là số vi khuẩn probiotic được vi bao trong calcium alginate beads Z là số vi khuẩn probiotic ở bên ngoài môi trường lỏng the calcium alginate beads. BẢO QUẢN Điều kiện bảo quản như là nhiệt độ, chiếu sáng, độ ẩm, lượng Oxy bảo quản, độ ẩm thành phần của bột có ảnh hưởng đáng kể đến sự tồn tại của probiotic trong bột đã sấy, và điều kiện bảo quản chính xác là yếu tố cần thiết duy trì sự sống sót vi khuẩn đã qua freeze-drying hoặc spray-draying. Sự sống sót vi khuẩn probiotic trong bảo quản bột quan hệ nghịch đảo với nhiệt độ bảo quản, (Gardiner et al., 2000; Mary, Moschetto, & Tailliez, 1993; Silva, Carvalho,n Teixeira, & Gibbs, 2002; Teixeira et al., 1995b). Bruno and Shah (2003) đã giải thích nhiệt duy trì ở 180C là điều kiện tốt nhất bảo quản dài lâu của freeze-dried probiotic, tăng tối đa khả năng sống sót của bifidobacteria, nhưng ngược lại nhiệt độ bảo quản hơn 200C không phù hợp, kết quả giảm đáng kể số lượng vi khuẩn sống sót. Nhưng Simpson et al. (2005) cho rằng có sự giảm đáng kể khả năng tồn tại số lượng loài bifidobacteria đã được sấy khô với chất mang là sữa gầy và bảo quản từ 15-250C. Hơi ẩm trên probitoc powder (moisture content of probiotic powders) là nhân tố quan trọng kéo dài thời gian sử dụng vi khuẩn sống này. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã cho thấy khả năng sống sót freeze-dried probiotic có mối quan hệ nghịch đảo với áp lực hơi nước (relative vapour pressure hay RVP), với 11.4% RVP khả năng sống sót của probiotic cao nhất trong quá trình bảo quản ở nhiêt độ phòng. Zayed and Roos (2004) cũng chứng minh rằng lượng nước còn lại sau khi sấy ảnh hưởng không chỉ khả năng tồn tại probiotic đã được xác định rõ ngay sau quá trình sấy, mà còn ảnh hưởng tốc độ tổn thất trong quá trình bảo quản. Điều kiện độ ẩm tốt nhất bảo quản L. salivarius subsp. Salivarius đã qua freeze-dried từ 2.8 – 5.6% (Zayed & Roos, 2004). Chất mang sử dụng trong quá trình sấy phun và sấy thăng hoa (freeze-drying) probiotic có ảnh hưởng độ ổn định bảo quản. Ananta et al. (2005) đánh giá ảnh hưởng chất mang trong sấy phun từ việc bảo vệ L. rhamnosus GG điều kiện bảo quản 25-370C, và đã phát hiện khả năng bảo vệ giảm theo thứ tự RSM > RSM/Polydextrose > RSM/Raftilose_P95. Vả lại độ bền của L. rhamnosus GG khi bảo quản lâu dài bị suy giảm do biến đổi thành phần sữa gầy hoặc thành phần prebiotic. Những dự kiện trên chứng minh sự thích hợp của sữa gầy như là môi trường sản xuất quy mô lớn của vi khuẩn probiotic cố định đã sấy phun. Vài nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của disaccharides có thể ổn định màng tế bào trong cả hai quá trình freeze và bảo quản (Carvalho et al., 2002; Conrad et al., 2000; Crowe et al., 1988). Như sorbitol ngăn cản sự hư hại màng tế bào bằng cách tác động qua lại với màng (sorbitol prevents membrane damage by interaction with the membrane) (Linders, de Jong, Meerdink, & Vantriet, 1997b), ổn định cấu trúc và chứng năng protein (Yoo & Lee, 1993). Kiểm soát giai đoạn chuyển đổi nhiệt độ trong màng của tế bào khô là một nhân tố quan trọng xác định sức chịu đựng sự sấy khô, thêm với hạn chế gốc tự do hoạt động (control of free radical activity) (Linders et al., 1997a). Nó làm suy giảm khả năng sống sót probiotic trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ cao tương ứng với độ ẩm sản phẩm có chứa đường có liên quan đến glass transition temperature (Vega & Roos, 2006). Lý giải cho điều này là đường giống như form highly viscous glasses tại nhiệt độ phòng khi chúng được khử nước, và cải thiện bảo quản của anhydrobiotes và liposomes có kết hợp với sự hiện diện ở trạng thái như thủy tinh. Những dữ kiện trên chứng minh rằng khả năng sống sót cao của đã freeze-dryed bột L. rhamnosus GG trong trehalose, lactose/trehalose và lactose/maltose có liên quan đến khả năng tạo lớp thủy tinh. Nhưng Carvalho et al. (2002) and Linders et al. (1997a) đã chứng minh rằng sorbitol là một chất bảo vệ có hiệu quả cho L. plantarum và L. rhamnosus trong quá trình bảo quản, trong khi đó, the superior glass former, trehalose không phải là chất bảo vệ tốt. CÁC SẢN PHẨM CHỨA PROBIOTIC TỪ SỮA Các dạng sản phẩm Sản phẩm Tên vi sinh vật Yoghurt Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus acidophilus Kefir Lactobacillusacidophilus Lactobacillus caucasicus Sour cream Streptococcus cremoris Pho mát Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Lactobacillus casei Lactobacillus caucasicus Lactobacillus lactic Lactobacillus plantarum Streptococcus cremoris Streptococcus faecium Sữa Acidophilus Lactobacillus acidophilus Sữa Bulgaricus Lactobacillus bulgaricus Sữa Bifidus Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium longum Sản phẩm trên thị trường Việt Nam Sữa chua truyền thống Sản phẩm Sữa chua trắng Vi sinh vật: Lactobacillus bulgaricus, S.thermophilus Hình 2 Sữa chua trắng Vinamilk Sữa chua Nestlè Vi sinh vật: Bifidobacterium bidum Hình 3 Sữa chua Nestlè Sữa chua Yao Vi sinh vật: Lactobacillus bulgaricus, S.thermophilus Hình 4 Sữa chua Yao Sữa chua Dutch Lady Vi sinh vật: Lactobacillus, Straptococcus Hình 5 Sữa chua Dutch Lady Tác dụng đối với sức khỏe Thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao: giàu Ca, protein, vitamin B Hỗ trợ tốt cho hệ tiêu hoá bằng cách sản xuất ra các enzym cần thiết. Có tác dụng tăng cường và giúp ổn định hệ thống miễn dịch của cơ thể. Acid lactic giúp hấp thụ Ca trong các sản phẩm sữa, do cơ thể dễ hấp thu Ca dưới dạng lactatecanci. Ngoài ra acid lactic giúp cơ thể tiêu hoá lactose tốt hơn. Giúp giảm lượng cholesterol trong máu, hạn chế sự cao huyết áp. Sản xuất ra các kháng sinh tự nhiên giúp ngăn ngừa các mầm bệnh. Sử dụng yoghurt thường xuyên có thể ngăn ngừa bệnh ung thư. SỮA CHUA KHUẤY Sữa chua trái cây Vi sinh vật: Lactobacillus bulgaricus, S.thermophilus Hình 6 Sữa chua trái cây Sữa chua dâu Dutch Lady Vi sinh vật: Lactobacillus, Straptococcus Hình 7 Sữa chua dâu Dutch Lady Nestlè Vi sinh vật: Bifidobacterium bidum Hình 8 Nestlè Sữa chua uống hương cam Vi sinh vật: Bifidus, Lactobacillus, streptococcus Hình 9 Sữa chua uống hương cam Nan1,2 Vi sinh vật: Bifidobacterium difidum, S. thermophilus Hình 10 Nan1,2 Một số sản phẩm Kefir trên thế giới Sản phẩm Original Plain Kefir Vi sinh vật: Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus caucasicus Hình 11 Original Plain Kefir LowFat Plain Kefir Vi sinh vật: Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus caucasicus Hình 12 LowFat Plain Kefir LowFat Vanilla Kefir Vi sinh vật: Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus caucasicus Hình 13 LowFat Vanilla Kefir LowFat Strawberry Kefir Vi sinh vật: Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus caucasicus Hình 14 LowFat Strawberry Kefir Tác dụng đối với sức khỏe Kefir là thức uống bổ dưỡng và cân bằng, phù hợp với mọi người, rất tốt cho sức khoẻ và có thể chữa được nhiều bệnh: Tiêu hoá: Sử dụng kefir thường xuyên sẽ giúp ngăn ngừa sự sa sút của đường ruột, tăng khả năng tiêu hoá, giảm bớt sự đầy hơi, làm hệ tiêu hoá khoẻ mạnh hơn và trị bệnh rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, loét dạ dày…. Kefir có nhiều vitamin, khoáng, axit amin, hệ protein hoàn hảo đã bị thuỷ phân 1 phần nên rất dễ tiêu hoá.. Kefir bổ sung vi khuẩn có lợi cho ruột non . Khi con người còn nhỏ, đường ruột hoàn toàn vô trùng. Sau đó, con người tiếp nhận sữa mẹ, đưa vào đường ruột 1 lượng vi khuẩn probiotic ( có khả năng kháng khuẩn).Uống kefir cũng có tác dụng tương tự. Kefir có thể được dùng như sữa mẹ vì dễ tiêu hoá hơn sữa tươi và sữa bột. Kefir ngăn chặn sự phát triển của nấm Candida .Thường nấm phát triển bắt nguồn từ việc dùng thuốc kháng sinh ( thuốc kháng sinh giết chết vi khuẩn có lợi nhưng không giết được nấm men và nấm mốc trong đường ruột).Sự phát triển của nấm Candida có thể tạo nhiều lỗ trong ruột, gây rò rỉ hệ miễn dịch trong ruột non, các phân tử protein của thức ăn và độc tố của nấm có thể thấm vào cơ thể.Những phân tử này dừng lại ở bất kì vị trí nào trong cơ thể như: xoang, não, túi mật, mạch máu, tim , khớp….làm đau và gây bệnh ở đó.Phương pháp điều trị: gồm probiotics , chất chống nấm tốt với thức ăn không đường và ngũ cốc. Probiotic tốt nhất là kefir làm ở nhà, nên dùng sữa dê thô để làm kefir vì nó có chứa lượng lớn axit caprylic, caproic có hiệu quả trong việc chống nấm. Rối loạn thần kinh: Kefir có nhiều Mg,Ca ( khoáng tốt cho hệ thần kinh) trytophan , giúp làm dịu thần kinh, phục hồi sức khoẻ trở lại, không còn mất ngủ, giảm suy nhược, ăn ngon miệng (dùng 1lít/ngày) Khả năng miễn dịch: Kefir giúp tăng khả năng miễn dịch, chống lại các bệnh virut rất hữu hiệu, giúp chịu đựng cả các bệnh ung thư, AIDS, bệnh mụn giộp, hội chứng mệt mỏi kinh niên…. Duy trì, phát triển, năng lượng: Kefir chứa nhiều Photpho (chất khoáng nhiều thứ 2 trong cơ thể), giúp cơ thể sử dụng gluxit, chất béo, protein cho các chức năng duy trì, phát triển, năng lượng. Chống rối loạn da, kéo dài tuổi thọ, tăng năng lượng : Kefir chứa nhiều vitamin B12, B1, K, biotin (giúp hấp thụ những vitamin B khác như acid Folic, B3, B12 ). Ngoài ra, kefir còn có tác dụng trị 1 số bệnh khác như: bệnh thiếu máu, chứng sưng mật, huyết áp cao, viêm gan… Một số sản phẩm khác Milk plus probiotic Vi sinh vật: Lactobacillus rhamnosus GG Hình 15 Milk plus probiotic Yo-baby Vi sinh vật: L.bugaricus, L.casei, L.reuteri, S.thermophillus Hình 16 Yo-baby Actimel Vi sinh vật: L.casei imunitass Hình 17 Actimel Sour cream Vi sinh vật: Streptococcus cremoris Hình 18 Sour cream Acidophilus milk Vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus Hình 19 Acidophilus milk KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN TƯƠNG LAI Vì vài loài vi khuẩn có sức chịu đựng thuốc kháng sinh rất nhanh, probiotic đã được nghĩ đến để thay thế thuốc kháng sinh, và có thể trở thành sản phẩm quan trọng cho ngành y trong tương lai gần. Tuy nhiên, tính hiệu lực cần phải được chứng minh. Hơn nữa, công cụ cần thiết để giám sát và xác định số lượng tính hiệu quả của of probiotics, prebiotics, và synbiotics trên cơ thể sống. Sản phẩm sự trao đổi chất/lên men từ probiotic LAB (lactic acid bacteria), có thể góp phần hoặc thậm chí là có lợi cho sức khỏe (even mediate specific beneficial health effects). Thí dụ, probiotic được tìm thấy có thể ngăn chặn một mầm bệnh nào đó hoặc là mất hoạt tính rồi sử dụng như là chất chữa bệnh. Vài nghiên cứu chỉ ra non-viable probiotics có ảnh hưởng tốt như as immune modulation and carcinogen binding trong ruột vật chủ (Ouwehand and Salminen, 1998; Salminen et al., 1999; Mercenier et al., 2003). Tế bào sống sót dường như có hiệu quả hơn nhưng tế bào đã chết. Tuy nhiên, dữ kiện trên gợi ra rằng những vi khuẩn tồn tại phát triển có hiệu quả/ cần thiết for specific effects, abiotics, những vi khuẩn probiotic không tồn tại được, thành phần tế bào (thành phần thành tế bào, lysates), chất chuyển hóa tế bào (thuốc kháng sinh làm từ vi khuẩn, nutraceuticals) từ đó tạo hiệu quả với từng trạng thái riêng. Tuy nhiên, sử dụng tế bào không tồn tại được cung cấp thuận lợi cả hai mặt kinh tế và xã hội, thuận tiện sử dụng chúng ở những nước đang phát triển. Vì lí do đó, trong tương lai nó có thể thực hiện phòng những chứng bệnh thuộc dạ dày – ruột do chọn sử dụng probiotic hoặc có chọn mục tiêu cho vi khuẩn ruột với prebiotic hoặc biotherapeutics. Các nghiên cứu phải được tiến hành trên quy mô rộng hơn nhằm làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của probiotic chống lại mầm bệnh. Những vi khuẩn probiotic khác nhau có cơ chế ngăn cản mầm bệnh khác nhau. Công nghệ gene nâng cao hoạt tính của probiotic. Tuy nhiên, những hiệu quả của probiotic nghiên cứu trong ống nghiệm, thú vật, không nhất thiết sẽ có hiệu quả cho người. Trong những năm gần đây, nhiều hãng sản xuất ở Mỹ và châu Âu rất quan tâm cơ hội kinh doanh những thực phẩm có chứa probiotic và prebiotic có lợi sức khỏe. Thành phần thực phẩm này được thừa nhận nâng cao tác dụng có lợi cho hệ sinh vật đường ruột, và liên kết tác dụng lên cơ thể làm giảm lượng lipid, nhân tố nguy hiểm với bệnh nhồi máu cơ tim (cholesterol, triacylglycerol). Probiotic được đưa vào trong sản phẩm bơ sữa như sản phẩm sữa lên men và yoghurt. Prebiotic hiện tại thu được nhiều tiền lời và điều này đã mở cửa thị trường ngành công nghệ bơ sữa một khu vực khác của công nghệ thực phẩm. Probiotic có thể nghiên cứu thêm vào bánh mì, bánh ngọt, ngũ cốc, thâm chí là cả súp. Synbiotic cũng được sự quan tâm chung từ những hãng sản xuất thực phẩm mà thành công trong việc nghiên cứu kết hợp probiotic và prebiotic. Trong khi đó khách hàng luôn quan tâm cải thiện sức khỏe của họ và chế độ ăn uống tốt. Điều này không hoàn toàn dễ thực hiện như là suy nghĩ. Gần đây vấn đề an toàn thực phẩm được quan tâm rất nhiều, việc giới thiệu đã gây nghi ngờ đối với thành phần mới này. Để tiến hành sản xuất khách hàng cần được biết những lợi ích sức khỏe và họ sử dụng sản phẩm này như thế nào trong thực đơn hàng ngày mà không để lại hậu quả bất lợi. Nghiên cứu kiểm tra dinh dưỡng cẩn thận để tiến hành xác định lợi ích của probiotic, prebiotic, synbiotic. Để sản xuất ra thực phẩm thu hút khách hàng, sản phẩm cần phải được định giá mà có thể sử dụng rộng rãi. Nghiên cứu tìm ra lượng bổ sung probiotic và prebiotic thấp nhất nhưng vẫn duy trì một hệ vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh. Ngược lại, sản phẩm có chứa hàm lượng cao prebiotic giúp giảm lượng lipid trong máu. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Tiina Mattila – Sandholm & Maria Saarela, ”Functional dairy products”, CRC Press, 395p [2] ] Marth E.H., steele J.L, “Applied dairy microbiology”, Marcel Dekker Inc., Newyork, 2001, 774p [3] Colette Shortt,Ph.D. , John O’Brien,Ph.D, “Handbook of functional dairy products”, CRC Press, 2004, 289p [4] X.C. Meng, C. Stanton, G.F. Fitzgerald, C. Daly, R.P. Ross, “Anhydrobiotics: The challenges of drying probiotic cultures”, 18 April 2007, [5] “Microstructural studies of probiotic bacteria-loaded – alginate microcapsules using standard electron microscopy techniques and anhydrous fixation.”, [6] “Effect of homogenisation on bead size and survival of encapsulated probiotic bacteria”, [7] “Selection of useful probiotic lactic acid bacteria from the Lactobacillus acidophilus group and their applications to functional foods”, Animal Science Journal (2004)