Thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase từ nấm nun Aspergilluse Niger, Mucor trên môi trường lên men bán rắn

Tên đề tài: Thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase từ nấm nun Aspergilluse Niger, Mucor trên môi trường lên men bán rắn. 2. Nhiệm vụ: Tủa enzyme bằng cồn và muối vô cơ trung tính ,xác định hoạt tính, hàm lượng protein và tinh sạch enzyme celỉulase từ hai chủng nấm mốc Aspergillus Niger và Mucor bằng phương pháp sắc kỷ lọc gel vú chạy diện ch bằng phương pháp SDS — PAGE 3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 05/09/2006 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 05/01/2007 TÓM TẮT KHÓA LUẬN “THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM Mốc ASPERGILLUSE NIGER, MUCOR TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN”. Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2006 đến tháng 01/2007 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM. Chế phẩm enzyme thô được nuôi cây ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ 4 trấu: 6 cám mì, độ ẩm 55%, pH5. Canh trường nuôi cây Asp.Niger và Mucor được sây khô ở 40ÍJC, xay nhỏ. Sản phẩm gọi là chế phẩm enzyme thô. Lấy chế phẩm enzyme thô thêm nước cất, đem khuấy trên máy khuấy, các dịch lọc đem ly tâm thu dịch chiết thô. Dịch chiếc enzyme thô này được tủa với muôi (NH4)2S04 ở các nồne độ: 50, 55, 60, 65,70, 75 và cồn 96° ở các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Cặn tủa thu được hoà tan vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính enzyme và khôi lượng protein nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tốt nhất cho việc tủa enzyme. Cuôì cùng tinh sạch enzyme có hoạt tính cao nhất được chạy qua sắc ký lọc sei và xác định trọng lượng phân tử protein bằng phương pháp điện di. Kết quả thu được như sau: ở cả hai chủng nồng độ muôi 70% độ bão hoà và tỉ lệ cồn tối ưu là 1:4. Enzyme của hai chủng hoạt độns tốt nhất ở pH 5 và nhiệt độ 40°c. ã về hoạt tính: CMCase Aps.Niger > Mưcor spp ã về hàm luỢng protein: Aps.Niger > Mucor spp ã về hoạt tính riêng: Aps.Niger > Mucor spp PHAN I. TONG QUAN TAI LIẸU 1.1 Khái quát chung về enzyme 1 1.1.1 Sờ lược về lịch sử enzyme .1 1.1.2Tính chất ưu việt của enzyme .1 1.1.3Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme 2 1.1.4Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật .3 1.2 Giới thiệu về enzyme Cellulase 3 1.2.1 Định nghĩa .3 1.2.2 Phân loại .4 1.2.3 Cấu tạo của Cellulase .4 1.2.4 Tính chất .6 1.2.4.1 Tính đặt hiệu 6 1.2.4.2 Đặc tính Vật Lý và hoá Lý 6 1.2.4.3 Các chất ức chế 6 1.2.4.4 Cơ chế tác động .6 1.3 Vi sinh tổng hợp Cellulase .6 1.3.1 Giới thiệu chung về nhóm vi sinh vật tổng hợp Cellulase .7 1.3.1.1 Xạ khuẩn .7 1.3.1.2 Vi khuẩn 7 1.3.1.3 Niên khuẩn 7 1.3.1.4 Nấm sợi 7 1.3.2 Nghiên cứu về nấm sợi Aspergilluse Niger .8 1.3.3 Nghiên cứu về nấm sợi Mucor .10 1.4 Nuôi cấy enzyme tổng hợp Cellulase .12 1.4.1 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng .12 1.4.2 Ẩnh hưởng của các yếu tô" dinh dường đối với quá trình sinh tổng hợp enzyme Cellulase của vi sinh vật .13 1.4.2.1 Nguồn Cacbon .13 1.4.2.2 Nguồn Nitơ 13 1.4.2.3 Nguồn tô" khoáng .14 1.4.2.4 Nhiệt độ nuôi cấy 14 1.4.2.5 pH ban đầu .14 1.5 Phương pháp lên men bán rắn và thu nhận enzyme Celỉulase từ nấm sợi Aspergilluse Niger và Mucor 14 1.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme .15 1.7 Phương pháp tách phân đoạn bằng sắc ký .17 1.8 Phương pháp lọc gel (Gel filtration) 20 1.9 Phân tích hỗn hỢp Enzym bằng phương pháp điện di mini- Gel SDS Polyacrylamide .21 1.10 Một sô" ứng dụng Enzyme Cellulase 22 PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU 2.1 Vật liệu .24 2.1.1 Chế phẩm enzyme Cellulase 24 2.1.2 Hoá chất và thiết bị 24 2.2 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme cellulase 24 2.2.1 Nuôi cấy nấm sợi Asp. Niger và Mucor .25 2.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme Cellulase thô 28 A: Tủa bằng cồn 28 B: Tủa bằng muối (NH4)2S04 29 2.2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 29 2.2.3.1 Nguyên tắc .29 2.23.2 Thực hành 29 A: Hoá chất và thiết bị 29 B: Lập đồ thị chuẩn .30 Tính kết quả .30 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Cellulase nấm sợi Asp.Niger và Mucor .31 2.2.4.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl Cellulase nấm sợi Asp. Niger và Mucor .31 2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme CMCase nấm sợi Asp. Niger và Mucor .35 2.2.4.3 2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme CMCase nấm sợi Asp. Niger và Mucor 35 2.2.5 Bước đầu tinh sạch enzyme CMCase nấm sợi Asp. Niger và Mucor bằng sắc ký lọc gel .35 2.2.5.1 Bản chất của phương pháp 35 2.2.5.2 Nguyên tắc .36 2.2.5.3 Chuẩn bị hoá chất và dụng cụ .37 2.2.5.4 Các bước tiến hành 38 2.2.6 Phân tách enzyme Cellulase nấm sợi Asp. Niger và Mucor bằng điện di trên gel Polyacrylamide 40 2.2.6.1 Nguyên tắc .40 2.2.6.2 Vật liệu và phương pháp .41 A: Vật liệu .41 B: Phương pháp 43 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Chiết xuất thô enzyme Cellulase, tủa protein từ nấm sợi Asp, Niger và Mucor .46 3.1.1 Chiêt xuất thô enzyme Cellulase, từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor và tủa protein trong cồn lạnh .46 3.1.2.1 Chiết xuất thô enzyme Cellulase và tủa protein từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor bằng muôi (NH4)2S04 .50 3.1.3 So sánh việc tủa enzyme trong cồn lạnh và tủa enzyme bằng muôi (NH4)2S04từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor 53 3.2 Xác định pH và nhiệt độ tốì ưu cho hoạt động của enzyme CMCase 55 3.2.1 pH tối ưu từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor .55 3.2.2 Nhiệt độ tốì ưu từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor .56 3.3 Tinh sạch enzyme CMCase từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor .57 3.3.1 Tác nhân tủa là cồn lạnh từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor 57 3.3.1.1 Xác định tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg) trong dịch chiết enzyme thô từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor .57 3.3.1.2 Tủa enzyme trong cồn và xác định tổng hoạt tính CMCase và tổng hàm lượng protein (mg) trong sản phẩm nấm sợi Asp. Niger và Mucor .58 3.3.1.3 Tinh sạch enzyme CMCase trên Sephadex G100 từ nấm sợi Asp.Niger và Mucor .58 3.3.2 Tác nhân tủa là muôi (NH4)2S04 70% từ nấm sợi Asp. Niger và Mucorố3 3.3.2.1 Xác định tổng hoạt tính CMCase (UI) và tổng hàm lượng protein (mg) trong dịch chiết enzyme thô từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor .63 3.3.2.2 Tủa enzyme bằng (NH4)2S04 và loại muôi trên gel Sephadex G2563 3.32.3 Tinh sạch enzyme CMC trên Sephadex G100 nấm sợi Asp. Niger và Mucor 63 3.4 Kết quả phân tách hệ enzyme Cellulase từ nấm sợi Asp. Niger và Mucor bằng phương pháp điện di trên gel SDS - PAGE 67 PHẦN IV: KẾT LUẬN