Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng monensin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10TCN 835:2006 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method HÀ NỘI - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 835 : 2006 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by high - performance liquid chromatographic method (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN ngày tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) 1. Ph¹m vi ¸p dông Tiªu chuÈn nµy ¸p dông ®Ó ph©n tÝch hµm l­îng kh¸ng sinh monensin trong thøc ¨n ch¨n nu«i b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC). Giíi h¹n ph¸t hiÖn cña ph­¬ng ph¸p lµ 40mg/kg. 2. Tµi liÖu viÖn dÉn C¸c tµi liÖu viÖn dÉn sau ®©y rÊt cÇn thiÕt cho viÖc ¸p dông tiªu chuÈn. §èi víi c¸c tµi liÖu viÖn dÉn ghi n¨m ban hµnh th× ¸p dông phiªn b¶n ®­îc nªu. §èi víi c¸c tµi liÖu viÖn dÉn kh«ng ghi n¨m ban hµnh th× ¸p dông phiªn b¶n míi nhÊt, bao gåm c¶ c¸c söa ®æi: TCVN 4851 (ISO 3696). N­íc dïng ®Ó ph©n tÝch trong phßng thÝ nghiÖm. Yªu cÇu kü thuËt vµ ph­¬ng ph¸p thö. ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs - Sampling. 3. Nguyªn t¾c Monensin trong mÉu thøc ¨n ch¨n nu«i ®­îc t¸ch chiÕt b»ng metanol, sau ®ã t¹o dÉn xuÊt b»ng 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNP) trong m«i tr­êng axit ë 55oC, t¸ch vµ ®Þnh l­îng trªn hÖ thèng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao víi detector UV ë b­íc sãng 392nm. 4. ThiÕt bÞ, dông cô 4.1. M¸y nghiÒn mÉu phßng thÝ nghiÖm. 4.2. Sµng phßng thÝ nghiÖm, cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm vµ 3,00 mm. 4.3. C©n ph©n tÝch cã ®é chÝnh x¸c 0,0001 g. 4.4. C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c 0,01 g. 4.5. M¸y ly t©m l¹nh cã tèc ®é 3000 vßng/phót, sö dông èng ly t©m dung tÝch 30 ml. 4.6. èng ly t©m, dung tÝch 30 ml b»ng polypropylen hoÆc b»ng thuû tinh, cã n¾p ®Ëy. 4.7. Tñ Êm, cã kh¶ n¨ng duy tr× nhiÖt ®é æn ®Þnh ë 55oC ± 1oC. 4.8. M¸y l¾c trßn hoÆc m¸y l¾c ngang cã thÓ ®¹t tèc ®é 250 vßng/phót. 4.9. èng nghiÖm dung tÝch 10ml cã nót xo¸y. 4.10. B×nh ®Þnh møc dung tÝch 10, 100, 1000 ml. 4.11. Pipet tù ®éng ®iÒu chØnh ®­îc tõ 1ml ®Õn 30 ml. 4.12. Micropipet dung tÝch tõ 10ml ®Õn 100 ml vµ tõ 200ml ®Õn 1000 ml. 4.13. Hót dung m«i tù ®éng 2 ml, 10 ml, 20 ml. 4.14. M¸y l¾c èng nghiÖm (Vortex mixer). 4.15. èng ®ong 1000ml. 4.16. BÓ siªu ©m. 4.17. B¬m hót ch©n kh«ng. 4.18. Mµng läc syranh cã kÝch th­íc 0,45 mm. 4.19. B×nh nãn dung tÝch 125ml. 4.20. Lä nhá ®ùng dÞch mÉu chuyªn dông cho HPLC, cã n¾p vÆn PTFE . 4.21. ThiÕt bÞ trén mÉu phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart Model C 100 T hoÆc t­¬ng ®­¬ng. 4.22. ThiÕt bÞ chia mÉu: ThiÕt bÞ chia ®«i hoÆc chia t­ mÉu: vÝ dô nh­ thiÕt bÞ chia t­ h×nh nãn, thiÕt bÞ chia nhiÒu ng¨n cã hÖ thèng ph©n h¹t hoÆc c¸c thiÕt bÞ chia kh¸c ®¶m b¶o ph©n chia mÉu thÝ nghiÖm thµnh mÉu thö ®ång nhÊt. 4.23. Hép ®ùng mÉu cã n¾p kÝn. 4.24. HÖ thèng HPLC gåm cã: 4.24.1. M¸y s¾c kÝ láng hiÖu n¨ng cao, b×nh chøa dung m«i, hÖ thèng b¬m mÉu, detector UV ®Æt ®­îc ë b­íc sãng 392nm, m¸y ghi hoÆc bé tÝch ph©n. 4.24.2. Cét ph©n tÝch HPLC pha ®¶o cã kÌm cét b¶o vÖ ChiÒu dµi 150mm §­êng kÝnh trong 4,6mm H¹t nhåi C 18; 5mm hoÆc t­¬ng ®­¬ng 5. Hãa chÊt vµ thuèc thö 5.1. Ho¸ chÊt ChØ sö dông ho¸ chÊt ®­îc c«ng nhËn ®¹t chÊt l­îng tinh khiÕt ph©n tÝch vµ n­íc cÊt cÊp h¹ng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). C¸c dung m«i ph¶i ®¹t chÊt l­îng ®Ó dïng cho ph©n tÝch HPLC. 5.1.1. Metanol. 5.1.2. Axit acetic (100%). 5.1.3. Acetonitrile 5.1.4. ChÊt chuÈn monensin, d¹ng muèi natri monensin, lo¹i tinh khiÕt, cã kÌm theo giÊy chøng nhËn hµm l­îng. 5.2. Thuèc thö 5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dÞch 500mg/ml. C©n 50g TCA chÝnh x¸c ®Õn 0,01g cho vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc b»ng n­íc cÊt. L¾c kü dung dÞch. 5.2.2. Thuèc thö DNP, dung dÞch 1mg/ml trong metanol. C©n 100mg DNP chÝnh x¸c ®Õn 1mg vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch b»ng metanol. L¾c kü dung dÞch. 5.2.3. Pha ®éng cho HPLC. Hçn hîp metanol: dung dÞch axit acetic 1,5% tØ lÖ 90:10 theo thÓ tÝch (v/v). 5.2.3.1. Dung dÞch axit acetic 1,5% trong n­íc, theo tØ lÖ thÓ tÝch (v/v). Cho 15ml axit acetic (5.1.2) vµo b×nh ®Þnh møc 1000ml. Thªm n­íc cÊt ®Õn v¹ch ®Þnh møc. L¾c ®Òu dung dÞch. 5.2.3.2. Hçn hîp pha ®éng. Cho 900ml metanol vµo èng ®ong dung tÝch 1000ml. Thªm tiÕp 100ml dung dÞch axit acetic 1,5% (5.2.3.1). Sau ®ã läc hçn hîp dung m«i thu ®­îc qua phÔu hót ch©n kh«ng víi mµng läc cã kÝch th­íc lç 0,45 mm, siªu ©m ®uæi khÝ ë nhiÖt ®é th­êng trong 30 phót. 5.2.4. Dung dÞch chuÈn 5.2.4.1. Dung dÞch chuÈn gèc 1000mg/ml Tïy theo hµm l­îng monensin ghi trong giÊy chøng nhËn (5.1.4), c©n mét l­îng nhÊt ®Þnh chÊt chuÈn natri monensin chÝnh x¸c ®Õn 0,1mg cho vµo b×nh ®Þnh møc dung tÝch 100ml, pha lo·ng vµ ®Þnh møc b»ng metanol ®Ó sao cho thu ®­îc dung dÞch gèc cã nång ®é 1000mg/ml. Dung dÞch chuÈn gèc ®­îc b¶o qu¶n trong lä n©u ë 40C, cã thÓ sö dông ®­îc trong vßng 2 tuÇn. 5.2.4.2. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc 100mg/ml. Hót chÝnh x¸c 10ml dung dÞch chuÈn gèc(5.2.4.1) vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, pha lo·ng vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch b»ng metanol. L¾c ®Òu. 6. LÊy mÉu vµ chuÈn bÞ mÉu 6.1. LÊy mÉu Ph­¬ng ph¸p lÊy mÉu kh«ng quy ®Þnh trong tiªu chuÈn nµy, nªn lÊy mÉu theo ISO 6497:2002. §iÒu quan träng lµ mÉu göi ®Õn phßng thÝ nghiÖm ph¶i lµ mÉu trung thùc vµ cã tÝnh ®¹i diÖn, kh«ng bÞ h­ h¹i hoÆc bÞ biÕn ®æi thµnh phÇn trong qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n. Khèi l­îng mÉu ph©n tÝch ph¶i kh«ng ®­îc Ýt h¬n 500 gam. 6.2. ChuÈn bÞ mÉu 6.2.1. MÉu ë d¹ng bét mÞn NÕu mÉu thÝ nghiÖm ë d¹ng bét lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm th× trén thËt ®Òu mÉu (500 gam) b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart (hoÆc t­¬ng ®­¬ng) trong vßng 10 phót. Sau ®ã chia hçn hîp b»ng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t­ cho ®Õn khi thu ®­îc l­îng mÉu thö kh«ng d­íi 100 gam. 6.2.2. MÉu cã kÝch th­íc h¹t võa 6.2.2.1. NÕu mÉu thÝ nghiÖm kh«ng lät hÕt qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm nh­ng lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç 3,00 mm th× trén thËt ®Òu mÉu (kh«ng Ýt h¬n 500 gam) b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart (hoÆc t­¬ng ®­¬ng) trong vßng 10 phót. 6.2.2.2. Dïng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t­ mÉu ®· trén ®Òu (6.2.2.1) cho ®Õn khi thu ®­îc l­îng mÉu thö kh«ng d­íi 100 gam. NghiÒn l­îng mÉu nµy cÈn thËn trong m¸y nghiÒn (4.1) cho dÕn khi mÉu lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm. 6.2.3. MÉu cã kÝch th­íc h¹t to. 6.2.3.1. NÕu mÉu kh«ng lät qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 3,00 mm th× cÇn nghiÒn mÉu (kh«ng Ýt h¬n 500 gam) trªn m¸y nghiÒn (4.1) cho ®Õn khi mÉu lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 3,00 mm, sau ®ã trén thËt ®Òu mÉu b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart (hoÆc t­¬ng ®­¬ng) trong vßng 10 phót. 6.2.3.2. Dïng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t­ mÉu ®· trén ®Òu (6.2.3.1) cho ®Õn khi thu ®­îc l­îng mÉu thö kh«ng d­íi 100 gam. NghiÒn l­îng mÉu nµy cÈn thËn trong m¸y nghiÒn (4.1) cho ®Õn khi mÉu lät hoµn toµn qua sµng cã kÝch th­íc lç sµng 1,00 mm. C¸c mÉu thö ®­îc b¶o qu¶n trong c¸c lä ®ùng mÉu (4.20) ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 2 – 250C, n¬i kh« r¸o. Chó ý: Nªn nghiÒn, trén mÉu trong c¸c phßng cã th«ng giã, nªn ®eo kÝnh, khÈu trang vµ g¨ng tay b¶o vÖ. 7. C¸ch tiÕn hµnh 7.1. §­êng chuÈn Hót chÝnh x¸c lÇn l­ît 10, 20, 50, 100, 200 vµ 400ml tõ dung dÞch chuÈn lµm viÖc (100mg/ml) cho vµo èng nghiÖm (4.9), pha lo·ng ®Õn 700ml b»ng metanol vµ t¹o dÉn xuÊt nh­ c¸c b­íc tiÕn hµnh ë môc 7.2. C¸c dung dÞch trªn sÏ cã nång ®é tõ 1mg/ml ®Õn 40mg/ml t­¬ng øng trªn ®å thÞ chuÈn. 7.2. ChiÕt mÉu vµ t¹o dÉn xuÊt C©n chÝnh x¸c ®Õn 0,1mg tõ 5,0g-10,0g mÉu thö ®· ®­îc nghiÒn mÞn theo môc 6 (tuú theo hµm l­îng kh¸ng sinh cã trong mÉu) cho vµo b×nh nãn 125ml, thªm tiÕp 50ml metanol. TiÕn hµnh chiÕt monensin b»ng c¸ch l¾c trªn m¸y l¾c ngang (4.8) trong thêi gian 1 giê víi tèc ®é 250vßng /phót. LÊy 10ml phÇn dÞch trong ë phÝa trªn cho vµo èng ly t©m (4.6) vµ ly t©m trong 10 phót ë tèc ®é 3000 vßng/phót. Hót 700ml dÞch ë phÝa trªn èng ly t©m cho vµo èng nghiÖm (4.9). Thªm tiÕp 100ml dung dÞch TCA (500mg/ml). L¾c èng nghiÖm trong 20 gi©y trªn m¸y l¾c (4.8), sau ®ã ®Ó èng nghiÖm ë nhiÖt ®é phßng trong 10 phót. Thªm tiÕp 200ml thuèc thö DNP (1mg/ml) vµo èng nghiÖm, vµ l¾c 20 gi©y trªn m¸y l¾c (4.8). §Æt èng nghiÖm vµo tñ Êm cã nhiÖt ®é æn ®Þnh 55oC (4.7) trong 20 phót. Lµm nguéi èng nghiÖm vµ dïng 10ml dung dÞch nµy ®Ó b¬m vµo hÖ thèng HPLC. 7.3. ChuÈn bÞ mÉu tr¾ng MÉu tr¾ng lµ mÉu thøc ¨n ch¨n nu«i ®­îc x¸c ®Þnh lµ kh«ng cã monensin. MÉu tr¾ng ®­îc chuÈn bÞ t­¬ng tù nh­ mÉu thö theo môc 7.2. 7.4. ChuÈn bÞ mÉu ®Ó x¸c ®Þnh ®é thu håi ViÖc x¸c ®Þnh ®é thu håi ®­îc chuÈn bÞ b»ng c¸ch cho mét l­îng dung dÞch chuÈn cã nång ®é thÝch hîp ®­îc pha tõ dung dÞch gèc vµo 5g mÉu tr¾ng (7.3) ®Ó ®¶m b¶o mÉu cã hµm l­îng monensin n»m trong d·y ®å thÞ chuÈn, mÉu ®­îc ®Ó yªn trong 30 phót tr­íc khi tiÕn hµnh chiÕt xuÊt. Sau ®ã tiÕp tôc qu¸ tr×nh chiÕt mÉu vµ t¹o dÉn xuÊt t­¬ng tù nh­ ®èi víi mÉu thö theo môc 7.2. 7.5. Ph©n tÝch trªn HPLC 7.5.1. §iÒu kiÖn s¾c ký: NhiÖt ®é cét 30oC Detector detector UV b­íc sãng 392 nm Tèc ®é dßng 1 ml/phót ThÓ tÝch b¬m mÉu 10 ml 7.5.2. TiÕn hµnh 7.5.2.1. Nªn sö dông b¶o vÖ cét, viÖc sö dông b¶o vÖ cét kh«ng cã bÊt cø ¶nh h­ëng nµo ®Õn kÕt qu¶ ph©n tÝch. 7.5.2.2. C©n b»ng hÖ thèng s¾c ký b»ng pha ®éng (5.2.3) 30 phót tr­íc khi b¬m mÉu. 7.5.2.3. Quy tr×nh b¬m mÉu theo thø tù nh­ sau: dÞch mÉu tr¾ng, c¸c dung dÞch chuÈn, dÞch mÉu thu håi, dÞch mÉu thö, c¸c dung dÞch chuÈn. Chó ý: CÇn b¬m c¸c dÞch chuÈn tr­íc vµ sau mçi ®ît ph©n tÝch, kh«ng nªn ®Ó qu¸ 20 lÇn b¬m mÉu cho mçi ®ît ph©n tÝch. NÕu qu¸ 20 lÇn th× ph¶i b¬m c¸c dung dÞch chuÈn thªm lÇn n÷a vµo kho¶ng gi÷a ®ît b¬m mÉu. 7.5.2.4. X¸c ®Þnh diÖn tÝch pic ®èi víi c¸c dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch mÉu thö t­¬ng øng 7.5.2.5. Sau khi ch¹y m¸y ph¶i lµm s¹ch hÖ thèng HPLC b»ng hçn hîp gåm n­íc cÊt : acetonitrile theo tû lÖ thÓ tÝch 40:60 trong 30 phót ®Õn 1 giê ®Ó lo¹i hÕt ®Öm trong hÖ thèng tr­íc khi t¾t m¸y. 8. TÝnh to¸n kÕt qu¶ 8.1. §­êng chuÈn 8.1.1. Ph¶i ®¶m b¶o r»ng c¸c diÖn tÝch pic cña mÉu thö ®Òu n»m trong ph¹m vi cña ®­êng chuÈn. NÕu mÉu thö nµo cã diÖn tÝch pic v­ît qu¸ chiÒu cao cña ®­êng chuÈn ë nång ®é cao nhÊt th× sÏ bÞ lo¹i vµ ph¶i tiÕn hµnh thö l¹i víi sù pha lo·ng. 8.1.2. X©y dùng ®­êng chuÈn biÓu thÞ mèi quan hÖ gi÷a diÖn tÝch pic thu ®­îc cña dung dÞch chuÈn víi nång ®é cña monensin theo quan hÖ tuyÕn tÝnh bËc1: y= ax + b Trong ®ã: y lµ diÖn tÝch pic x lµ nång ®é cña kh¸ng sinh a lµ hÖ sè gãc b lµ h»ng sè 8.2. TÝnh to¸n 8.2.1. Hµm l­îng monensin cã trong mÉu thö ®­îc tÝnh to¸n dùa vµo ®­êng chuÈn håi qui tuyÕn tÝnh (8.1.2) theo c«ng thøc sau: Trong ®ã: X lµ hµm l­îng monensin cã trong mÉu thö, tÝnh b»ng mg/kg Y lµ hiÖu sè gi÷a diÖn tÝch pic cña dÞch chiÕt mÉu thö vµ diÖn tÝch pic cña mÉu tr¾ng a, b lµ c¸c th«ng sè cña ®­êng chuÈn y = ax + b V lµ thÓ tÝch dÞch chiÕt mÉu (7.2), tÝnh b»ng ml m lµ khèi l­îng mÉu thö, tÝnh b»ng gam 8.2.2. KÕt qu¶ cuèi cïng lµ gi¸ trung b×nh cña hai lÇn ph©n tÝch nh¾c l¹i. Trong qu¸ tr×nh tÝnh to¸n lu«n ph¶i lÊy hai sè sau dÊu phÈy. Gi¸ trÞ trung b×nh ®­îc lµm trßn ®Õn mét ch÷ sè thËp ph©n. 8.2.3. X¸c ®Þnh ®é thu håi (R) tÝnh theo phÇn tr¨m theo c«ng thøc sau: Trong ®ã: C1 lµ hµm l­îng monensin x¸c ®Þnh ®­îc theo quy tr×nh ph©n tÝch (tÝnh b»ng mg/kg) C lµ hµm l­îng monensin ®­îc n¹p thªm vµo mÉu (tÝnh b»ng mg/kg). §é thu håi ®­îc x¸c ®Þnh cho mçi lÇn ch¹y mÉu Ýt nhÊt ph¶i ®¹t 80%. 9. B¸o c¸o thö nghiÖm B¸o c¸o kÕt qu¶ ph¶i bao gåm Ýt nhÊt c¸c th«ng tin d­íi ®©y: - Mäi th«ng tin cÇn thiÕt ®Ó nhËn biÕt mÉu thö. - ViÖn dÉn cña tiªu chuÈn nµy hoÆc ph­¬ng ph¸p thö. - KÕt qu¶ vµ ®¬n vÞ biÓu thÞ kÕt qu¶. - Ngµy th¸ng lÊy mÉu vµ kiÓu lo¹i lÊy mÉu (nÕu cã). - Ngµy th¸ng thö nghiÖm. - C¸c ®iÓm ®Æc biÖt quan s¸t ®­îc trong qu¸ tr×nh thö nghiÖm. - Mäi thao t¸c kh«ng qui ®Þnh trong tiªu chuÈn nµy, hoÆc ®­îc coi lµ tuú chän, cïng víi c¸c chi tiÕt cña sù cè bÊt kú mµ cã thÓ ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶. KT. BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng